专利名称：胞二磷胆碱在治疗缺血性疾病中的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及胞二磷胆碱的医药新用途，特别是涉及胞二磷胆碱在促进缺血脑区血管新 生和神经重塑、治疗缺血性脑血管疾病以及多种缺血性血管新生不足性疾病中的用途。
背景技术：
脑血管疾病是世界公认的三大致死疾病之一，具有发病率高、死亡率高和致残率高的 特点。脑卒中幸存者长期的功能障碍给社会、家庭和患者带来沉重的负担。脑缺血如能及 时恢复血供，重建血循环，可逆转缺血损伤，超早期使用t-PA溶栓，显示出较好的临床效 果就是明显的例证(Birmingham K， 2002)。但t-PA治疗时间窗短，且有加重脑水肿和脑 出血的危险，使受益于T-PA溶栓治疗的患者不足3。/。 (Birmingham K， 2002; IadecolaC， 2004)。
血管新生在脑缺血神经保护和神经修复过程中均发挥重要作用，尸检结果证明缺血
脑区新生血管的数量与中风患者的存活时间和神经功能恢复程度成正相关(Kmpinski J, 1994， 2003)。在脑缺血后神经修复过程中，脑微血管新生的范围与程度直接关系到缺血 边缘区血流的改善，影响受损神经元生理功能的恢复，新生血管形成可在一定程度上减轻 神经功能缺失，与脑卒中患者的功能预后密切相关。因此，卒中后神经功能恢复是神经可 塑和血管结构、功能重建协同作用的结果，缺血后循环重建依赖于血管新生，血循环重建 是神经功能恢复的重要解剖基础和前提。采用药物促进内源性血管新生，重建缺血区循环， 促进神经血管重塑是改善卒中后神经功能恢复状况的重要策略。目前尚缺乏有效促进神 经、血管修复的药物。
胞二磷胆碱(又名二磷酸胞苷胆碱、尼古林、尼可林、胞胆碱、胞磷胆碱)为核苷衍 生物，目前临床主要用于急性颅脑外伤和脑手术后的意识障碍，胰腺炎。还可促进脑卒中 患者偏瘫上肢运动功能恢复。大量研究表明胞二磷胆碱具有较强的神经保护作用，但其对 脑缺血后神经修复研究相对较少，迄今未有涉及血管修复重塑方面的研究(M.D.Ginsberg, 2008)。
发明内容
本发明申请人经过多年研究，釆用神经行为学评价手段和电镜等技术，验证并拓展了 胞二磷胆碱促神经功能恢复效应与神经可塑性部分机制，同时意外地发现胞二磷胆碱具有显著的促血管新生效应，对于缺血性疾病血管修复重塑具有重要的理论意义和临床价值。 采用离体和整体实验发现，胞二磷胆碱具有促进神经元轴突生长，增加脑缺血后神经元突 触数目，加速神经功能恢复以及显著的促缺血脑区血管新生作用，具有治疗多种血管新生 不足缺血性疾病(如重症缺血性心脏病、闭塞性动脉硬化症、糖尿病神经血管病变等)的 作用。本发明目的如下
1、 胞二磷胆碱在促进皮质神经元轴突生长中的应用
胞二磷胆碱能明显促进离体培养的皮质神经元存活，并在一定浓度范围内(2mg/ml 5mg/ml)显著促进神经元轴突生长。
2、 胞二磷胆碱在促进脑缺血神经缺失功能恢复中的应用
采用Bederson神经功能评分、肌力评定、平衡木行走实验和左前肢食物抓取实验等多 种方法评定脑缺血后1、 4、 7、 15和21天各实验组大鼠神经缺失功能恢复状况，证实胞 二磷胆碱对脑缺血后功能恢复有促进作用。其中在脑缺血后21天，胞二磷胆碱(0.025、 0.05、 0.10g/kg)组受累前肢(左)食物抓取成功率分别为32.3%±3.8%， 45.6%±4.8%， 58.8% ±4.4%,具有较明显的量效关系，与模型组(25.8% ±4.1%)比较差异具有显著性(； <0.05)。提示胞二磷胆碱对脑缺血后感觉运动功能恢复有促进作用。
3、 胞二磷胆碱在增加大脑感觉运动皮质神经毡内突触数目中的应用
电镜下，感觉运动皮质神经毡内突触数目除假手术组外，各实验组缺血侧均比健侧减 少。模型组健侧神经毡内突触数目与假手术组差异无显著性(p 〉0.05)，但缺血侧明显 少于假手术组(p <0.05)，提示脑缺血后存在突触丢失现象；胞二磷胆碱低、中、高剂 量组健侧和缺血侧均比模型组和生理盐水组明显增加(p <0.05)，提示胞二磷胆碱对脑 缺血后突触重构有明显促进作用。
4、 胞二磷胆碱在促进缺血区大脑血管新生中的应用
免疫荧光双标技术观察各实验组大鼠局灶脑缺血后缺血区周围血管新生变化，M因子 和PCNA分别单独标记血管和增殖细胞，分别显示为红色和绿色；激光共聚焦技术合成单 独标记的图像后，環因子和PCNA阳性的共表达区域为黄色，同时又有未共表达的血管和 细胞存在，背景非常清晰，较可靠地表征了胞二磷胆碱促血管新生的效应。与模型组相比 较，胞二磷胆碱各剂量组具有显著的促血管新生作用，共表达VBI因子和PCNA的血管数目 和微血管密度均显著增加(户<0.05)。
更进一步，本发明还可实现以下发明目的
胞二磷胆碱在制备促进缺血神经缺失功能恢复的药物及其组合物中的应用。
4胞二磷胆碱在制备促进神经元轴突生长的药物及其组合物中的应用。 胞二磷胆碱在制备增强缺血灶周围大脑皮质芽生轴突、增加大脑感觉运动皮质神经毡
内突触数目的药物及其组合物中的应用。
胞二磷胆碱在制备上调脑缺血后BDNF和TrkB蛋白表达、增强突触重构的药物及其
组合物中的应用。
胞二磷胆碱在制备促进脑血管内皮细胞增殖、促进缺血区血管新生和重建血循环的药 物及其组合物中的应用。
胞二磷胆碱在制备上调血管内皮生长因子VEGF表达的药物及其组合物中的应用。
胞二磷胆碱在制备与血管新生相关、需要促进血管新生、重建循环的其他缺血性疾病 中运用的药物及其组合物中的应用。
图l为大鼠行为学测试，其中左为平衡木测试；中为肌力测试；右为采用测试盒 行左前肢食物抓取功能测试
图2为胞二磷胆碱0.25 kg、 0.5 kg、 1.0g/kg6h给药对脑缺血大鼠受累前肢食物抓取 功能的影响
图3为胞二磷胆碱延迟给药对神经行为的影响
图4为胞磷胆碱对神经元及其突触超微结构的影响(40000x)，其中左(A)为模型组； 右(B)为胞磷胆碱治疗组
图5为激光共聚焦显示胞二磷胆碱对pMCAO后15d大鼠新生微血管的影响 本发明的优点是
胞二磷胆碱可以与在药理学上可接受的赋型剂配制成不同的剂型促进内皮细胞增殖， 促进缺血区脑血管新生，有助于重建缺血脑区循环；增加神经元轴突数目和促进离体培养
的神经元轴突生长，促进脑缺血后受累肢体神经功能恢复。胞二磷胆碱可以与其它促神经 修复药物和脑血管可塑性药物以不同的比例配成具有上述治疗作用的组合物，并配制成药 理学上可接受的不同剂型。并且胞二磷胆碱可以推广到其他系统的由于新生血管不足导致 的缺血性疾病的治疗运用。
具体实施例方式
用以下的实施例对本发明作具体说明，但本发明并不局限于实施例所列举的内容。本
发明的实验动物，购自重庆医科大学实验动物中心(合格证号检动字2002A040)。 实施例一..胞二磷胆碱诱导大鼠大脑皮质神经元轴突生长的离体实验无菌条件下取出生后24h内的乳鼠大脑皮质，剪去胼胝体和其他白质，D-Hank液清洗 两遍，0.2X胰酶溶液37'C消化5min，制备细胞悬液，以1X105细胞密度接种于两块96孔 板内，每孔种100W。在37。C、 5。/。的C02培养箱中培养，培养基为DF12，血清浓度为15%。 培养24h后全量换成NeurobasalA神经元专用培养基(含2XB27),选择性培养神经元，以后 每3天半量换液1次。皮层神经元培养第6天后进行神经元鉴定，并分组开始作相应药物干 预，继续培养48h后行指标检测。实验分为空白对照组、胞二磷胆碱干预组。空白对照组 不用任何药物进行干预；胞二磷胆碱干预组分设终浓度为l.O、 2.0、 5.0mg/ml三个亚组， 每组重复3次。
各实验组药物干预48h后，1000r'min"离心2min，弃原培养液，每孔加入180nl无血 清培养液及20plMTT，继续培养4h。 1000 r min"离心2min，弃原液，每孔加入二甲亚砜 (DMSO) 200^1，震荡5min，选择570nm波长，用全自动酶标仪(BioRad 550型)检测各 孔吸光值(A值)。神经元种植后定时在倒置相差显微镜下观察其生长情况。药物干预48h 后，HE染色，400倍镜下测量神经元轴突起始部至生长锥末端的距离，计为神经元轴突长 度。每组各孔随机选择5个视野，共测量100个神经元轴突长度，所测细胞必须有晕光和突 起，取其平均值作为该组的实验结果。本实验中测量目尺1个刻度-25X 10/98 pm。结果见 下表
胞二磷胆碱干预对神经元生存活性及轴突长度的影响(5±S) Tab 1-1.Effects of Citicoline on the neuronal survival and axon growth of the cultured neurons( X ±S ) )_
组别
吸光度A值 (570nm)
轴突平均长度(Pm)
空白对照组 胞磷胆碱组
1 mg/ml亚组
2 mg/ml亚组 5 mg/ml亚组
0. 463 ±0. 042
0. 464±0. 025 0. 568±0. 020A 0. 781±0. 069A
72. 779±21. 404
72. 562±15. 783 98.068土14. 89A 118. 108 ±18. 47A
注胞二磷胆碱中、高浓度治疗组吸光度A值分别与空白对照组 相比较，均p〈0.05;胞二磷胆碱中、高浓度治疗组轴突平均长度与空 白对照组比较》<0.05
从表中可以分析得出胞二磷胆碱能明显促进培养的皮质神经元存活，并在一定浓度
范围内显著促进神经元轴突生长。
实施例二胞二磷胆碱促脑缺血大鼠神经修复的行为学评价
61、 制备局灶脑缺血模型，造模后6h开始腹腔注射不同剂量胞二磷胆碱进行干预，采 用神经行为学评定方法观察造模后不同时点各组大鼠神经功能恢复状况，初步明确胞二磷 胆碱对脑缺血大鼠神经功能恢复有无积极作用。同时，设置一组造模后24h首次给予胞二 磷胆碱中剂量治疗组，初步了解大鼠脑缺血后延迟给予胞二磷胆碱治疗是否有效，探讨胞 二磷胆碱的有效给药时间窗。实验分为7组，即假手术组，模型组，生理盐水组，造模后 6h给药胞二磷胆碱低、中、高剂量(分别为0.25、 0.5、 1.0g/kg体重)治疗组，造模后24h 给药胞二磷胆碱中剂量治疗组。每组6只。
2、 Bederson评分粗略反映各组脑缺血大鼠神经功能恢复状况，可见术后第15天和第 21天，术后6h给药胞二磷胆碱各剂量组和术后24h给药胞二磷胆碱中剂量组大部分鼠已 恢复到假手术组的功能状态，比其他实验组恢复更好，且差异具有显著性(P <0.05)。提 示胞二磷胆碱可促进脑缺血大鼠神经功能恢复，且延迟至脑缺血后24h给药仍然有效。
3、 平衡木试验(附图l左)反映脑缺血大鼠感觉运动整合能力和运动协调功能的恢 复状况。可见术后15d和21d时，术后6h开始给药的胞二磷胆碱各剂量组和术后24h开 始给药的胞二磷胆碱中剂量组得分明显低于其他各实验组(P <0.05)，但均未恢复至假手 术组水平。提示胞二磷胆碱对脑缺血大鼠运动平衡功能的恢复有促进作用，且延迟给药也 有效。
4、 肌力评定(附图l中)除假手术组外，各组术后第24小时，肌力低下程度与首 次给药前相同，组间无明显差异(户>0.05)，各组与假手术组比较差异有显著性(尸< 0.05)。术后第4天，各组(假手术组除外)肌力开始恢复，7天时肌力己明显改善(尸< 0.05)，尤其是胞二磷胆碱各剂量治疗组改善更明显，与模型组和生理盐水组比较差异具有 显著性(户<0.05)。术后第15天和第21天时，术后6h给药胞二磷胆碱各剂量治疗组、 术后24h给药胞磷胆碱组肌力己恢复正常，而模型组和生理盐水组仍未完全恢复正常，提 示胞二磷胆碱可促进脑缺血大鼠瘫痪肢体肌力恢复，且脑缺血后延迟用药仍有效。
5、 食物抓取试验(附图l右)反映脑缺血大鼠受累肢体精细感觉和运动功能恢复状 况。各实验组大鼠术前测定左前肢食物抓取成功率基线为65.7%±4.8% 68.0%±3.6%， 组间无明显差异(尸〉0.05)。假手术组术后1、 4、 7、 15和21d左前肢食物抓取成功率维 持在基线水平，波动在65.0%±5.1% 70.2%±5.3%之间。模型组、生理盐水组、和胞 磷胆碱术后6h组第1天，大鼠抓取成功率明显下降，各组抓取成功率降为1.5%±1.2% 2.5%±1.9%，组间差异无显著性(P >0.05)。术后第4天，各组左前肢抓取功能开始恢 复，抓取成功率上升至11.55%±2.5% 13.8%±2.2%，但组间无明显差异(i5 >0.05)。术后第7天，各实验组大鼠受累前肢抓取成功率明显增加，其中，模型组为15.7%±4.1%， 胞二磷胆碱低、中、高治疗组分别为17.3%±2.8%， 25.6%±4.2%， 38.8%±4.4%，胞二磷 胆碱中、高剂量治疗组与模型组差异具有显著性(户<0.05)。术后第15天，各组大鼠左 前肢抓取功能仍在恢复，胞二磷胆碱中、高剂量组明显比其他实验组恢复好，差异具有显 著性(户<0.05)。术后21天，模型组受累前肢抓取成功率恢复至25.8%±4.1% (约相当 于基线值38%)，胞二磷胆碱低、中、高剂量治疗组抓取成功率分别为32.3% ±3.8%、 45.6% ±4.8%和58.8%±4.4%，与模型组差异具有显著性(P <0.05)。提示胞二磷胆碱对脑缺血 后感觉运动功能恢复有促进作用。术后24h开始给予胞二磷胆碱治疗组，观察至术后21 天，发现术后7d、 15d和21d受累前肢抓取功能均比模型组对应时点恢复更好(P <0.05)， 但与术后6h开始给予胞二磷胆碱治疗组对应时点无显著性差异(尸<0.05)。提示脑缺血 后延迟给予胞二磷胆碱治疗仍对大鼠功能恢复有促进作用。
从上可以看出胞二磷胆碱可剂量依赖性地促进脑缺血大鼠肢体功能恢复(附图2); 脑缺血后24h胞二磷胆碱延迟给药仍然有显著的疗效(附图3 )。
实施例三、胞二磷胆碱增加大鼠脑缺血后突触数目的作用
1、 采用投射电镜结合体视学方法观察各实验组大鼠局灶脑缺血后缺血灶周围残存大 脑皮质内神经元突触数目的变化，从超微结构水平了解胞二磷胆碱是否能促进大鼠局灶脑 缺血后有效轴突芽生。实验分为5组，即假手术组，模型组，生理盐水组，胞二磷胆碱中 剂量治疗组。每组3只。
2、 采用免疫荧光组织化学技术和Western blot分析方法检测各实验组大鼠局灶脑缺血 后缺血灶周围残存脑组织内脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体TrkB蛋白表达的变化， 初步探讨胞二磷胆碱影响大鼠局灶脑缺血后突触重构的可能机制。实验分为6组，即假手 术组，模型组，生理盐水组，胞二磷胆碱低、中、高剂量治疗组。每组6只。
胞二磷胆碱低、中、高剂量分别为0.25、 0.5、 lg/kg体重，上述药物均用生理盐水配 制，终体积为3ml。生理盐水组给予等体积生理盐水。术后1天开始腹腔注射给药，每日 l次，连续7天。假手术组和模型组不给任何干预。
实验结果提示胞二磷胆碱治疗后，突触前、后膜肿胀较模型组明显减轻，部分突触 后膜结构破坏，神经毡水肿，电子密度较模型组深，突触数目明显增加。表明胞二磷胆碱 可有效减轻脑缺血后神经元及突触超微结构损伤，增加突触数目(附图4);上调脑缺血后 脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体TrkB蛋白表达，促进神经元有效轴突芽生。
实施例四胞二磷胆碱促进大鼠脑缺血后血管新生的作用与机制实验一、采用免疫荧光双标技术和共聚焦显微技术观察各实验组大鼠局灶脑缺血后缺 血灶周围血管新生数目和微血管密度。实验分为5组，即假手术组，模型组，生理盐水组， 胞二磷胆碱中剂量治疗组。每组3只。
实验二、采用免疫荧光组织化学技术和Western blot分析方法检测各实验组大鼠局灶 脑缺血后缺血灶周围残存脑组织内血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的变化，初步探 讨胞二磷胆碱影响大鼠局灶脑缺血后血管新生的可能机制。实验分为6组，即假手术组， 模型组，生理盐水组，胞二磷胆碱低、中、高剂量治疗组。每组6只。
胞二磷胆碱低、中、高剂量分别为0.25、 0.5、 lg/kg体重，上述药物均用生理盐水配 制，终体积为3ml。生理盐水组给予等体积生理盐水。术后1天开始腹腔注射给药，每曰 l次，连续7天。假手术组和模型组不给任何干预。
实验结果提示胞二磷胆碱可显著促进脑缺血缺血区新生血管数目和微血管密度(附 图5);上调脑缺血后血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达，促进缺血区血循环重建，加 速脑缺血后神经功能恢复。
权利要求
1、胞二磷胆碱在促进缺血脑区血管新生和神经重塑、治疗缺血性脑血管疾病以及多种缺血性血管新生不足性疾病中的应用。
2、 如权利要求1所述，血管新生不足缺血性疾病是指重症缺血性心脏病、闭塞性动 脉硬化症或糖尿病神经血管病变。
3、 如权利要求l所述，胞二磷胆碱在促进皮质神经元轴突生长中的应用。
4、 如权利要求l所述，胞二磷胆碱在促进脑缺血神经缺失功能恢复中的应用。
5、 如权利要求1所述，胞二磷胆碱在增加大脑感觉运动皮质神经毡内突触数目中的 应用。
6、 如权利要求l所述，胞二磷胆碱在促进缺血区大脑血管新生中的应用。
7、 如权利要求1或4所述，胞二磷胆碱在制备促进缺血神经缺失功能恢复的药物及 其组合物中的应用。
8、 如权利要求1或3所述，胞二磷胆碱在制备促进神经元轴突生长的药物及其组合 物中的应用。
9、 如权利要求1或5所述，胞二磷胆碱在制备增强缺血灶周围大脑皮质芽生轴突， 增加大脑感觉运动皮质神经毡内突触数目的药物及其组合物中的应用。
10、 如权利要求1或5所述，胞二磷胆碱在制备上调脑缺血后BDNF和TrkB蛋白表达， 增强突触重构的药物及其组合物中的应用。
11、 如权利要求1或6所述，胞二磷胆碱在制备促进脑血管内皮细胞增殖，促进缺血 区血管新生和重建血循环的药物及其组合物中的应用。
12、 如权利要求1或6所述，胞二磷胆碱在制备上调血管内皮生长因子VEGF的表达 的药物及其组合物中的应用。
13、 如权利要求1或6所述，胞二磷胆碱在制备与血管新生相关，需要促进血管新生， 重建循环的其他缺血性疾病中运用的药物及其组合物中的应用。
全文摘要
胞二磷胆碱促血管和神经修复的医药新用途，胞二磷胆碱可促进脑缺血区血管新生，增加神经元轴突数目和促进离体培养的神经元轴突生长；明显促进脑缺血后受累肢体神经功能恢复。胞二磷胆碱可以与在药理学上可接受的赋型剂配制成不同的剂型促进内皮细胞增殖，促进缺血区脑血管新生，有助于重建缺血脑区循环；增加神经元轴突数目和促进离体培养的神经元轴突生长，促进脑缺血后受累肢体神经功能恢复。胞二磷胆碱可以与其它促神经修复药物和脑血管可塑性药物以不同的比例配成具有上述治疗作用的组合物，并配制成药理学上可接受的不同剂型。同时还可推广到其他系统的由于新生血管不足导致的缺血性疾病的治疗运用。
文档编号A61K31/7042GK101444524SQ200810237288
公开日2009年6月3日 申请日期2008年12月30日 优先权日2008年12月30日
发明者东 万, 徐晓玉, 祝慧凤 申请人:西南大学