专利名称：一种从啤酒花中提取黄腐酚的方法
技术领域：
本发明涉及从啤酒花中提取黄腐酚的方法，特别是提供一种通过超临界CO2萃取酒花的萃余物质，使用超声分离、硅藻土纯化获得黄腐酚的方法，以及利用该方法获得的黄腐酚和包含该黄腐酚的产品。
背景技术：
啤酒花在啤酒生产中用量不大，但却是重要的原料，被喻为“啤酒的灵魂”，它能赋予啤酒特殊的香味和苦味，增加啤酒的防腐作用，提高啤酒的非生物稳定性，促进泡沫形成并提高泡沫的持久性。酒花的成分很复杂，其主要成分大体上可分为酒花树脂、酒花精油、单宁、果胶、含氮化合物和碳水化合物等。其中，树脂类化合物，主要是α—酸和β—酸类，可赋予啤酒独特的苦味特征；精油类成分使啤酒具有明显的香味特征；而啤酒花中的多酚可对啤酒的风味及其风味稳定性产生重要的影响。近代啤酒工业对多酚的研究结果表明，啤酒酿造过程中多酚的影响是利大于弊。所以，保留适量的多酚比除去多酚显得有利，啤酒中比较合适的总多酚的数值在110-130mg/L之间。
黄腐酚(Xanthohumol，简称Xn)是一种结构简单的含异戊二烯基的查耳酮。在自然界，它是雌性蛇麻草中的特有成分，是啤酒花中主要的含异戊二烯基类黄酮(8—异戊二烯基—4，5，7—三羟黄烷酮和异黄腐酚，占啤酒花干重的0.1％～1％)，属于酒花硬树脂的一部分。目前，黄腐酚生理活性的研究已经成为啤酒花黄酮类化合物研究的一个热点，诸多研究表明黄腐酚具有抑制癌细胞扩增、预防癌症产生、抑制骨质增生、抗诱变效果、抗菌活性、抑制甘油二酯酰基转移酶的活性及预防动脉硬化等生物活性。
黄腐酚 异黄腐酚 黄腐酚碎片的理论形成是碎片m/z 299是由于C-1’通过亲核攻击4’-OH2+上的氧，失掉了含异戊二烯基的片断而形成的。其中黄腐酚和异黄腐酚被分割成为m/z 299的物质均是由于失去了含异戊二烯基的片断得到的(黄腐酚和异黄腐酚的核质比是相同的均为m/z＝355，他们仅能依靠出峰时间的不同和已确定标准品来进行区别)。黄腐酚异构化转变为异黄腐酚是在电喷雾电子源的作用下而发生的。m/z 235[A1H]+片断的形成则主要是由异黄腐酚转变而来的。
我国酒花领域的研究和发展不但起步较晚，而且对酒花的研究还仅仅停留在最基本酿造特性如苦味、香气等研究，对其生物活性物质的研究少有涉足，更谈不上对其的开发利用。我国虽有丰富的酒花资源，然而除全酒花、酒花粉和颗粒酒花外，其它酒花制品在国内目前仍未形成规模化生产。充分利用我国丰富的酒花资源，开发生产优质的各类酒花制品，替代昂贵的进口产品，使酒花这一农产品资源得以大幅增值，不仅能填补我国在酒花深加工方面的空白，促进我国酒花业的发展，推进我国中西部的经济建设和社会进步，同时还能有效地促进我国啤酒工业的发展，具有较大的经济效益和社会效益。
对于黄腐酚的研究，国内外科技文献多见对黄腐酚性质方面研究的著作，现有的酒花提取黄腐酚工艺多为通过二氧化碳超临界萃取，美国专利(US5972411)公开黄腐酚提取工艺，工艺原料是针对乙醇树脂浸膏，进一步进行二氧化碳超临界萃取，此时的萃余物中的黄腐酚已经得到了初步富集，为1.5％.我国由于没有乙醇树脂浸膏产品，因此只能得到二氧化碳浸膏，其萃余物中黄腐酚的含量最高也不过0.4％，因此增加了萃取的难度，本发明克服了现有提取黄腐酚成本较高的缺陷，通过优化工艺方法，降低了分离成本，简化了工艺，获得至少纯度达76％以上的黄腐酚。
发明内容
本发明提供一种从啤酒花中提取黄腐酚的方法，其通过超临界CO2萃取酒花萃余物质进一步提取获得，特征在于将超临界CO2萃取制取酒花萃余物在超声条件下通过有机溶剂提取；并将提取液经过浓缩、纯化步骤获得黄腐酚制品。
上述提取黄腐酚的方法，其中超声提取条件为提取时酒花萃余物与有机溶剂料液的料液比为110～15，温度10℃～30℃，超声时间3～5min，甲醇浓度90～100％。
上述提取黄腐酚的方法，其中浓缩、提取步骤优选为 1)收集上述超声波提取液，过滤，使用旋转蒸发仪将其浓缩； 2)将硅藻土与上述浓缩液混合，并搅拌使之混合均匀； 3)将上述混合物装入布氏漏斗，分别两次使用洗脱液洗脱； 4)收集第二次洗脱液，使用旋转蒸发仪浓缩，即可得到黄腐酚沉淀。
上述提取黄腐酚的方法，其中提取黄腐酚的第一种洗脱液，配比为甲醇水＝14；第二种洗脱液，配比为甲醇水＝21。
上述提取黄腐酚的方法，其中旋转蒸发后的浓缩液优选为50ml，第一种洗脱液优选为300ml，第二种洗脱液优选为600ml。
上述提取黄腐酚的方法，其中在得到黄腐酚沉淀步骤后，还包含收集该沉淀利用冻干仪将其冷却干燥，得黄腐酚纯品固体粉末。
上述方法所制得的黄腐酚。
包含上黄腐酚的添加剂，其可用于食品，如药物、化妆品组合物、营养保健品和食品中。
上述方法获得的黄腐酚，经紫外扫描图谱分析，黄腐酚样品与黄腐酚标准品有两个共同的峰，第一个峰的波峰在205nm处，而另一个较长的峰的波峰在370nm处，此为一典型的查尔酮紫外图谱，同时也说明纯化后获得的黄腐酚样品与黄腐酚标准品具有相同的组分。
利用LC-ESI-MS对纯化制得的黄腐酚样品进行检测，结果表明阳离子ESI-MS m/z355.1[M+H]+，其化合物的实际分子量为354，与黄腐酚的分子量相吻合。且由二级质谱图可知，黄腐酚形成m/z 355.1的分子离子峰[M+H]+，主要可以被破碎成m/z210.8、234.9和299的子离子。
制得的黄腐酚样品经HPLC测定后，与黄腐酚标准品的液相色谱图相比，其出峰时间相同，均为min，说明应为同一物质，且从高效液相色谱图中还可以看出纯化的效果较好，并没有其他杂峰出现。
经过超临界二氧化碳萃取后，酒花萃余物中绝大多数的α-酸、β-酸均已被去除掉，大量的Xn存在于酒花萃余物中。经硅藻土过滤后制得的Xn样品中α-酸、β-酸含量仅为1％和0.16％，而Xn含量可达86.2％，经过重结晶处理后，黄腐酚纯度可以提高到97.8％。
本发明工艺结合黄腐酚自身的物性特点，吸取现有工艺的优点并进行改进提高，利用超临界二氧化碳萃取所得的酒花萃余物为原料，通过超声分离工艺，降低了分离成本，简化了工艺，并且通过优化超声分离条件和洗脱条件，提高了黄腐酚的产品收获率和纯度；利用硅藻土对黄腐酚进行纯化，同样起到降低提取的经济成本，简化纯化方法的作用，能够获得至少纯度达76％以上的黄腐酚。制得的黄腐酚纯品还可为酒花的综合应用、啤酒品种的多样化开发及功能性研究提供重要的物质基础。
基于黄腐酚的众多生理活性作用，可在啤酒酿造过程中更改工艺，添加本发明的高纯的黄腐酚制品，来提高啤酒中黄腐酚的含量，进而增强啤酒的保健作用。此外，纯化的黄腐酚制品可广泛的在医药、食品、化妆品、保健酒等领域的获得研究应用。
图1黄腐酚样品(下图)和黄腐酚标准品(上图)紫外扫描图 图2黄腐酚样品一级质谱图 图3黄腐酚样品二级质谱图 图4黄腐酚标准品液相色谱图 图5从酒花萃余物中纯化得到的黄腐酚样品液相色谱图
具体实施例方式 实施例1 黄腐酚的制备 1 酒花的预处理酒花经粉碎后，过60目(0.30mm)筛，取出部分测定水分。
2.1 酒花萃余物的制备经粉碎后的啤酒花样品，在以下条件下进行超临界CO2萃取萃取压力为20Mpa，萃取温度为45℃，CO2流量为25L/h，萃取时间为3h。收集萃余物放于4℃冰箱备用。
2.2 黄腐酚的分离提取称取75g酒花萃余物样品，加入750ml的有机溶剂(甲醇/乙醇)，在温度为20℃，功率300W的条件下超声提取5min后，过滤去除固体渣质，收集滤液备用。
2.3 黄腐酚的纯化 a)利用旋转蒸发仪将上述收集到的滤液低温浓缩至50ml后，加入60g硅藻土，用玻璃棒搅拌使之混合均匀； b)将混合物倒入布氏漏斗，先后用两种不同洗脱液洗脱(第一种洗脱液；300ml，甲醇水＝14；第二种洗脱液600ml，甲醇水＝21)； c)收集第二种洗脱液，过0.2um的滤膜，低温浓缩后再经冷冻干燥，即可得到黄腐酚纯品。
实施例2 黄腐酚的检测鉴定 1.紫外扫描将纯化后的黄腐酚样品适当稀释后，在波长为150～500的范围内扫描。
2.LC-ESI-MS分析鉴定称取一定量纯化后的黄腐酚样品，按一定比例溶解在甲醇溶液中，过0.45um的滤膜，待测。
液相条件液相色谱Agillent 1100；色谱柱Zorbax C18(2.1×150mm，5um)；检测器DAD检测器；波长370nm；柱温室温；流速0.2ml/min；进样量30ul；流动相甲醇水＝8521 质谱条件 质谱仪美国热电公司(LCQ Deca XP)； 质量分析仪器离子阱； 离子源ESI； 喷雾电压4.5KV； 毛细管温度300℃； 扫描范围(一级)280～700nm； 3.HPLC测定其纯度 a)标准曲线的绘制 标准溶液的配置准确称取10mg黄腐酚，用甲醇定容至10ml得到黄腐酚的标准溶液。使用时准确移取一定量的标准溶液，配制成浓度分别为0.5g/L、0.25g/L、0.125g/L、0.05g/L和0.025g/L的标准溶液备用。标准溶液不用时放于4℃冰箱保存。
标准曲线的制作在已确定的色谱条件下将不同浓度梯度的标准使用液通过进样器准确进样，根据各标样的进样质量与峰面积的关系得到标准曲线、回归方程、线性范围及相关系数。
b)黄腐酚纯度的计算 精确称取0.1000g纯化后的黄腐酚样品，用甲醇定溶于50ml的容量瓶中，取少量过0.45um的滤膜，进HPLC检测。根据标准曲线计算出其含量，并依据所得结果计算出黄腐酚的纯度，数值以％表示。
式中 p——黄腐酚纯度，％； c——50ml样品中黄腐酚的浓度，单位为mg/L(根据标准曲线求得)； m——所称取纯化后黄腐酚样品的质量，单位为g。
实施例3 α-酸和β-酸的测定 1.样品的前处理 1.1 酒花浸膏标样的前处理酒花浸膏标样置于25℃～30℃水浴中，搅匀。称取0.5g，于50ml烧杯中，加入30ml甲醇溶解，置于超声波水浴中30min，转移到100ml容量瓶中，用甲醇定容，充分混匀。取20ml于50ml容量瓶中，用甲醇定容，充分混匀。用0.45um膜过滤，存于样品瓶中，准备进样。样品应低温避光保存，此样在24h内稳定。
1.2 纯化后黄腐酚样品的前处理称取0.5g，于50ml烧杯中，加入30ml甲醇溶解，置于超声波水浴中30min，转移到100ml容量瓶中，用甲醇定容，充分混匀。取20ml于50ml容量瓶中，用甲醇定容，充分混匀。用0.45um膜过滤，存于样品瓶中，准备进样。样品应低温避光保存，此样在24h内稳定。
1.3 酒花萃余物前处理称取酒花(酒花萃余物)粉末试样10g，置于250ml具塞锥形瓶中，用20ml甲醇和100ml乙醚(或甲苯)萃取，于恒温25℃摇床振荡30min，加入40ml盐酸溶液，在摇床振荡10min后，静置20min，分层。取上层乙醚层20ml，用甲醇定容至50ml，充分混匀，用0.45um膜过滤，存于样品瓶中，准备进样。样品应低温避光保存，此样品在24h内稳定。
2.α-酸和β-酸的检测 2.1HPLC检测 α-酸和β-酸的液相条件 液相色谱仪日本岛津 色谱柱Nucleosil-5 C18 250mm×4.6mm 检测器SPD-M10A 柱温30℃ 流速1ml/min 波长315nm 进样量20ul 流动相甲醇重蒸水磷酸(85％)＝85190.26 2.2 结果计算 2.2.1 标样校正因子的测定 酒花浸膏标样，进样量20ul，重复进样六次，计算平均校正因子。各组分的校正因子按式计算 式中 fi——各组分的校正因子； mi——标样的质量，单位为克(g)
——标样中各组分的质量分数，％； Ai——标样中各组分的峰面积。
2.2.2 试样的测定 待测试样，进样20ul，外标法计算各组分质量分数，试样中各组分的质量分数按式计算，数值以％表示。
式中 wi——试样中各组分的质量分数，％； fi——各组分的校正因子； A——试样中各组分的峰面积； n——试样的稀释倍数； m——试样的质量，单位为克(g)。
所得结果表示至一位小数。
3 结果与分析 3.1 紫外扫描结果(图1) 经硅藻土过滤、低温浓缩干燥后所得的黄腐酚标准品和黄腐酚样品在波长150～500nm之间的紫外扫描图谱如图1所示，图中黄腐酚标准品与黄腐酚样品有两个共同的峰，第一个峰的波峰在205nm处，而另一个较长的峰的波峰在370nm处，说明此为一典型的查尔酮紫外图谱，同时也说明经纯化获得的黄腐酚样品与黄腐酚标准品具有相同的组分。
图1上图为黄腐酚标准品紫外扫描图，下图为本发明获得的黄腐酚样品。
3.2LC-ESI-MS分析鉴定结果(图3) 纯化后的黄腐酚样品，经LC-ESI-MS检测，一级质谱图结果如图2所示。阳离子ESI-MS m/z355.1[M+H]+，其化合物的实际分子量为354，与黄腐酚的分子量相吻合。由二级质谱3可知，黄腐酚形成m/z 355.1的分子离子峰[M+H]+，主要可以破碎成m/z210.8、234.9和299的子离子。
3.3 黄腐酚的HPLC测定结果 3.3.1 黄腐酚标准曲线绘制结果 黄腐酚标准曲线的线性方程为y＝1.4×10-5x+8.5279。在相应的线性范围内，相关系数R大于0.99，说明峰面积与浓度呈线性关系。
3.3.2 黄腐酚样品的HPLC检测图谱 利用超临界二氧化碳的酒花萃余物做原料，经过超声波提取，再经硅藻土过滤、低温浓缩干燥，制得的黄腐酚样品高效液相色谱图如图6所示。与黄腐酚标准品的液相色谱图相比，其出峰时间相同，均为5.33min，说明应为同一物质，且从图中还可以看出纯化效果较好，没有其他杂峰出现。
3.4 Xn、α-酸和β-酸的测定结果 以超临界二氧化碳的酒花萃余物为原料，甲醇(乙醇)为提取剂，经超声波辅助提取，后经硅藻土过滤并收集滤液，再通过低温浓缩干燥处理，即可得到粗制的黄腐酚样品，其纯度可达86.2％以上。经上述方法所制得的黄腐酚样品为黄色粉末状固体，不易溶于水，在水中程淡黄色悬浊液，不易澄清；极易溶于甲醇，易溶于乙醇，且程黄色清亮液体。表1显示了酒花萃余物与经过提取纯化后所制得黄腐酚样品中Xn、α-酸和β-酸含量的对比关系。
表1 Xn、α-酸和β-酸的测定结果
从表1中可以看出经过超临界二氧化碳萃取后，酒花萃余物中绝大多数的α-酸、β-酸均已被去除掉，而Xn在萃余物中的百分比例在经过超临界二氧化碳萃取的作用后有所增加，进而也说明了有大量的多酚类物质会存留在酒花萃余物中[5]。经硅藻土过滤后制得的Xn样品中α-酸、β-酸含量仅为1％和0.16％，而Xn含量可达86.2％，其中未滤掉的硅藻土粉末、DMX及IXn等占据了剩余的百分含量。通过以上试验数据的对比，说明使用价格低廉的硅藻土作为介质，过滤后纯化得到的黄腐酚纯度较高，再经过重结晶处理后，黄腐酚纯度可达到97.8％。
权利要求
1.一种从啤酒花中提取黄腐酚的方法，其通过超临界CO2萃取酒花萃余物质进一步提取获得，特征在于将超临界CO2萃取制取酒花萃余物在超声条件下通过有机溶剂提取；并将提取液经过浓缩、纯化步骤获得黄腐酚制品。
2.权利要求1所述提取黄腐酚的方法，其中超声提取条件为提取时酒花萃余物与有机溶剂料液比为110～15，温度10℃～30℃，超声时间3～5min，甲醇浓度90～100％。
3.权利要求1或2所述提取黄腐酚的方法，其中浓缩、提取步骤优选为
1)收集上述超声波提取液，过滤，使用旋转蒸发仪将其浓缩；
2)将硅藻土与上述浓缩液混合，并搅拌使之混合均匀；
3)将上述混合物装入布氏漏斗，分别两次使用洗脱液洗脱；
4)收集第二次洗脱液，使用旋转蒸发仪浓缩，即可得到黄腐酚沉淀。
4.权利要求3所述提取黄腐酚的方法，其中提取黄腐酚的第一种洗脱液，配比为甲醇水＝14；第二种洗脱液，配比为甲醇水＝21。
5.权利要求4所述提取黄腐酚的方法，其中旋转蒸发后的浓缩液优选为50ml，第一种洗脱液优选为300ml，第二种洗脱液优选为600ml 。
6.权利要求3所述提取黄腐酚的方法，其中在得到黄腐酚沉淀步骤后，还包含收集该沉淀利用冻干仪将其冷却干燥，得黄腐酚纯品固体粉末。
7.如权利要求1-6之任意一项方法所制得的黄腐酚。
8.包含权利要求7所述黄腐酚的添加剂，其可用于药物、化妆品组合物、营养保健品和食品中。
全文摘要
本发明提供了一种从酒花提取黄腐酚的方法及获得产品。该方法主要将粉碎后的酒花，先用超临界二氧化碳萃取，收集酒花萃余物后，以甲醇(乙醇)作为提取剂，对酒花萃余物进行超声波提取；提取液经过浓缩，与硅藻土混合均匀，先后经两种洗脱液洗脱，将收集到的洗脱液经过过滤、低温浓缩干燥处理后，即可得到黄腐酚纯品。获得黄腐酚纯度为86.2％。纯化后的黄腐酚为黄色粉末状固体，经重结晶纯度可达97.8％以上。达到简化黄腐酚提取工艺，降低纯化黄腐酚的成本的作用。获得黄腐酚可广泛用于医药、化工、食品等领域。
文档编号A61P35/00GK101440029SQ200810225869
公开日2009年5月27日 申请日期2008年11月4日 优先权日2008年11月4日
发明者谷方红, 张五九, 朱晓建, 宋绪磊, 涛 宋, 王异静, 王德良 申请人:中国食品发酵工业研究院