专利名称：：一种pH敏感型抗癌前药及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种pH敏感型抗癌前药及其制备方法和用途，属于医药化工领域。
背景技术：
：近年来，大分子靶向抗癌药物成为对淋巴转移的化疗药物研究的重点，这类偶联物具有较大的分子体积，在局部注射后，不能透过毛细血管非常狭窄的内皮间隙进入血液，而比较容易通过毛细淋巴管较宽的内皮间隙进入局部的引流淋巴结。另外，这类偶联物还可以通过被巨噬细胞吞噬的方式，带到局部淋巴结，在淋巴结内酶的作用下，被水解释放出活性物质(抗癌药物)，起到杀死淋巴结内转移癌细胞的作用。因而这类大分子载体靶向药物最适于淋巴癌转移的治疗。果胶常用作片剂、微球、微囊和脂质体等的衣层，制备滴丸与颗粒剂，包埋液体或固体药物，起到缓释作用和掩蔽药物的不适臭味，是天然的大分子多糖聚合物，广泛存在于植物的细胞壁中，是由a-(1—4)-D-吡喃半乳糖醛酸单位组成的酸性大分子多糖(HyunjoKim，etal.InternationalJournalofPharmaceutics,1998，161:149-159)，其分子由3个单位构成一螺旋状结构，其螺旋的节距为1.34nm。此外，其结构中还带有乙酰基和其他中性(多)糖支链，如鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖木糖等存在；果胶可通过增强单核巨噬细胞系统，激活巨噬细胞、T细胞和B细胞、NK细胞和补体系统，促进细胞因子分泌，增强红细胞免疫等提高宿主免疫功能；通过改变实体癌细胞膜的生长特性、影响实体癌细胞内信号传递途径、抗自由基作用、诱导分化与凋亡、抑制实体癌细胞的核酸与蛋白质合成、影响实体癌细胞超微结构、影响癌基因、抗突变作用、抑制实体癌血管形成而发挥直接的抗癌作用(中国中医药信息杂志，1999，5:64)。果胶在pH6—8的条件下是溶于水的，但是随pH降低，溶解度将减小。果胶一阿霉素偶联物适于制备淋巴靶向药物、肝靶向药物或肺靶向药物，但是若果胶一阿霉素偶联物在血液中(pH^7.4)循环时，还未到达癌实体已经释放阿霉素，则会引起毒副作用，同时降低阿霉素的治疗效果。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种pH敏感型抗癌前药，该抗癌前药在pH为46时溶解度最大，而在其它条件难溶，尤其在血液中(pH^7.4)循环时，由于溶解度小，在循环过程中几乎不释放阿霉素，从而毒副作用小。本发明的技术方案以生物相容性好的果胶为载体，直接通过共价键将阿霉素与果胶偶联，该共价键能被体内的酶逐渐水解而缓慢释放出抗癌药物。具体地说，它是通过化学键将阿霉素与分子量为7.l万40万(平均分子量15-30万，优选20万)的果胶偶联得到的偶联物，其中果胶、阿霉素的重量配比为果胶1份、阿霉素0.051份；该抗癌前药在pH为46时溶解度最大，而在pH小于3或大于7时几乎不溶。本发明所要解决的第二个技术问题是提供上述pH敏感型抗癌前药的制备方法，它是由果胶含水溶液与阿霉素含水溶液在pH6—8的条件下，加入脱水剂反应后透析、浓縮而得。其合成过程如下a、将分子量为7.l万40万的果胶溶于水，用氢氧化钠溶液调节为pH6—8，与阿霉素水溶液混匀后加入脱水剂，控温208(TC，搅拌324h;优选反应温度为5(TC，反应时间为8h;b、转移到透析袋，水透析，透析物浓縮至干即得。所述脱水剂为N，N—二环己基碳二亚胺(简称DCC)、N—环己基一N'—二甲胺丙基碳二亚胺(简称CDC)、l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称EDC'HC1)，优选EDC'HC1作为脱水剂。果胶为天然高分子，具有良好的生物相容性，其结构特点使它具备淋巴靶向特性，在局部注射以后，可以特异性地进入到注射部位周围的引流淋巴结，可以作为设计淋巴靶向性新药的载体使用。果胶在PH6—8的条件下是溶于水的，但是随着pH值降低，溶解度将减小。不同的制备方法或制备条件制备得到的果胶与阿霉素偶联物的对pH值的敏感性是不同的，发明人也制备出了水溶性的果胶一阿霉素偶联物(详见对比试验例)，其溶解度与果胶具有相同的趋势，随pH降低而迅速减小。本发明果胶一阿霉素偶联物的溶解度随着pH的降低先增大后减小，且在pH为5时溶解度最大，而在pH为7.4时溶解度非常小，pH为5时的溶解度是pH为7.4时的14倍。这表明注射该果胶一阿霉素偶联物后，在血液中(pH^7.4)循环时，由于溶解度小，在循环过程中几乎不释放阿霉素，从而毒副作用小。而当颗粒被细胞吞噬，进入溶酶体(pH^5)后，溶解度会增大，从而能够缓慢释放抗癌药物阿霉素，因此该偶联物具有良好的pH敏感性。本发明pH敏感型抗癌前药可以用于治疗和抑制肿瘤的淋巴转移、治疗肝癌或肺癌。可以通过局部注射给药或静脉给药，可以注射到在实体癌癌灶中，也可以注射到实体癌周围的引流淋巴结中，偶联物进入淋巴结后被巨嗜细胞吞噬，在淋巴结中酶的作用下水解释放出抗癌药物，用于治疗实体癌(例如乳腺癌、胃癌、食道癌、头颈部癌、宫颈癌、宫内膜癌、大肠癌等)及其引流淋巴结转移。本发明与现有技术比较有如下优点本发明合成的果胶一阿霉素偶联物具有pH敏感性，在pH为4-6，尤其pH为5的磷酸盐缓冲液中溶解度大大高于其它条件的溶解度，且在pH为5时的粒径小，分布较窄，能较好地被肿瘤细胞吞噬。图l本发明果胶一阿霉素偶联物和水溶性果胶一阿霉素偶联物在磷酸盐缓冲液中的溶解度參本发明果胶一阿霉素偶联物的溶解度■对比试验的果胶一阿霉素偶联物的溶解度图2本发明果胶一阿霉素偶联物在磷酸盐缓冲液中的释放情况图3本发明果胶一阿霉素偶联物在pH为3的磷酸盐缓冲液中的粒径分布图图4本发明果胶一阿霉素偶联物在pH为5的磷酸盐缓冲液中的粒径分布图图5本发明果胶一阿霉素偶联物在pH为7.4的磷酸盐缓冲液中的粒径分布图图6黑色素瘤肺转移模型小鼠生存时间曲线图(n=10)。令本发明果胶一阿霉素偶联物组；國盐酸阿霉素组；A对照组。具体实施例方式以下通过具体实施方式对本发明进一步描述，但不应理解为是对本发明的限定。本领域普通技术人员根据上述技术方案，还可以做出多种形式的修改、替换、变更。凡基于上述技术思想所作的修改、替换、变更均属于本发明的范围。下面通过实施例对本发明作进一步描述。实施例l本发明果胶一阿霉素偶联物的制备称取lg果胶(分子量7.l万40万，平均分分子量20万)，加入100ml水，果胶溶解后，用氢氧化钠溶液调节pH至6—8。将O.5g盐酸阿霉素溶解于100ml水，转移到果胶溶液中，控温在5(TC，搅拌30分钟。加入lgEDOHCl，控制温度在5(TC，搅拌反应6.5小时。到达所需时间后，转移到截留分子量为7000的透析袋，用二次水透析24小时，透析物浓縮至干，得到红色固体O.9g。实施例2本发明果胶一阿霉素偶联物的制备称取lg果胶(分子量7.l万40万，平均分分子量20万)，加入100ml水，果胶溶解后，用氢氧化钠溶液调节pH至6—8。将O.5g盐酸阿霉素溶解于100ml水，转移到果胶溶液中，控温在5(TC，搅拌30分钟。加入lgEDOHCl，控制温度在5(TC，搅拌反应8小时。到达所需时间后，转移到截留分子量为7000的透析袋，用二次水透析24小时，透析物浓縮至干，得到红色固体l.lg。实施例3本发明果胶一阿霉素偶联物的制备称取lg果胶(分子量7.l万40万，平均分分子量20万)，加入100ml水，果胶溶解后，用氢氧化钠溶液调节pH至6—8。将O.5g盐酸阿霉素溶解于100ml水，转移到果胶溶液中，控温在3(TC，搅拌30分钟。加入lgEDOHCl，控制温度在30。C，搅拌反应24小时。到达所需时间后，转移到截留分子量为7000的透析袋，用二次水透析24小时，透析物浓縮至干，得到红色固体lg。实施例4本发明果胶一阿霉素偶联物的制备称取lg果胶(分子量7.l万40万，平均分分子量20万)，加入100ml水，果胶溶解后，用氢氧化钠溶液调节pH至6—8。将O.5g盐酸阿霉素溶解于100ml水，转移到果胶溶液中，控温在40。C，搅拌30分钟。加入lgEDOHCl，控制温度在40。C，搅拌反应10小时。到达所需时间后，转移到截留分子量为7000的透析袋，用二次水透析24小时，透析物浓縮至干，得到红色固体O.8g。实施例5难溶性果胶一阿霉素偶联物的制备称取lg果胶(分子量7.l万40万，平均分分子量20万)，加入100ml水，果胶溶解后，用氢氧化钠溶液调节pH至6—8。将O.5g盐酸阿霉素溶解于100ml水，转移到果胶溶液中，控温在6(TC，搅拌30分钟。加入lgEDOHCl，控制温度在6(TC，搅拌反应5小时。到达所需时间后，转移到截留分子量为7000的透析袋，用二次水透析24小时，透析物浓縮至干，得到红色固体O.9g。实施例6本发明果胶一阿霉素偶联物的制备称取lg果胶(分子量7.l万40万，平均分分子量20万)，加入100ml水，果胶溶解后，用氢氧化钠溶液调节pH至6—8。将O.5g盐酸阿霉素溶解于100ml水，转移到果胶溶液中，控温在7(TC，搅拌30分钟。加入lgEDOHCl，控制温度在7(TC，搅拌反应6小时。到达所需时间后，转移到截留分子量为7000的透析袋，用二次水透析24小时，透析物浓縮至干，得到红色固体l.lg。对比实施例l水溶性果胶一阿霉素偶联物的制备称取lg果胶(分子量7.l万40万，平均分分子量20万)，加入100ml二甲基甲酰胺和水(体积比为l:1)的混合溶液，果胶溶解后，用氢氧化钠溶液调节pH至6—8，然后将0.5g盐酸阿霉素溶解于100ml二甲基甲酰胺和水(体积比为l:1)的混合溶液中，加入果胶溶液，控温在5(TC，搅拌30分钟。加入lgEEDQ，控制温度在5(TC，搅拌反应8小时。到达所需时间后，浓縮到约100ml，加入300ml乙醇，产生沉淀，离心。沉淀用水溶解，转移到截留分子量为7000的透析袋，用二次水透析24小时。透析袋内液浓縮后，真空干燥，得水溶性果胶一阿霉素偶联物0.9g。对比实施例2水溶性果胶一阿霉素偶联物的制备称取lg果胶(分子量7.l万40万，平均分分子量20万)，加入100ml二甲基甲酰胺和水(体积比为l:1)的混合溶液，果胶溶解后，用氢氧化钠溶液调节pH至6—8，然后将0.5g盐酸阿霉素溶解于100ml二甲基甲酰胺和水(体积比为l:1)的混合溶液中，加入果胶溶液，控温在7(TC，搅拌30分钟。加入lgEEDQ，控制温度在7(TC，搅拌反应6小时。到达所需时间后，浓縮到约100ml，加入300ml乙醇，产生沉淀，离心。沉淀用水溶解，转移到截留分子量为7000的透析袋，用二次水透析24小时。透析袋内液浓縮后，真空干燥，得水溶性果胶一阿霉素偶联物lg。对比实施例3水溶性果胶一阿霉素偶联物的制备称取lg果胶(分子量7.l万40万，平均分分子量20万)，加入100ml二甲基甲酰胺和水(体积比为l:1)的混合溶液，果胶溶解后，用氢氧化钠溶液调节pH至6—8，然后将0.5g盐酸阿霉素溶解于100ml二甲基甲酰胺和水(体积比为l:1)的混合溶液中，加入果胶溶液，控温在40。C，搅拌30分钟。加入lgEEDQ，控制温度在40。C，搅拌反应24小时。到达所需时间后，浓縮到约100ml，加入300ml乙醇，产生沉淀，离心。沉淀用水溶解，转移到截留分子量为7000的透析袋，用二次水透析24小时。透析袋内液浓縮后，真空干燥，得水溶性果胶一阿霉素偶联物0.8g。试验例l偶联物载药量的测定1、标准曲线的制备称取10mg盐酸阿霉素，溶解于100ml二次水中，分别移取l、2、3、4、5ml于10ml比色管中，用水稀释到刻度。得浓度分别为9.37、18.74、28.11、37.48、46.85yg/mL标准液，于480nm(紫外可见分光光度计光谱扫描确定)处测定吸光度。用浓度对吸光度作回归，得回归方程为A4.0174C-0.0028(R2=0.9927)2、本发明果胶一阿霉素溶液的制备及载药量的测定称取实施例2制备的难溶性果胶一阿霉素10mg，加入80mlpH二2的盐酸溶液，超声溶解，然后定容到100ml，在480nm测定吸光度，代入回归方程，经计算，载药量为19.8%。3、对比实施例果胶一阿霉素溶液的制备及载药量的测定称取对比实施例l制备的水溶性果胶一阿霉素10mg，加入80ml去离子水，超声溶解，然后定容到100ml，在480nm测定吸光度，代入回归方程，经计算，载药量为18.9%。试验例2果胶一阿霉素在不同pH磷酸盐缓冲液中的溶解度试验考査了实施例2制备的果胶-阿霉素偶联物和对比实施例l制备的果胶-阿霉素偶联物以及果胶在不同pH(3、4、5、6、7.4、8)的磷酸盐缓冲液中的溶解度。见图l。结果表明，本发明果胶一阿霉素偶联物的溶解度随着pH的降低先增大后减小，且在pH为5时溶解度最大，而在pH为7.4时溶解度非常小，pH为5时的溶解度是pH为7.4时的14倍。这表明注射该果胶一阿霉素偶联物后，在血液中(pH^7.4)循环时，由于溶解度小，在循环过程中几乎不释放阿霉素，从而毒副作用小。而当颗粒被细胞吞噬，进入溶酶体(pH^5)后，溶解度会增大，从而能够缓慢释放抗癌药物阿霉素，因此该偶联物具有良好的pH敏感性。对于对比实施例的水溶性果胶-阿霉素偶联物，其在磷酸盐缓冲液中的溶解度则随pH降低而迅速减小。试验例3果胶一阿霉素在不同pH磷酸盐缓冲液中的释放试验考査了实施例2制备的果胶-阿霉素偶联物和对比实施例l制备的果胶-阿霉素偶联物在pH为3、5和7.4的磷酸盐缓冲液中的释放情况。结果表明，对比实施例l制备的果胶-阿霉素在三种pH的磷酸盐缓冲液中均没有释放出阿霉素，而实施例2制备的果胶-阿霉素随着pH值降低，相同时间内释放阿霉素的量增大，见图2试验例4测定果胶一阿霉素在不同pH磷酸盐缓冲液中的粒径取20mg实施例2制备的果胶一阿霉素偶联物，分别置于10mlpH为3、5和7.4的磷酸盐缓冲液中，搅拌5小时，2000rpm离心15min，取上清液用纳米粒度仪测定粒径。结果表明在pH为3的磷酸盐缓冲液中，果胶一阿霉素粒径主要分布在3091—5560nm之间；在pH为5的磷酸盐缓冲液中，果胶一阿霉素粒径主要分布在342—458nm之间；在pH为7.4的磷酸盐缓冲液中，果胶一阿霉素粒径主要分布在396—825nm之间。因此，该偶联物的粒径也具有pH敏感性。本发明果胶一阿霉素偶联物在pH为3、5和7.4的磷酸盐缓冲液中粒径分布图见图3、4、5。试验例5本发明果胶-阿霉素偶联物全身给药后在小鼠体内的分布试验1、受试药物a、称取21.4mg盐酸阿霉素，溶解于10ml生理盐水中，得到含阿霉素2mg/ml的注射剂。b、称取实施例2的果胶一阿霉素101mg(相当于含阿霉素20mg)，加入100mg泊洛沙姆188，混匀后，加入几滴O.5%的羧甲基纤维素钠溶液，用研铂研磨60min，转移到10ml的容量瓶，用0.5%的羧甲基纤维素钠溶液定容，得到阿霉素浓度为2mg/ml的混悬注射剂。c、称取对比实施例l制备的果胶一阿霉素106mg(相当于含阿霉素20mg)，用生理盐水溶解，定容到10ml，得到含阿霉素2mg/ml的注射剂。所有注射剂在做动物实验之前用Y—射线灭菌。2、动物昆明种小鼠，雌雄各半，体重1822g，购自四川大学华西医学院动物中心。3、方法3.1给药方法选取50只小鼠，随机分为5组，每组10只。分别给予尾静脉注射a、b、c和生理盐水0.lml/只。3.2样品采集及处理给药后2小时摘除眼球取血，处死小鼠。取适量的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏组织用匀浆液(含O.3mol/L盐酸的60。/。乙醇)按重量体积比l:9配成组织匀浆液。匀浆后3000rpm离心10min。取O.lml上清液进行荧光检测。血样3000rpm离心10min。取O.lml上清液进行荧光检测。4、结果不同组织样品中阿霉素的荧光光度值见表l。表1给药后2小吋不同组织样品中阿霍素的荧光光度值(n=10〕<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注a.阿霉素生理盐水组；b.本发明果胶-阿霉素生理盐水；bl本发明果胶-阿霉素混悬注射剂组；C.对比实施例的水溶性果胶-阿霉素组；d.生理盐水组。5、结论不同阿霉素制剂在小鼠体内的分布不尽相同。本发明果胶-阿霉素和对比实施例的难溶性果胶-阿霉素都有在肝脏和肺脏中富集的趋势，随制剂不同有所区别，但都明显高于血液中的浓度。说明果胶-阿霉素具有一定的趋肝性和肺靶向性。试验例6本发明果胶-阿霉素抗小鼠肺转移瘤和肺癌的实验研究1.主要材料取用试验例5中的盐酸阿霉素注射剂和本发明果胶一阿霉素注射剂。2.动物和细胞株C57BL/6J小鼠，雌性，1822g，46周龄，购自四川大学实验动物中心。小鼠Lewis肺癌细胞系(LL/2)，购于ATCC(AmericanTypeCultureCollection)，本实验室保种。3.肺癌模型制备与治疗肺癌模型制备收集对数生长期的LL/2细胞，1500rpm离心3min，细胞沉淀用无血清、无抗生素的培养基洗涤l次，计数细胞数量后用无血清、无抗生素培养基调整细胞浓度为lX107/ml。每只小鼠于尾静脉注射1X1()6个(0.1ml)肿瘤细胞，种瘤后3天开始治疗。治疗分三组，对照组(生理盐水)、阿霉素组(剂量10mg/kg)、难溶性果胶-阿霉素组(相当于阿霉素剂量10mg/kg)，尾静脉注射，注射体积100ml，每5天1次，共34次。4.结果不同药物对肺癌荷瘤小鼠生存时间的影响见图6;各组药物对肺癌荷瘤小鼠肺部转移节结数多少的影响见表2。表2不同药物对肺癌荷瘤小鼠肺部转移节结数多少的影响〔n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>总之，本发明果胶一阿霉素和盐酸阿霉素组与对照组相比均可延长肺癌荷瘤小鼠的生存时间，抑制癌节结在肺部的生长。本发明果胶一阿霉素效果更为明显。权利要求权利要求1一种pH敏感型抗癌前药，其特征在于它是通过化学键将阿霉素与分子量为7.1万～40万的果胶偶联得到的偶联物，其中果胶、阿霉素的重量配比为果胶1份、阿霉素0.05～1份。2根据权利要求l所述的pH敏感型抗癌前药，其特征在于它是由果胶水溶液与阿霉素水溶液在pH6—8的条件下，加入脱水剂反应后透析、浓縮而得。3pH敏感型抗癌前药的制备方法，其特征在于其合成过程如下a、将分子量为7.l万40万的果胶溶于水，调节为pH6—8，与阿霉素水溶液混匀后加入脱水剂，控温2080。C，搅拌324h;b、转移到透析袋，用二次水透析，透析物浓縮至干即得。4根据权利要求3所述的制备pH敏感型抗癌前药的方法，其特征在于:所述脱水剂为N，N—二环己基碳二亚胺、N—环己基一N'—二甲胺丙基碳二亚胺或l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。5根据权利要求3所述的制备pH敏感型抗癌前药的方法，其特征在于:反应温度为5(TC，反应时间为8h。6权利要求l或2所述pH敏感型抗癌前药在制备治疗癌症的药物中的用途。7权利要求l或2所述pH敏感型抗癌前药在制备治疗肺癌的药物中的用途。8pH敏感型抗癌药物制剂，其特征在于它是由权利要求1或2所述的pH敏感型抗癌前药加入药学上可接受的辅助性成分制备而成。9根据权利要求8所述的pH敏感型抗癌药物制剂，其特征在于所述抗癌药物制剂是局部注射给药或静脉给药制剂。全文摘要本发明涉及一种pH敏感型抗癌前药及其制备方法和用途，属于医药化工领域。本发明所要解决的技术问题是提供一种pH敏感型抗癌前药，该抗癌前药在pH为4～6时溶解度最大，而在pH小于3或大于7时几乎不溶，尤其在血液中(pH≈7.4)循环时，由于溶解度小，在循环过程中几乎不释放阿霉素，从而毒副作用小。本发明pH敏感型抗癌前药是通过化学键将阿霉素与分子量为7.1万～40万的果胶偶联得到的偶联物。它是由果胶水溶液与阿霉素水溶液在pH6-8的条件下，加入脱水剂反应后透析、浓缩而得。文档编号A61P35/00GK101433723SQ20081030646公开日2009年5月20日申请日期2008年12月23日优先权日2008年12月23日发明者唐小海,鑫宋,谢永美,宇邱申请人:重庆莱美药业股份有限公司