专利名称：：使用补体因子d抑制剂治疗老年性黄斑变性的制作方法
技术领域：
：本发明涉及眼病的预防和治疗领域。具体而言，本发明涉及通过施用补体因子D抑制刺在存在补体家族基因风险变体的患者中治疗和预防AMD。2.
背景技术：
：老年性黄斑变性(AMD)是一种致残、致盲性疾病，其主要影响黄斑区或视网膜中负责高视敏度视力的中心区域，并且是导致老年人不可逆性视力丧失的原因。已知遗传因素和环境因素都与AMD有关。例如，吸烟、脂质的摄入和年龄都是罹患AMD的已知风险因素。AMD有两种形式，干性AMD和湿性AMD,美国AMD患者达1100多万。AMD患者中80%为干性AMD，其特征为视网膜色素上皮(RPE)下层的玻璃膜(Bruch膜)中出现细胞残骸(玻璃疣)、RPE色素异常或地图状萎缩。剩余的20%AMD患者罹患湿性AMD，其特征为脉络膜新生血管和/或RPE脱落。AMD患者眼中还可观察到胞外基质异常。干性AMD的诊断标准为RPE下出现玻璃疣，这在患病初期即可观察到。玻璃疣是由蛋白质、脂质和细胞残骸构成的类黄色的胞外沉积物小体。玻璃疣的一个主要成分就是补体蛋白[Johnson等2001]。玻璃祝通常伴随显著的色素变化和后极部色素沉积。RPE通常出现萎缩，容易观察到下层的脉络丛。干性AMD后期，这些小型的局部萎缩病灶合并形成大片萎缩区域，严重影响视力，称为地图状萎缩。湿性AMD的特征是出现脉络膜新生血管，并且可能出现RPE提升(RPEelevation)、渗漏或浮见网膜下积液。已知血管内皮生长因子(VEGF)是与眼内病症有关的新血管生成过程中关键的调节因子(Ferrara等1997)。眼液中VEGF水平与糖尿病患者和其它缺血性视网膜病患者的活性血管增生水平密切相关(Aiello等1994)。其它研究证明了在AMD患者脉络膜新生血管膜中存在VEGF(Lopez等1996)。目前批准的AMD疗法的目的在于降低过剩VEGF的水平或阻断其生成。例如，Macugei^中的活性成分旅加他尼钠是一种作为VEGF拮抗剂的寡肽的共价结合体。1^肌61^8@中的活性成分雷珠单抗是一种与VEGF结合的抗体片段。Macugei^是每六周经玻璃体内注射施用，而Lucentis是每个月进行玻璃体内注射。批准用于治疗湿性AMD的其它治疗方法包括激光凝固法和光动力疗法。目前没有能够逆转AMD症状的疗法，但年龄相关性眼病研究(AREDS)表明抗氧化饮食补剂可减緩AMDii^[AREDS才艮告编号8(2001)]。很多研究组进行了大量的研究，寻找导致AMD或与AMD有关的基因。单核苷酸多态性(SNP)基因分型为快速鉴别与疾病有关的基因带来了希望(Hirschhorn&Daly，2005;Hinds等2005)。《科学快迅》(ScienceExpress)和《美国科学院院净艮》(PNAS)中发表的报告(Edwards等2005;Haines等2005;Klein等2005;和Hageman等2005)描述了使用SNP基因分型鉴别与AMD风险增加有关的补体因子H基因(CFH)中的单个多态性。据报道，CFH中单个^J^酸变化(Y402H)可以解释40-50%的AMD病例。德克萨斯大学西南医学中心(UTSouthwestern)、波士顿大学和Sequenom公司的科学家们参与了Edwards研究(Edwards等2005)。他们开始使用24个SNP通过ARMD1基因座(locus)进行SNP基因分型，然后再用其它SNP对该区域进行详细分析，在两个设有对照组的群体中(第一群体中有224名AMD患者和134名对照，第二群体中有176名患者和68名对照)进行。Edwards等报告，在补体因子H中具有一个Y402HSNP拷4贝的个体(即杂合个体)t艮为AMD的风险高2.7倍。这一单个SNP似乎可以解释两个群体中约50%的AMD病例。Haines研究(Haines等2005)是范得比而特大学(VanderbiltUniversity)和杜克大学的合作项目。与Edwards研究相似，Haines及其同事使用SNP基因分型在两组AMD患者中对ARMD1基因座进行了分析。他们的A^由182个AMD家族和一个对照A^M且成，有495名AMD患者和185名对照。Haines等开始使用44个SNP对ARMD1基因座进行筛查，然后使用其它的SNP细化搜索.在整个AMD人群中，他们发现杂合个体罹患AMD的风险升高2.45倍，而具有两个Y402HSNP拷贝的个体(即同合子个体)罹患AMD的风险升高3.33倍。对于新生血管型(湿性)AMD的患者而言风险更高(杂合个体升高3.45倍，同合子个体升高5.57倍)。Haines等估计Y402HSNP导致研究A^中43%的AMD病例。来自于洛克菲勒大学(RockefellerUniversity)、耶鲁大学、国家眼科研究所(NEI)和EMMES公司的科学家参与了Klein研究(Klein等2005)。与前两项研究不同，Klein研究组使用116,000个以上的SNP在96名AMD患者和50名对照中进行了全基因组SNP基因型筛查。该研究中的所有个体均根据AREDS研究人群进行了清晰的临床定义。Klein研究组独立地将AMD易感基因座定位在染色体lq上(与ARMD1位于同一区域)并将CFH中的Y402HSNP鉴定为风险等位基因。杂合个体.限患AMD的风险升高4.6倍，而同合子个体罹患AMD的风险升高7.4倍。Hageman研究(Hageman等2005)中参与的患者来自于衣阿华大学和哥伦比亚大学。Hageman等AJtCFH的分析是基于其先前的研究(所述研究在玻璃疣的形成中鉴别出了补体)以及先前的连锁分析研究(所述研究鉴别出了染色体基因座lq25-32)的基础上。Hageman的研究组分析了900名AMD患者和400名相匹配的对照的CFH基因的SNP。除了先前发表的文章中鉴别的Y402H变体之外，Hageman等还鉴别出其它AMD风险变体，例如I62V、间隔序列l、2、6和10、A307A和A473A。至少三项后续研究(即Conley等2005;Zareparsi等2005;和Souied等2005)可证实Edwards、Haines、Klein和Hageman的研究结果。Conley等研究了796例家族性AMD病例和196例散发性AMD病例，以120例未患病、无亲缘关系的个体为对照，发现Y402H变体与AMD患者之间有显著关联。Zareparsi等在单中心研究人群中发现外显子9(Y402H)中的T>C取代与AMD有关。Souied等将Y402H多态性与AMD的相关性从开始发现的北美人群扩展至欧洲4(法国)。Souied等研究了60例散发性AMD病例和81例家族性AMD病例，并与91例健康对照比较，发现Y402H多态性与AMD有显著关联。因此Y402H多态性与AMD的关联性似乎是可以重现的普遍结果。对于由于存在Y402H多态性而被鉴别为有风险懼患AMD或从干性AMD发展为湿性AMD的患者，前述各项研究均未能提出治疗方案。目前需要一种鉴别有风险罹患AMD的患者的方法，并需要为其提供预防性治疗方案。还需要在已诊断患有AMD并在具有Y402H多态性或补体家族基因中的其它风险变体的患者中抑制视力丧失或改善视敏度的治疗方案。
发明内容通过提供一种治疗由于补体因子H(CFH)基因中存在Y402H多态性或者补体家族基因中存在其它风险变体而患有AMD或有风险罹患AMD的患者的方法，本发明克服了现有技术中的这些和其它的缺陷。根据本发明的方法，对患者进行鉴别，确定其属于具有Y402H多态性或者其补体家族基因中具有其它风险变体。Y402H多态性或其它风险变体的鉴别可以通过获得患者的组织例如面颊拭子或血样来完成。通过本领域技术人员使用的常规方法从组织中分离CFH基因或其它补体家族基因。将从患者中分离的基因的序列与不含Y402H多态性的CFH基因或其它补体家族基因(也称为"正常补体基因"或"野生型补体基因")的序列进行比较，确定患者的组织样品中是否存在Y402H多态性或其它风险变体。若鉴别结果确定患者具有Y402H多态性或其它风险变体，则向患者施用含有补体因子D抑制剂的组合物以抑制与老年性黄斑变性(AMD)有关的视敏度丧失或预防患者罹患AMD。因此，本发明的方法包括以下步骤a)在患者中鉴别Y402H多态性或其它风险变体，方法是i)从患者获取组织样品；ii)分析組织样品中CFH基國的Y402H多态性或#傳家族基因中的其它风险变体，其中CFH基因中存在Y402H多态性或补体家族基因中存在其它风险变体表明患者罹患AMD的风险升高或者从千性AMD发展为湿性AMD的风险升高；b)向以上步骤(a)中确定CFH基因中存在Y40ZH多态性或补体家族基因中存在其它风险变体的患者施用治疗有效量的含有补体因子D抑制剂的組合物。本发明使用的术语"蜂h^家族基闳"是指蜂傳途径中的任何成员，如图1所示。本文使用的术语"风险变体，，是指从患者中分离的基因的序列与野生型基因序列之间的差异，其中已确定这种差异与特定患者群体中AMD发病率升高有关。本发明的另一实施方案提供在已诊断患有AMD的患者中治疗AMD的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的含有补体因子D抑制剂的组合物。本发明范围内的#^因子D抑制剂包括但不限于抑制酶的丝氨酸蛋白酶活性的小分子；抑制性抗体；与因子D结合并使之灭活的非抗体蛋白质；以及抑制因子D表达的活性剂例如小分子干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、核酶、脱氧核酶和反义RNA。本发明组合物中的蜂傳因子D抑制剂的量通常为0.01重量％-10重量％。在本发明方法的一个优选方面中，补体因子D抑制剂是BCX-l470(见以下结构式)(Szalai等2000)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>虽然本发明的組合物可以通过任何已知的眼部局部递送手段施用，但优选的组合物施用方法是眼部外用、后部巩膜旁施用、玻璃体内注射、筋膜下施用或者通过植入方式进行玻璃体内植入或经巩膜植入。优选将本发明组合物通过后部巩膜旁途径或玻璃体内植入的持续递送装置施用。附图筒述本说明书包括以下附图，旨在进一步说明本发明的某些方面。通过参考该附图并结合本文给出的具体实施方案的详细描述，可更好地理解本发明。图l概述了补体系统，图例说明经典途径、MBL途径和旁路途径。发明详述最近报道补体因子H(CFH)的单核苷酸多态性(SNP)可解释近50%的AMD风险(Edwards等，2005;Haines等，2005;Klein等，2005;Hageman等，2005)。CFH的正常功能似乎是预防补体过度激活。补体系统补充并放大机体对外来病原体的抗体反应，主要包括三条途径经典途径、MBL途径和旁路途径(图1)。在旁路补体途径中，少部分血浆中固有的生物学惰性蛋白质C3的硫酯键自发水解生成C3(H20)。水解后的C3与血浆蛋白因子B的结合亲和力大大高于C3本身，与血浆蛋白因子B形成非共价复合物。C3(H20)-因子B复合物是血浆丝氨酸蛋白酶因子D的底物，血浆丝氨酸蛋白酶因子D将因子B裂解为两个新的蛋白质，较小的Ba片段和活性蛋白酶Bb，Bb8继续保持与C3(H20)的结合状态生成C3(H20)Bb复合物。该复合物是一种液相C3转变酶，可将很多C3分子裂解为C3a和C3b,C3a是一种促炎性化学吸引剂，吸引白细胞例如中性粒细胞，C3b是一种调理剂，被其标记的细胞可被专门的吞噬细胞摄取。这样形成的C3b大部分被水解作用灭活，但一部分通过其反应性硫酯基与宿主细胞表面或与病原体共价结合。在细胞表面沉积的C3b能够与因子B结合，然后被因子D裂解生成小片段Ba和活性蛋白酶Bb，最后导致在细胞表面上生成旁路途径C3转变酶C3bBb。细胞表面结合的C3转变酶C3bBb可以与另一分子C3b结合生成C5转变酶C3bBbC3b。该C5转变酶与C5反应，将有效价的化学吸引剂释放至血浆中。衍生于C5的残基片段C5b动员C6-C9蛋白生成膜攻击复合物(MAC)，MAC是一种寡聚蛋白复合物，在其附着的细胞膜上形成孔隙引发溶胞作用。通过各种方式抑制因子D功能，例如抑制其表达、利用抗因子D抗体或核酸适体与其结合或抑制其丝氨酸蛋白酶活性，在理论上可以称为降低旁路补体系统活性程度的一种策略，通过减少调理剂C3b的生成因而减少标记细胞的细胞吞噬作用，通过减少MAC的生成减少溶胞作用。这样可能减轻旁路补体系统的不恰当激活对AMD病理学/组织破坏所产生的作用。尚未见通过抑制补体因子D来预防和/或减轻人类AMD相关疾病病理学的尝试。本发明涉及通过抑制补体因子D来预防和治疗AMD,可通过基因筛查确定补体因子D抑制剂疗法的目标患者群，例如4吏用面颊拭子或血液分析，通过Y402HSNP或其它风险变体的基因分型来确定。可使用QIAampDNABloodMaxi试剂盒(Qiagen，Valencia,CA)从外周血液白细胞中分离基因组DNA。可使用单链构象多态性(SSCP)分析、应用生物系统SNPAssays-On-Demand定量PCR或直接对扩增的DNA进行测序检测DNA多态性。检测CFH基因多态性的其它手段也包括在内，它们是本领域技术人员熟知的。9本发明的补体因子D抑制剂可以经系统方式或局部方式施用。系统施用方式包括口服、透皮、真皮下、腹膜内、皮下、经鼻、舌下或直肠方式。最优选的系统施用途径是口服施用。目艮部局部施用方式包括外用、玻璃体内、眼周、经巩膜、球后、巩膜旁、筋膜下方式或通过眼内装置来施用。优选的局部递送方式包括经巩膜通过后部巩膜旁施用途径、玻璃体内注射或通过插管例如美国专利6，413，245bl中所述方法递送至黄斑。或者可通过玻璃体内或经巩膜植入的持续释放装置或其它已知的眼部局部递送方式递送所述的抑制剂。本发明还涉及含有补体因子D抑制剂及其类似物的组合物及其使用方法。4艮据本发明的方法，将用于系统施用或局部眼部施用的含有一种或多种本发明化合物以及可药用载体的组合物施用于有需要的哺乳动物。优选用于本发明方法中的组合物含有补体因子D抑制剂例如BCX-1470。针对期望的特定施用路径，根据本领域已知的方法配制本发明的组合物。才艮据本发明的方法，将用于系统施用或局部眼部施用的含有一种或多种补体因子D抑制剂以及可药用载体的组合物施用于有需要的哺乳动物。本发明施用的組合物包含药学有效量或治疗有效量的一种或多种补体因子D抑制剂。本文使用的术语"药学有效量"或"治疗有效量";1A以减弱或预防AMD和/或与AMD有关的视敏度丧失的活性剂的量。一般而言，用于系统施用治疗AMD的组合物中，补体因子D抑制剂的总量约为0.01-100mg/kg。对于局部施用，组合物中补体因子D抑制剂的优选浓度为约0.01%至约10%w/v]。以下实施例旨在举例说明本发明优选的实施方案。本领域技术人员应该理解，本发明以下实施例中公开的技术是本发明的发明者发现非常适合本发明实践的技术，因此可认为这些实施例中包含实践本发明的优选方式。但是本领域技术人员应该理解，根据本发明的公开内容，公开的具体实施方案可以进行#>多改变仍然可以得到相似结果而不偏离本发明的精神和范围。实施例l<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例3<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>%实施例4<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例5<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>的内容制备和实施而无需过多的实验。虽然本发明的组合物和方法是以优选实施方案的形式描述的，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，都可以做出改变而不偏离本发明的概念、精神和范围。更具体而言，显而易见，在化学上和结构上具有相关性的某些活性剂可以替代本文所述的活性剂而取得相似结果.对于本领域技术人员显而易见的所有这种替换和改变都被认为是包括在所附权利要求书所定义的本发明的精神、范围和概念内。参考文献以下参考文献提供了实例性的方法或其它可以补充本文内容的细节，本文在此》程度上将这些文献引入作为参考.美国专利和公开的申请6，413，245bl2003/0207309书籍其它出版物AREDSReportNo.8，"ARandomized,Placebo-ControHed，ClinicalTrialofHigh-DoseSupplementationwithVitaminsCandE，BetaCarotene,andZincforAge-RelatedMacularDegenerationandVisionLoss,"JrcA0/^幼《/柳0/,(2001),pp.1417-1436，Vol,119，JAMA&ArchivesEdwards,A.O.，Ritter，R.，3rd,Abd，K.J.，Manning,A,，Panhuysen,C.，Farrer，L.A.，Haines,J.Hauser，M.A"Schmidt,S.，Scott,W.K"爭(2005)。ComplementfactorHpolymorphismandage-relatedmaculardegeneration.ScienceJ朋，421-424。Furlong,S.T.，Dutta，A.S.，Coath，M.M.，Gormley，J.J,，Hubbs，S.丄，Lloyd，D.，Mauger，R.C.，Strimpler，A.M.，Sylvester,M.A,Scott,C.W.，和Edwards,P.D.(2000)。C3activationisinhibitedbyanalogsofcompstatinbutnotbyserineproteaseinhibitorsorpeptidylalpha-ketoheterocycles.Immunopharmacology4S，199-212。Hagcman，G,S.，Anderson,D,H.，Johnson,L.V.，Hancox，L.S.，Taiber,A.J.,Hardisty,L.I.,Hageman，J.L.，Stockman,H.A，，Borchardt,J,D.，Gehrs，K.M.辨2005)。AcommonhaplotypeinthecomplementregulatorygenefactorH(HF1/CFH)predisposesindividualstoage~relatedmaculardegeneration.ProcNatlAeadSciUSA風7227-7232。Haines，J.L.，Hauser,M.A.，Schmidt,S.,Scott，W.K.,Olson,L.M.,GalHiis，P"Sp雖er，K,L.，Kwan，S,Y,，Noureddine，M"Gilbert,J.R,爭(2005)。ComplementfactorHvariantincreasestheriskofage-relatedmaculardege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