专利名称：S1p在制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡药物上的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体地说涉及S1P的一种新用途。
背景技术：
1-磷酸鞘氨醇(英文名称为sphingosine 1-phosphate,简称S1P)系血 清来源的具有生物学活性的鞘磷脂代谢产物，具有重要的生理功能，既可以作 为细胞内第二信使发挥作用，又可以与细胞表面的特定受体结合而发挥重要的
生物学功能。1-磷酸鞘氨醇的化学结构式为
其分子式为C18H38N05P，其分子量为379.47。目前，专利申请《1-磷酸-鞘氨 醇(S1P)受体激动剂用于治疗脑变性性疾病的应用》(申请号200480037861. 1) 和《组合S1P受体激动剂/调节剂和免疫抑制药的抗淋巴细胞抗体诱导》(申请 号200680003305.1)等公开了 S1P的一些用途。
长久以来，S1P—直被认为是真核细胞膜反转过程中形成的鞘脂类代谢物。 然而，自从10年前发现其调节了细胞生长以来(Zhang， H等.(1991) J. Cell Biol. 114， 155-167) ， S1P已经被报道参与了许多不同的生物学过程，比如， 细胞生长，分化，存活，血管发生和细胞迁移(Goetzl， E.J等.(1998) FASEB J. 12， 1589-1598,Spiegel, S.等.(2000) Biochim. Biophys. Acta 1484， 107-116.Pyne， S.等.(2000) Biochem. J. 349， 385-402.Hla， T等， (2001) Science 294， 1875-1878)。近来发现，S1P通过影响T细胞功能和淋巴 细胞运输同样参与了免疫功能的调节(Jolly， P.等.(2002) Mol. Immunol. 38， 1239-1245.Mandala， S等.(2002) Science 296， 346-349. Brinkmann， V 等.(2002) J. Biol. Chem. 277， 21453-21457)。另外，塞诺菲-安万特德国 有限公司在《S1P的用途》(申请号:200480015055. 4)中公开了SIP及其功能片 段在调节、预防以及消除疼痛等作用。在心血管系统SIP更是扮演着多重角色，
通过调节包括心肌细胞(P. Robert等，丄Mol. Cell. Cardiol. 33 (2001) 1589 - 1606)，心脏成纤维细胞(Lucia Cavallini等，Arch Biochem Biophys, Oct 1999; 370(2) :156-62. Lee K等.Am J Physiol Heart Circ Physiol, Jun 2007; 292: H2698 - H2711)，血管内皮以及血管平滑肌细胞(Waeber C等， Vascular sphingosine-l- phosphate S1P1 and S1P3 receptors. Drug News Perspect 2004, 17:365-382. Tamama K等，0kajima F: Sphingosine i-phosphate signaling in atherosclerosis and vascular biology. Curr Opin Lipidol 2002， 13:489-495. PanetU TS: Differential effects of sphingosine l-phosphate and lysophosphatidic acid on endothelial cells. Biochim Biophys Acta 2002， 1582:190-196)在内的细胞的肥大，增殖，存活 和迁移等牛物学特性进而参与调控了心血管系统多种生理学以及病理生理学过 程的发生和发展。
心肌梗塞的发病率和死亡率逐年升高，严重影响着人们的生活质量。心机梗 死导致心肌缺血的发生，而心肌缺血致使心肌细胞因营养匮乏发生进行性死亡， 继而形成瘢痕组织，心肌发生过度重塑，最终导致心力衰竭(几Aceves等.Rev Invest Clin， Mar 2005; 57(2): 156-62)。近年，细胞移植治疗心肌梗塞取 得了较快的发展。骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,以下 简称MSCs)可以作为种子细胞移植到缺血心肌，其并通过分化形成心肌细胞， 旁分泌作用等途径有效地改善缺血心肌血供，部分恢复和改善了心功能
(Kimikazu Hamano等.Ann. Thorac. Surg. ， Apr 2002; 73: 1210-1215. Julia Feygin等.Am J Physiol Heart Circ Physiol, Sep 2007; 293: H1772 — H1780)。 目前，MSCs细胞移植已成为国内外临床治疗缺血性心脏病的安全有效方法
(Haider H. Expert Rev Cardiovasc Ther. 2006;4(4):557-568. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Y Miyahara等,Apr 2006; 12(4): 459-65)。然而， 研究发现，移植入心梗区的MSCs只有部分能够存活并发挥作用，有相当数量的 干细胞在缺血组织中大量凋亡(Y0NG-JI認GENG等，Acad. Sci. ， Dec 2003; 1010: 687 697)。因此，如何有效的减少移植入缺血组织的MSCs凋亡率，提 高其存活率，从而达到最佳的细胞移植治疗效果，是目前干细胞移植治疗缺血 性心脏病以及其他肢体缺血性疾病亟待解决的难题，并且直接影响到细胞移植 的疗效。经检索，没有发现有关SIP在缺氧缺血环境下抑制骨髓间充质干细胞凋亡 作用的报道。
发明内容
本发明是针对目前临床细胞移植治疗缺血性心肌病的种子细胞-骨髓间充 质干细胞的存活率低、治疗效果差等缺点，提供了一种能提高骨髓间充质干细 胞存活进而增强其疗效的药物。
本发明的第一 目的是SIP在制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡药物上的应用。 本发明的第二目的是SIP在制备治疗缺血性心脏病药物上的应用。 本发明的第三目的是SIP在制备治疗肢体缺血性疾病药物上的应用。 所述的S1P是指S1P或含有S1P的药物组合物。所述的S1P (sphingosine l-phosphate，简称S1P)，中文名称为1-磷酸鞘氨醇，其化学结构式为
分子式为UHwNOJ3 分子量为379.47
上述骨髓间充质干细胞凋亡主要是由移植后的缺血缺氧环境引起的，所述 的缺血缺氧环境包括缺(低)氧缺(低)血、缺(低)氧无缺(低)血、缺(低) 血无缺(低)氧等。
本发明所述的S1P可通过购买获得，使用时以甲醇或BSA等溶解为所需浓 度(0. 1 50%)即可。
本发明中S1P的使用方式(1)、在移植前将骨髓间充质干细胞在浓度为 0. 1 50uM的SlP中孵育20 120min; (2)、在骨髓间充质干细胞移植前给患者 口服S1P或含有S1P的药物，如高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL); (3)、在骨髓间充质千细胞移植前给患者静脉注射S1P或含有S1P的药物，提 高血清中的S1P含量，如高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)等。
本发明具有的优点(1)本发明效果好，能显著提高临床移植用于治疗的 骨髓间充质干细胞的存活率(存活率能提高50%); (2)本发明应用范围广，不 仅可用丁移植间充质干细胞治疗缺血性心脏病、还可用于肢体缺血性疾病等。
图1.不同处理骨髓间充质干细胞的细胞核的荧光显微镜照片。
其中A:正常对照组、B:凋亡模型组、C: 0. l幽SIP +凋亡模型组、 D: 1MM SIP +凋亡模型组、E: 10幽SIP +凋亡模型组、 F: 20幽SIP +凋亡模型组、G: 50MM S1P +凋亡模型组。 图2.不同处理骨髓间充质干细胞A皿exin V/PT流式细胞术检测结果。 其屮A:正常对照组、B:凋亡模型组、C:S1P 0. lMM+凋亡模型组、 D: S1P lMM+凋亡模型组、E: S1P 10,+凋亡模型组、F: S1P 20幽+凋 亡模型组、G: S1P 50MM+凋亡模型组。 图3.不同处理骨髓间充质干细胞凋亡率的柱状统计图
其中A:正常对照组、B:凋亡模型组、C:S1P 0. lMM+凋亡模型组、 D: S1P l幽+凋亡模型组、E: S1P 10MM+凋亡模型组、F: S1P 20刚+ 凋亡模型组、G: S1P 50幽+凋亡模型组。 图4.不同处理对caspase-3活化片段影响的免疫印迹图。
其中l:正常对照组、2:凋亡模型组、3: S1P(IOmM)+凋亡模型组、 4: SlP(10幽)+凋亡模型组+LY294002 (25uM)、 5: SlP(10幽)+凋亡模 型组+U0126(20uM). 图5.为检测S1P激活PI3K/Akt信号通路的免疫印迹图。
其中l:正常对照组、2:凋亡模型组、3: S1P(10幽)+凋亡模型组、 4:SlP(10幽)+凋亡模型组+LY294002 (25uM)、 5: S1P(IO幽)+凋亡模型 组+U0126 (20uM) 图6.为检测S1P激活MEK/ERK1/2信号通路的免疫印迹图。
其中l:正常对照组、2:凋亡模型组、3: S1P(IO幽)+凋亡模型组、 4: SlP(10幽)+凋亡模型组+LY294002 (25uM)、 5: SlP(10MM)+凋亡模 型组+U0126(20uM)
图7.不同处理的骨髓间充质十细胞移植缺血心肌后存活细胞数的比较图。 其中纵坐标为存活的细胞数，横坐标为细胞移植的天数。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对木发明做进一步的说明，但下面的具体实施方案 仅仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的保护范围。 实施例1、 S1P抑制骨髓间充质干细胞凋亡的体外试验 按照如下方法进行 (1)、 MSCs分离及培养
取用Sprague-Dawley大鼠，雌雄不拘，以盐酸氯胺酮(60-80mg/kg)腹腔麻 醉后，75%酒精浸泡消毒3 5分钟；于超净台内剪取大鼠股骨和胫骨，以完全 培养基(IMDM+15%FBS) (IMDM和FBS均购自Gibcol生物公司)冲洗骨髓腔 10次，以微吸管反复吸吹骨髓，形成分散的单细胞悬液，接种于培养瓶中，置 37°C、 5%C02细胞培养箱培养；5天后细胞可生长至80%以上融合，以1: 3传 代(0.25%胰酶)(胰酶购自Sigma-Aldrich公司)；取生长良好的第一代细胞 进行实验。
(2)、实验分组及处理
a. 正常对照组以完全培养基aMDM+15%FBS)正常培养MSCs;
b. 凋亡模型组以无血清(頂DM)及缺氧处理MSCs (置于密闭缺氧罐中， 内置耗氧剂)，37"C、 5%(:02孵育6小时；
c. S1P处理组分别以浓度为O. l幽、1MM、 IO刚、20,、 50幽的S1P (购 自美国Sigma-Aldrich公司)预处理MSCs 1小时，然后在缺氧无血清条件下继 续孵倉.6小时。所述的SlP的制备方法是将SlP溶丁-甲醇，然后再用BSA稀释 至所需浓度即可；如将lmg S1P溶解于263. 5ul甲醇里，达到10uM的储液，然 后用0. 4%BSA分别稀释为0. 1和luM的浓度(当使用20uM， 50uM时，分别加入 2倍和5倍的S1P剂量即可)。
(3)、荧光显微镜下观察细胞核的变化
经上述(2)处理各组MSCs细胞后，用含1X戊二醛的PBS室温固定30分 钟，然后用PBS洗2遍，再用5u g/ml Hoechst 33342室温固定30分钟，荧光 显微镜下观察凋亡细胞核的形态。
结果正常对照组(见图1A)细胞核大而均质，淡蓝染色；凋亡模型组(见 图1B)及O. l幽S1P处理组(见图1C)细胞核固縮、碎裂，形态不规则，染色 深；l,、 10幽、20MM、 50MM S1P处理组(见图1D-G)细胞核似正常对照组， 核大而均质，淡蓝染色。说明S1P能够抑制骨髓间充质干细胞的细胞核发生凋 亡形态改变，即S1P能够抑制MSCs凋亡的发生。
实施例2、骨髓间充质干细胞凋亡率检测试验
试验方法如下
(1) 实验分组同实施例1。
(2) 按照Annexin V/PI凋亡检测试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司) 说明，将实施例1中用胰酶消化处理所得的各组细胞，用冷PBS洗2遍，再用
AnnexinV溶液室温孵育30分钟，接着加入PI溶液孵育5分钟，然后上流式细 胞仪检测凋亡率(Armexin-V/PI流式检测可以区分细胞的早期凋亡与中晚期凋 亡。早期凋亡时细胞膜上的PS外翻到细胞膜外层，表现为Armexin-V阳性，但 细胞膜是完整的，PI为阴性，其中Annexin V+/PI-代表早期细胞凋亡)。
结果正常对照组(如图2A，图3A)的早期凋亡率为2. 03%，凋亡模型组(图 2B，图3B)凋亡率为31.28%， 0. luM、 luM、 10uM、 20uM、 50uM浓度的S1P各 处理组的早期凋亡率(如图2C-G，图3C-G)分别为28. 29%、 22.91%、 13. 12%、 9.97%、 10.86%，加入S1P的各处理组的早期凋亡率均低于凋亡模型组。说明不 同浓度的S1P均能够有效抑制MSCs凋亡。
实施例3、 S1P对caspase-3活力影响的试验
(1) 试验处理
(a)正常对照组以完全培养基(BffiM+15%FBS)正常培养；(b)凋亡 模型组以无血清(IMDM)及缺氧处理(置于密闭缺氧罐中，内置耗氧剂)，37°C， 5%0)2孵育6小时；(c) SIP (购自美国Sigma公司)处理组以10uM的SIP 预处理MSCs 1小时，然后在缺氧无血清条件下继续孵育6小时；(d)SlP(10MM)十 凋亡模型+LY294002(25uM)组(LY294002购自cellsignal公司)；(e)SlP(10幽)+ 凋亡模型组+U0126(20uM)组(U0126购自cellsignal公司)。
(2) 试验方法各组细胞无血清缺氧6小时后，胰酶(0.25%)消化、收 集细胞，提取细胞蛋白，以考马斯亮蓝法测蛋白浓度。按50Pg蛋白质量上样电 泳，Western blot (详见分子克隆第二版第十八章第三节888-898页)检测 caspase-3活化片段
结果正常对照组(图4 -1)的MSC几乎没有Caspase3活化片段的产生； 而凋亡模型组(图4 -2)有大量的Caspase3活化片段产生；S1P处理组(图4 -3) 的Caspase3活化片段大大减少；使用PI3K和ERK抑制剂LY294002和U0126(图 4一4、 5)抑制了这两个通路后，Caspase3活化片段又比S1P处理组增多。说 明S1P通过抑制Caspase3活化片段的产生而抑制了 MSCs的凋亡。
实施例4、抑制剂对S1P的抗骨髓间充质干细胞凋亡作用影响试验
(1)试验处理(a)正常对照组以完全培养基(IMDM+15%FBS)正常 培养；(b)凋亡模型组以无血清(IMDM)及缺氧处理(置于密闭缺氧罐中， 内置耗氧剂)，37'、C， 5XCCy浮育6小时；(c) S1P (购自美国Sigma公司)处理 组以10uM的SIP预处理MSCs 1小时，然后在缺氧无血清条件下继续孵育6
小时。(d) SlP(10MM)+凋亡模型+LY294002 (25uM)组；(e) SlP(10,)+凋亡模 型组+U0126(20uM)组。
(2)、上述各组细胞处理结束后，上流式细胞仪检测PI3K抑制剂LY294002 和/或ERK1/2抑制剂U0126对S1P抗凋亡作用的影响。
结果(如图5和图6)说明LY294002和U0126均能明显抑制S1P的抗骨髓 间充质千细胞凋亡效果。PI3K和ERK通路抑制剂LY294002和U0126均能够单独 抑制S1P的抗骨髓间充质干细胞凋亡作用，也间接说明了 S1P的抗骨髓间充质 干细胞凋亡作用。
实施例5
S1P促骨髓间充质干细胞存活作用的动物试验
(1) 、试验处理
a. 对照组以完全培养基培养(頂DM，含L-谷氨酰胺和25 mM HEPES) 50ul注 射大鼠心梗模型心梗周边区；
b. S1P处理组以含有S1P的完全培养基培养(IMDM) 50ul悬浮2Xl(f间 充质十细胞，预处理lh (SlP终浓度是10uM)。而后一起注射大鼠心梗模型心梗 周边区；
(2) 、试验方法试验采用雄性大鼠骨髓间充质干细胞注射雌性大鼠心梗
模型的方式，3个组分别在注射后1小时，1天和1周后提取心脏组织DNA，然 后用Realtime PCR的方法通过检测SRY基因的含量进而检测存活的间充质十细 胞数。
结果(见图7)在细胞移植1小时后，对照组存活的MSC的数目是 490939.3615，而S1P处理组细胞存活数为1051256. 348，明显高于对照组；细 胞移植1天后，对照组和S1P处理组存活的MSC的数目分别是331059.9和 682976.6， S1P处理组存活的MSCs数目亦显著高于对照组；细胞移植1周后， S]P处理组存活的MSC的数目为27721. 43，高于间充质干细胞组13357. 12。说 明在实验动物体内S1P显著提高了移植MSC的存活率。
权利要求
1、S1P在制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡药物上的应用。
2、 S1P在制备治疗缺血性心脏病药物上的应用。
3、 S1P在制备治疗肢体缺血性疾病药物上的应用。
4、 按照权利要求l、 2或3所述的应用，其特征在于所述的SIP是指SIP 或含有S1P的组合物。
全文摘要
本发明公开了S1P在制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡药物上的应用。以及在制备治疗缺血性心脏病药物上的应用和治疗肢体缺血性疾病药物上的应用。本发明能显著提高临床移植用于治疗的骨髓间充质干细胞的存活率。
文档编号A61K31/661GK101361745SQ20081022236
公开日2009年2月11日 申请日期2008年9月17日 优先权日2008年9月17日
发明者刘学彬, 曦 陈 申请人:中国医学科学院阜外心血管病医院