专利名称：二吲哚甲烷及其衍生物在类风湿关节炎治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及应用二吲哚甲垸及其衍生物治疗类 风湿性关节炎疾病。
二背景技术：
类风湿性关节炎是最常见的结缔组织疾病之一，是以累及周围关节为主的多 发性炎症性的自身免疫病，其特征为对称性、周围性多个关节慢性炎性病变，病 理为慢性滑膜炎，侵及下层的软骨和骨，造成关节破坏，致使劳动力丧失，甚至 致残。针对类风湿性关节炎的治疗过去主要集中在非甾体抗炎药，糖皮质激素， 免疫抑制剂等。但是传统的治疗存在靶点不明确，副作用较大等缺点。类风湿性 关节炎的发病机制虽然并不清楚，但近年来的研究表明炎症因子如肿瘤坏死因子 a (TNF-a)、白细胞介素-1|3 (IL-lp)、白细胞介素-6 (IL-6)、粒细胞-巨噬细胞 集落刺激因子(GM-CSF)等在发病过程中起了主导作用。因此，针对炎症因子 的耙点治疗逐渐引起人们的注意。其中，发展尤为迅猛的是针对TNF-a为靶点 的治疗，主要为蛋白质药物和基因药物。但是，在临床试验过程中，基因药物因 致死性感染等巨大的毒副作用一直未能有效解决而被停止，蛋白质药物如TNF —a可溶性受体，恩利(Etanercept)， TNF—a的抗体，英非单抗(Infliximab) 同样存在着副作用较大，价格昂贵等缺点，也未能被广泛使用。
干扰素-Y (IFN-Y)用于类风湿性关节炎的治疗由来己久，上世纪八十年代 人们发现IFN-Y可用于类风湿性关节炎的治疗，但是，在后期的临床试验中，干 扰素-Y并没有表现出比安慰剂更好的疗效，同时，由于IFN-Y在类风湿关节炎中 的作用机理不清楚，这一计划就被暂时搁置了。近年来越来越多的研究表明， IFN-Y —方面通过抑制多型核中性粒细胞迁移至发病关节，从而阻止疾病发展； 另一方面，IFN-Y通过抑制破骨细胞形成减轻关节损害。这一发现给类风湿性关 节炎的治疗带来了新的希望。但是，研究表明IFN-Y系统给药并不能完全阻断类 风湿性关节炎的发病，关节腔局部给药效果更加明显，同时，因IFN-y在体内的 代谢半衰期极短，只有半小时，这些局限性给IFN-Y用于类风湿性关节炎的治疗 带来了困难。 三
发明内容
本发明需要解决的问题是公开了一类能够有效提高机体IFN-Y浓度，从而阻断类风湿性关节炎疾病发展的小分子药物，具体涉及应用二u引哚甲烷及其衍生物 治疗类风湿性关节炎疾病以及3， 3'-二吲哚甲垸及其衍生物水溶液(以下简称3， 3'-二B引哚甲烷或DIM)制剂的制备及其应用于类风湿性关节炎的治疗。
本发明涉及有效提高机体IFN-Y浓度有机小分子药物为3, 3'-二吲哚甲烷 (DIM)的可选择取代物，具有如下结构式
其中R1 ,R2,R4,R5,R6，R7,R8， Rl',R2',R4'，R5'，R6',R7'，R8'相互独立，可以是氢原子 或者选之以下取代基卤素，羟基，硝基，-OR9,-CN，-NR9R10，-NR9R10Rll+， -COR9, -CF3, .S(0)nR9 (n=0-2), -SO2NR9R10, -CONR9R10, -NR9COR10, ^119(:(0^11101^1,- (0)(0119)11(11=1-2)，可选择的取代基有烷基，卤乙烯基，
链烯基，炔基，芳香基，杂烷基，杂芳香基，环烷基，环烯基，并且所有从一号 到十号碳原子中可以有一到三个原子为其他杂原子如氧或者氮取代，其中
R9，R10,R11的取代基可以是一到十个碳原子的烷基，卤乙烯基，链烯基，炔基， 芳香基，杂烷基取代，而R8和R8'也可以是酮基。在一个具体的实例中，除R1，R1' 位置之外均包含有一个位置的取代基，而每个取代基为包含有一到五个碳原子的 直链或支链烷基或是垸氧基，或是碘，溴，氯，氟等卤素。在一个特定的实例中， 具体化合物可以是单吲哚，双n引哚，三n引哚，或是更多个B引哚的取代物。
本发明涉及3， 3'-二吲哚甲烷及其衍生物为商业购买所得(南京锐马精细化 工有限公司)或依据文献报道方法合成。本发明的技术方案如下
1. 合成不同的取代基吲哚基团。
2. 通过排列组合的方式产生一个3， 3'-二吲哚甲垸的衍生物库，H引哚环上
的取代基相互独立，二吲哚或是三吲哚环之间的取代基相互独立，产生 如R2,4,5，6或7， R2', 4', 5'， 6'或7' 二-F,-CI,或-Br-3，3'-二卩引哚甲烷;R2，4,5,6或7， R2'，4'，5'，6'或7' 二-甲基-,乙基-，丙基-，丁基_，或戊基-3,3' -二卩引哚甲垸；R2，4，5，6或7，R2'，4'，5',6'或7'二-甲氧基-，乙氧基-，丙氧基 -，丁氧基-，或戊氧基-3,3'-二吲哚甲烷；R2，4,5,6或7， R2',4',5'，6'或7'二-羟 基,氨基-，甲胺基-，磺酸基-，或硝基-3,3' 二吲哚甲烷； R2，4,5,6,7,R2',4'，5',6',7'十-氟代(全氟)-3,3'-二吲哚甲垸等。 3.通过高通量筛选的方式筛选免疫调节活性合适的3， 3'-二H引哚甲烷衍生 物
本发明所述3， 3'-二吲哚甲垸及其衍生物的水溶液注射制剂的制备过程.
1. 配置适量的环糊精溶液，将3， 3'-二吲哚甲垸用环糊精溶液溶解，选择 适当配比，并搅拌过夜至澄清透明溶液为止。
2. 在双蒸水中透析冻干，即得3， 3'-二吲哚甲烷水溶液注射制剂的干粉制剂。
3. 将称取上述干粉制剂溶于一定量的生理盐水，制备3， 3'-二吲哚甲垸生 理盐水注射液备用。
本发明所述3， 3'-二吲哚甲垸及其衍生物水溶液注射制剂在类风湿性关节炎 治疗中的应用
1. 使用完全弗氏佐剂0. lml于SD大鼠右足跖部皮下注射，建立佐剂型关节 炎模型。
2. 将上述3， 3'-二吲哚甲烷注射液于建立佐剂型关节炎模型同时进行腹腔 注射，进行关节炎的干预性治疗，或者与佐剂注射2-3周后腹腔注射， 对佐剂性关节炎进行治疗。
3. 治疗后每天测量大鼠脚踝肿胀程度，并进行评分，定期抽取血液用于测 量血清炎症因子，定期进行X放射性影像学检查并进行评分.在治疗2 周后处死大鼠，取右足做关节组织切片，评价治疗效果。
本发明的有益效果是提供了一种新的治疗类风湿性关节炎的方法，通过给予 3， 3'-二吲哚甲烷适当提高机体及局部的IFN-Y浓度，从而阻断和抑制疾病的发 展，并通过全新的方法，有效提高了3， 3'-二吲哚甲烷的溶解性，增加了3， 3'-二吲哚甲垸的使用途径。同时，本发明中使用的材料易于获取，价格低廉，制备 条件全部为常规条件下物理复合，不改变药物性质，并增加了3， 3'-二吲哚甲烷的稳定性，制备设备要求较低，制备过程简易，制备成本低。另外，本法制备二 吲哚甲烷新剂型包封率高，性质稳定，便于保存和运输。本发明可作为治疗类风 湿性关节炎，雌激素、雄激素依赖性肿瘤，其他肿瘤，病毒感染，痤疮药物。 四
图1: DIM衍生物刺激脾细胞悬液的IFN- Y的酶联免疫吸附试验(ELISA)结果 从左往右依次为l.空白对照组，2. 3,3'-二吲哚甲垸组，3. 5,5'-二氯-二吲哚 甲垸组，4.5，5'-二氟-二吲哚甲烷组，5.5，5'-二甲基-二吲哚甲烷组，6.5，5'-二丙基 -二吲哚甲烷组，7. 5，5'-二戊基-二吲哚甲烷组，8.5，5'-二乙氧基-二吲哚甲烷组， 9. 5，5'-二丁氧基-二吲哚甲烷组，10. N，N'- 二甲基-二吲哚甲垸组，ll.N,N'-二丙 基-二吲哚甲烷组，12.N,N'-二戊基-二吲哚甲烷组，13. 2，2'-二乙基-二吲哚甲垸组， 14.2,2'-二丁基-二吲哚甲烷组，15.2,2'-二羟基-二吲哚甲烷组，16.2，4-二羟基-二 吲哚甲垸组，17.2，5-二羟基-二吲哚甲烷组，18.5,5'-二溴-二吲哚甲烷组，19.全 氟-3,3'-二吲哚甲烷组，20. 5,5'-二乙基-二吲哚甲垸组，21. 5,5'-二丁基-二吲哚甲 垸组，22. 5,5'-二甲氧基-二吲哚甲烷组，23. 5,5'-二丙氧基-二吲哚甲烷组，24. 5,5'-二戊氧基-二吲哚甲烷组，25. N，N'-二乙基-二吲哚甲烷组，26. N，N'-二丁基-二吲 哚甲烷组，27. 2,2'-二甲基-二吲哚甲烷组，28.2,2'-二丙基-二吲哚甲烷组，29. 2,2'-二戊基-二吲哚甲垸组，30.2-羟基二吲哚甲烷组，31.2，2'-二羟基-二吲哚甲烷组， 32. 2，4'-二羟基-二吲哚甲垸组。
图2:不同剂量的DIM干预治疗佐剂性关节炎两周的临床评分结果。
图3:小鼠腹腔给予DIM后血清IFN-Y的酶联免疫吸附试验(ELISA)结果1未
给药，2给药后12小时，3给药后24小时。
图4: DIM治疗后一周大鼠血清IL-ie的ELISA结果1佐剂性关节炎模型组， 2正常对照组，3DIM治疗组。
图5: DIM治疗后一周大鼠血清IL-8的ELISA结果1佐剂性关节炎模型组，2 正常对照组，3DIM治疗组。
图6: DIM治疗后一周大鼠血清TNF-a的ELISA结果1佐剂性关节炎模型组， 2正常对照组，3DIM治疗组。
图7: DIM用于干预治疗大鼠佐剂性关节炎的临床评分结果參DIM治疗组， ■佐剂性关节炎模型阳性对照组。图8:不同剂量DIM治疗佐剂性关节炎三周后大鼠患足照片图1阳性对照组，
2 2mg/kg体重治疗组，3 4mg/kg体重治疗组，4 8mg/kg体重治疗组，5 16mg/kg 体重治疗组，6空白对照组. 五具体实施例方式
本发明所述3， 3'-二吲哚甲烷应用于类风湿性关节炎的治疗以及通过环糊精助溶 后，制得生理盐水注射剂的制备。在具体实施过程中，使用的环糊精包括a-环 糊精，e-环糊精和Y-环糊精。 1. DIM应用脾细胞悬液进行活性筛选
将不同的DIM衍生物溶于二甲亚砜(DMSO)配置成1000X测试储液。断 颈处死ICR小鼠，在无菌条件下取出小鼠脾脏，用眼科剪剪碎脾脏，在八目网 筛中研碎脾脏碎片，用无菌生理盐水反复冲洗，收集网筛滤过脾细胞悬液。将粗 制脾细胞悬液以1000转/分转速离心五分钟，得粗制脾细胞沉淀。将粗制脾细胞 沉淀重新悬浮在生理盐水中，用5倍体积的红细胞裂解液裂解红细胞10分钟， 1000转/分转速离心五分钟，然后将沉淀用1XPBS洗涤两次，即得所需的脾细 胞，使用1640培养液(10%血清+双抗)悬浮上述脾细胞，控制细胞密度为106 细胞/ml培养液。加入10-100 u g/ml上述DIM储液，同时设置空白对照组加入 等量的DMSO，于37t:孵箱培养24小时，800-1200转/分离心，收集上清液， 使用酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞悬液中IFN-gamma的浓度。具体结果 见图l，可见3， 3-二吲哚甲垸衍生物均具有一定的免疫调节功能。图l实例中 的测试衍生物有5,5'-二氯-二吲哚甲垸、5,5'-二氟-二吲哚甲垸、5，5'-二甲基-二吲 哚甲垸、5,5'-二丙基-二吲哚甲烷、5,5'-二戊基-二吲哚甲烷、5,5'-二乙氧基-二吲 哚甲烷、5，5'-二丁氧基-二吲哚甲烷、N，N'- 二甲基-二吲哚甲烷、N,N'-二丙基-二 吲哚甲烷、N,N'-二戊基-二吲哚甲垸、2,2'-二乙基-二吲哚甲烷、2,2'-二丁基-二吲 哚甲烷、2，2'-二羟基-二吲哚甲烷、2，4-二羟基-二吲哚甲烷、2，5-二羟基-二吲哚甲 烷、5，5'-二溴-二吲哚甲烷、全氟-3，3'-二吲哚甲垸、5，5'-二乙基-二吲哚甲烷、5，5'陽 二丁基-二吲哚甲垸、5,5'-二甲氧基-二吲哚甲垸、5,5'-二丙氧基-二吲哚甲烷、5,5'-二戊氧基-二吲哚甲垸、N,N'-二乙基-二吲哚甲烷、N,N'-二丁基-二吲哚甲垸、2,2'-二甲基-二吲哚甲垸、2,2'-二丙基-二吲哚甲烷、2，2'-二戊基-二吲哚甲垸、2-羟基 二吲哚甲垸、2,2'-二羟基-二吲哚甲烷、2,4'-二羟基-二吲哚甲烷，但具体测试实例不限于上述化合物。
2. 以a -环糊精为助溶剂的DIM生理盐水注射剂的制备
称取a-环糊精，配置浓度为200mg/ml的a-环糊精生理盐水溶液。向a-环 糊精生理盐水溶液加入DIM,使得MDIM/Ma., =l/3-10，搅拌过夜，并适当加热， 得到DIM的澄清透明溶液。双蒸水透析，每天换水3次，透析三天。冻干，即得 a -环糊精为助溶剂的DIM注射剂的干粉剂，其中DIM含量为9.091 %-25.000% 。
3. 以e-环糊精为助溶剂的DIM生理盐水注射剂的制备 称取e-环糊精，配置浓度为200mg/ml的e-环糊精生理盐水溶液。向P-环
糊精生理盐水溶液加入DIM，使得MD丽Mp^鹏4/4-12，搅拌过夜，并适当加热， 得到DIM的澄清透明溶液。双蒸水透析，每天换水3次，透析三天。冻干，即得 0 -环糊精为助溶剂的DIM注射剂的干粉剂，其中DIM含量为7.692%-20.000% 。
4. 以y-环糊精为助溶剂的DIM生理盐水注射剂的制备
称取y -环糊精，配置浓度为200mg/ml的P -环糊精生理盐水溶液。向y -环 糊精生理盐水溶液加入DIM，使得MDIM/MY4,ffi=l/3-15，搅拌过夜，并适当加热， 得到DIM的澄清透明溶液。双蒸水透析，每天换水3次，透析三天。冻干，即 得y-环糊精为助溶剂的D頂注射剂的干粉剂，其中DIM含量为0.625%-25.000 % 。
5. DIM生理盐水注射剂的药效评估
称取上述DIM注射剂的干粉剂，用生理盐水配成DIM浓度为lmg/ml的生 理盐水溶液。给予18—22克ICR小鼠按16mg/kg剂量腹腔给药，分别于给药后 12小时，24小时随机选取若干小鼠，眼球取血，ELISA法测定血清IFN- y浓度。
如图2所示，DIM给药后，12小时血清IFN-Y浓度即开始升高，并在24小 时还在持续升高。而文献报道一般的DIM只有口服给药才能取得良好的效果， 腹腔或者静脉给药并不能明显提高机体IFN-Y浓度，可见通过本法制得DIM注 射同样有很好的提高机体IFN-"/浓度的效果。
6. DIM治疗佐剂性关节炎的研究 按文献报道方法建立大鼠佐剂性关节炎模型，即完全弗氏佐剂O.lml于SD
大鼠右足跖部皮下注务」'，2-3周后建成佐剂型关节炎模型。称取上述DIM注射 剂的干粉剂，用生理盐水配成DIM浓度为10mg/ml的生理盐水溶液。建模成功后，将关节炎大鼠随机分成5组，分别给予16mg/kg， 8 mg/kg， 4 mg/kg， 2 mg/kg， lmg/kg， 0mg/kg治疗。每天给药一次，并测量右足厚度，并作疾病严重程度评
分，评分标准为各关节病变按0 4共五级评分法0级无红肿；1级关节稍红 肿；2级关节轻度红、肿、热；3级关节中度红、肿、热、轻度功能障碍；4级 关节重度红、肿、热、严重功能障碍。关节炎分数(AS)为每只鼠各关节病变 分数的总和。并于治疗后第7天和第14天，通过心脏取血，获得大鼠血清，用 于炎症因子的测定。其中，Omg/ml治疗组实施过程实际使用环糊精生理盐水溶 液作为对照。
如图1和图7所示，DIM能显著控制关节炎的发病，并呈明显的剂量依赖性。 IL-ie是在关节炎发病过程中的一个重要的炎症因子，在关节炎发病过程能活化 多种炎症细胞，造成严重的组织损伤。图3是DIM治疗一周后大鼠血清IL-ie 的ELISA结果，其中DIM治疗组为16mg/kg剂量治疗组。从图中可见，经DIM 治疗，DIM治疗组大鼠血清IL-1 e浓度显著低于模型组。IL-8也是关节炎发病 过程中一种重要的炎症因子，其主要作用是和血液中的多型核中性粒细胞结合， 促进多型核中性粒细胞向关节部位趋化，造成关节损害。图4是DIM治疗两周 后大鼠血清IL-8的ELISA结果，同图3，其中DIM治疗组为16mg/kg剂量治疗 组。从图中可见，经DIM治疗，DIM治疗组大鼠血清IL-8浓度显著低于模型组。 由此可见，DIM能够提高血清中IFN-Y浓度，并有效降低血清中的炎症因子如 IL-1P， IL-8等，从而有效控制关节炎的发展，减轻疾病损害 7. DIM用于干预治疗佐剂性关节炎的研究
按文献报道方法建立大鼠佐剂性关节炎模型，即完全弗氏佐剂0. lml于SD 大鼠右足跖部皮下注射。称取上述DIM注射剂的干粉剂，用生理盐水配成DIM 浓度为10mg/ml的生理盐水溶液。并于建模当日，将大鼠随机分成2组，分别 给予16mg/kg, 0 mg/kg作干预治疗研究。每天给药一次，并测量右足厚度，并 作疾病严重程度评分，评分标准为同实例5。并于治疗后第7天，通过心脏取血， 获得大鼠血清，用于炎症因子的测定。其中，Omg/ml治疗组实施过程实际使用 环糊精生理盐水溶液作为对照。
如图6所示，经DIM干预治疗，关节炎症状明显减轻，部分大鼠未能正常发 病，说明DIM不仅能有效治疗类风湿性关节炎，并能有效阻断发病，即DIM能够阻断类风湿性关节炎的发生发展。TNF-ci作为类风湿性关节炎发病过程中最 重要的炎症因子之一，已经被关注多年。如图5所示，在干预治疗研究中，DIM 治疗组的血清TNF- a显著低于模型组。
权利要求
1. 3，3′-二吲哚甲烷及其衍生物在制备治疗类风湿性关节炎、风湿性关节炎疾病药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述3， 3'-二吲哚甲垸及其衍生物的水溶液制剂，其特征是 应用环糊精作为助溶剂，制备3， 3'-二吲哚甲烷及其衍生物的水溶液制剂。
3. 根据权利要求2所述3，3'-二吲哚甲垸及其衍生物的水溶液制剂的制备方法， 其特征是由以下步骤构成(1) 配置环糊精溶液，配置浓度为200mg/ml，将3， 3'-二吲哚甲烷用环糊 精溶液溶解，3， 3'-二吲哚甲烷与环糊精的质量比为1/3-15，并搅拌过夜至澄 清透明溶液为止。(2) 在双蒸水中透析冻干，即得3， 3'-二吲哚甲垸水溶液注射制剂的干粉制剂。
4. 根据权利要求2所述3， 3'-二吲哚甲烷及其衍生物的水溶液制剂，其特征是 助溶剂环糊精为a -环糊精及其衍生物或e -环糊精及其衍生物或y -环糊精 及其衍生物。
5. 根据权利要求4所述3， 3'-二吲哚甲烷及其衍生物的水溶液制剂，其特征是 a-环糊精及其衍生物为a-环糊精，或丁基-a-环糊精，或六-(2，3，6-三-0-乙酰 基)-a-环糊精，或六-(2,3，6-三-0-甲基)-a-环糊精，或(2-羟丙基)-a-环糊精， 或琥珀酰-a-环糊精，或六-(2，3,6-三-0-辛基)-a-环糊精，或六-(6-0-叔丁基-二 甲基硅烷)-a-环糊精；e-环糊精及其衍生物为(3-环糊精，或6-0-麦芽糖基-环糊精，或七-(2,3-二-0-乙酰基-6-0-磺基)-P-环糊精，或七-(3-0-乙酰基-2,6-二-O-甲基)-P-环糊精，或七-(2,3,6-三-0-苯甲酰基)-P-环糊精，或七-(2，3,6-三 -O-乙基)-p-环糊精，或七-(2,6-二-0-乙基)-p-环糊精，或p-环糊精聚合物，或 七-(2，3，6-三-0-苯甲酰基)-P-环糊精，或琥珀酰-(2-羟丙基)-P-环糊精，或三乙 酰基-P-环糊精，或(2,6-二-0-)乙基-p-环糊精，或(2-羧乙基)-p-环糊精，或(2-羟乙基)-(3-环糊精，或(2-羟丙基)-P-环糊精，或乙酰基-(3-环糊精，或丁基-p-环糊精，或羧甲基-P-环糊精或七-(2,3，6-三-0-甲基)-li-环糊精，或七-(2,6-二-0-甲基)-(i-环糊精，或甲基-P-环糊精，或季铵化P-环糊精，或琥珀酰-p-环糊精， 或磺丙基-p-环糊精，或6-单脱氧-6-单氨基-卩-环糊精，或6-0-a-D-葡萄糖苷-卩-环糊精，或6-0-a-麦芽糖基-P-环糊精，或七-(2,3,6-三-0-乙基)-|3-环糊精，或硅烷基[(6-0-叔丁基-二甲基)-2，3,-二-0-乙酰基)-p-环糊精；Y -环糊精及其衍 生物为Y-环糊精，或Y-环糊精聚合物，或八-(2,3,6-三0-甲基)-Y-环糊精，或 八-(2，6-二-0-戊垸基)卞环糊精，或八-(6-0-叔丁基二甲基硅烷基)个环糊精，或羟丙基-Y-环糊精，或丁基-Y-环糊精。
6.根据权利要求2所述以环糊精为助溶剂的3， 3'-二吲哚甲烷及其衍生物水溶 液制剂在制备治疗类风湿性关节炎，雌激素、雄激素依赖性肿瘤，肿瘤，病 毒感染，痤疮疾病药中的应用。
全文摘要
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及二吲哚甲烷及其衍生物在类风湿性关节炎疾病中的应用以及二吲哚甲烷及其衍生物一种新的水溶液制剂的制备。二吲哚甲烷及其衍生物在体外和体内都能有效提高干扰素-γ的水平，调节机体免疫，从而阻断疾病的发生发展，减轻疾病造成的损害。另外，本品水溶液制剂主要涉及中间媒介为环糊精。本品的水溶液制剂能够有效提高水溶性，方便使用。本品水溶液制剂的使用不仅仅局限于类风湿性关节炎治疗的应用，还包括在二吲哚甲烷及其衍生物在其他疾病治疗过程中的应用，如肿瘤的治疗，雄激素，雌激素相关疾病等。
文档编号A61P29/00GK101428016SQ20081024355
公开日2009年5月13日 申请日期2008年12月23日 优先权日2008年12月23日
发明者夏苏华, 张峻峰, 磊 董, 陈江宁 申请人:南京大学