碱性成纤维细胞生长因子脂质体疫苗及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：：碱性成纤维细胞生长因子脂质体疫苗及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物医药领域，具体涉及一种新型碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)脂质体疫苗及其制备方法和用途。技术背景血管发生是正常组织生长与发育所必需的过程，而在成年人中，除了女性的生殖系统及机体的修复过程(如伤口愈合)有血管发生外，其它组织则少见，且其过程一般较短暂并受机体严格调控。与之相反，在某些病理性疾病中，如肿瘤、类风湿性关节炎、增生性视网膜病(黄斑变性)、牛皮癣等，常有不受控制的血管发生，根据其中存在不受控制的血管生成的各种病理学疾病状态分类为血管生成依赖性的或血管生成相关性的疾病。在正常的生理过程中，血管发生中血管内皮细胞的生长受血管生长因子和抑制因子的严格调控；而在与血管生成相关的疾病过程中，它可过度表达一种或几种血管生成因子，如成纤维细胞生长因子(aFGF和bFGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板来源的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)等，相互协同作用刺激血管生成。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为一种细胞丝裂原和促进血管生长因子，在许多肿瘤的生长中及与异常新生血管相关的疾病，包括牛皮癣、黄斑变性等起重要的作用。肿瘤的生长和血管生成是相辅相成的，肿瘤细胞产生的促血管生成因子能够刺激内皮细胞的生长及生存，而血管的生成不仅是提供营养、氧气和运走代谢物，血管内皮细胞还可向肿瘤提供生长启动的因子。因此，阻止bFGF产生以及抑制其生物学活性的发挥作为一种有效的抗肿瘤方法得到研究，而使用bFGF疫苗，在体内产生bFGF抗体，达到抑制肿瘤生长目的是一种被认为有应用潜力的方法。免疫佐剂(immunoadjuvant)又称非特异性免疫增生剂。本身不具抗原性，但同抗原一起或预先注射到机体内能增强免疫原性(见抗原)或改变免疫反应类型。种类很多，目前尚无统一的分类方法，常用的佐剂可分为4类无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等；有机佐剂，微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、内毒素、细菌提取物(胞壁酰二肽)等；合成佐剂，如人工合成的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、异丙肌苷等；油剂，如弗氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等。弗氏佐剂目前在实验动物中最常用，又可分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种。免疫佐剂的生物作用包括(1)抗原物质混合佐剂注入机体后，改变了抗原的物理性状，可使抗原物质缓慢地释放，延长了抗原的作用时间；(2)佐剂吸附了抗原后，增加了抗原的表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬；(3)佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理；(4)佐剂可促进淋巴细胞之间的接触，增强辅助T细胞的作用；(5)可刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体，故免疫佐剂的作用可使无免疫原性物质变成有效的免疫原；(6)可提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴变；(7)改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应，并使其增强。近年来，脂质体在免疫佐剂领域中开始得到应用。作为免疫佐剂，脂质体有着安全性好;毒副作用小；提高抗原稳定性，延长疫苗使用期；能降低被包裹抗原的毒性，增强受体耐受高剂量病原微生物或其毒素攻击的能力等优点。但是不同的疫苗是否都能使用脂质体作为免疫佐剂目前没有定论，并且不同疫苗所需要的脂质体免疫佐剂的配方还需要反复地寻找和筛选。尽管随着DNA重组疫苗、合成肽疫苗等新型疫苗不断涌现，免疫佐剂研究越来越受到人们的关注，佐剂活性物质的研究报道也很多。但由于佐剂加强免疫反应是一个非常复杂的过程，关于各种佐剂的作用机制至今仍尚未完全了解，每种抗原的合适的佐剂配方需要重新筛选，如何开发适合完整bFGF的免疫佐剂系统目前进展较小，也没有见到关于脂质体作为完整的bFGF免疫佐剂的报道。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种性能良好的，可作为bFGF的免疫佐剂的阳离子脂质体。解决本发明技术问题的技术方案是一种阳离子脂质体，由下述配比的成分制备而成含有D0PE和D0TAP，其摩尔比例为DOPE:D0TAP=2:12，还含有重量百分比为O.11%的MPLA。进一步的，上述的阳离子脂质体中DOPE禾nDOTAP的摩尔比例为DOPE:D0TAP=2:1，其中MPLA的重量百分含量为O.51%。上述的阳离子脂质体可用于制备免疫佐剂。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种bFGF脂质体复合物。该bFGF脂质体复合物是由上述的阳离子脂质体包裹bFGF制备而成。其中，上述bFGF脂质体复合物中的bFGF和脂质体的重量比，即药脂比为310%。进一步的，上述bFGF脂质体复合物中bFGF和脂质体的药脂比为59呢。更进一步的，上述bFGF脂质体复合物中bFGF和脂质体的药脂比为78。/0。优选的，上述bFGF脂质体复合物中bFGF和脂质体的药脂比为7.5%。本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种上述bFGF脂质体复合物的方法。该方法包括以下步骤a、称取D0PE、D0TAP、MPLA置于反应容器中，加入溶剂溶解，所述溶剂配方为氯仿甲醇=1:1;b、真空旋转蒸发得脂质体膜，干燥；c、在脂质体膜中加入超纯水进行超声水化得空白脂质体溶液；d、将bFGF加入脂质体溶液，进行冻融，即得。其中，上述方法中的冻融条件为在液氮下速冻，4"C水浴下孵化1小时。进一步的，上述方法还包括步骤e:将步骤d产物再冻融l5次。更进一步的，上述方法还包括步骤f:将冻融产物挤压通过0.45ym聚碳酸酯膜812次本发明还提供了上述的bFGF脂质体复合物在制备肿瘤的抗血管生成治疗性疫苗和治疗血管生成相关疾病的疫苗中的应用。本发明以及还提供了一种bFGF脂质体疫苗，是由上述的bFGF脂质体复合物添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。该bFGF脂质体疫苗可用于治疗肿瘤和血管生成相关疾病。根据本发明的第一个方面，为了构建好的可用于bFGF免疫佐剂的脂质体，考察了多种脂质体配方。结果发现由于bFGF等电点为9.4，带有正电荷，而阳离子脂质体包裹正电抗原，抗原可以在静电作用下包裹在脂质体内部水相中，而不会包裹(或吸附)在磷脂层中，从而进一步提高抗原的免疫效应，而且阳离子脂质体作为免疫佐剂比中性(或阴离子)脂质体可能有更高的免疫效应，因此bFGF更适合用阳离子脂质体。发明人又对多种制备阳离子脂质体的原料中进行大量的筛选，发现使用D0PE和D0TAP制成阳离子脂质体作为免疫佐剂包裹bFGF，在体内产生bFGF抗体，能达到抑制肿瘤生长的目的。同时，为了取得更好的效果，对药脂比进行了筛选，并优选了MPLA作为添加剂，完成了对脂质体配方的优化。免疫试验中通过与标准佐剂——弗氏佐剂比较，本发明阳离子脂质体作为佐剂产生的bFGF抗体滴度也令人满意。在动物实验中，用该阳离子脂质体包裹bFGF制备得到的bFGF脂质体疫苗也能得到该免疫效果，甚至更好。同时，bFGF脂质体疫苗的抑制肿瘤转移的效果也不低于弗氏佐剂。根据本发明的另一个方面，对制备本发明bFGF脂质体复合物的方法进行了确定和优化。在按照通常的工艺参数制备阳离子脂质体的基础上，采用冻融法包裹bFGF。另外还对挤压次数；冻融次数以及孵化温度等各个工艺参数进行了优化，以提高bFGF的包封率并同时保持其较高的抗体滴度。结果发现，采用优化后的工艺使bFGF包封率得到显著提高，最终达到50%，其免疫效果也维持在需要的高水平，达到了原料利用率和免疫效果的平衡。根据本发明的再一个方面，本发明bFGF脂质体复合物作为肿瘤的抗血管生成治疗性疫苗和治疗血管生成相关疾病的疫苗，也可再添加药学上可以接受的辅助性成分制备成上述疫苗本发明的有益效果为本发明的脂质体配方是在大量筛选的基础上得到的，具有免疫活性强、包封率好、回收率高等优点，是一种优秀的针对bFGF的脂质体免疫佐剂。本发明的bFGF脂质体复合物的制备方法则是在现有的普通制备方法上进行了进一步的优化，具有更好的包封率和回收率高，制备的bFGF脂质体复合也具有更高的免疫效果及抗肿瘤效果，为bFGF疫苗的开发和应用提供了新的选择。图1为过膜挤压对bFGF阳离子脂质体粒径分布的影响。图2为过膜挤压次数对bFGF阳离子脂质体包封率以及回收率的影响试验结果。图3为经过连续六次每两周一次的免疫后，各组小鼠的抗体滴度比较。图4为经过连续六次每两周一次的免疫后，各组小鼠的IFN-y表达水平测定结果。图5为经过连续六次每两周一次的免疫后，接种肿瘤细胞，小鼠肺部重量比较结果。具体实施方式以下通过对本发明具体实施方式的描述说明但不限制本发明。实施例一脂质体配方的选择及优化材料二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和l，2-二油酰-3-三甲铵基丙烷(D0TAP)购于Avanti公司；单磷酰脂A(MonophosphoryllipidA，MPLA)、胆固醇(CH0L)和十八胺(0ctadecylamine)购于Sigma公司；双十二烷基二甲基溴化胺(DDAB)及大豆磷脂(PC)购于百灵威公司。重组人bFGF购自美国跳D公司，纯度大于97%。在材料方面，使用PC:DDAB体系、PC:十八胺体系、DOPE:D0TAP体系进行筛选。上述体系所得的包封率分别为40.32%、39.78%、47.43%。试验表明，使用D0PE和D0TAP材料更有利于包裹bFGF，故选用D0PE和D0TAP作为基础体系。通过改变D0PE:D0TAP:CH0L的比例(摩尔比)，观察对bFGF包封率的影响。在D0PE:dotap:chol=2:2:o、2:2:i、2:2:2、2:1:0、2:1:1、2:1:2条件下，包封率分别为46.56%、32.43%、31.86%、48.63%、33.13%、31.28%。可以看出，胆固醇的加入不利于脂质体包裹药物；DOPE:D0TAP的比例2:12对包封率影响不大，在考虑成本后，优选DOPE:D0TAP=2:1。最后还需要再添加占整个脂质体的重量百分比为O.1P/。的MPLA，优选为O.51%，才能使其达到更佳的免疫佐剂效果。药脂比考察上，在保持bFGF浓度(lmg/ml)相同，药脂比分别为3%、5%、7.5%、10%、15%、20%条件下，包封率分别为50.65%、49.34%、50.03%、44.67%、41.61%、35.21%。结果表明，药脂比在7.520%中，包封率随着药脂比的增加，包封率快速下降；但是药脂比在3%-10%范围内，包封率变化不大。综合考虑，配方上选择DOPE:D0TAP=2:1、药脂比优选为310%范围内，因本发明脂质体包封率高、载药量大，故以药脂比为7.5%时最佳。实施例二制备工艺条件的进一步优化冻融次数的优化整个工艺过程中，bFGF的包裹主要依靠冻融来得以实现，但是这个过程中，在得到高包封率的情况下，保持bFGF高活性至关重要，因此对冻融次数和条件进行优选。首先，考察冻融次数对包封率的影响。脂质体在反复冻融2、4、6、8、IO次时的包封率变化见表l。数据显示，开始冻融时，冻融次数的增加有利于bFGF的包裹；但是反复冻融6次之后，包封率没有明显的变化，且活性还可能所降低。为了縮短操作时间，保持bFGF高活性，冻融l-6次均能基本达到目的，46次更好，最佳次数为6次。表l:冻融次数对bFGF包封率以及活性的影响:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>冻融孵化条件的优化孵化条件考察上，分别考察孵化温度(结果见表2)、孵化时间(结果见表3)对包封率以及bFGF活性的影响。孵化温度上选择4。C、8°C、l(TC，孵化时间是上选择40、60、80、100、120分钟。表2孵化温度对bFGF的包封率以及活性的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>数据显示，孵化温度对包封率影响不大，但是低的孵化温度有利于bFGF高活性的保持，应保持1(TC以下水浴，4"C最佳；孵化时间上，4080分钟在得到高包封率以及保持bFGF高活性上都比较满意，6080分钟更好，60分钟左右最佳。表3孵化时间对bFGF的包封率以及活性的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例三过膜挤压次数的考察脂质体在经过冻融后，得到是一个较宽的粒径分布而且平均粒径也偏大，如果通过薄膜挤压可以得到较窄的粒径分布以及改善平均粒径，提高整体性能。通过反复过膜挤压0-20次，考察了过膜挤压对粒径分布(结果见图l)、包封率以及bFGF回收率(结果见图2)的影响结果表明，挤压前几次，脂质体容易被阻挡在薄膜外，导致包封率和bFGF回收率快速下降，在继续挤压后，bFGF的包封率和回收率明显回升。挤压后脂质体得到较窄的粒径分布。结果说明经过多次挤压后，脂质体由大变小并逐步通过薄膜，经过挤压10次后，脂质体全部被挤压出薄膜并得到较好的粒径分布。但是如果继续过膜挤压容易造成脂质体破裂，包封率将逐步下降。故挤压8-12次即可，IO次左右最佳。经过上述工艺优化，可得到一最佳的制备工艺按处方精确称取DOTAP、DOPE、MPLA置于茄形瓶中，加入氯仿甲醇=1:l的有机溶剂溶解，33'C真空旋转蒸发得脂质体膜，放入真空干燥箱常温真空干燥过夜，加入超纯水超声水化(200W，IO分钟)得空白脂质体溶液。将bFGF加入脂质体溶液，在液氮下速冻，4"C水浴下孵化1小时，连续冻融六次，再使用挤压法经过IO次O.45ym聚碳酸酯膜，得本发明bFGF脂质体复合物备用。试验例一本发明新型bFGF脂质体疫苗的动物免疫试验分组bFGF脂质体疫苗(LB)组，使用本发明bFGF脂质体复合物，bFGF剂量为20yg/次；bFGF加常规弗氏佐剂(FA)组，bFGF剂量为20yg/次；单独脂质体(L)组，剂量同LB组中所使用的脂质体剂量；PBS组，每次使用同LB组bFGF脂质体复合物相同体积的PBS。按上述分别免疫四组4周龄C57BL/6小鼠(每组七只)。每两周免疫一次，共免疫六次。每次免疫前尾静脉采血，分离血清，置于-2(TC保存。分别检测其诱导的体液免疫及细胞免疫效应。检测指标及方法体液免疫的测定通过ELISA法检测各组小鼠血清中的抗体滴度的产生情况。ELISA检测方法为将bFGF用包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释至5yg/ml，在96孔板中每孔加入100y1，4。C过夜。次日，弃去孔内溶液，PBST洗涤3次。用5%脱脂奶粉37。C封闭1小时，PBST洗涤3次。血清样品用5%脱脂奶粉稀释(1:100-1:12,800)，每孔加100yl稀释的血清样品，37。C孵育l小时。PBST洗涤5次。其后，每孔加入100ylHRP-Pr.A(l:3000稀释)，37。C孵育l小时。PBST洗涤5次。各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100yl，室温显色20分钟后，加入1NH2S04100yl终止反应，450nm波长读数。细胞免疫的检测方法采用体外培养淋巴细胞检测细胞因子——y-干扰素表达。具体如下，小鼠免疫后两周处死，取出脾脏。将脾脏放在200目尼龙网上研磨，培养基(DMEM+5%FBS+双抗生素)混悬，过尼龙毛柱，得到脾淋巴细胞，测定细胞密度，将细胞数稀释至2X107个。24孔板中每孔加入lml细胞液，再加入lml20yg/mlbFGF蛋白溶液，置于C02孵箱培养48小时，取细胞混悬液，2000Xg离心3分钟，收集上清液，用ELISA检测试剂盒测定IFN-Y的含量。各组的滴度检测结果见图3，PBS组、单独脂质体组无抗体产生，脂质体疫苗组(LB)较弗氏佐剂组(FA)提前2周产生抗体，随着免疫次数的增加，抗体滴度逐渐上升，最高可达到1:6400;而弗氏佐剂组在第三次免疫后即达到最高滴度水平(1:3200)，随着免疫次数的增加，抗体滴度水平也没有提高。各组IFN-y的表达水平见图4，结果表明IFN-y水平以脂质体疫苗组(LB)最高，也高于弗氏佐剂组(FA)，与PBS组和单独脂质体组相比存在显著性差异(P〈0.01)。IFN-y的表达说明机体通过免疫bFGF诱发了针对bFGF的细胞免疫过程。结果表明，本发明的bFGF脂质体疫苗中所用的脂质体佐剂配方能达到甚至超过国际通用的疫苗佐剂的金标准一弗氏佐剂的免疫效应，包括体液免疫和细胞免疫，是针对bFGF的优秀免疫佐剂。试验例二本发明新型bFGF脂质体疫苗的动物保护试验试验例一中的各组小鼠在最后一次免疫l周后，尾静脉接种lX1()5个Lewis肺癌细胞(LL/2)。接种肿瘤后四周处死小鼠并解剖，取出肺，称重。肺部外观比较结果显示，脂质体疫苗组(LB)及弗氏佐剂组(FA)的转移灶明显少于单纯脂质体组(L)和PBS组；小鼠肺部重量比较结果(见图5):LB组、FA组的肺重量与L组、PBS组相比有显著性差异(P《0.01)，LB组的肺重量小于FA组。结果表明，本发明的bFGF脂质体疫苗能有效抑制肿瘤的转移，效果好于用弗氏佐剂制备的bFGF疫苗。上述实例表明，使用本发明的新型bFGF脂质体疫苗的配方，包封率可达50%，粒径均一性好，bFGF活性保持良好，脂质体作为佐剂的免疫效果和抑制肿瘤转移的效果较好，优于使用弗氏佐剂的水平，并且安全性更好，可作为一种新型的抗肿瘤或其它与血管发生相关疾病的抗血管生成疫苗。本发明技术简单易行，可行性强，具有广阔的应用前景。以上的较优的具体实施方式是对本发明作进一步的举例说明，但并非对本发明范围的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种变形或改进，只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的精神及所附上的权利要求书定义的范围之内。权利要求1.一种阳离子脂质体，其特征在于由下述配比的成分制备而成含有DOPE和DOTAP，其摩尔比例为DOPE∶DOTAP＝2∶1～2，还含有重量百分比为0.1～1％的MPLA。2.根据权利要求l所述的阳离子脂质体，其特征在于由下述配比的成分制备而成所述的D0PE禾nD0TAP的摩尔比例为D0PE:D0TAP=2:1，所述MPLA的重量百分含量为O.51%。3.权利要求l所述的阳离子脂质体在制备免疫佐剂中的用途。4.一种bFGF脂质体复合物，其特征在于由权利要求12任一项所述的阳离子脂质体包裹bFGF制备而成。5.根据权利要求4所述的bFGF脂质体复合物，其特征在于所述的bFGF的用量为阳离子脂质体重量的310。/。。6.根据权利要求5所述的bFGF脂质体复合物，其特征在于所述的bFGF的用量为阳离子脂质体重量的59。/。。7.根据权利要求7所述的新型bFGF脂质体复合物，其特征在于所述的bFGF的用量为阳离子脂质体重量的78呢。8.根据权利要求8所述的新型bFGF脂质体复合物，其特征在于所述的bFGF的用量为阳离子脂质体重量的7.5呢。9.一种制备权利要求48任意一项所述的bFGF脂质体复合物的方法，其特征在于包括以下步骤a、称取DOPE、D0TAP、MPLA置于反应容器中，加入溶剂溶解，所述溶剂配方为氯仿甲醇=1:1;b、真空旋转蒸发得脂质体膜，干燥；c、在脂质体膜中加入超纯水进行超声水化得脂质体溶液；d、将bFGF加入脂质体溶液，进行冻融，即得。10.根据权利要求9所述的制备bFGF脂质体复合物的方法，其特征在于步骤d所述冻融条件为在液氮下速冻，4'C水浴下孵化1小时。11.根据权利要求9所述的制备bFGF脂质体复合物的方法，其特征在于还包括步骤e:将步骤d产物再冻融l5次。12.根据权利要求9、lO或ll任一项所述的制备bFGF脂质体复合物的方法，其特征在于还包括步骤f:将冻融产物挤压通过0.45ym聚碳酸酯膜812次。13.由权利要求912任一项所述的方法制备的bFGF脂质体复合物。14.权利要求48或13任意一项所述的bFGF脂质体复合物在制备肿瘤的抗血管生成治疗性疫苗和治疗血管生成相关疾病的疫苗中的应用。15.一种bFGF脂质体疫苗，是由权利要求48或13任意一项所述的bFGF脂质体复合物添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。全文摘要本发明属于生物医药领域，涉及一种碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)脂质体疫苗及其制备方法和用途。本发明所要解决的技术问题为提供一种性能良好的尤其适用于bFGF的脂质体佐剂。本发明脂质体由下述配比的成分制备而成DOPE∶DOTAP＝2∶1～2(摩尔比)，MPLA占0.1～1％(重量比)。本发明bFGF脂质体复合物可用于制备肿瘤的抗血管生成疫苗以及其他与血管生成相关的疾病疫苗，为bFGF新型疫苗的开发和应用提供了新的思路。文档编号A61P35/00GK101234089SQ20081030048公开日2008年8月6日申请日期2008年3月6日优先权日2008年3月6日发明者莉杨,霞赵,陈俐娟,魏于全申请人:四川大学