专利名称：：菊芋提取物在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤保健品中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抗肿瘤药物，具体地说菊科向日葵属植物菊芋在制药中的新应用，尤其是菊芋叶提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
：菊芋(HelianthustuberosusLinn)俗称洋姜、鬼子姜，原产于北美洲，为菊科(Compositae)向日葵属(HelianthusL.)的多年生草本植物，具有耐旱、耐寒、耐盐碱、抗风沙、繁殖能力强、保持水土、管理粗放的特点，目前在我国西北、东北等荒漠地区种植，具有很好的防风固沙作用。国外对菊芋的开发利用研究始于70年代，主要针对菊芋块茎的开发利用上，研究菊粉的提取和利用，也有利用微生物菊粉酶生产超高果糖浆等深加工的研究报道。在我国菊芋多用于加工酱菜食用，附加值低，利用量小。菊芋深加工研究开发起步较晚，主要制成菊粉、果寡糖、高果糖浆，作为添加剂、保健品等。此外，有民间利用嫩叶或嫩根加少许食盐捣烂后治小儿无名痄腮的报道。而菊芋叶的药理活性方面几乎没有报道。菊科向日葵属植物在全世界分布约有100种，主要分布在北美一带。该属植物化学成分及生物活性的研究早有报道。化学成分主要集中于倍半萜内酯、二萜、甾体、黄酮和香豆素类等。富含倍半萜类化合物是该属植物的一大特点，也是该属植物呈现很多较强生物活性的根本原因所在。其研究的生物活性主要表现为细胞毒活性(包括抗白血病作用，抑制癌细胞DNA和RNA的合成)，抗菌活性，杀虫作用等。
发明内容本发明的目的是提供向日葵属植物菊芋在制药中的新用途，尤其是菊芋提取物在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤保健品中的应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案菊芋的有机溶剂提取物在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤保健食品中的应用。所述有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、丙醇或丁醇。菊芋的有机溶剂提取物的制备方法如下将菊芋原料干燥粉碎，将菊芋原料与有机溶剂按lg:8-30ml比例混合，常温浸提>12小时，过滤，减压浓縮除去有机溶剂，得提取液浓縮浸膏或干燥物；临做药理实验时以完全培养基配制成所需浓度。所述菊芋原料为菊科向日葵属植物菊芋的花、茎、叶中的一种或多种。所述菊芋的有机溶剂提取物最好为菊芋叶的乙酸乙酯提取物，菊芋的乙酸乙酯提取物的制备方法如下1)将菊芋原料干燥粉碎，将菊芋原料与乙酸乙酯按lg:8-30ml比例混合，常温浸提>12小时，过滤，减压浓縮除去有机溶剂，得提取液浓縮浸膏或干燥物；临做药理实验时以完全培养基配制成所需浓度。2)将乙酸乙酯提取浸膏以甲醇溶解后，过滤滤液浓縮至干，上样，过NKA大孔吸附树脂，分别以体积浓度10-20%乙醇、30-40%乙醇、60-70%乙醇洗脱，收集60-70%乙醇部位的流份，蒸干得到菊芋的乙酸乙酯提取物；临做药理实验时以完全培养基配制成所需浓度。所述的药物剂型为任何一种药剂学上的剂型；所述药物应用时的给药方式为任何一种药剂学上的给药方式。本发明具有以下优点l本发明发现了一种常见植物菊芋的抗肿瘤活性，从而使该植物可以药用，丰富了我国的天然药物资源；2菊芋作为一种生物适应性良好的多年生草本植物，无需太多栽培即可旺盛生长，从而使制药原材料极易获得且价格低廉，同时又能增加农民收入；3本发明达到了扩大菊芋植物在医药等方面利用的目的，不仅有利于环境及生态治理，而且符合我国农业产业化的政策。具体实施例方式为了更好的理解本发明，现详细介绍一下化合物的提取及药理实验过程。实例仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。实施例1菊芋叶乙酸乙酯提取物对小细胞肺癌细胞株A549的抑制作用菊芋叶乙酸乙酯提取物的制备将菊芋叶干燥粉碎，定量称取，将菊芋叶与乙酸乙酯按lg:10ml比例混合，浸泡24小时，过滤，减压浓縮至浸膏；临做药理实验时以完全培养基配制成所需浓度。小细胞肺癌细胞株A549，用含10%新生牛血清(体积比)，1.0mM的丙酮酸钠，青霉素10万单位/升，链霉素10万iig/升的MEM(Eagle)培养基在37°C，5%C02(体积比)的培养箱中培养；实验时取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化液消化，调节细胞浓度为105个/mL，加入96孔板，100yL/孔，培养过夜海孔分别加入配制好的四组不同浓度菊芋叶乙酸乙酯提取物100i!L，继续培养24小时，MTT法检测生长抑制率，计算IQ值，结果见表l。表1.菊芋叶乙酸乙酯提取物对A549细胞生长的抑制率及IC50值<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>实施例2菊芋叶乙酸乙酯提取物对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用菊芋叶乙酸乙酯提取物的制备同实施例1。临做药理实验时以完全培养基配制成所需浓度。乳腺癌细胞株MCF-7，用含10%新生牛血清，青霉素10万单位/升，链霉素10万Pg/升的RPMI1640培养基在37°C，5%C02的培养箱中培养；实验时取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化液消化，调节细胞浓度为105个/mL，加入96孔板，100yL/孑L培养过夜；每孔分别加入配制好的四组不同浓度菊芋叶乙酸乙酯提取物100iiL，继续培养24小时，MTT法检测生长抑制率，计算IC5。值，结果见表2。表2.菊芋叶乙酸乙酯提取物对MCF-7细胞生长的抑制率及IC50值浓度(Pg/mL)MCF-7DDP42010064.20±1.62±0.1115.30±1.260.6937.74±3.85±0.8911.21±1.492.2950093.48±7.2594.86±11.35IC5070.67144.57实施例3菊芋叶乙酸乙酯提取物对宫颈癌细胞株Hela的抑制作用菊芋叶乙酸乙酯提取物的制备同实施例1。临做药理实验时以完全培养基配制成所需浓度。宫颈癌细胞株Hela，用含10%新生牛血清，青霉素10万单位/升，链霉素10万Pg/升的RPMI1640培养基在37°C，5%C02的培养箱中培养；实验时取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化液消化，调节细胞浓度为105个/mL，加入96孔板，100yL/孑L培养过夜；每孔分别加入配制好的四组不同浓度菊芋叶乙酸乙酯提取物100iiL，继续培养24小时，MTT法检测生长抑制率，计算IC5。值，结果表3。表3.菊芋叶乙酸乙酯提取物对Hela细胞生长的抑制率及IC50值浓度(Pg/mU420100500IC50Hela14.02±0.5910.29±0.3222.29±2.0777.26±1.08223.09DDP8.21±1.3313.28±2.1139.37±2.49100.93±4.4766.33实施例4菊芋叶乙酸乙酯提取物对肾癌细胞株ACHN的抑制作用菊芋叶乙酸乙酯提取物的制备同实施例1。临做药理实验时以完全培养基配制成所需浓度。肾癌细胞株ACHN，用含10%新生牛血清，1.0慮的丙酮酸钠，青霉素10万单位/升，链霉素10万iig/升的MEM(Eagle)培养基在37°C，5%C02的培养箱中培养；实验时取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化液消化，调节细胞浓度为105个/mL，加入96孔板，100L/孔，培养过夜；每孔分别加入配制好的四组不同浓度菊芋叶乙酸乙酯提取物100L，继续培养24小时，MTT法检测生长抑制率，计算IC5。值，结果见表4。表4.菊芋叶乙酸乙酯提取物对ACHN细胞生长的抑制率及IC50值浓度(Pg/mU420100500IC505.66±35.77±91.71±ACHN13.43±1.840.534.4412.5796.1444.66±44.71±6L07土DDP28.83±0.581.271.123.97213.79实施例5菊芋叶乙酸乙酯提取物60X乙醇部位对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用菊芋叶乙酸乙酯提取物60%乙醇部位的制备1)采用与实施例1相同的方法制备菊芋叶乙酸乙酯提取物；2)将乙酸乙酯提取浸膏以甲醇溶解后、过滤滤液浓縮至干，过NKA大孔吸附树脂，分别以体积浓度20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇洗脱，收集60%乙醇部位，蒸干得到菊芋叶60%乙醇部位；临做药理实验时以完全培养基配制成所需浓度。乳腺癌细胞株MCF-7，用含10%新生牛血清，青霉素10万单位/升，链霉素10万Pg/升的RPMI1640培养基在37°C，5%C02的培养箱中培养；实验时取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化液消化，调节细胞浓度为105个/mL，加入96孔板，100yL/孔，培养过夜；每孔加入配制好的四组不同浓度菊芋乙酸乙酯提取物60%乙醇部位lOOyL，继续培养24小时，MTT法检测生长抑制率，计算IC5。值，结果见表5。表5.菊芋叶乙酸乙酯提取物60%乙醇部位对MCF-7细胞生长的抑制率及IC50值浓度(ug/mU420100500IC5060%乙醇部87.14±88.54±位3.03±0.0947.47±3.536.5619.0541.0937.74±94.86±DDP3.85±0.8911.21±1.492.2911.35144.57实施例6菊芋叶二氯甲烷提取物对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用菊芋叶二氯甲烷提取物的制备将菊芋叶干燥粉碎，定量称取，将菊芋叶与二氯甲烷按lg:10ml比例混合，浸泡24小时，过滤，减压浓縮至浸膏；临做药理实验时以完全培养基配制成所需浓度。乳腺癌细胞株MCF-7，用含10%新生牛血清，青霉素10万单位/升，链霉素10万Pg/升的RPMI1640培养基在37°C，5%C02的培养箱中培养；实验时取对数生长期细胞，6用0.25%胰蛋白酶消化液消化，调节细胞浓度为105个/mL，加入96孔板，100yL/孑L培养过夜；每孔分别加入配制好的四组不同浓度菊芋叶二氯甲烷提取物100i！L，继续培养24小时，MTT法检测生长抑制率，计算IC5。值，结果见表6。表6.菊芋叶二氯甲烷提取物对MCF-7细胞生长的抑制率及IC50值<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例7菊芋叶乙醇提取物对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用菊芋叶乙醇提取物的制备将菊芋叶干燥粉碎，定量称取，将菊芋叶与乙醇按lg:10ml比例混合，浸泡24小时，过滤，减压浓縮至浸膏；临做药理实验时以完全培养基配制成所需浓度。乳腺癌细胞株MCF-7，用含10%新生牛血清，青霉素10万单位/升，链霉素10万Pg/升的RPMI1640培养基在37°C，5%C02的培养箱中培养；实验时取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化液消化，调节细胞浓度为105个/mL，加入96孔板，100yL/孔，培养过夜；每孔分别加入配制好的四组不同浓度菊芋叶乙醇提取物100i!L，继续培养24小时，MTT法检测生长抑制率，计算IC5。值，结果见表7。表7.菊芋叶乙醇提取物对MCF-7细胞生长的抑制率及IC50值<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>从上述实验数据可以看出我们将菊芋叶乙酸乙酯提取物，乙酸乙酯提取物过NKA大孔吸附树脂后60%乙醇洗脱部位，二氯甲烷提取物和乙醇提取物作为实验样品，采用经典体外抗癌药物筛选方法MTT法研究菊芋叶提取物的抗肿瘤活性。采用的肿瘤细胞株分别为购买于中国典型培养物保藏中心(即武汉大学保藏中心，地址武汉大学)的肺癌细胞株(A549)和肾癌细胞株(ACHN)，乳腺癌细胞株(MCF-7)，宫颈癌细胞株(Hela)。所有药理实验均采用顺铂注射液(DDP)为阳性对照药品，完全培养基为阴性对照。注射用顺铂，商品名方坦，山东罗欣药业股份有限公司，批号06010401。实验结果显示1)菊芋叶乙酸乙酯提取物，二氯甲烷提取物，乙醇提取物对MCF-7细胞均有抑制作用，其抑制作用的IC50值分别为70.67iig/mL，90.36yg/mL，106.27yg/mL;即其抑制MCF-7细胞的活性为乙酸乙酯提取物>二氯甲烷提取物>乙醇提取物。2)菊芋叶乙酸乙酯提取物对乳腺癌细胞株的抑制作用最强，IC5。值为70.67yg/mL;其次为肾癌细胞株，IC5。值为96.14g/mL;然后为肺癌和宫颈癌细胞株，IC5。值分别为158.08iig/mL和223.09iig/mL;60%乙醇部位对MCF-7细胞的IC50值为41.09iig/mL，小于乙酸乙酯总提物对MCF-7细胞的IC50值，即70.67yg/mL，说明活性成分主要富集在NKA60X乙醇洗脱部位。实验结果分析1)菊芋叶的多种有机溶剂提取物均对肿瘤细胞有抑制作用，且以乙酸乙酯提取物的活性最强；2)菊芋叶提取物对多株肿瘤细胞有抑制作用，具有广谱抗肿瘤作用，且活性成分主要富集在乙酸乙酯提取物过NKA大孔吸附树脂60%乙醇洗脱部位。通过对提取物的化学成分分析，我们推测乙酸乙酯和二氯甲烷提取物的主要可能活性成分为倍半萜内酯类化合物，乙醇提取物的可能活性成分为酚酸类化合物。权利要求菊芋的有机溶剂提取物在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤保健品中的应用。2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于菊芋的有机溶剂提取物为菊芋的乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、丙醇或丁醇提取物。3.按照权利要求1所述的应用，其特征在于所述菊芋的有机溶剂提取物的制备方法如下，将菊芋原料干燥粉碎，将菊芋原料与有机溶剂按lg:8-30ml比例混合，常温浸提>12小时，过滤，减压浓縮除去有机溶剂，得提取液浓縮浸膏或干燥物。4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于所述有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、丙醇或丁醇。5.按照权利要求3所述的应用，其特征在于所述菊芋原料为菊科向日葵属植物菊芋的花、茎、叶中的一种或多种。6.按照权利要求1所述的应用，其特征在于所述菊芋的有机溶剂提取物为菊芋的乙酸乙酯提取物，其制备方法如下，将菊芋原料干燥粉碎，将菊芋原料与乙酸乙酯按lg:8-30ml比例混合，常温浸提^12小时，过滤，减压浓縮除去有机溶剂，得提取液浓縮浸膏；将乙酸乙酯提取浸膏以甲醇溶解后，过滤滤液浓縮至干，上样，过NKA大孔吸附树脂，分别以体积浓度10-20%乙醇、30-40%乙醇、60-70%乙醇洗脱，收集60-70%乙醇部位的流份，蒸干得到菊芋的乙酸乙酯提取物。7.按照权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物剂型为任何一种药剂学上的剂型。8.按照权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物应用时的给药方式为任何一种药剂学上的给药方式。全文摘要本发明涉及抗肿瘤药物，具体地说为菊芋的有机溶剂提取物在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤保健品中的应用。体外细胞实验表明，菊芋叶乙酸乙酯提取物对多种肿瘤细胞，如肺癌细胞株(A549)，乳腺癌细胞株(MCF-7)，宫颈癌细胞株(Hela)，肾癌细胞株(ACHN)均有抑制作用。文档编号A61K125/00GK101744856SQ200810229889公开日2010年6月23日申请日期2008年12月17日优先权日2008年12月17日发明者杜昱光,程受衍,程孟春,肖红斌,袁晓艳申请人:中国科学院大连化学物理研究所