包含nkt活化剂、cd40激动剂和任选的抗原的佐剂组合,及其诱导细胞免疫协同增强的用途的制作方法

专利名称：包含nkt活化剂、cd40激动剂和任选的抗原的佐剂组合,及其诱导细胞免疫协同增强的用途的制作方法
技术领域：
本发明总体上来说涉及协同佐剂组合，其上调免疫细胞表达CD70和促进抗原特 异性细胞免疫。更特别地，本发明涉及具体的协同组合，包括自然杀伤T细胞(NKT)活化剂， 例如a -半乳糖苷神经酰胺(a -Gal-Cer)或iGb3，和CD40激动剂，例如拮抗性抗CD40抗 体或CD40L多肽或缀合物，和进一步任选地，包括靶抗原。更进一步本发明还提供了新的免 疫疗法，包括给予这种协同佐剂组合或蛋白缀合物以提高抗原特异性细胞免疫，即CD8+免 疫。具体地说，也教导了包含这些佐剂组合和/或多肽缀合物的组合物作为免疫佐剂用于 治疗各种慢性疾病，包括癌症、传染病、自身免疫病、过敏性或炎症性疾病的用途。
背景技术：
身体抗微生物的防御系统以及身体抵抗其他慢性疾病例如影响细胞增殖的疾病 的防御物是通过先天免疫系统的早期反应和适应性免疫系统的迟发反应介导的。先天免疫 包括识别例如是微生物病原体特征性的结构的机制和在哺乳动物细胞中不存在的机制。这 种结构的实例包括细菌脂多糖(LPS)、病毒双链DNA、和非甲基化CpG DNA核苷酸。先天免 疫反应系统的效应细胞包括中性白细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)。除先天免疫 之外，脊椎动物，包括哺乳动物，具有进化的免疫防御系统，其通过接触传染物而被剌激，和 每次连续接触特定抗原，幅度和有效性增加。由于它适应特异性感染或抗原损害的能力，这 个免疫防御机制已被描述为适应性免疫。有两种类型的适应性免疫反应，称为体液免疫，包 括B淋巴细胞产生的抗体，和细胞免疫，由T淋巴细胞介导。 已经描述过两种类型的主要T淋巴细胞，CD8+细胞毒性淋巴细胞(CTLs)和CD4辅 助细胞(Th细胞)。CD8+T细胞是效应细胞，通过T细胞受体(TCR)识别由I类MHC分子呈 递的例如感染病毒或细菌的细胞上的外来抗原。识别外来抗原时，CD8+细胞经历活化、成熟 和增殖过程。这个分化过程产生CTL克隆，其具有破坏显示外来抗原的靶细胞的能力。另 一方面T辅助细胞参与在体液和细胞介导的两种效应免疫反应形式中。至于体液或抗体免 疫反应，B淋巴细胞通过与Th细胞相互作用而产生抗体。具体地说，细胞外抗原，例如循环 微生物被特异性抗原呈递细胞(APCs)接受、加工、并与II类主要组织相容性复合体(MHC) 分子结合而呈递给CD4+Th细胞。随后这些Th细胞激活B淋巴细胞，引起抗体产生。相反， 细胞介导的或细胞的免疫反应，发挥作用中和定居在细胞内位置的微生物，例如靶细胞成 功感染后。外来抗原，例如微生物抗原，在感染细胞内合成并与I类MHC分子结合重置于这 种细胞表面上。这种表位的呈递引起上述CD8+CTLs受剌激，随后被CD4+Th细胞剌激也是 这个过程。Th细胞由至少两个不同的亚群，称为为Thl和Th2细胞组成。Thl和Th2亚型 代表Th细胞两极分化的群，它们在接触抗原后从共同的前体分化出。 每个T辅助细胞亚型分泌细胞因子，细胞因子促进彼此相反的不同免疫效果并交 叉调节彼此的扩展和作用。Thl细胞分泌大量细胞因子，例如干扰素(IFN) Y、肿瘤坏死因 子-a (TNF-a)、白介素-2(IL-2)和IL-12,和少量IL_4。 Thl结合细胞因子促进CD8+细胞毒性T细胞(CTL)活性和最常伴发细胞介导的抗细胞内病原体的免疫反应。相反，Th2 细胞分泌大量细胞因子，例如IL-4、 IL-13和IL-10，而分泌少量IFN-y ，并促进抗体反应。 Th2反应与体液反应特别相关，例如保护不受炭疽病的损害和消除蠕虫感染。
所产生的免疫反应是Thl还是Th2驱动的很大程度上取决于所涉及的病原体和细 胞环境中的因素，例如细胞因子。不能激活T辅助反应，或正确的T辅助亚类，不仅可导致不 能产生足够的反应来对抗特定病原体，而且对于抗再感染产生的免疫力也低。很多传染物 是细胞内病原体，其中预期细胞介导的反应，以Thl免疫举例说明，将在保护和/或治疗中 起重要作用。此外，对于很多这些感染，已经表明诱导不适当的Th2反应消极地影响疾病后 果。实例包括结核分枝杆菌、曼氏血吸虫(S.mansoni)，以及起反作用的Th2样占优势的免 疫反应。瘤型麻风(L印romatous l印rosy)看来特征是流行但不适当的Th2样反应。HIV 感染代表另一个实例。在那里，已经提示Thl样细胞与其他Th细胞群的比值降低可能在疾 病症状进展中起着决定性作用。 作为抗传染物的保护措施，已经开展了保护不受一些微生物损害的接种疫苗方
案。抗传染性病原体的接种疫苗方案常常受到疫苗免疫原性低、反应类型不适当(抗体对
细胞免疫)、缺乏引发长期免疫记忆能力和/或不能产生抗不同血清型给定病原体的免疫
的阻碍。目前接种疫苗策略的目标是引发对给定血清型和很多普通病原体特异性的抗体，
例如病毒血清型或病原体。应当致力于复发基础以监测全世界流行哪个血清型。这样的一
个实例是每年监测出现的预期是主要传染性菌株的流行性感冒A血清型。 为支持接种疫苗方案，已经进一步开发了支持抗特异性传染病的免疫反应产生的
佐剂。例如，铝盐已被用作相对安全和有效的疫苗佐剂以增强对某些病原体的抗体反应。这
种佐剂的一个缺点是它们剌激细胞介导免疫反应的效率相对低，和产生大部分偏向于Th2
的免疫反应。 现在普遍认可保护性免疫的产生不仅取决于接触抗原，而且取决于抗原遇到的环 境。存在很多实例，其中新抗原引入非炎性环境中的宿主，产生免疫耐受性而不是长期免 疫，而在炎性物质(佐剂)存在下接触抗原却诱导免疫。(Mondino et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. ，USA 93 :2245(1996) ;Pulendran et al. ，J.Exp.Med. 188 :2075(1998) ;Jenkins et al. ， Immunity 1 :443(1994) ;andKea潔y et al. ， Immunity 1 :327(1994))。
已知调节适应性免疫的天然存在分子是CD40。 CD40是TNF受体亚家族的成员， 是细胞介导的免疫反应系列必需的，并是T细胞依赖性体液免疫的发展所需的(Aruffo et al. ， Cell 72 :291 (1993) ;Farrington et al. ， Proc Natl Acad Sci. ， USA 91 : 1099(1994) ;Renshaw et al. ， J Exp Med 180:1889(1994))。在其自然作用中，CD4+T细 胞上表达的CD40配体与DCs或B细胞上表达的CD40相互作用，促使APC激活增加，和伴 随T细胞进一步活化(Liu et al Seminl匪nol 9:235(1994) ;Bishop et al. ， Cytokine Growth Factor Revl4 :297(2003))。对于DCs, CD40结合体典型地通过TLRs引起类似于 剌激的反应，例如活化标记上调和产生炎性细胞因子(Quezada et al. A皿u Rev Immunol 22:307(2004) ;0' Sullivan B and Thomas R CritRev Immunol 22:83(2003))。研究证 明了它在CD8反应中的重要性，该研究表明APCs通过CD40受到剌激援救了缺乏CD4细胞 时CD4依赖性CD8+T细胞反应(Lefrancois et al. ， J Immunol. 164 :725(2000) ;Bennett et al.，Nature 393:478(1998) ;Ridge et al. ，Nature393 :474(1998) ;Schoenberger etal. ，Nature 393:474(1998)。这些发现引发了很多推测，在一些疾病环境下，单独CD40激 动剂可以潜在援救失败的CD8+T细胞反应。 然而其他研究已证明单独CD40剌激不足以促进长期免疫。在一些模型系统中， 单独抗CD40治疗不足以促进长期免疫。在一些模型系统中，单独抗CD40治疗可以引起无 效炎性细胞因子产生、抗原特异性T细胞缺失(Mauri et al. Nat Med 6:673(2001) ;Kedl etal.Proc Natl Acad Sci. ，USA 98 :10811(2001))和B细胞反应终止(Erickson et al.， J Clin Invest 109:613(2002))。同样，可溶三聚CD40配体已经在临床上用作CD40途径 的激动剂，和如此少的报道与单独CD40剌激不能重新建立长期CD8+T细胞免疫的所有必要 信号的结论相一致(Vonderheide et al. ， J Clin Oncol 19:3280(2001))。
不同团体已经报道了各种激动性抗体。例如，已报道一个mAb CD40.4(5c3) (PharMingen， San Diego California)使CD40和CD40L之间活化增加大约30-40 % 。 (Schlossman et al. ， LeukocyteTyping， 1995， 1 :547-556)。同样，美国专利号6， 843， 989 中的Seattle遗传学宣称提供了使用激动性抗人CD40抗体治疗人类癌症的方法。声称它 们的抗体传递剌激信号，该信号使CD40和CD40L的交互作用增强至少45%，和增强CD40L 介导的剌激，具有体内致瘤活性。它们从S2C6获得了这个抗体——激动性抗人CD40抗体， 以前表明它给B淋巴细胞传递强烈的促生长信号(Paulie et al. ， 1989， J. Immunol. 142 : 590-595)。 由于CD40在先天和适应性免疫反应中的活性，已经探究了各种CD40激动剂用作 疫苗佐剂和期望在细胞免疫增强的治疗中。最近，据证实抗原结合一些TLR激动剂和抗 CD40治疗免疫(TLR/CD40激动剂组合免疫)诱导强力CD8+T细胞扩充，引出比两种激动剂 任何一种单独免疫高10-20倍的反应(Ahonen et al.，J Exp Med 199:775(2004))。这首 次证明了在没有感染病毒或微生物物质时，可以产生强力CD8+T细胞反应。TLR/CD40激动 剂组合免疫引出抗原特异性CD8+T细胞证明细胞溶解功能、y干扰素产生和对抗原挑战的 继发反应增强。用TLR1/6、2/6、3、4、5、7和9激动剂已经表明抗CD40在诱导CD8+T细胞扩 充中的协同活性。这提示TLR/CD40激动剂组合免疫可以重新建立引发深入获得性细胞免 疫所需的所有信号。 众所周知NKT细胞是免疫调节T淋巴细胞，其表达受非多态性CDld抗原呈递分子 限制的T细胞受体。NKT细胞识别CDld呈递糖脂——a -半乳糖苷神经酰胺(a -Gal-Cer)。 一识别a -631-[61~，服1细胞就变活化并产生细胞因子，包括1卜4、1卜10、1卜13和1 ^ Y ， 和照这样，它们可以通过促进免疫调节细胞因子分泌而上调或下调免疫反应。缺乏NKT细 胞的小鼠对细菌感染更敏感和对一些肿瘤具有抗性，证明NKT细胞在宿主防御中的重要作 用。还表明了 a-Gal-Cer给予小鼠，NKT细胞活化，作为单一治疗，可以增强对肿瘤的免 疫，获得了有限的成功(Matsuyoshi， H. ， S. Hirata， Y. Yoshitake， Y. Motomura， D. Fuk丽， A. Kurisaki， T. Nakatsura， Y. Nishimura， and S. Senju. 2005. Therapeutic effect o falpha-galactosylcer咖ide-loaded dendriti ccells geneticallyengineered to express S1X/C(X21 along with tumor antigenagainst peritoneally disseminated tumor cells. Cancer Sci. 96 :889-896 ;Crowe， N. Y. ， J. M. Coquet, S. P. Berzins， K. Kyparissoudis， R. Keating, D. G. Pellicci， Y. Hayakawa， D. I. Godfrey, and M. J. Smyth. 2005. Differential antitumor immunitymediated by NKT cell subsetsin vivo. J. Exp. Med. 202 :1279-1288 ;Smyth， M. J. ， N. Y. Crowe， Y. Hayakawa， K. Takeda， H. Yagita， and D. I. Godfrey. 2002. NKT cells-conductors of tumor immunity Curr. Opin. Immunol. 14 :165-171)。 为了增加例如接种疫苗方案中或微生物感染过程中适应性免疫反应的有效性，因 此开发新的更有效的疫苗佐剂很重要。本发明满足了这个需要并且也提供了其他优点。以 前，本发明人报道了新的协同佐剂，包含toll样受体(TLR)激动剂和CD40激动剂组合。 这些激动剂组合引发细胞免疫的协同效应。2004年7月22日公开的美国公开专利申请 US20040141950中公开了这些协同佐剂及其预防和治疗用途，该专利申请的全部内容引入 这里作为参考。本发明涉及另一个协同佐剂组合的发现及其作为治疗或预防性免疫增强组 合的用途。
发明概述 本发明涉及协同免疫佐剂，包括以下的组合(i)至少一种NKT活化剂，例如 a _半乳糖苷神经酰胺(a -GalCer)或iGb3 ;和(ii)至少一种CD40激动剂例如CD40激动 性抗体或其片段，或CD40L多肽例如单聚或多聚(三聚)CD40L蛋白、CD40L蛋白片段或含 有CD40L的缀合物和(iii)任选地，抗原，期望引出针对该抗原的细胞免疫反应。本发明进 一步涉及这种组合作为免疫佐剂和治疗期望增强T细胞免疫的病情的用途。
如下面详细描述，可以将这些免疫组合给予需要这种治疗的宿主，通过(i)诱导 比仅仅给予CD40激动剂或NKT活化剂更高频数的抗原特异性CD8+T细胞；(ii)诱导比仅 仅给予CD40激动剂或NKT活化剂更大量的抗原特异性CD8+T细胞；和(iii)相对于仅仅给 予CD40激动剂或NKT活化剂，肿瘤免疫力增强。 这些任选地可以进一步包含抗原的免疫佐剂组合可以用于治疗任何疾病或病情， 其中上面确定的细胞免疫反应增强是治疗期望的，尤其是传染病，增殖性紊乱例如癌症、过 敏、自身免疫紊乱、炎性紊乱，和其他慢性疾病，其中细胞免疫增强是期望的治疗结果。本发 明的优选应用特别包括治疗慢性疾病，例如癌症。
附图简述

图1含实验，其中显示了抗CD40和a -GalCer组合给药的效应和这种给药在体内 协同增强抗原特异性T细胞的扩充。 图2含实验，其中量化了作为用抗CD40和a-GalCer组合免疫的结果的免疫反 应。 图3含实验，其中在用黑素瘤细胞免疫的小鼠中表明CD40/TLlf接种疫苗治疗性 干扰全身黑素瘤。 图4含实验，其中表明抗CD40和a -GalCer给药在体内诱导在DCs上表达CD70。 (在这个实验中，给小鼠注射下列组合2ug a -GalCer、50ug polyIC和/或50ug抗CD40腹 膜内。在注射后18-20小时，取出脾)。 图5含实验，其中表明a -GalCer/CD40免疫引发强力CD8+T细胞反应，该反应是 STAT4、 IFNy和IFNab非依赖性的，但是STAT1和T-bet非依赖性的。发明详述 本发明涉及协同免疫佐剂组合的用途，该组合包含协同有效量的(i)至少一种自 然杀伤T细胞(NKT)活性剂例如a -半乳糖苷神经酰胺(a -GalCer)或另一种NKT细胞活 性剂；(ii)至少一种CD40激动剂和(ii)任选地，至少一种抗原。这些佐剂可以用于(i)扩 充抗原特异性效应CD8 T细胞和/或(ii)增强免疫反应。基于以上这些协同佐剂可以预 防性和治疗性用于治疗具有下述病情的受试者，其中期望增强细胞免疫，例如癌症及其他 增殖性紊乱、病毒及其他感染、自身免疫病、炎性疾病和过敏性紊乱。特别是，本主题协同佐 剂可以用作疫苗佐剂。因此这种疫苗佐剂的基本成分将是NKT细胞活化剂、CD40激动剂和 如果批准，添加肿瘤或传染病抗原。这种发明将对任何情况有用，该情况下想要增强免疫反 应，像癌症或传染病，或改变免疫反应，像在自身免疫病中。 更具体地说，本发明提供了新的协同激动性组合，包含NKT活化剂，例如a -半乳
糖苷神经酰胺(a -Gal-Cer)或iGb3和CD40激动剂(例如CD40L蛋白或片段或衍生物或
其多聚体，或结合CD40，优选人类CD40的激动性抗体或抗体片段)和任选的抗原。当这些
佐剂组合给予宿主，优选人类时，可以用于产生增强的抗原特异性细胞免疫反应。 在优选实施方案中，NKT活化剂是a-半乳糖苷神经酰胺(a-Gal-Cer)、
isoglobotrihexosylceramide(iGb3)或可以剌激NKT的任何其他分子，例如CDld抗原呈递
分子呈递的其他糖脂。 本发明还提供了使用所述协同佐剂组合和含有其的载体给予宿主的方法，其中在 宿主中期望引发抗原特异性免疫反应，例如有慢性疾病的人，例如癌症或传染性或过敏性 紊乱。 更进一步，本发明还提供了包含所述新的协同NKT活化剂/CD40激动剂组合的组 合物，其适于给予宿主以便引发增强的抗原特异性细胞免疫反应。 特别地，本发明提供了新的免疫疗法，包括将所述新的协同佐剂组合给予需要这 种治疗的宿主以便引发增强的抗原特异性细胞免疫反应。在优选实施方案中，这些组合物 和缀合物将给予受试者，该受试者患有癌症，感染，尤其是慢性传染病，例如涉及病毒、细菌 或寄生虫；或自身免疫病、炎性或过敏性病情，或存在发展为这些疾病的风险。特别地，在优 选实施方案中，本发明可以用于引发抗黑素瘤的抗原特异性细胞免疫反应。
因此，本发明开发了强效疫苗，对抗癌症和其他增殖性疾病，例如自身免疫疾病， 过敏性紊乱，和炎性疾病以及慢性传染病，涉及病毒、细菌、真菌或寄生虫，其中有效的治疗 需要NKT活化剂/CD40激动剂组合免疫能够产生的细胞免疫的数量和质量。
发明应用 本发明提供了新的佐剂组合，包含至少一种NKT活化剂、至少一种CD40激动剂和 任选的抗原。本发明包括任何抗原与本主题NKT活化剂和CD40激动剂结合使用，治疗上期 望针对该抗原的细胞免疫反应增强。在一些实施方案中，该抗原可以与NKT活化剂分开给 予，或宿主可以是自然接触该抗原。在一些实施方案中，全部三个部分，即CD40激动剂例如 抗CD40抗体，NKT活化剂和抗原，可以同时给予。另外，在一些实施方案中，全部三个部分， 即CD40激动剂例如抗CD40抗体，NKT活化剂和抗原，可以以分开的分离实体共同给予。为 了达到期望的细胞免疫协同增强，优选所有这些部分基本上同时给予。这些部分可以以任何顺序给予。 示例性抗原包括但不限于细菌、病毒、寄生虫、过敏原、自身抗原和肿瘤相关抗原。 特别地，该抗原可以包括蛋白抗原、肽、完整灭活生物体等等。 可以用在本发明中的抗原的具体实例包括来自以下的抗原甲型、乙型、丙型或 丁型肝炎、流感病毒、李斯特氏菌属(Listeria)、肉毒杆菌(Clostridium botuli皿m)、肺 结核、兔热病、重型天花(天花)、病毒性出血热、鼠疫耶尔森氏菌(温疫(plague))、HIV、 疱疹、乳头状瘤病毒，和与传染物相关的其他抗原。其他抗原包括与肿瘤细胞相关的抗 原，与自身免疫病情、过敏和哮喘相关的抗原。这种抗原连同本主题激动剂组合鞭毛蛋白 (Flagellin)和抗CD40抗体一起给予可以用在治疗或预防性疫苗中提供抗这种病情的免 疫。 在一些实施方案中，该方法和组合物可用于治疗存在感染风险或患有包括来自传
染物的抗原引起的感染的个体。感染是指可归因于宿主中存在外来生物体或在宿主内复制
的物质的疾病或病情。存在感染风险的受试者是倾向于发展为感染的受试者。这种个体可
以包括例如已知或怀疑接触传染性生物体或物质的受试者。存在感染风险的受试者还可以
包括与对传染物或生物体产生免疫反应的能力受损相关的病情的受试者，例如先天性或获
得性免疫缺陷的受试者、经历放疗或化疗的受试者、烧伤损害的受试者、外伤性损伤的受试
者、进行手术的受试者或其他侵入医学或牙科步骤，或类似的免疫能力受损的个体。 可以用本发明的疫苗组合物治疗或预防的感染包括细菌、病毒、真菌和寄生虫。其
他不太普遍类型的感染还包括立克次体、支原体和引起羊痒病的物质、牛海绵状脑病(BSE)
和阮病毒病(例如kuru和早老痴呆症(Creutzfeldt-Jacob disease))。感染人类的细菌、
病毒、真菌和寄生虫的实例是众所周知的。感染可以是急性的、亚急性的、慢性的或潜伏性
的，和也可以是局部的或全身性的。此外，在宿主中传染性生物体的物质的生活史的至少一
个时期期间，感染可以主要是细胞内的或细胞外的。 可以使用本主题疫苗和方法进行对抗的细菌感染包括革兰氏阴性和革兰氏阳性 细菌。革兰氏阳性细菌的实例包括但不限于巴斯德氏菌属种、葡萄球菌属种和链球菌属种。 革兰氏阴性细菌的实例包括但不限于大肠杆菌、假单胞细菌属种和沙门氏菌属种。感染菌 的具体实例包括但不限于幽门螺旋杆菌、布氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、嗜肺军团 菌(Legionella pneumophilia)、分枝杆菌禾中(例如结核分枝杆菌(M. tuberculosis)、鸟 分枝杆菌(M. avium)、胞内分枝杆菌(M. intracellilare)、堪萨斯分枝杆菌(M. kansaii)、 登氏分枝杆菌(M. gordonae))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、淋球菌 (Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、单核细胞增 生李斯特氏菌(Listeriamonocytogeners)、化月农性链球菌(Streptococcus pyogenes)、 (A组链球菌属)、无乳链球菌(无乳链球菌)(B组链球菌)、链球菌属(Str印tococcus) (viridans组)、类链球菌(Str印tococcusfaecalis)、牛链球菌(streptococcus bovis)、 链球菌属(Streptococcus) (aenorobic禾中)、月市炎链球菌(Str印tococcuspneumoniae)、 至文病性弯曲杆菌(pathogenic Campylobacter)禾中、肠球菌属(Enterococcus)、流 感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、白喉杆 菌(Corynebacteriumdiptheriae)、棒杆菌属(Corynebacterium)、猪红斑丹毒丝 菌(Erysipelothrix rhusiopathie)、 产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、石皮伤风杆菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、克雷 白氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)、多杀巴其jf德氏菌(Pasteurella multocida)、 拟杆菌属(Bacteroides)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌 (Str印tobacillus moniliformis)、苍白密螺旋体(Tr印o固apallidum)、雅司螺旋体 (Tr印o固a perte騰)、钩端螺旋体(L印tospira)、立克次体(Rickettsia)禾口衣氏放线菌 (Actinomycesisraelii)。 引起人类感染的病毒的实例包括但不限于逆转录病毒科(例如人缺陷病毒，例 如HIV-1 (也称为HTLV-III) 、 HIV-II、 LAC或IDLV-III/LAV或HIV-III和其他分离株例 如HIV-LP)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎、肠 道病毒、人类柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)、杯状病毒科(Calciviridae)(例如引起胃 肠炎的菌株)、披膜病毒科(Togaviridae)(例如马脑脊髓炎病毒、风疹病毒)、黄病毒科 (Flaviviridae)(例如登革热病毒、脑炎病毒、黄热病毒)、冠状病毒科(例如冠状病毒)、 弹状病毒禾斗(Rhabdoviridae)(例如vesicular stomata病毒、狂犬病病毒)、丝状病毒 科(Filoviridae)(例如埃博拉(ebola)病毒)、副粘病毒科(例如副流感病毒、腮腺炎 病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流感病毒)、 布尼亚病毒科(B皿gaviridae)(例如汉坦病毒(Hataan virus) 、 b皿ga病毒、白蛉病毒 (phleoboviruses)禾口 Nairo病毒)、砂粒病毒禾斗(Arenaviridae)(出血热病毒)、呼肠孤病 毒科(Reoviridae)(例如呼肠孤病毒、环状病毒、轮状病毒)、传染性法氏囊病毒属双RNA病 毒科(Bimaviridae)、肝去氧核糖核酸病毒科(H印adnaviridae)(乙型肝炎病毒)、细小病 毒科(Parvoviridae)(细小病毒)、乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头状瘤病毒、多瘤病 毒)、腺病毒科(Adenoviridae)(腺病毒)、疱疹病毒科(Herpeviridae)(例如单纯疱疹病 毒(HSV)I和11、水痘带状疱疹病毒、痘病毒)和虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如非洲猪 瘟病毒)和未分类病毒(例如海绵状脑病的致病物、丁型肝炎的致病物、非甲非乙型肝炎的 致病物(l类肠道传播的；2类肠胃外传播的，例如丙型肝炎)；诺沃克(Norwalk)和相关的 病毒和星状病毒。 真菌的实例包括曲霉(Aspergillus spp.)、粗球孢子菌(Coccidoides immitis)、 新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、白色念珠菌(Candida albicans)及其他 念珠菌(Candida spp.)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、荚膜组织胞桨菌 (Histoplasmacapsulatum)、沙目艮衣原体(Chlamydia trachomatis)、诺卡氏菌(Nocardia spp.)禾口卡氏月市孢子虫(Pneumocytis carinii)。 寄生虫包括但不限于生于血液的和/或组织寄生虫，例如田鼠巴贝虫(Babesia microti)， Babesi divergans，溶组织内阿米巴(Entomoeba histolytica)，兰伯氏 贾第鞭毛虫(Giarda lamblia)，热带利什曼原虫(Leishmania tropica)，利什曼原 虫(Xeishmaniaspp.)，巴西利什曼原虫(Xeishmania braziliensis)，杜氏利什曼原虫 (Leishmania donovdni)，恶性症原虫(Plasmodium falciparum)，三曰症原虫(Plasmodium malariae)，卵形症原虫(Plasmodiumovale)，间目症原虫(Plasmodium vivax)，冈U地 弓形虫(Toxoplasmagondii)，冈比亚锥虫(Trypanosoma gambiense)禾P罗得西亚锥虫 (Trypanosoma rhodes iense)(非洲|维虫病(African sle印ingsickness))，克氏维虫 (Trypanosoma cruzi)(卡格氏病(Chagus' disease))和刚地弓形虫，叶状软体蜗虫(flatworms)禾口虫回虫(roundworms)。 注意本发明进一步包括本主题缀合物治疗增殖性疾病的用途，例如癌症，和在优 选实施方案中，治疗黑素瘤的用途。癌症是细胞不受控制生长的病情，其妨碍身体器官和系 统的正常功能。患有癌症的受试者是该受试者体内存在客观可测量的癌细胞的受试者。存 在发展为癌症的风险的受试者是倾向于发展为癌症的受试者，例如基于家族史、遗传倾向 性、受试者接触放射线或其他致癌物质。从它们的原始部位转移并定居在重要器官中的癌 症通过受影响器官的功能衰竭最终可以引起受试者死亡。造血系统癌症，例如白血病，能够 竞争掉受试者正常的造血空间，由此引起造血失败(以贫血、血小板减少和中性粒细胞减 少的形式)，最终致命。 转移是癌细胞的部位与原发肿瘤的位置不同，是由癌细胞从原发肿瘤播散到身体 其他部分引起的。在诊断原发肿瘤块时，可监测受试者转移的存在。通过单独的核磁共振 成像(MRI)、计算机断层(CT)、扫描、血和血小板计数、肝功能研究、胸部X线和骨扫描加上 具体症状的监测，或它们的组合使用常常探测到转移。 根据本发明的佐剂组合和含有该组合的组合物可用于治疗各种癌症或存在发展 为癌症风险的受试者，通过包含肿瘤相关抗原(TAA)或编码DNA。这是在肿瘤细胞中表达的 抗原。这种癌症的实例包括乳腺、前列腺、结肠、血癌例如白血病、慢性淋巴细胞性白血病等 等。本发明的接种疫苗方法可用于剌激免疫反应，通过抑制或延缓肿瘤生长或减小肿瘤尺 寸而治疗肿瘤。肿瘤相关抗原也可以是主要由肿瘤细胞但并非只有肿瘤细胞表达的抗原。
另外的癌症包括但不限于基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑和中枢神经系统 (CNS)癌症、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌症、子宫内膜癌、食管 癌、眼癌、头颈癌、胃癌、上皮瘤、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌(小细胞、大细胞)、淋巴瘤包括霍奇 金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(例如唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺 癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；肉瘤；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；甲 状腺癌；子宫癌；泌尿系统癌症；以及其他癌肿和肉瘤。 根据本发明的佐剂组合和含有该组合的组合物还可以用于治疗自身免疫病例如 多发性硬化、类风湿性关节炎、1型糖尿病、银屑病或其他自身免疫紊乱。潜在可以用本发明 的疫苗和免疫佐剂治疗的其他自身免疫病包括克罗恩氏病及其他炎症性肠病，例如溃疡性 结肠炎、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫脑脊髓炎、重症肌无力(MG)、桥本氏甲状腺炎、肺 出血肾综合征(Goodpasture' s syndrome)、天疱疫、突眼性甲状腺肿(Graves disease)、 自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、具有抗胶原抗体的硬皮病、混合型 结缔组织病、多肌炎(polypyositis)、恶性贫血、特发性阿狄森病(idiopathic Addison' s disease)、自身免疫相关性不育症、肾小球性肾炎(例如新月形肾小球肾炎、增生性肾小球 肾炎)、大疱性类天疱疮、干燥综合征、牛皮癣关节炎、胰岛素抵抗、自身免疫性糖尿病(1型 糖尿病；胰岛素依赖型糖尿病)、自身免疫性肝炎、自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴组 织增生综合症(ALPS)、自身免疫性肝炎、自身免疫血友病、自身免疫性淋巴组织增生综合 症、自身免疫性葡萄膜视网膜炎(uveoretinitis)和吉-巴综合征。最近，动脉硬化和阿尔 茨海默氏病已经被公认为自身免疫病。因此，在本发明的这个实施方案中，抗原可以是自身 抗原，针对该抗原宿主引发不需要的免疫反应，该反应促进组织破坏和正常组织的损害。
根据本发明的佐剂组合和含有该组合的组合物也可以用于治疗哮喘和过敏性和炎性疾病。哮喘是以气道炎症和狭窄和气道对吸入物质的反应性增加为特征的呼吸系统紊乱。哮喘常常与变应性或过敏性症状相关，尽管不是仅仅与之相关。过敏是对物质(过敏原)获得性的过敏症。过敏性病情包括湿疹、过敏性鼻炎或鼻炎、枯草热、支气管性哮喘、荨麻疹和食物变应性及其他变应性病情。过敏原是可以在易感受试者中诱导过敏性或哮喘反应的物质。存在很多过敏原，包括花粉、昆虫毒液、动物毛发皮屑、粉尘、真菌孢子和药物。
自然和植物过敏原的实例包括下列属特有的蛋白犬、尘螨属、猫属(Felis)、豕草(Ambrosia) 、Lotium、柳杉属、链格孢属、桤木、Ali皿s、桦属、栎属(Quercus)、洋橄榄、蒿属(Artemisia)、大蕉、墙草、小蠊属、蜜蜂属、柏木属(Cupressus)、桧属、金钟柏(Thuya)、扁柏属(Chamaecyparis)、大蠊(Periplanet)、冰草属(Agopyron)、黑麦属、小麦属、鸭茅属、羊茅属(Festuca)、早熟禾属、燕麦属、绒毛草属(Holcus)、黄花茅属(Anthoxanthum)、燕麦草属、剪股颖属(Agrostis)、猫尾草(Phleum)、篛草(Phalaris)、雀稗属、高粱属和Bromis。 很清楚根据本发明的佐剂组合和包含该组合的组合物可以与其他疗法组合治疗具体病情，例如传染病、癌症或自身免疫病情。例如在癌症的情况下，本发明方法可以与化疗或放疗组合。 组合物制备成疫苗的方法是本领域技术人员熟知的。NKT活化剂、CD40激动剂和任选的抗原的有效量可以通过经验确定，但可以基于动物模型中的免疫有效量确定。待考虑的因素包括抗原性、剂型、给药途径、给予的免疫剂的次数、个体的身体情况、体重和年龄等等。这种因素对本领域技术人员是熟知的并可以由本领域技术人员确定(参见例如Paoletti and Mcl皿es， eds. ， Vaccines, fromConc印t to Clinic :A Guide to theDevelopment and ClinicalTesting of Vaccines for Human Use CRC Press (1999))。如这里公开的，很清楚本主题DNAs或蛋白缀合物可以单独给予或连同其他佐剂一起给予。
本发明的佐剂可以通过本领域已知的任何方法局部或全身给予，包括但不限于肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、鼻内、口服或其他粘膜途径。另外的途径包括颅内(例如脑池内或心室内)、眶内、眼、囊内、脊柱内和局部给药。本发明的佐剂和疫苗组合物可以在适当的无毒药物载体中给予，或可以配制在微胶囊或缓释植入物中。如果期望，为了维持期望的细胞免疫反应，本发明的免疫原性组合物可以多次给予。合适途径、剂型和免疫接种程序可以由本领域技术人员确定。 在本发明的方法中，有些情况下抗原和NKT活化剂/CD40激动剂缀合物可以分开给予或组合在相同制剂中给予。在有些情况下包括几个抗原可能有用。这些组合物可以以达到期望细胞免疫协同增强的任何顺序分开或组合给予。典型地，这些组合物在一个接一个短时间内给予，即一个接一个大约几个小时内，更优选大约半小时，在一些实施方案中，它们可以一个接一个在大约24-48小时内共同给予。 在有些情况下，在佐剂中包括促进亲和纯化的部分可能有益。这种部分包括不干扰佐剂组合功能的相对小的分子。做为选择，标记可以通过切割而去掉。这种标记的实例
包括聚组氨酸标记、血球凝集素标记、麦芽糖酶结合蛋白、凝集素、谷胱甘肽-s转移酶、抗
生物素蛋白等等。其他合适的亲合标记包括FLAG、绿色荧光蛋白(GFP)、myc等等。 本主题佐剂组合可以与生理可接受载体例如生理盐水一起给予。该组合物还
可以包含另一种载体或赋形剂，例如缓冲液，例如柠檬酸盐、磷酸盐、醋酸盐和碳酸氢盐，氨基酸，尿素，乙醇，抗坏血酸，磷脂，蛋白质例如血清白蛋白，乙二胺四乙酸，氯化钠或其他盐，脂质体，甘露糖醇，山梨糖醇，甘油等等。根据相应的给药途径，本发明的佐剂可以用多种方法配制。例如，可以制备液体制剂用于吞食或注射，可以制备凝胶用于吞食、吸入或局部施用。制备这种制剂的方法是熟知的并可以在例如"Remington' sPharmaceuticalSciences， 〃 18th Ed. ， Mack Publishing Company, Easton Pa. 中找至Ll。
本发明还包括基于DNA的疫苗。可编码期望抗原和/或CD40佐剂的这些DNAs可以作为裸DNA给予，或可以包含在表达载体中给予。此外，本主题核酸序列可以在移植物移植前导入移植物的细胞。这个DNA优选被人源化以促进在人类受试者中表达。
本主题佐剂组合可以进一步包含"标记"或"报道子"。标记或报道分子的实例包含P内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶、腺苷脱氨酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素B-磷酸转移酶、胸苷激酶、lacz和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶等。
可用来促进本主题佐剂或抗原表达的原核和真核细胞包括例如微生物、植物和动物细胞，例如，原核生物例如大肠杆菌、枯草杆菌等等，昆虫细胞例如Sf21细胞，酵母细胞例如酵母、假丝酵母、克卢费氏酵母、裂殖酵母属(Schizzosaccharomyces)和毕赤氏酵母，和哺乳动物细胞例如C0S、 HEK293、 CH0、 BHK、 NIH 3T3、 HeLa等等。本领域技术人员可以容易地选择用于特定表达系统的合适成分，包括适于期望细胞或生物体的表达载体、启动子、选择性标记等等。各种表达系统的选择和使用可以在例如Ausubel etal. ， 〃 CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York,N. Y. (1993);禾口Po騰ls et al.，Cloning Vectors :A LaboratoryMa皿al" :，1985 S聊l.(1987).中找到。还提供了包含和表达本主题DNA构建体的真核细胞。
在细胞移植的情况下，细胞可以通过移植程序或用导管介导的注射程序通过血管壁给予。有些情况下，细胞可以通过释放到脉管系统而给予，通过该系统，细胞随后被血流分配和/或移动到周围组织中。 对本发明有用的"NKT活化剂或激动剂"包括本领域通常已知的所有NKT细胞的活化剂或激动剂。NKT活化剂或激动剂的实例包括例如US20060211856和US20060052316中公开的神经酰胺和其他糖脂化合物，这两篇公开的专利申请的全部内容引入作为参考。例如这包括a -半乳糖苷神经酰胺、a _葡糖基神经酰胺、磷脂酰肌醇(phosphatidylinisitol)和葡基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinisitol)和所引用专利中公开的作为NKT活化剂的和本领域已知的各种其他糖脂化合物和衍生物。也参见Parekh et al. ， Crit. Rev.Immunol. 25)3) :183-213(2005);和Parekh et al. ， J Immunol. 173(1) :3693-706(2006)，两篇参考文献的全部内容也引入这里作为参考。 如所指出用于对本发明的"CD40激动剂"优选地包括特异性结合CD40的激动性抗CD40抗体或其片段，优选鼠或人CD40或CD40L蛋白、衍生物、多聚体例如三聚CD40L缀合物。本文使用的术语"抗体"使用其最广义，以包括多克隆和单克隆抗体，以及其抗原结合片段。这包括Fab、F(ab' )2、Fd和Fv片段。 此外，术语"抗体"包括天然抗体以及非天然存在抗体，例如单链抗体、嵌合抗体、双功能和人源化抗体。本发明优选使用的是嵌合、人源化和完全人抗体。合成嵌合、人源化、CDR-移植的、单链和双功能抗体的方法是本领域技术人员熟知的。此外，CD40特异性抗体是普遍已知和可得到的，和通过用CD40抗原，优选人CD40免疫适当的宿主可以制备。
很清楚本文提供的本发明定义中也提供了基本上不影响本发明各种实施方案活性的改动。
实施例 CD40激动剂与a -GalCer在诱导抗原_特异性CD8反应中的协同作用。 下列实验揭示了 NKT a -半乳糖苷神经酰胺(a -GalCer)与抗CD40抗体协同扩充
具有裂解功能的CD8细胞，类似于以前用TLR激动剂所观察到的。CD40激动剂和a -GalCer
组合给予诱导高水平的细胞免疫。
实施例1 抗CD40和a -GalCer组合给予在体内协同增强抗原特异性T细胞的扩充。
这个实施例涉及图1包含的实验。其中，500ug卵白蛋白、100ug抗CD40、100ugS-27609(TLR7激动剂)、4 uga-GalCer以图中指出的组合静脉注射给予小鼠。五天后，进行使用Siinfekl脉冲的靶的标准CTL试验，如以前描述。指出试剂给予后第6天，四聚体染色剂测定OVA特异性CD8+T细胞的数量，如以前所述，以及在体外再剌激后产生IFN y的抗原特异性CD8+T细胞的数量。 图1中的结果令人惊奇地证明新抗原(OVA)与CD40激动剂(抗CD40)和TLR激动剂(S-27609)或抗CD40和a -GalCer组合给予诱导高水平OVA特异性CD8+T细胞(由四聚体染色剂测定，使用0VA-H-2b四聚体)和重新恢复了 OVA特异性CD8+T细胞产生IFN- a的反应。
实施例2 作为使用抗CD40和a -GalCer组合免疫结果的定量免疫反应(基于图1中的数据)和CD40激动剂与a -GalCer在诱导保护性抗肿瘤免疫中的协同作用的证明。
因为给予抗CD40/ a -GalCer/OVA或抗CD40/609/0VA与使用单独的物质作为单一疗法相比，在增加抗原特异性CD8+T细胞总数量方面有效得多，联合治疗被测试作为在黑素瘤鼠模型中诱导治疗性免疫的有效方法。使用抗CD40和TLR*或a -GalCer的最初研究证明这个活化剂连同肽或完整蛋白的组合给药弓I出极其高(CD8+T细胞中四聚体+T细胞>5%)频数的抗原特异性细胞毒性T细胞。然后我们想探究是否可以引出高频数"自我反应性或肿瘤反应性"T细胞以保护不受同源肿瘤的影响。酪氨酸酶相关蛋白_2(TRP-2)是参与黑色素合成的蛋白并已用作免疫疗法的黑素瘤相关抗原。TRP-2在正常黑色素细胞和黑素瘤中表达和已经被鉴定为CTLs识别的人肿瘤抗原，和随后被鉴定为B16黑素瘤的肿瘤排斥抗原。已经描述了人和小鼠的CD8+T细胞肽表位。为测试使用CD40/TLR平台是否可以诱导抗自我反应性CD8+T细胞，用50ug杂环形式TRP-2 ( A V肽；TRP_2 (SVYDFFVWL)，抗CD40和TLR7*或抗CD40和a -GalCer (和每一种单一疗法)腹膜内免疫已给予B16黑素瘤(四天前)的小鼠。 图2中的结果表明根据给予肿瘤后21天后肺转移的数量来判定，抗CD40/TLR/ A V或抗CD40/a-GalCer/AV组合使用提供了最有效的治疗性保护。a-GalCer和AV提供了一些预防性保护。然而，根据我们其他治疗的经验，与接受a-GalCer/AV治疗的小鼠相比，使用抗CD40/ a -GalCer/ A V引起那些鼠存活率增加。 体内杀死试验还提示组合疗法(OVA/抗CD40/ a -GalCer)也比测试的任何单一疗法(抗CD40/0VA或a -GalCer/OVA或TLR/OVA)更有效(见图2)。
实施例3 CD40/TLR*接种疫苗治疗性干扰全身黑素瘤。 这个实施例涉及图3包含的实验。在图3包含的这个实验中，静脉注射100kB16-F10肿瘤细胞后四天免疫B6小鼠(4只/组)。特别地，使用以下指出的物质组合免疫小鼠抗CD40(100ug/小鼠，腹膜内)、S27609 (TLR7*) (100ug) 、 A V-肽(100ug)或a-GalCer (4ug)静脉注射。给予肿瘤(使用+4天介入方案)后二十天，取出肺(见典型照片，图3顶部)和肉眼计算定量肺转移数量(见图3的底图)。
实施例4 抗CD40抗体和a -GalCer在体内诱导DCs表达CD70。 在图4包含的实验中，用下列组合注射小鼠2uga-GalCer、50ug polyIC和/或50ug抗CD40，腹膜内。然后，注射后18-20小时，取出脾。胶原酶消化脾，染色CDllc+并用CD8+和CD8-(CDllb+)DCs分析。 这个图中的结果出乎意料地揭示了 CD70的表达仅在从CD40激动剂和a -GalCer组合给予的小鼠获得的树突细胞上诱导出。 本发明人以前报道了仅当抗CD40和TLR激动剂组合给予时，体内树突状细胞表面上表达CD70增加。此外，我们已表明CD70表达是抗原特异性CD8+T细胞随后扩充所必需的。 相当出乎意料地，用本主题新的协同佐剂组合给予观察到了相似的结果。特别地，和类似于用TLR和CD40激动剂所见到的协同作用，抗CD40和a -GalCer组合给药也见到了 DCs上CD70上调。如图4所示，仅当给予抗CD40和TLR激动剂(polyIC)时，或抗CD40和a -GalCer时，观察到CD8+和CD8_CDllc+DCs上CD70表达显著增加。
实施例5 a -GalCer/CD40免疫引出强力CD8+T细胞反应，它是STAT4、IFN y禾P IFNab非依赖性的，但是STAT1和Tbet依赖性的。 转录信号转导剂和活化剂(STAT)蛋白调节细胞生长的很多方面。STAT1参与由于I型或II型干扰素引起的信号来上调基因。在对IFN-y剌激的反应中，STAT1与STAT3形成与GAS(干扰素-y活化序列)启动子元件结合的同源二聚体或异源二聚体；在对IFN-a或IFN-P剌激的反应中，STAT1与STAT2形成可结合ISRE (干扰素剌激反应元件)启动子元件的异源二聚体。IL-12在细胞免疫中的作用主要由STAT-4转录因子介导。STAT-4对IL-12活性是必不可少的。T-bet是转录因子的T-box家族成员，调节CD4(TH)淋巴细胞中承载的谱系。这部分是有活化IFN- y而进行的。T-bet是控制CD4和NK细胞产生I FN所需的，而不是CD8细胞。 在图5所含实验中，静脉注射50ug抗CD40 (FGK45) 、2ug a -GalCer和2Q0ug完整卵白蛋白免疫小鼠(wtB6或wt B6/129F1' s和K0)。七天后，杀死小鼠并分离PBLs和脾 细胞，用Kb/ova MHC四聚体染色，以鉴定ova特异性CD8+T细胞，如前所述(Sanchez et al. 2007Journal of Immunology)。所示点图针对所有活的CD8+B220-细胞，和关于表面标 记KLRG1方面显示了四聚体+和_细胞的表型。显示的数字表示总CD8+T细胞中四聚体+ 的百分比。显示的点图是PBL，但是脾反映出类似的趋势。这个实验表明a-GalCer/CD40 免疫引发强力CD8+T细胞反应，是STAT4、IFN y和IFNab非依赖性的，但是STAT1和T-bet 依赖性的。
结论 至少根据图1-5中实验所含的结果，CD40激动剂连同抗原和触发NK_T细胞的激 动剂(a-GalCer)组合给药诱导出增高超过这些激动剂单独给予的免疫(引发免疫协同效 应)。与单独任何激动剂，有或者没有抗原时相比，CD40激动剂和a -GalCer组合引起更高 频数的抗原特异性CD8+T细胞，更多数量的抗原特异性CD8+T细胞并增加抗肿瘤免疫。
因此，CD40激动剂和NK-T细胞活化剂，如a -GalCer组合使用，会充当强力疫苗 平台，引发抗肿瘤和传染病的保护性细胞介导的免疫反应。 本文引用的期刊、专利和其他出版物的各种参考文献包括现有技术并如同完全列 出一样引入作为参考。 本发明进一步由随后的权利要求限定。
权利要求
佐剂组合，其引发T细胞免疫的协同效应，包含(i)至少一种CD40激动剂；(ii)至少一种NKT活化剂；和(iii)任选地，至少一种期望的抗原。
2. 权利要求1的佐剂组合，其中NKT活化剂是a -半乳糖苷神经酰胺(a -GalCer)或 iGb3。
3. 权利要求1的佐剂组合，其中CD40激动剂是抗CD40抗体或抗体片段或CD40L蛋白、 衍生物、片段，或其多聚体或包含CD40L的缀合物。
4. 权利要求3的佐剂组合，其中所述免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白。
5. 权利要求3的佐剂组合核酸构建体，其中所述免疫球蛋白是人源化免疫球蛋白。
6. 权利要求3的佐剂组合，其中所述免疫球蛋白是人免疫球蛋白。
7. 权利要求3的佐剂组合，其中所述免疫球蛋白是单链免疫球蛋白。
8. 权利要求3的佐剂组合，其中所述免疫球蛋白包含人重链和轻链恒定区。
9. 权利要求3的佐剂组合，其中所述免疫球蛋白选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4组成的组。
10. 权利要求3的佐剂组合，其中所述免疫球蛋白由编码免疫球蛋白轻链的核酸序列 和编码免疫球蛋白重链的核酸序列所编码，它们与同一启动子可操作连接。
11. 权利要求10的佐剂组合，其中所述免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链序列中间插 入IRES。
12. 权利要求1的佐剂组合，其中所述抗原是病毒、细菌、真菌或寄生虫抗原。
13. 权利要求1的佐剂组合，其中所述抗原是人抗原。
14. 权利要求13的佐剂组合，其中所述人抗原是癌抗原、自身抗原或其他人抗原，它的 表达与慢性人疾病相关或参与其中。
15. 权利要求12的佐剂组合，其中所述病毒抗原对选自下组的病毒是特异性的HIV、 疱疹、乳头状瘤、埃博拉、小核糖核酸病毒(picorna)、肠道病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、禽 流感病毒、狂犬病病毒、VSV、登革热病毒、肝炎病毒、鼻病毒、黄热病毒、bunga病毒、多瘤病 毒、冠状病毒、风疹病毒、埃可病毒、痘病毒、水痘带状疱疹、非洲猪瘟病毒、流感病毒和副流 感病毒。
16. 权利要求12的佐剂组合，其中所述细菌抗原源自于选自下组的细菌沙门氏菌 属(Samonella)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞细菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属 (Bacillus)、弧菌属(Vibrio)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺旋杆菌属(Heliobacter)、 欧文氏菌属(Erwinia)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、粘土杆菌属(Pelobacter)、梭菌 属(Clostridium)、沙雷氏菌属(Serratia)、黄单胞菌属(Xanothomonas)、耳卩尔森氏菌 属(Yersinia)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholdia)、李斯特氏菌属(Listeria)、志贺氏 菌属(Shigella)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、肠杆菌属(Enterobacter)、棒杆菌属 (Corynebacterium)禾口链球菌属(Streptococcus)。
17. 权利要求12的佐剂组合，其中所述寄生虫抗原源自于选自下组的寄生虫巴贝虫属(Babesia)、内阿米巴属(Entomoeba)、利什曼原虫属(Leishmania)、症原虫属 (Plasmodium)、锥虫属(Trypanosoma)、弓形虫属(Toxoplasma)、贾第虫属(Giarda)、口十状软f本虫呙虫(flat worms)禾口虫回虫(round worms)。
18. 权利要求12的佐剂组合，其中所述真菌抗原源自于选自下组的真菌曲霉菌属 (Aspergillus)、球抱菌属(Coccidoides)、隐球菌属(Cryptococcus) 、 Candida Nocardia、 月市囊虫属(Pneumocystis)和衣原体属(Chlamydia)。
19. 权利要求1的佐剂组合，其中抗原是选自下组的人癌症所表达的癌抗原前列腺 癌、胰腺癌、脑癌、肺癌(小或大细胞)、骨癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、皮肤癌、 淋巴瘤、白血病、结肠癌、甲状腺癌、宫颈癌、头和颈癌、肉瘤、神经胶质癌和胆囊癌。
20. 权利要求l的佐剂组合，其中抗原是自身抗原，其表达与自身免疫病相关。
21. 包含根据权利要求1-20任一项的佐剂组合的重组微生物。
22. —种引发抗原特异性细胞免疫反应的方法，其通过给予根据权利要求1-20任一项 的佐剂组合或包含所述佐剂组合的组合物。
23. 权利要求22的方法，其中所述给药引起下列至少一个(i) 诱导比仅仅给予CD40激动剂或NKT活化剂更高频数的抗原特异性CD8+T细胞；(ii) 诱导比仅仅给予CD40激动剂或NKT活化剂更大量的抗原特异性CD8+T细胞；禾口(iii) 相对于仅仅给予CD40激动剂或NKT活化剂，肿瘤免疫力增强。
24. 权利要求23的方法，其中抗原选自病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、自身抗原、过敏 原和癌抗原。
25. 权利要求24的方法，其中抗原是HIV抗原。
26. 权利要求25的方法，其中HIV抗原是gag或env。
27. 权利要求24的方法，其中抗原是人肿瘤表达的抗原。
28. 权利要求24的方法，其中抗原是黑素瘤表达的抗原。
29. 权利要求23的方法，其中所治疗的疾病选自癌症、过敏症、炎性疾病、传染病和自 身免疫病。
30. 权利要求29的方法，其中所治疗的疾病是黑素瘤。
31. 权利要求23的方法，其中传染病由病毒、细菌、真菌或寄生虫引起。
32. 权利要求31的方法，其中病毒是HIV。
33. 权利要求30的方法，其中所述给药引起下列至少一种(i) 弓I发相对于单独给予CD40激动剂或NKT活化剂或激动剂实质上增强的初级和记忆 CD8+T细胞反应；(ii) 诱导抗原特异性CD8+T细胞指数级扩充；禾口(iii) 在CD4缺陷宿主中产生与正常(非CD4缺陷)宿主可比的保护性免疫反应。
全文摘要
公开了佐剂组合，包含至少一种NKT活化剂例如α-半乳糖苷神经酰胺(α-Gal-Cer)或iGb3，CD40激动剂和任选的抗原。也提供了这些免疫佐剂用于治疗各种慢性疾病例如癌症的用途。
文档编号A61K45/00GK101730546SQ200880013233
公开日2010年6月9日 申请日期2008年4月25日 优先权日2007年4月25日
发明者C·阿霍宁, R·诺勒 申请人:Immurx公司