专利名称：：从辣根中制备苯乙基异硫氰酸酯的方法
技术领域：
：本发明涉及植物提取物
技术领域：
，特别涉及一种从十字花科辣根属辣根中提取苯乙基异硫氰酸酯的方法。
背景技术：
：辣根C4wwrac/a/qpflAz/o/,aGilib.)，又名西洋山葵，马萝卜，为十字花科辣根属多年生草本植物。其肉质根及地下茎外皮较厚，黄白色或肉白色，圆柱型，全部入土长约30-60cm，茎粗约56cm，原产欧洲南部，以陆地栽培为主。辣根是一种经济价值很高的蔬菜兼药用植物。其独特的刺激性和辛香辣味具有提鲜和杀菌作用，是日本料理、凉拌菜、生食海鲜等常用的佐料。同时也是制作辣根酱必不可少的原料，在日本广为流行。硫代葡萄糖苷是广泛存在于辣根、芥末和油菜籽等十字花科植物中的含硫次级代谢产物。常见的硫代葡萄糖苷有23种以上,如甲基硫代葡萄糖苷、烯丁基硫代葡萄糖苷、烯丙基硫代葡萄糖苷等。硫代葡萄糖苷的基本结构为据文献报道，不同的硫代葡萄糖苷类化合物水解产物主要有烯丙基异硫氰酸酯(AITC)、3-丁烯基异硫氰酸酯、4-戊烯基异硫氰酸酯、5-己烯基异硫氰酸酯、5，7-甲亚硫基己基异硫氰酸酯、3-苯基乙基、苯基和苄基异硫氰酸酯等。目前研究最多的十字花科植物有芥末、辣根、山葵(日本辣根)、油菜籽、甘蓝、抱子甘蓝、花椰菜、萝卜等等，其辛辣风味主要来自于植物中的烯丙基异硫氰酸酯(AITC)。伊藤宽报道芥菜叶中含有大量的强烈刺鼻性的挥发性风味组分AITC和丁烯腈。国内研究比较晚，主要对象为芥末油等。姜子涛等指出调味芥末油中辛辣成分主要为AITC，且其含量越大，辣味越重。在抑菌杀虫方面的活性研究也多为烯丙基异硫氰酸酯，胡尚勤研究表明山葵有效成分烯丙基异硫氰酸酯对病原菌的作用明显，对白色念珠球菌，溶血链球菌等最高杀死率为99%。Shik研究表明，日本辣根(山葵)各个部位(根、杆和叶子)中的烯丙基异硫氰酸酯都能有效的抑制幽门螺旋杆菌，其中叶子的活性要强于根部。吴华等研究发现95%辣根素原油(烯丙基异硫氰酸酯)对玉米象、谷蠹、赤拟谷盗和书虱均有较好的熏蒸生物活性。烯丙基异硫氰酸酯(AITC)结构为H2C=CH—CH2^N=C=S文献报道了异硫氰酸酯的水解条件和检测方法。黄明深研究了山葵各组织部位的异硫氰酸酯含量，结果表明根茎中的含量最高，叶子最少。张清峰等研究了辣根中异硫氰酸酯的水解稳定性，结果表明当温度越高，水解速度越快，在超声波条件下，有利于加快水解，且异硫氰酸酯在丙酮溶液中性质稳定。在检测方法上，姜子涛提出许多测定ITCs的方法，如哌啶滴定法、氯胺2T间接氧化法、吗啉滴定法、哌嗪非水滴定法、二硫代碳氨酸形成法。褚兴棣等直接用异硫氰酸丙基酯与l，2苯二硫酚反应作标准，建立了尿液中ITCs的反相高效液相色谱测定方法，HPLC条件HP1090M，配二极管阵列检测器；色谱柱为Supelco。18柱(150mmx416mm)，流动相为甲醇:水=70:30，流速1.75mL/min，进样量20，检测波长365nm。目前对于烯丙基异硫氰酸酯的化学、提取工艺、含量分布、生物活性研究居多，国外专利(WO00/61163),提供山芥属植物种子(巻心菜、芜菁、萝卜和水田芹)等不同植物源中苯乙基异硫氰酸酯的含量研究，但尚未对辣根苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)进行研究。而苯乙基异硫氰酸酯具有抗肿瘤活性，能够阻抑I期代谢中的细胞色素p450酶，促进II期代谢中的还原型辅酶II(QR，UDP-葡萄糖醛酸基转移酶和GST)。
发明内容本发明的目的在于提供一种从天然植物辣根中提取分离苯乙基异硫氰酸酯的方法，该方法工艺简单，得到的产品含量高，适合工业化生产。本发明的技术方案为从辣根中提取分离苯乙基异硫氰酸酯的方法，包括以下步骤第一步原料预处理将采摘一周内的辣根洗净晾干切片，烘干后粉碎成细粉；第二步原料水解将粉碎后的细粉以1克原料加入10-30mL蒸馏水的比例加入蒸馏水水解，水解温度30-40°C，pH为5-7，维生素C添加量与辣根细粉原料质量比为1-10:1000，水解时间60-140min，水解结束后，过滤；第三步粗品的制备滤液部分用低极性溶剂等体积萃取第二步得到的滤液1-5次，合并低极性溶剂部分，真空浓縮，得苯乙基异硫氰酸酯粗品；滤渣部分a、用水蒸汽直接蒸馏滤渣部分，水蒸汽蒸馏液冷却至室温，再经大孔树脂吸附后，先用2-6BV的水洗，再用2-6BV的无水乙醇洗脱，无水乙醇洗脱部分旋转蒸发浓縮，得苯乙基异硫氰酸酯粗品，乙醇回收；b、用低极性有机溶剂萃取a步中水蒸汽蒸馏后的滤渣，滤渣与低极性有机溶剂的比例为lg滤渣加入5-25mL低极性有机溶剂，加热搅拌提取1-4次，每次提取时间1-3h，温度20-40。C，过滤，合并滤液，真空浓缩，得到苯乙基异硫氰酸酯粗品，低极性有机溶剂回收；站rm止烛止"将第三步得到的苯乙基异硫氰酸酯粗品合并经溶剂萃取分离后柱层析分离a、将第三步得到的苯乙基异硫氰酸酯粗品溶于甲醇中，粗品与甲醇的比例为lg粗品加入20-50mL甲醇，除去不溶物，将甲醇溶解部分，真空旋转蒸发浓缩，回收甲醇溶剂，浓縮物再溶于石油醚中，浓縮物与石油醚的比例为lg浓縮物加入20-50mL石油醚，除去不溶部分，将石油醚溶解部分真空旋转蒸发浓縮，回收石油醚，得到苯乙基异硫氰酸酯，经HPLC分析质量百分含量在80。/。以上；b、将a得到的苯乙基异硫氰酸酯进一步进行柱层析分离，将a得到的苯乙基异硫氰酸酯溶于石油醚，经过极性填料柱吸附后，采用石油醚-乙酸乙酯体积比100:1-50的洗脱液逐级梯度洗脱，收集洗脱液，得到苯乙基异硫氰酸酯，经HPLC分析质量百分含量在90%以上。有益效果(1)本发明通过筛选辣根水解条件，对比不同工艺，利用水蒸气蒸馏法和加热搅拌提取法提取辣根中的苯乙基异硫氰酸酯，首次通过萃取分离及柱层析分离制备质量百分含量在90%以上的苯乙基异硫氰酸酯，并在此基础上建立了该物质的HPLC检测方法。(2)本发明以我国山东临沂产辣根为原料，首次从辣根中提取分离苯乙基异硫氰酸酯，并鉴定其化学结构。(3)本发明工艺方法简单，得到的产品含量高，适合工业化生产。图1为苯乙基异硫氰酸酯的HPLC标准曲线图。图2为苯乙基异硫氰酸酯的HPLC图谱。图3为苯乙基异硫氰酸酯的质谱图。图4为苯乙基异硫氰酸酯的红外谱图。图5为苯乙基异硫氰酸酯的核磁共振氢谱图。图6为苯乙基异硫氰酸酯的核磁共振碳谱图。图7为实施例2中方法1的总离子流图。图8为实施例2中方法2的总离子流图。图9为实施例2中方法3的总离子流图。具体实施例方式一种从辣根中制备苯乙基异硫氰酸酯的方法，包括以下步骤第一步原料预处理将釆摘一周内的辣根根部经清洗、切片、晒干、粉碎成100um-1000ym细粉，在30-60。C的条件下烘干，水分低于10Mwt。第二步原料水解将粉碎后的细粉以1克原料加入10-30mL蒸馏水的比例加入蒸馏水水解，水解温度30-40°C,pH为5-7，维生素C添加量与辣根细粉原料质量比为1-10:1000，水解时间60-140min，水解结束后，过滤。第三步粗品的制备滤液部分用低极性溶剂等体积萃取第二步得到的滤液1-5次，合并低极性溶剂部分，真空浓縮，得苯乙基异硫氰酸酯粗品。滤渣部分a、用水蒸汽直接蒸馏滤渣部分，水蒸汽蒸镏液冷却至室温，再经大孔树脂吸附后，先用2-6BV的水洗，再用2-6BV的无水乙醇洗脱，无水乙醇洗脱部分旋转蒸发浓縮，得苯乙基异硫氰酸酯粗品，乙醇回收；大孔树脂为AB-8、X-5、S-8、DM1400、DM130、DM301、DA201、DlOl。b、用低极性有机溶剂萃取a步中水蒸汽蒸馏后的滤渣，滤渣与低极性有机溶剂的比例为lg滤渣加入5-25mL低极性有机溶剂，加热搅拌提取1-4次，每次提取时间l-3h，温度20-4(TC，过滤，合并滤液，真空浓縮，得到苯乙基异硫氰酸酯粗品，低极性有机溶剂回收；第三步中的低极性溶剂为石油醚、正己烷、乙醚、苯、氯仿或二氯甲烷。第四步精制将第三步得到的苯乙基异硫氰酸酯粗品合并经溶剂萃取分离后柱层析分离a、将第三步得到的苯乙基异硫氰酸酯粗品溶于甲醇中，粗品与甲醇的比例为lg粗品加入20-50mL甲醇，除去不溶物，将甲醇溶解部分，真空旋转蒸发浓縮，回收甲醇溶剂，浓縮物再溶于石油醚中，浓縮物与石油醚的比例为lg浓縮物加入20-50mL石油醚，除去不溶部分，将石油醚溶解部分真空旋转蒸发浓縮，回收石油醚，得到苯乙基异硫氰酸酯，经HPLC分析质量百分含量在80。/。以上。b、将a得到的苯乙基异硫氰酸酯进一步进行柱层析分离，将a得到的苯乙基异硫氰酸酯溶于石油醚，经过极性填料柱吸附后，采用石油醚-乙酸乙酯体积比100:1-50的洗脱液逐级梯度洗脱，收集洗脱液，得到苯乙基异硫氰酸酯，经HPLC分析质量百分含量在90%以上。本方法中采用水蒸汽蒸馏法提取辣根苯乙基异硫氰酸酯，经过溶剂萃取、树脂吸附和解附、极性介质分离制备百分含量达到95%的苯乙基异硫氰酸酯，经GC-MS、IR、'H-NMR、13C-NMR和MS鉴定为苯乙基异硫氰酸酯，该化合物在辣根中首次分离鉴定，其结构为如图36所示，该化合物红外谱图中，3028、1347、749和699cm"分别为苯的特征吸收，为一取代苯，2921、2870和1454cm"为亚甲基的特征吸收，2198和2094为异硫氰化物的特征吸收位置。在'H-NMR(500MHz，CDC13)特征图谱中，S:2.95(2H，H-3)、3.68(2H，H-2)、7.19(2H,H-5，H-9)、7.32(2H，H-6，H-8)、7.25(1H，H-7)，且7.19、7.32、7.25这三个位移为苯环氢的特征位移，2.95和3.68为亚甲基氢的特征位移。在13C-NMR(125MHz,CDCl3)S:36.39(C-3)、46.25(C-2)、127.04(07)、128.65(C-5，C-9)、136.89(C匿4)、128.59(C-6,C-8)。36.39和46.25为亚甲基碳的特征位移，127.04、128.65、128.59和136.89为苯环上碳的特征位移。该物质的质谱图中，含有M+2峰，推断其含有硫离子，且分子量163为奇数，含有奇数个氮，105这个碎片离子峰为去掉-N:C:S得到的，同时含91、77、65这些苯环特有碎片离子峰，故鉴定该化合物为苯乙基异硫氰酸酯。所述原料辣根来自于山东临沂，在制备苯乙基异硫氰酸酯粗品和精品过程中，低极性溶剂采用石油醚、正己烷、乙醚、苯、氯仿或二氯甲烷，优选石油醚、二氯甲垸。所述真空浓縮为旋转蒸发浓縮，温度为30-60°C，真空度为0.02陽0.09MPa。所述辣根硫苷的水解条件提取方式，采用微波提取、热回流提取或超声波提取，优选超声波辅助提取。对功率、时间、pH、维生素C添加量(即lg辣根细粉原料需加入维生素C的mg数)、料液比(每lg辣根细粉原料需加入蒸馏水的mL数)进行单因素实验，功率(W)分别选取20、40、60、80、100、120，时间(min)选取IO、15、20、25、30、35、40，pH分别选取2、3、4、5、6、7、8，维生素C添加量(mg/g)选取0、0.2、2、20、200，料液比(g/mL)选取1:5、1:10、1:15、1:20、1:25。通过硫代葡萄糖苷水解L16(44)正交试验，结果如表1_2。表1硫代葡萄糖苷正交试验结果与分析<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>通过对各因素的综合评价，由极差大小可见，A、B、C、D4因素影响异硫氰酸酯含量的主次顺序为A〉C〉D〉B，即各因素对异硫氰酸酯含量的影响依次为功率〉pH〉料液比〉时间。由表1可看出最佳工艺为A晶C4Di和A^CJ)2，即优选功率20W，时间35min，pH为7，维生素C添加量为2mg/g，料液比(g/mL)为1:10。在上述的树脂吸附和解附中，大孔树脂选择为AB-8、X-5、S-8、DM1400、DM130、DM301、DA20KD101中的任意一种，大孔树脂的静态吸附试验表明吸附效果最好的是DM1400，其次为X-5、AB-8和薩130。解附效果最好的是DlOl，其次是DA201，AB-8，S-8和X-5。用乙醇进行解吸附，解吸效果随乙醇浓度的增大而提高，无水乙醇洗脱效果最好。从综合考虑吸附和解附，优选X-5或AB-8作为辣根异硫氰酸酯的富集纯化的树脂。如表3-4。表3不同树脂对异硫氰酸酯的静态吸附率及脱附率树脂吸附率nL/g脱附率％(resins)(adsorptionrate)(desorptionrate)AB-855.7050.68S-849.3448.94DM140064.7043.79X-561.5248.89DA20142.9952.48D10139.8169.70画13055.7044.88DM30154.1144.82表4X-5树脂纯化效果比较方法Method样品体积(mL)(samplevolume)异硫氰酸酯含量(%)(isothiocyanatescontent)得率(%)(yield)X-5树脂吸附，无水乙醇解吸附X-5resinadsorptionand50046.9%0.187%alcoholelution二氯甲烷萃取dichlorometh肌eextraction50040.5%0.206%本发明采用极性介质分离纯化，极性填料为硅胶、氧化铝、硅藻土等，优选硅胶；柱层析分离25梯度采用石油醚-乙酸乙酯体积比100:1-50的洗脱液逐级梯度洗脱，第1梯度为100%石油醚洗脱，2-5梯度分别为石油醚乙酸乙酯=15:1，10:1，10:3，10:5，第6梯度用乙酸乙酯洗脱。本发明采用气/质色谱条件:气相色谱条件柱子Hp-20M，25X0.32X0.3Mm，进样口温度250°C，柱温50。C，再经过5。C/min程序升温至200。C，并在200。C保持20min。载气He，流速lmL/min，进样量l叱，不分流。质谱电离方式EI，电离电压70ev，质谱检测器25(TC，质量范围50-550。红外光谱本样品为油状物，故将溴化钾玻璃片用无水乙醇洗净，再将样品均匀涂于玻璃片表面，测量范围4000-400cm—、分辩率为2cm—'。核磁共振采用氘代氯仿作溶剂，碳谱在125MHz的条件下进行扫描，氢谱在500MHz的条件下进行扫描。HPLC测定方法以苯乙基异硫氰酸酯为标准品，用Hypersil0DS25um4.6mm+250ram色谱柱，以体积比甲醇水=70:30的比例配制的混合液为流动相，以243nm为检测波长。实施例l辣根苯乙基异硫氰酸酯HPLC分析方法(1)色谱条件:色谱柱Hypersil0DS25um4.6mm*250mm,以体积比甲醇水=70:30的比例配制的混合液为流动相，以243nm为检测波长，流速lmL/min。(2)标准曲线绘制准确移取异硫氰酸烯丙酯0.lmL，用50%wt的乙醇溶解后移至100mL的容量瓶中，并用定容至刻度，得其浓度为lA/mL的标准液。分别吸取上述异硫氰酸烯丙酯标准液1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mL于100mL容量瓶中，再用50%的乙醇定容至刻度，配制成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10pL/mL的标准液。以50%乙醇溶液为空白，在243nm处测吸光值，绘制标准曲线，如图1。标准曲线线性方程y=8.6273x-0.0036，r=0.9998，线性范围0.010.H(3)样品提取与测定采摘一周内的辣根根部经清洗、切片、晒干、粉碎后备用，精密称取辣根样品2.5g置于锥形瓶中，按选择的因素和水平进行水解，将其转移到500mL圆底烧瓶中，接通水蒸气发生仪，缓慢加热产生水蒸气进行蒸馏，冷凝液用盛有50mL无水乙醇的100mL容量瓶接收，蒸馏快到刻度时，停止蒸馏，用蒸馏水定容，摇匀后于紫外光243mi处测吸收值。根据标准曲线求出样品的苯乙基异硫氰酸酯(4)本发明制备的苯乙基异硫氰酸酯粗制品和精制品，经HPLC分析含量分别在40%-80%和80%-100%。图2为苯乙基异硫氰酸酯的HPLC图谱。实施例2辣根硫代葡萄糖苷水解产物的制备(1)原料预处理采摘一周内的辣根根部经清洗、切片、晒干、粉碎成100um-1000ixm细粉，在40-6(TC的条件下烘干，水分低于10%wt。(2)原料水解方法l:辣根粉在30。C-4(TC、pH5-7、料液比1:10-25(g/mL)的条件下，加入维生素C量为辣根粉的0.2y。wt，在水中水解1-3h，然后经水蒸汽蒸馏，蒸馏液经冷却后过滤，二氯甲垸萃取4次，二氯甲垸层浓千，制备辣根硫代葡萄糖苷水解产物样品，供GC-MS分析。方法2:辣根粉在40°C、pH7、料液比1:20(g/mL)的条件下，加入维生素C量为辣根粉的O.P/。wt，水解液为体积比二氯甲烷:水=1:2-5，水解2h，水解后物料经过滤，滤渣部分用二氯甲垸淋洗数次，滤液部分用二氯甲烷萃取4次，合并二氯甲烷层，浓干，制备辣根硫代葡萄糖苷水解产物样品，供GC-MS分析。方法3:先提取辣根粉中的黑芥子酶，再提取辣根粉中的硫代葡萄糖苷。将两者放入40。C、pH6-7、料液比1:10-20(g/mL)的水中，加入维生素C量为辣根粉的0.1-0.2%wt，在水中水解2h。酶解完后过滤，滤渣部分用二氯甲垸淋洗数次，滤液经二氯甲垸萃取4次，合并二氯甲烷层，浓干，制备辣根硫代葡萄糖苷水解产物样品，供GC-MS分析。(3)辣根苯乙基异硫氰酸酯的纯化方法将方法l所得的样品，溶于石油醚，除去不溶部分，经过硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集体积比为石油醚乙酸乙酯=10:1的洗脱馏分，回收溶剂，样品经GC-MS分析,制备含量95M的单一化合物，经鉴定为苯乙基异硫氰酸酯。(4)色谱条件气相色谱条件柱子Hp-20M，25X0.32X0.3Mm，进样口温度250°C，柱温50。C，再经过5。C/min程序升温至200。C，并在200。C保持20min。载气He，流速lmL/min，进样量l叱，不分流。质谱电离方式EI，电离电压70ev，质谱检测器25(TC，质量范围50-550。(5)辣根硫代葡萄糖苷水解产物的化学组成分析3种水解方法所得挥发油经过GC-MS联用法分析，其总离子流图如图7-9。所得的质谱数据进入HP-586/66XM数据处理机库(美国国家标准库)，用INCOS数据系统进行检索和质谱解析，对拟合指标和质谱数据进一步加以确认，用峰面积归一化法计算了各成分的相对百分含量，其分析鉴定结果见表5。表5三种方法所得辣根油的成分鉴定比较<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表5分析表明方法l、2、3通过气质图谱分别得到5、6、5个峰，其中5个峰的保留时间一致。与标准谱图库比对，同时含有苯乙基异硫氰酸酯、十六烷酸、9,12-十八碳二烯酸、11,14,17-二十碳三烯酸甲酯。除了烯丙基异硫氰酸酯和苯乙基异硫氰酸酯是辣根异硫氰酸酯类物质，其它均为脂肪酸类物质。方法1所得的苯乙基异硫氰酸酯的相对含量最高，为88.707%，因为水解液经过水蒸汽蒸馏，将辣根中挥发油成分带出，所得的样品，杂质较少。而方法2通过二氯甲烷直接与辣根粉接触进行水解，所得的异硫氰酸酯的成分比其它两种方法多一种烯丙基异硫氰酸酯，但异硫氰酸酯的相对含量只在60%，这是由于二氯甲烷和水在水解辣根粉的时候，二氯甲烷把辣根粉中的一些脂溶性成分也提取出来了，所以脂肪酸类物质含量就有所提高。方法3是将硫代葡萄糖苷和黑芥子酶分别提取出来，再将两者进行水解，但是得到的苯乙基异硫氰酸酯的含量只有10.67%，主要含有脂肪酸类的物质。这由于在提取黑芥子酶的过程中，黑芥子酶的活性一部分被破坏，硫代葡萄糖苷的提取不完全，所以导致苯乙基异硫氰酸酯的含量最低。实施例3苯乙基异硫氰酸酯的制备(1)原料预处理采摘一周内的辣根根部经清洗、切片、晒干、粉碎成100-1000um细粉，在30'C的条件下烘干，水分低于10%wt。(2)原料水解将粉碎后的原料放入到水解罐中，以1克原料加入10mL蒸馏水的比例加入蒸馏水，在温度3(TC,pH5，维生素C添加量与原料比在lmg/g的条件下水解60min。水解结束后，过滤。(3)粗品的制备滤液部分用石油醚等体积萃取(2)得到的滤液l次，合并石油醚部分，真空浓縮，得苯乙基异硫氰酸酯粗品。滤渣部分a、用水蒸汽直接蒸馏滤渣部分，水蒸汽蒸馏液冷却至室温，再经大孔树脂X-5吸附后，先用2BV的水洗，再用2BV的无水乙醇洗脱，无水乙醇洗脱部分旋转蒸发浓縮，得苯乙基异硫氰酸酯粗品，乙醇回收；b、用石油醚萃取a步中水蒸汽蒸馏后的滤渣，滤渣与石油醚的比例为lg滤渣加入5mL石油醚，加热搅拌提取l次，提取时间lh，温度2(TC，过滤，合并滤液，真空浓縮，得到苯乙基异硫氰酸酯粗品，石油醚回收。(4)精制将上述得到的苯乙基异硫氰酸酯粗品进行萃取分离及柱层析分离。a、将上述得到的苯乙基异硫氰酸酯粗品溶于甲醇中，粗品与甲醇的比例为lg粗品加入20mL甲醇，除去不溶组分。将甲醇溶的部分，旋转蒸发浓干，回收甲醇。再将甲醇溶组分溶于石油醚中，浓縮物与石油醚的比例为lg浓縮物加入20mL石油醚，除去不溶部分，将石油醚溶组分旋转蒸发浓干，回收石油醚。得到苯乙基异硫氰酸酯，HPLC含量为82M。b、将得到的苯乙基异硫氰酸酯进一步进行层析分离。采用硅胶填料，样品采用石油醚溶上样，然后加洗脱液，逐级洗脱，洗脱液依次为2倍柱体积的石油醚与乙酸乙酯进行梯度洗脱，流速1.5mL/min，收集洗脱液。其洗脱液为第1梯度为纯石油醚洗脱，其后梯度为体积比石油醚乙酸乙酯=15:1，10:1，10:3，10:5，最后用乙酸乙酯洗脱。经HPLC分析苯乙基异硫氰酸酯的含量为93%。(5)苯乙基异硫氰酸酯结构鉴定HPLC色谱条件色谱柱HypersilODS25wm4.6mm*250mra，以体积比甲醇水=70:30的比例配制的混合液为流动相，以243nm为检测波长，流速lmL/min。红外光谱本样品为油状物，故将溴化钾玻璃片用无水乙醇洗净，再将样品均匀涂于玻璃片表面，测量范围4000-400cm—'，分辩率为2cm—、核磁共振采用氘代氯仿作溶剂，碳谱在125MHz的条件下进行扫描，氢谱在500MHz的条件下进行扫描。苯乙基异硫氰酸酯特征结构色谱图为图3-图6。苯乙基异硫氰酸酯具有如下化学结构。6实施例4(1)原料预处理采摘一周内的辣根根部经清洗、切片、晒干、粉碎成100-1000um细粉，在60'C的条件下烘干，水分低于10%wt。(2)原料水解将粉碎后的原料放入到水解罐中，以1克原料加入30mL蒸馏水的比例加入蒸馏水，在温度40。C,pH7，维生素C添加量与原料比在10mg/g的条件下水解140min。水解结束后，过滤。(3)粗品的制备滤液部分用二氯甲烷等体积萃取(2)得到的滤液5次，合并二氯甲垸部分，真空浓縮，得苯乙基异硫氰酸酯粗品。滤渣部分a、用水蒸汽直接蒸馏滤渣部分，水蒸汽蒸馏液冷却至室温，再经大孔树脂AB-8吸附后，先用6BV的水洗，再用6BV的无水乙醇洗脱，无水乙醇洗脱部分旋转蒸发浓縮，得苯乙基异硫氰酸酯粗品，乙醇回收。b、用二氯甲烷萃取a步中水蒸汽蒸馏后的滤渣，滤渣与二氯甲垸的比例为lg滤渣加入25mL二氯甲烷，加热搅拌提取4次，每次提取时间3h，温度4(TC，过滤，合并滤液，真空浓縮，得到苯乙基异硫氰酸酯粗品，二氯甲垸回收。(4)精制将上述得到的苯乙基异硫氰酸酯粗品进行萃取分离及柱层析分离。a、将上述得到的苯乙基异硫氰酸酯粗品溶于甲醇中，粗品与甲醇的比例为lg粗品加入50mL甲醇，除去不溶组分。将甲醇溶的部分，旋转蒸发浓干，回收甲醇。再将甲醇溶组分溶于石油醚中，浓縮物与石油醚的比例为lg浓縮物加入50mL石油醚，除去不溶部分，将石油醚溶组分旋转蒸发浓干，回收石油醚。得到苯乙基异硫氰酸酯，HPLC含量为87。/。。b、将得到的苯乙基异硫氰酸酯进一步进行层析分离。采用硅胶填料，样品采用石油醚溶上样，然后加洗脱液，逐级洗脱，洗脱液依次为2倍柱体积的石油醚与乙酸乙酯进行梯度洗脱，流速1.5mL/min，收集洗脱液。其洗脱液为第1梯度为纯石油醚洗脱，其后梯度为体积比石油醚乙酸乙酯=15:1，10:1，10:3，10:5，最后用乙酸乙酯洗脱。经HPLC分析苯乙基异硫氰酸酯的含量为96%。实施例5(1)原料预处理采摘一周内的辣根根部经清洗、切片、晒干、粉碎成100-1000um细粉，在45'C的条件下烘干，水分低于10%wt。(2)原料水解'将粉碎后的原料放入到水解罐中，以1克原料加入20mL蒸馏水的比例加入蒸馏水，在温度35°C,pH6，维生素C添加量与原料比在5mg/g的条件下水解100min。水解结束后，过滤。(3)粗品的制备滤液部分用石油醚等体积萃取(2)得到的滤液3次，合并石油醚部分，真空浓縮，得苯乙基异硫氰酸酯粗品。滤渣部分a、用水蒸汽直接蒸馏滤渣部分，水蒸汽蒸馏液冷却至室温，再经大孔树脂S-8吸附后，先用4BV的水洗，再用4BV的无水乙醇洗脱，无水乙醇洗脱部分旋转蒸发浓缩，得苯乙基异硫氰酸酯粗品，乙醇回收。b、用石油醚萃取a步中水蒸汽蒸馏后的滤渣，滤渣与石油醚的比例为lg滤渣加入15mL石油醚，加热搅拌提取3次，每次提取时间2h，温度30'C，过滤，合并滤液，真空浓縮，得到苯乙基异硫氰酸酯粗品，石油醚回收。(4)精制将上述得到的苯乙基异硫氰酸酯粗品进行萃取分离及柱层析分离。a、将上述得到的苯乙基异硫氰酸酯粗品溶于甲醇中，粗品与甲醇的比例为lg粗品加入50mL甲醇，除去不溶组分。将甲醇溶的部分，旋转蒸发浓干，回收甲醇。再将甲醇溶组分溶于石油醚中，浓縮物与石油醚的比例为lg浓縮物加入50mL石油醚，除去不溶部分，将石油醚溶组分旋转蒸发浓干，回收石油醚。得到苯乙基异硫氰酸酯，HPLC含量为85n/。。b、将得到的苯乙基异硫氰酸酯进一步进行层析分离。采用硅胶填料，样品采用石油醚溶上样，然后加洗脱液，逐级洗脱，洗脱液依次为2倍柱体积的石油醚与乙酸乙酯进行梯度洗脱，流速1.5mL/min，收集洗脱液。其洗脱液为第1梯度为纯石油醚洗脱，其后梯度为体积比石油醚乙酸乙酯=15:1，10:1，10:3，10:5，最后用乙酸乙酯洗脱。经HPLC分析苯乙基异硫氰酸酯的含量为94%。实施例6(1)原料预处理采摘一周内的辣根根部经清洗、切片、晒干、粉碎成100-1000um细粉，在35"的条件下烘干，水分低于10。/。Wt。(2)原料水解将粉碎后的原料放入到水解罐中，以1克原料加入15mL蒸馏水的比例加入蒸馏水，在温度32i:,pH5.4，维生素C添加量与原料比在2mg/g的条件下水解70min。水解结束后，过滤。(3)粗品的制备滤液部分用正己烷等体积萃取(2)得到的滤液3次，合并正己垸部分，真空浓縮，得苯乙基异硫氰酸酯粗品。滤渣部分a、用水蒸汽直接蒸馏滤渣部分，水蒸汽蒸馏液冷却至室温，再经大孔树脂DM1400吸附后，先用5BV的水洗，再用3BV的无水乙醇洗脱，无水乙醇洗脱部分旋转蒸发浓縮，得苯乙基异硫氰酸酯粗品，乙醇回收。b、用正己烷萃取a步中水蒸汽蒸馏后的滤渣，滤渣与正己垸的比例为lg滤渣加入10mL正己烷，加热搅拌提取3次，每次提取时间1.5h，温度25'C，过滤，合并滤液，真空浓缩，得到苯乙基异硫氰酸酯粗品，正己烷回收。(4)精制将上述得到的苯乙基异硫氰酸酯粗品进行萃取分离及柱层析分离。a、将上述得到的苯乙基异硫氰酸酯粗品溶于甲醇中，粗品与甲醇的比例为lg粗品加入25mL甲醇，除去不溶组分。将甲醇溶的部分，旋转蒸发浓干，回收甲醇。再将甲醇溶组分溶于石油醚中，浓縮物与石油醚的比例为lg浓縮物加入25mL石油醚，除去不溶部分，将石油醚溶组分旋转蒸发浓干，回收石油醚。得到苯乙基异硫氰酸酯，HPLC含量为83%。b、将得到的苯乙基异硫氰酸酯进一步进行层析分离。采用硅胶填料，样品采用石油醚溶上样，然后加洗脱液，逐级洗脱，洗脱液依次为2倍柱体积的石油醚与乙酸乙酯进行梯度洗脱，流速1.5mL/min，收集洗脱液。其洗脱液为第1梯度为纯石油醚洗脱，其后梯度为体积比石油醚乙酸乙酯=15:1，10:1，10:3，10:5，最后用乙酸乙酯洗脱。经HPLC分析苯乙基异硫氰酸酯的含量为94%。实施例7(1)原料预处理采摘一周内的辣根根部经清洗、切片、晒干、粉碎成100-1000um细粉，在4(TC的条件下烘干，水分低于10%wt。(2)原料水解将粉碎后的原料放入到水解罐中，以1克原料加入20mL蒸馏水的比例加入蒸馏水，在温度34'C,pH5.7，维生素C添加量与原料比在4mg/g的条件下水解80min。水解结束后，过滤。(3)粗品的制备滤液部分用乙醚等体积萃取(2)得到的滤液4次，合并乙醚部分，真空浓縮，得苯乙基异硫氰酸酯粗品。滤渣部分a、用水蒸汽直接蒸馏滤渣部分，水蒸汽蒸馏液冷却至室温，再经大孔树脂DM130吸附后，先用3BV的水洗，再用5BV的无水乙醇洗脱，无水乙醇洗脱部分旋转蒸发浓縮，得苯乙基异硫氰酸酯粗品，乙醇回收。b、用乙醚萃取a步中水蒸汽蒸镏后的滤渣，滤渣与乙醚的比例为lg滤渣加入5mL乙醚，加热搅拌提取3次，每次提取时间2h，温度25。C，过滤，合并滤液，真空浓縮，得到苯乙基异硫氰酸酯粗品，乙醚回收。(4)精制将上述得到的苯乙基异硫氰酸酯粗品进行萃取分离及柱层析分离。a、将上述得到的苯乙基异硫氰酸酯粗品溶于甲醇中，粗品与甲醇的比例为lg粗品加入30mL甲醇，除去不溶组分。将甲醇溶的部分，旋转蒸发浓干，回收甲醇。再将甲醇溶组分溶于石油醚中，浓縮物与石油醚的比例为lg浓縮物加入30mL石油醚，除去不溶部分，将石油醚溶组分旋转蒸发浓干，回收石油醚。得到苯乙基异硫氰酸酯，HPLC含量为84。/。。b、将得到的苯乙基异硫氰酸酯进一步进行层析分离。采用硅胶填料，样品采用石油醚溶上样，然后加洗脱液，逐级洗脱，洗脱液依次为2倍柱体积的石油醚与乙酸乙酯进行梯度洗脱，流速1.5mL/min，收集洗脱液。其洗脱液为第1梯度为纯石油醚洗脱，其后梯度为体积比石油醚乙酸乙酯=15:1，10:1，10:3，10:5，最后用乙酸乙酯洗脱。经HPLC分析苯乙基异硫氰酸酯的含量为95%。实施例8(1)原料预处理采摘一周内的辣根根部经清洗、切片、晒干、粉碎成100-1000nm细粉，在5(TC的条件下烘干，水分低于10%wt。(2)原料水解将粉碎后的原料放入到水解罐中，以1克原料加入25mL蒸馏水的比例加入蒸馏水，在温度35'C,pH6.3，维生素C添加量与原料比在5mg/g的条件下水解90min。水解结束后，过滤。(3)粗品的制备滤液部分用苯等体积萃取(2)得到的滤液2次，合并苯部分，真空浓縮，得苯乙基异硫氰酸酯粗品。滤渣部分a、用水蒸汽直接蒸馏滤渣部分，水蒸汽蒸馏液冷却至室温，再经大孔树脂DM301吸附后，先用4BV的水洗，再用6BV的无水乙醇洗脱，无水乙醇洗脱部分旋转蒸发浓縮，得苯乙基异硫氰酸酯粗品，乙醇回收。b、用苯萃取a步中水蒸汽蒸馏后的滤渣，滤渣与苯的比例为lg滤渣加入10mL苯，加热搅拌提取3次，每次提取时间2.5h，温度25'C，过滤，合并滤液，真空浓縮，得到苯乙基异硫氰酸酯粗品，苯回收。(4)精制将上述得到的苯乙基异硫氰酸酯粗品进行萃取分离及柱层析分离。a、将上述得到的苯乙基异硫氰酸酯粗品溶于甲醇中，粗品与甲醇的比例为lg粗品加入35mL甲醇，除去不溶组分。将甲醇溶的部分，旋转蒸发浓干，回收甲醇。再将甲醇溶组分溶于石油醚中，浓縮物与石油醚的比例为lg浓縮物加入30mL石油醚，除去不溶部分，将石油醚溶组分旋转蒸发浓干，回收石油醚。得到苯乙基异硫氰酸酯，HPLC含量为84。/。。b、将得到的苯乙基异硫氰酸酯进一步进行层析分离。采用硅胶填料，样品采用石油醚溶上样，然后加洗脱液，逐级洗脱，洗脱液依次为2倍柱体积的石油醚与乙酸乙酯进行梯度洗脱，流速1.5mL/min，收集洗脱液。其洗脱液为第1梯度为纯石油醚洗脱，其后梯度为体积比石油醚乙酸乙酯=15:1，10:1，10:3，10:5，最后用乙酸乙酯洗脱。经HPLC分析苯乙基异硫氰酸酯的含量为94%。实施例9(1)原料预处理采摘一周内的辣根根部经清洗、切片、晒干、粉碎成100-1000ym细粉，在5(TC的条件下烘干，水分低于10%wt。(2)原料水解将粉碎后的原料放入到水解罐中，以1克原料加入25mL蒸馏水的比例加入蒸馏水，在温度35。C,pH6.5，维生素C添加量与原料比在7mg/g的条件下水解110min。水解结束后，过滤。(3)粗品的制备滤液部分用氯仿等体积萃取(2)得到的滤液5次，合并氯仿部分，真空浓縮，得苯乙基异硫氰酸酯粗品。滤渣部分a、用水蒸汽直接蒸馏滤渣部分，水蒸汽蒸馏液冷却至室温，再经大孔树脂DA-201吸附后，先用5BV的水洗，再用2BV的无水乙醇洗脱，无水乙醇洗脱部分旋转蒸发浓缩，得苯乙基异硫氰酸酯粗品，乙醇回收。b、用氯仿萃取a步中水蒸汽蒸馏后的滤渣，滤渣与氯仿的比例为lg滤渣加入25mL氯仿，加热搅拌提取2次，每次提取时间3h，温度30。C，过滤，合并滤液，真空浓縮，得到苯乙基异硫氰酸酯粗品，氯仿回收。(4)精制将上述得到的苯乙基异硫氰酸酯粗品进行萃取分离及柱层析分离。a、将上述得到的苯乙基异硫氰酸酯粗品溶于甲醇中，粗品与甲醇的比例为lg粗品加入40mL甲醇，除去不溶组分。将甲醇溶的部分，旋转蒸发浓干，回收甲醇。再将甲醇溶组分溶于石油醚中，浓缩物与石油醚的比例为lg浓縮物加入50mL石油醚，除去不溶部分，将石油醚溶组分旋转蒸发浓干，回收石油醚。得到苯乙基异硫氰酸酯，HPLC含量为83M。b、将得到的苯乙基异硫氰酸酯进一步进行层析分离。采用硅胶填料，样品采用石油醚溶上样，然后加洗脱液，逐级洗脱，洗脱液依次为2倍柱体积的石油醚与乙酸乙酯进行梯度洗脱，流速1.5mL/min，收集洗脱液。其洗脱液为第1梯度为纯石油醚洗脱，其后梯度为体积比石油醚乙酸乙酯=15:1，10:1，10:3，10:5，最后用乙酸乙酯洗脱。经HPLC分析苯乙基异硫氰酸酯的含量为95%。实施例10(1)原料预处理采摘一周内的辣根根部经清洗、切片、晒干、粉碎成100-1000um细粉，在55'C的条件下烘干，水分低于10%wt。(2)原料水解将粉碎后的原料放入到水解罐中，以1克原料加入30mL蒸馏水的比例加入蒸馏水，在温度3(TC,pH6.7，维生素C添加量与原料比在8mg/g的条件下水解130min。水解结束后，过滤。(3)粗品的制备滤液部分用二氯甲烷等体积萃取(2)得到的滤液4次，合并二氯甲烷部分，真空浓縮，得苯乙基异硫氰酸酯粗品。滤渣部分a、用水蒸汽直接蒸馏滤渣部分，水蒸汽蒸馏液冷却至室温，再经大孔树脂D-101吸附后，先用3BV的水洗，再用6BV的无水乙醇洗脱，无水乙醇洗脱部分旋转蒸发浓縮，得苯乙基异硫氰酸酯粗品，乙醇回收。b、用二氯甲垸萃取a步中水蒸汽蒸馏后的滤渣，滤渣与二氯甲烷的比例为lg滤渣加入20mL二氯甲烷，加热搅拌提取4次，每次提取时间2.5h，温度35。C，过滤，合并滤液，真空浓縮，得到苯乙基异硫氰酸酯粗品，二氯甲垸回收。(4)精制将上述得到的苯乙基异硫氰酸酯粗品进行萃取分离及柱层析分离。a、将上述得到的苯乙基异硫氰酸酯粗品溶于甲醇中，粗品与甲醇的比例为lg粗品加入45mL甲醇，除去不溶组分。将甲醇溶的部分，旋转蒸发浓干，回收甲醇。再将甲醇溶组分溶于石油醚中，浓縮物与石油醚的比例为lg浓缩物加入45mL石油醚，除去不溶部分，将石油醚溶组分旋转蒸发浓干，回收石油醚。得到苯乙基异硫氰酸酯，HPLC含量为85M。b、将得到的苯乙基异硫氰酸酯进一步进行层析分离。采用硅胶填料，样品采用石油醚溶上样，然后加洗脱液，逐级洗脱，洗脱液依次为2倍柱体积的石油醚与乙酸乙酯进行梯度洗脱，流速1.5mL/min，收集洗脱液。其洗脱液为第1梯度为纯石油醚洗脱，其后梯度为体积比石油醚乙酸乙酯=15:1，10:1，10:3，10:5，最后用乙酸乙酯洗脱。经HPLC分析苯乙基异硫氰酸酯的含量为95%。权利要求1、一种从辣根中制备苯乙基异硫氰酸酯的方法，其特征在于，包括以下步骤第一步原料预处理将辣根洗净晾干切片，烘干后粉碎成细粉；第二步原料水解将粉碎后的细粉以1克原料加入10-30mL蒸馏水的比例加入蒸馏水水解，水解温度30-40℃，pH为5-7，维生素C添加量与辣根细粉原料质量比为1-101000，水解时间60-140min，水解结束后，过滤；第三步粗品的制备滤液部分用低极性溶剂等体积萃取第二步得到的滤液1-5次，合并低极性溶剂部分，真空浓缩，得苯乙基异硫氰酸酯粗品；滤渣部分a、用水蒸汽直接蒸馏滤渣部分，水蒸汽蒸馏液冷却至室温，再经大孔树脂吸附后，先用2-6BV的水洗，再用2-6BV的无水乙醇洗脱，无水乙醇洗脱部分旋转蒸发浓缩，得苯乙基异硫氰酸酯粗品，乙醇回收；b、用低极性有机溶剂萃取a步中水蒸汽蒸馏后的滤渣，滤渣与低极性有机溶剂的比例为1g滤渣加入5-25mL低极性有机溶剂，加热搅拌提取1-4次，每次提取时间1-3h，温度20-40℃，过滤，合并滤液，真空浓缩，得到苯乙基异硫氰酸酯粗品，低极性有机溶剂回收；第四步精制将第三步得到的苯乙基异硫氰酸酯粗品合并经溶剂萃取分离后柱层析分离a、将第三步得到的苯乙基异硫氰酸酯粗品溶于甲醇中，粗品与甲醇的比例为1g粗品加入20-50mL甲醇，除去不溶物，将甲醇溶解部分，真空旋转蒸发浓缩，回收甲醇溶剂，浓缩物再溶于石油醚中，浓缩物与石油醚的比例为1g浓缩物加入20-50mL石油醚，除去不溶部分，将石油醚溶解部分真空旋转蒸发浓缩，回收石油醚，得到苯乙基异硫氰酸酯，经HPLC分析质量百分含量在80％以上；b、将a得到的苯乙基异硫氰酸酯进一步进行柱层析分离，将a得到的苯乙基异硫氰酸酯溶于石油醚，经过极性填料柱吸附后，采用石油醚-乙酸乙酯体积比100∶1-50的洗脱液逐级梯度洗脱，收集洗脱液，得到苯乙基异硫氰酸酯，经HPLC分析质量百分含量在90％以上。2、如权利要求1所述从辣根中制备苯乙基异硫氰酸酯的方法，其特征在于，所述辣根原料来自于山东临沂。3、如权利要求1所述从辣根中制备苯乙基异硫氰酸酯的方法，其特征在于，所述真空浓缩为旋转蒸发浓縮，温度为30-6(TC，真空度为0.02-0.09MPa。4、如权利要求1所述从辣根中制备苯乙基异硫氰酸酯的方法，其特征在于，第三步中的低极性溶剂为石油醚、正己烷、乙醚、苯、氯仿或二氯甲垸。5、如权利要求1所述从辣根中制备苯乙基异硫氰酸酯的方法，其特征在于，第四步中极性填料为硅胶、氧化铝或硅藻土。6、如权利要求1所述从辣根中制备苯乙基异硫氰酸酯的方法，其特征在于，第三步中大孔树脂为AB-8、X-5、S-8、DM1400、DM130、DM301、DA201、DlOl。7、如权利要求1所述从辣根中制备苯乙基异硫氰酸酯的方法，其特征在于，第四步中的HPLC测定方法以苯乙基异硫氰酸酯为标准品，用HypersilODS25um4.6mm*250mm色谱柱，以体积比甲醇:水=70:30的比例配制的混合液为流动相，以243nm为检测波长。全文摘要本发明公开了一种从辣根中制备苯乙基异硫氰酸酯的方法，包括以下步骤将辣根洗净、切片粉碎。在优化的水解条件下进行水解，过滤，滤液用低极性溶剂萃取数次，滤渣部分可采用水蒸汽蒸馏，大孔树脂吸附富集和有机溶剂提取，回收有机溶剂，得到粗品，再通过溶剂萃取分离和柱层析分离，制备90％以上高纯度的苯乙基异硫氰酸酯。其方法工艺简单，得到的产品含量高，适合工业化生产。文档编号A61K36/72GK101440054SQ20081023542公开日2009年5月27日申请日期2008年12月2日优先权日2008年12月2日发明者王成章,陈虹霞申请人:中国林业科学研究院林产化学工业研究所