专利名称：：稳定蛋白质的方法稳定蛋白质的方法
技术领域：
：本发明涉及稳定水性蛋白溶液对抗外源胁迫的方法和稳定水性蛋白溶液的容器的用途。使水性蛋白溶液对抗外源胁迫(例如机械胁迫，例如振荡)而稳定仍然是制药工业的技术难题。已知下述事实水性蛋白溶液在受到机械胁迫时具有聚集的趋向。在水性蛋白溶液(例如在容器中，例如药瓶中)运输期间几乎总会发生此类机械胁迫。本领域中常用的解决方案是使用例如稳定剂如聚山梨酯进行物理-化学稳定，其中广泛使用聚山梨酯20(也称为Tween2(FM)或聚山梨酯80(Tween80TM)、泊洛沙姆188或其它表面活性剂。但是，易于理解的是，不用化学产品进行稳定将有很多优点。具体而言，可能涉及到化学稳定剂对人体安全性的影响。因此，行政管理机构通常希望将药物制剂中包含的化学稳定剂的数量和含量都最小化。与健康问题相比的次要考虑是为了稳定水性蛋白溶液必须加入的化学稳定剂的成本。因此，很清楚的是，需要不使用化学稳定剂来使水性蛋白溶液对抗外源胁迫而稳定的方法。对于该目的，本申请人发现，使用包括将所述水性蛋白溶液填装入容器中，以使得容器在封闭时基本没有气体顶部空间的步骤的方法，令人吃惊地能够在不使用稳定剂的条件下使水性蛋白溶液对抗外源胁迫(例如机械胁迫)而稳定。考虑到克服了通常存在的技术偏见，该发现甚至更加令人吃惊。事实上，本发明的方法克服了公知的技术偏见，即必须使用化学稳定剂来使水性蛋白溶液对抗外源胁迫而得到稳定。图1显示了根据本发明的方法可在水溶液中被稳定的AP抗体的糖基化位点。图2显示了10mg/ml抗体(MabA)制剂于5°C在振荡胁迫下在6ml瓶中随时间进程的情况，其中使用3种填装体积(A)2.5ml(B)5.3ml(C)9.0ml，并且有不同的PS20的量(画0%;□0.0025%;▲0.005%;△0.01%)，这是通过可见的颗粒计数、浊度和可溶的聚集产物来分析的。图3显示了10mg/ml抗体(MabA)制剂于25°C在振荡胁迫下在6ml瓶中随时间进程的情况，其中使用3种填装体积(A)2.5ml(B)5.3ml(C)9.0ml，并且有不同的PS20的量(國0%;□0.0025%;▲0.005%;△0.01%)，这是通过可见的颗粒计数、浊度和可溶的聚集产物来分析的。图4显示了10mg/ml抗体(MabA)制剂于5°C在振荡胁迫下在6ml瓶中随时间进程的情况，其中使用3种填装体积(A)2.5ml(B)5.3ml(C)9.0ml,并且有不同的PS20的量(謹0%;□0.0025%;▲0.005o/o;△0.01%)，这是通过对每ml中^2pm、^10jim和^25^mi的镜检可见的(sub-visible)颗粒来分析的。图5显示了10mg/ml抗体(MabA)制剂于25。C在振荡胁迫下在6ml瓶中随时间进程的情况，其中使用3种填装体积(A)2.5ml(B)5.3ml(C)9.0ml，并且有不同的PS20的量(隱0%;□0.0025%;▲0.005%;厶0.01%)，这是通过对每ml中^2^im、210pm和^25jim的镜检可见的颗粒来分析的。图6显示了两种10mg/ml的抗体MabA■和MabB0在(A)非胁迫条件下和25°C振荡胁迫72小时条件下的聚集物形成，其在6ml瓶中使用3种填装体积(B)2.5ml(C)5.3ml(D)9.0ml，并且有不同的PS20的量(0%;0.0025%;0.005%)，这是通过可见的颗粒计数、浊度和可溶的聚集产物来分析的。图7显示了两种10mg/ml的抗体MabA■和MabB0在(A)非胁迫条件下和25。C振荡胁迫72小时条件下的聚集物形成，其在6ml瓶中使用3种填装体积(B)2.5ml(C)5.3ml(D)9.0ml,并且有不同的PS20的量(0%;0.0025%;0.005%)，这是通过对每ml中^2jim、SlOpm和^25pm的镜检可见的颗粒来分析的。图8和9显示了外源胁迫(此处是机械胁迫)之后填装有水性蛋白溶液的容器(此处是可药用的瓶)的照片。左侧显示了与现有技术类似的在封闭时具有气体顶部空间的含有蛋白溶液的容器。右侧显示了根据本发明方法的在封闭时基本没有气体顶部空间的含有蛋白溶液的容器。术语"稳定"是指用下文实施例中描述的相应试验进行测量时，水性蛋白溶液基本上不含显著量的聚集物和/或浑浊和/或镜检可见的颗粒和/或可见的颗粒。"外源胁迫，，这种表述指通过外源作用诱导的对水性蛋白溶液的胁迫。外源作用指来自包含容器和水性蛋白溶液的系统之外的作用。外源胁迫的一种例子是机械胁迫。机械胁迫的一种例子是振荡。在制药工业中的振荡可偶然发生(例如在运输期间)或主动发生(例如用于匀化溶液)。术语"容器"指可药用容器。合适的容器包含与开关装置相连的容纳器(recipieiit)部分。优选地，容器由与开关装置相连的容纳器构成，例如常规的带有封闭盖子的可药用瓶、预装填的注射器、胶嚢或安瓿。进一步更优选地，容器是带有封闭盖子的常规可药用瓶。容器可装有密封关闭装置，例如，对瓶起密封关闭作用的盖子，防止周围外界大气进入水性蛋白溶液。"水性蛋白溶液"这种表述指含有蛋白的水性溶液。蛋白质浓度可以是0.01-280mg/mL。"在封闭时基本没有气体顶部空间"这种表述表示用水性蛋白溶液填装容器的本领域技术人员将容器填装至该容器的最大体积，所述最大体积是通过例如目测或者通过计算预先确定的。这可通过例如用水性蛋白溶液将容器填装至容器的最大可能体积来实现，测量的精密度通过对所述溶液在最大体积时形成的凹液面在实验室目测确定，或通过对容器称重而从重量上测定，或者使用本领域已知的标准设备通过体积测定，其通常是制药工业在规^莫生产时的所用方法。填装体积表示仍旧足以使容器关闭而不会溢出。因此，术语"基本"在与"在封闭时基本没有气体顶部空间"这种表述一起使用时表示目测的、采用重量或体积测定的最大体积和/或没有气体顶部空间的精确度，其取决于目测时操作填装者的精确度或者在采用重量或体积测定时所用设备的精确度。术语"通常可药用的赋形剂"是指施用给人类或动物的市售产品或其它研发产品中已经含有的赋形剂。该术语包含下列类别的赋形剂緩沖剂(包括柠檬酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、磷酸盐、组氨酸、甘氨酸、精氨酸緩冲液)、氨基酸(包括精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、色氨酸、甲硫氨酸)、糖或糖醇(包括蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇)、表面活性剂(包括聚山梨酯20、聚山梨酯80、泊洛沙姆188、十二烷基硫酸钠、TritonX)和其它赋形剂(例如聚乙烯吡咯烷酮、环糊精、聚乙二醇)，等等。术语"单克隆抗体"或"单克隆抗体组合物"在本文中使用时指单种氨基酸组成的抗体分子的制备物。因此，术语"人单克隆抗体"指显示出单种结合特异性的抗体，其具有源于人类种系的免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。在一种实施方式中，人单克隆抗体通过杂交瘤产生，所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的B细胞，该B细胞来自于转基因的非人动物(例如转基因小鼠)，具有包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组。抗体分子作为蛋白质药物类的一部分，非常易于物理和化学降解，例如变性和聚集、脱酰胺、氧化和水解。蛋白质稳定性受蛋白自身特性(例如氨基酸序列)影响和外界影响(例如温度、溶剂pH、赋形剂、界面、振荡或剪切率)的影响。因此，确定最佳的制剂条件以保护蛋白质在生产、贮藏和给药过程中避免降解反应是很重要的。术语"抗IGF-1R人单克隆抗体，，或"huMAbIGF-IR"是指在WO2005/005635中所述的和要求保护的抗体，该文献的内容、尤其是权利要求引入本文作为参考。"Ap"指能够特异性结合淀粉样蛋白-p肽的Ap抗体(或其混合物)。特异性结合Ap的抗体是本领域已知的。能用于本发明的制剂中的A卩抗体的具体例子已在公开的PCT专利申请WO03/070760中、尤其是权利要求中被描述过，该文献的内容通过引用并入本文。淀粉样蛋白-P肽也被称为"p淀粉样蛋白"、"Ap"、"A卩4"或"p-A4"，特别是在本发明的上下文中被称为"AjT，是与形成淀粉样病变的疾病例如阿尔茨海默症有关的细胞外神经斑的主要组分；参见，Sdkoe(1994)，Ann.Rev.CellBiol.10，373-403，Koo(1999)，PNASVol.96，pp.9989-99卯，US4，666，829或Glenner(1984),BBRC12，1131。该卩淀粉样蛋白源于"阿尔茨海默前体蛋白/p-淀粉样蛋白前体蛋白"(APP)。APP是整合膜糖蛋白(见Sisodia(1992)，PNASVol.89，pp.6075)，其内的A(5序列,皮一种质膜蛋白酶a-分泌酶进行内源性蛋白酶切除(见Sisodia(1992)，如上述文献)。而且，其它一些分泌酶活性，特别是p-分泌酶和，分泌酶活性导致了包含39个氨基酸(A卩39)、40个氨基酸(AP40)、42个氨基酸(A^42)或43个氨基酸(A卩43)的p淀粉样蛋白(AP)的细胞外释放；见Sinha(1999)，PNAS96，11094-1053;Price(1998)，Science282，1078-1083;WO00/72880或Hardy(1997)，TINS20，154。A卩具有几种天然存在的形式，其中人的形式被称为上述的AP39、A卩40、AP41、Ap42和Ap43。最主要的形式AP42具有下述氨基酸序列(从N-末端开始)在A卩41、Ap40、AP39中，分别丢失了C-末端的氨基酸A、IA和VIA。在AP43形式中，在上述序列(SEQIDNO:3)的C-末端包含额外的苏氨酸残基。合适的Ap抗体是免疫球蛋白分子，例如IgG分子。IgG特征在于包含两条重链和两条轻链(如图1所示)，这些分子包含两个抗原结合位点。所述抗原结合位点包含由重链的部分(VH)和轻链的部分(VL)构成的"可变区"。抗原结合位点通过VH和VL结构域并列形成。关于抗体分子或免疫球蛋白分子的一般信息，还可参见常用教科书，例如Abbas"CellularandMolecularImmunology",W.B.SoundersCompany(2003)。在一种实施方式中，本发明的水性蛋白溶液中存在的蛋白是Ap抗体(或此类抗体的混合物)，其中所述抗体的重链中至少一个可变区包含N-糖基化。重链的可变区(VH)中糖基化的天冬酰胺(Asn)可以处于互补性决定区域2(CDR2区域)中，所述糖基化的天冬酰胺(Asn)可处于SEQIDNO:1所示的重链可变区(VH)的第52位上。术语"单糖基化抗体"指在羊个抗体分子的一个(Vh)区域中包含N-糖基化的抗体分子；也见图1。术语"双糖基化抗体"定义了在重链的两个可变区都被N-糖基化的抗体分子(图1)。在两个重链(VH)结构域上都没有N-糖基化的抗体分子被称为"非糖基化抗体"(图1)。单糖基化抗体、双糖基化抗体和非糖基化抗体可包含相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列。单糖基化抗体和双糖基化抗体在本文中被称为"糖基化抗体亚型"。经纯化的抗体分子其特征为至少一个抗原结合位点包含在重链可变区(VH)中的糖基化，是指单糖基化抗体，其不含选自双糖基化抗体和非糖基化抗体的亚型或者仅含有非常低的量，即"经纯化的单糖基化抗体"。本发明含有非常低的量，即"经純化的双糖基化抗体"。根据本发明方法的水性蛋白溶液中的蛋白质可以是单糖基化或双糖基化或非糖基化的抗体，或其被具体定义的混合物。本文提供的抗体混合物或抗体库可以包含50%的如本文所述的单糖基化抗体和50%的双糖基化抗体。但是，30/70至70/30的比例也是本发明所包括的。并且，本领域技术人员知道，本发明的抗体混合物也包括其它比例。例如，10/卯或90/10、20/80或80/20以及40/60或60/40的比例也可用于本发明的范围。本发明体，其特别有用的比例是40/60至45/55。术语"不含或仅含有非常低的量"是指完全不存在各种其它(糖基化)亚型，或其它(糖基化)亚型以至多10%,例如至多5%，例如至多4%，例如至多3%，例如至多2%，例如至多1%，例如至多0.5%,例如至多0.3%,例如至多0.2%的浓度存在。术语"抗体"在本文中使用时与术语"抗体分子"同义，其在本发明的范畴中包括抗体分子，例如完整的免疫球蛋白分子，例如IgMs、IgDs、IgEs、IgAs或IgGs(例如IgGl、IgG2、IgG2b、IgG3或IgG4)以及此类免疫球蛋白分子的部分，例如Fab片段、Fab，片段、F(ab)2片段、嵌合F(ab)2或嵌合Fab，片段、嵌合Fab片段或经分离的VH区域或CDR区域(所述经分离的VH区域或CDR区域是例如被整合或加工在相应的"框架"中)。因此，术语"抗体，，还包含免疫球蛋白的已知亚型和修饰物，例如单链抗体或单链Fv片段(scAB/scFv)或双特异性抗体构建体，所述亚型和修饰物的特征在于包含至少一个本文所定义的糖基化的VH区域。此类亚型或寸务饰物的一个具体例子可以是VH-VL或VL-VH形式的sc(单链)抗体，其中所述VH包含本文所述的糖基化。双特异性的scFv也包括在本文内，例如VH-VL-VH-VL、VL-VH-VH-VL、VH-VL-VL-VH形式。术语"抗体"还包括双抗体和包含与至少一个抗原结合部位/肽连接的作为载体的抗体Fc结构域的分子，例如WO00/24782所述的肽抗体。从上文明显可知，用于本发明方法中的水性蛋白溶液还包括含有抗体/抗体分子的混合物的水性Ap抗体溶液。所述抗体的一种具体"混合物"是上文所述的，即，抗A卩的"单"和"双，，糖基化抗体的混合物。"抗体片段"还包括本身不能提供效应物功能(ADCC/CDC),但在与合适的抗体恒定结构域组合后能以本发明的方式提供该功能的此类片段。Ap抗体可用作为本发明方法中的水性蛋白溶液中的蛋白质，其包括重组产生的Ap抗体。这些抗体可在哺乳动物细胞培养系统，例如CHO细胞中产生。此类哺乳动物细胞培养系统特别是用于制备AP抗体或糖基化的AP抗体/抗体分子，如本文具体例举的在可变区包含N-糖基化的Ap抗体。抗体分子还可通过系列的色镨或过滤步骤来纯化，例如按照下文所述纯化特异性的糖基化抗体亚型。术语"单克隆抗体"或"单克隆抗体组合物"在本文中使用时指单种氨基酸组成的抗体分子的制备物。因此，术语"人单克隆抗体"指显示出单种结合特异性的抗体，其具有源于人类种系的免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。在一种实施方式中，人单克隆抗体通过杂交瘤产生，所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的B细胞，该B细胞来自于转基因的非人动物(例如转基因小鼠)，具有包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组。A卩抗体可包含或具有如SEQIDNO:l定义的可变区:NGKEYKCKVSNKALPAP正KTISKAKGQPREPQVY丁LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:1)该序列也在下文中阐述，其中指出了CDR、CH区域、重区域以及两个N-糖基化位点(Asn52和Asn306):QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSR皿Q-G股墜.SYM邸AL朋HYT.Q.跳區巡.(SEQIDNO:1)力口框CDRl、2、3下划线:cm铰链双下划线:CH2處煞.下.M终.CH3粗体N:N-连接的糖基化位点本文所述的包含SEQIDNO:1的示例性A卩抗体还可包含轻链，所述轻链可包含或具有下述氨基酸序列TGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQ簡MPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTENO:2)术语"AP抗体A"在本文中使用时指包含如SEQIDNO:1所定义的重链和如SEQIDNO:2所定义的轻链的A卩抗体。术语"单糖基化抗体，，在本文中使用时指在单个抗体分子(例如免疫球蛋白，例如IgG，例如IgGl)的一个(VH)区域中包含N-糖基化的抗体分子。例如，所述"单糖基化形式"包含在重链的一个可变区上的糖基化，例如在本文所述的"AP抗体A"的天冬酰胺位置"Asn52"上。如本文所述，该"单糖基化的IgGl形式或单糖基化的亚型，，还可包括在Fc部分的高度保守的糖基化位点中的糖基化，例如在本文示例的"A卩抗体A"的非可变Fc部分中的天冬酰胺Asn306。在本发明的含义中，术语"双糖基化抗体，，包含如本文定义的在重链(VH)区域的两个可变区上的糖基化。该"M基化形式"还包含在两条重链的可变区上的糖基化，例如，在本文所述的"AP抗体A"的天冬酰胺位置"Asn52"上。该"双糖基化的IgGl形式或双糖基化的亚型"还可包括如本文所述在非可变/恒定的Fc部分中高度保守的糖基化位点上的糖基化，特别是在示例的"A卩抗体A"的第306位上。所附的图l说明了相应的抗体分子。在可变区(例如重链的两个可变区(两个(VH)区域))没有此类翻译后修饰的抗体在本发明范畴内被视为"非糖基化形式"，包括在重链的可变区没有糖基化的。但是，该"非糖基化形式"可在抗体的恒定区(C-区域)包含糖基化，例如，最常见是在Fc部分的高度保守的糖基化位点上，特别是本文所定义的非可变/恒定的Fc部分的天冬酰胺(Asn)306上；也参见SEQIDNO:1。本发明方法中的水性蛋白溶液中的蛋白质可以是上文所定义的示例性的"AP抗体A，，。因此，所述蛋白质可以是A卩抗体A，其包含如上文所定义的单糖基化Ap抗体A或双糖基化Ap抗体A或非糖基化A卩抗体A，或它们的混合物。对重组表达的Ap抗体分子的糖基化亚型的纯化包括下述步骤(1)蛋白A柱纯化；(2)离子交换柱纯化，例如阳离子交换色镨；以及任选地，(3)尺寸排阻柱纯化。纯化方案还可包含其它步骤，例如进一步的浓缩步骤(例如渗滤)或分析步骤(例如包括分析柱)。还可釆取重复某些特定步骤(例如，可进行两次离子交换色谱步骤)或者省略某些步骤(例如尺寸排阻色语法)。蛋白A是与大多数IgGl的同种型的Fc区域结合的基团特异性配体。其由一些金黄色葡萄球菌菌抹合成，并可从中加以分离，将其与色语粒偶联。也可从商业上获得一些类型的凝胶制备物。可使用的蛋白A柱的例子是MabSelect(商标)柱。理想地，用25mMTris/HCl、25mMNaCl、5mMEDTA对柱加以平衡，将细胞培养物上清液上样到柱上，用lMTris/HClpH7.2洗柱，使用100mM乙酸在pH3.2时洗脱抗体。阳离子交换色谱利用了固定相中带正电荷的基团和移动相中样品之间的相互作用。当使用弱阳离子交换剂(例如CMToyopearl650⑧)时，进行下述色谱步骤用100mM乙酸pH4预平衡、将蛋白A洗脱液上样和用100mM乙酸pH4洗柱后，通过应用250mM乙酸钠(pH7.8-8.5)和500mM乙酸钠(口117.8-8.5)的步骤洗脱抗体和分级分离。采用第一个步骤，通常洗脱出双糖基化亚型流分和单糖基化亚型流分的混合物，使用第二个步骤通常洗脱出非糖基化亚型流分。可通过盐步骤从强阳离子交换剂(例如SPToyopearl650)洗脱出抗体用50mM乙酸pH5.0对柱加以平衡、将pH4的蛋白A洗脱液上样后，使用50mM乙酸和210mM氯化钠进行第一个洗脱步骤。然后，用50mM乙酸和350mM氯化钠进行第二个洗脱步骤。通过第一个盐步骤，通常洗脱出双糖基化亚型流分和单糖基化亚型流分的混合物，第二个盐步骤通常洗脱出非糖基化亚型。此外，还可通过盐梯度从强阳离子交换柱(例如SP-Sepharose⑧)洗脱出抗体在pH4.5下对柱预平衡、上样和洗涤之后，应用从50mMMESpH5.8至50mMMES/1M氯化钠pH5.8的盐梯度。此时，通常分别洗脱出双糖基化亚型、单糖基化亚型和非糖基化亚型的流分。随后，双糖基化亚型和单糖基化亚型流分可以合并，以得到产品库和/或所需的抗体混合物。双糖基化和单糖基化的抗体分子(例如免疫球蛋白)的混合物可通过尺寸排阻色谱法进行进一步纯化。可用的柱的例子是Superdex200⑥柱。操作緩沖液的例子包括组氨^/氯化钠，例如10mM组氨^/125mM氯化钠/pH6，和磷酸盐緩沖盐水(PBS)。以流穿模式进行阴离子交换色谱、随后进行浓缩/透析是一种备选的纯化步骤。QSepharose⑧是阴离子交换步骤的树脂的一个例子。例如，可用37.5mMTris/HClpH7.9对来自SP色镨的洗出液进行三倍稀释，并使其通过预先用25mMTris/83mM乙酸钠平衡过的Q-Sepharose柱。收集流穿液体，将其调节至pH5.5，并用例如Hydrosart30kD⑧膜通过超滤浓缩。随后，浓缩物可在例如10倍体积的20mM组氨^7HC1pH5.5中透析。如上文所定义的，抗体亚型还可包含处于抗体分子的恒定/非可变部分的其它糖基化，例如在IgG的Fc部分，例如在IgGl的Fc部分中。Fc部分中的所述糖基化涉及高度保守的糖基化，其特征是位于重链的Asn306位置上(例如，4艮据本文定义的SEQIDNO:1的重链)。本发明的制剂中所包含的抗体的IgG-Fc区域可以是同源二聚体，其包含链间二硫键连接的铰链区、糖基化的CH2结构域(其在CH2的天冬酰胺306(Asn-306)处带有N-连接的寡糖)和非共价配对的CH3结构域。Asn-306上糖基化的寡糖是复合双触角(biantennary)型的，可包含核心的庚糖结构，并具有可变添加的外臂糖。寡糖影响或决定了Fc结构和功能(Jefferis(1998)ImmunolRev.163，50-76)。效应物的功能(编号为具体的特异性的IgG-Fc/效应物配体作用)已被讨论过(Jefferis(2002)ImmunolLett.82(1-2)，57-65和Krapp(2003)JMolBiol.325(5)，979-89)。该保守的Fc位置Asn306对应于Kabat系统中的"Asn297"(Kabat(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,BethesdaMD.)。"稳定剂"这种表述是指能使水性蛋白溶液对抗机械胁迫而化学稳定的可药用稳定剂。此类稳定剂的例子是表面活性剂，例如Tween20、Tween80、Tween40、Tween60、泊洛沙姆、SDS或TritonX或任何其它两亲的分子，或它们的混合物。表面活性剂在水性溶液中的作用已被广泛描述过，它是本领域技术人员公知的。"注射装置"这种表述指可药用的注射装置。此类装置的一个例子是注射器。如上文所述，申请人已发现了使水性蛋白溶液对抗机械胁迫而稳定的方法，所述方法包括下述步骤将所述水性蛋白溶液填装进容器，从而使得所述容器在封闭时基本没有气体顶部空间。在才艮据本发明的方法的任何实施方式中，可通过例如目测、采用重量或体积方法对没有气体顶部空间加以预先测定。在根据本发明的方法的任何实施方式中，容器可被填装至超过容器总体积的约97%。在才艮据本发明的方法的任何实施方式中，气体顶部空间可占容器总体积的少于约3%，优选少于2%，更优选少于1%。在根据本发明的方法的任何实施方式中，蛋白质可以是抗体，特别是单克隆抗体，例如选自IgGl或IgG2和IgG4，优选地选自针对至少一种下述耙点的有效的单克隆抗体IGF-1R、CD20、CD19、CCR5、淀粉样蛋白、0X40、EGF受体、VEGF、HER、IL1R、IL13、IL6、IL17或P-选择素。抗体还可选自本々页域已知的和以Actemra、Avastin或Herceptin的名称公开的那些抗体。冲艮据本发明的方法还可通过下述事实来表征水性蛋白溶液中没有用于对抗外源胁迫(特别是机械胁迫)的稳定剂。在根据本发明的方法的任何实施方式中，机械胁迫可以是振荡。机械胁迫通常在约0。C至约40。C之间的温度下发生。在根据本发明的方法中稳定的水性蛋白溶液包含水、蛋白质和其它常规的可药用赋形剂。根据本发明的方法可通过下述事实来表征一旦被稳定，在振荡时水性蛋白溶液基本没有显著的混浊和/或聚集物和/或可见的颗粒。在根据本发明的一种特定实施方式中，容器不是注射装置，例如不是注射器。容器可包含与开关装置相连的容纳器部分。在一种实施方式中，容器由与开关装置相连的容纳器组成，优选与打开和密封关闭装置相连的容纳器。本发明还涉及包含与开关装置相连的容纳器部分的容器用于使水性蛋白溶液对抗4几械胁迫而稳定的用途。该用途可才艮据上文所述的本发明方法来实现。下述实施例用来阐述本发明，但并非将其限制为本文公开的单独的实施方式。实施例在下述实施例中，在振荡胁迫下，在两种不同温度、不同填装体积和不同量的聚山梨酯条件下，研究了两种单克隆抗体(IgGl)的聚集行为。使用多种分析技术目测、浊度、光遮蔽、尺寸排阻色谱法和动态光散射来在尺寸和数量方面对聚集物形成进行检测和监测。用尺寸为6ml020mm的玻璃瓶来测定容器体积和表面积，它们进而被用于计算每种填装体积的气-液界面程度(通过表面积与体积的比例和顶部空间与体积的比例)。实施例中的所有实验都在这样的瓶中进行。从下表1和表2可以看出，填装体积越小，顶部空体积就越大，这是针对与液体样品相互作用的气体体积量的振荡实验过程中的重要方面。填装至最大体积的样品没有顶部空间，振荡期间液体在瓶中的物理运动受到限制。表面积与填装体积的比例随着填装体积的降低而增加，这使振荡过程中玻璃、表面的接触更多(表2)。表l:计算出的6ml02Omm瓶的表面积和容器体积<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表2:计算出的表面积与填装体积和顶部空间与填装体积的比例<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>通过在5°C和25°C，在168小时的时期内选定的时间点，对含有0%、0.0025%、0,005%和0.01。/0(w/v)的PS20的蛋白制剂随时间进程的情况加以观察，在用橡皮塞和密封铝箔封闭的额定6ml体积的瓶中进行不同填装体积(2.5ml、5.3ml和9ml)的振荡研究。进行该研究是为了评估振荡期间顶部空间对蛋白质稳定性的影响，这是由于蛋白质所暴露的气-液或液-玻璃界面是基于样品瓶中存在的气-液的体积。PS20对蛋白质对抗这些界面以及由此抵抗振荡期间的变性和聚集而加以保护的程度也被评估。图2-9中概括了由于振荡胁迫所致的浑浊、可见的颗粒计数、镜检可见的颗粒和可溶的聚集产物的结果。从上述结果(图2-9)可以看出，瓶中存在顶部空间对在5°C和25°C下受到振荡胁迫的抗体制剂稳定性都有很大影响。处于"最大"填装体积的所有制剂(图2-5的C栏和图6-7的D栏)以及作为对照的安慰剂(数据未显示)保持稳定，受胁迫的样品表现出与未受胁迫的样品相当的结果。填装至最大体积的样品没有显著的顶部空间(少于3%的顶部空间体积)，因此液体在瓶内的运动被限制，没有观察到对蛋白的损害。与市面上的常规药物产品中所用的一样，具有"标准"的顶部空间时，液体样品在振荡过程中具有在瓶内旋转和泼溅的能力，这导致气-液相互作用，从而使得蛋白不稳定。所有样品的液体以同样的方式移动，每种制剂都具有1.1158±0.002mPa.s的动力学粘度。在有和无顶部空间时，振荡时蛋白稳定性之间的差别明显，而在具有体积为2.51111或5.31111的顶部空间的样品之间，振荡时没有观察到显著差别。在两个温度下针对可见的颗粒计数、浊度和镜检可见的颗粒计数进行分析时，即使少到只存在0.0025%的PS20对空瓶和额定填装量(图2-5,A和B栏；图6-7，B和C栏)中的蛋白质也提供了与不含PS并且填装至最大量的样品(图2-5，C栏；图6-7，D栏)相似的保护。但是，通过SEC分析，发现对于聚集产物的抑制，尽管0.0025%的PS20在5。C下足以防止MabA的可溶聚集物形成(图2，最下面一行)，但在25。C振荡条件下还需要显著更高的量(0.01。/。PS20)(图3,最下面一行)。因此，振荡胁迫对形成可溶聚集物的负面影响在25°C时要比在5°C时明显得多，尤其是对于有顶部空间(2.5ml和5.3ml)的样品来说。但是，在整个研究中，在5。C、0。/。PS20下，具有2.5ml填装体积的样品的浑浊导致比25°C下高得多的FTU值。这种浑浊结果与对MabA同一样品的镜检可见的颗粒计数和可溶聚集物分析所得的数据并不对应。浑浊被描述为由于各种大小的镜检可见的颗粒散射和吸收了决定液体光学性质的光，导致溶液混浊或模糊。具有5.3ml额定填装体积MabA和B样品(图3B，6C和7C)显示出随着PS20含量的增加，可溶聚集物和镜检可见的颗粒预期的减少趋势。在2.5ml的MabA填装体积下也观察到了可溶聚集物形成对PS20浓度的强烈依赖性(图3A，最下面一行)，但是有趣的是，与5.3加1填装体积的样品相反，0.0025%PS20的制剂导致了比0%PS20更大量的聚集物。总之，数据显示，在配制期间填装至"最大量"的振荡样品(即，顶部空间最小化)表现为不需要PS来抑制颗粒或聚集物形成(图2-5,C栏；图6-7,D栏)，然而，具有常规顶部空间的样品如果受到胁迫，则需要PS作为稳定剂。所有在玻璃瓶中的市售液体蛋白制剂都有顶部空间(预装填的注射器除外)。目前对于含有蛋白溶液的瓶子所必需的顶部空间体积还没有任何指导或说明。对于商业产品而言，没有顶部空间或仅有最小顶部空间的填装(被定义为封闭的填装体积的97%)对生物医药产品的稳定性有很大价值，使得蛋白溶液中所需的稳定剂最小化。缺少PS20会导致镜检可见的颗粒数量很多，而这一点却通过在同样制剂中不含顶部空间而被完全抑制。另一点是在分析聚集物时正交方法的重要性。如本文中，仅仅基于浊度分析的制剂稳定性表明，0.0025%的PS20足以在25。C振荡期间保护蛋白质，但是与之相反，考虑到SEC数据时必须采用高于0.005%的PS20。数据显示，当受到振荡胁迫时，瓶中顶部空间的存在对蛋白制剂的稳定性有很大影响。填装至最大体积的样品没有显著的顶部空间，因此，在振荡期间液体在瓶中的运动受到限制，没有观察到对蛋白的损害。在不含PS20的制剂中除去顶部空间所产生的在振荡时的保护性能，与存在0.70cm3/cm3和2.61cm3/cm3的顶部空间与体积比例的含有0.0025%PS20的制剂相似，而在0.70cm3/cm3和2.61cm3/cm3这两种体积比例之间没有观察到显著差别。权利要求1.使水性蛋白溶液对抗外源胁迫而稳定的方法，所述方法包括下述步骤将所述水性蛋白溶液填装进容器，以使所述容器在封闭时基本没有气体顶部空间。2.权利要求l所述的方法，其中通过目测、重量或体积方法对没有气体顶部空间加以预先确定。3.权利要求1或2中任意一项所述的方法，其中所述容器被填装至超过所述容器总体积的约97%。4.权利要求1至3中任意一项所述的方法，其中所述气体顶部空间占所述容器总体积的少于约3%。5.权利要求1至4中任意一项所述的方法，其中所述气体顶部空间占所述容器总体积的少于约2%。6.权利要求1至5中任意一项所述的方法，其中所述气体顶部空间占所述容器总体积的少于约1%。7.权利要求1至6中任意一项所述的方法，其中所述蛋白是抗体。8.权利要求1至7中任意一项所述的方法，其中所述蛋白是单克隆抗体。9.权利要求8所述的方法，其中所述单克隆抗体是IgGl或IgG2或IgG4。10.权利要求9所述的方法，其中所述单克隆抗体针对至少一种下述把点GF-1R、CD20、CD19、CCR5、淀粉样蛋白、0X40、EGF受体、VEGF、HER、IL1R、IL13、IL6、IL17或P-选择素。11.权利要求10所述的方法，其中所述单克隆抗体选自Actemra、Avastin或Herceptin。12.权利要求l至ll中任意一项所述的方法，其中所述水性蛋白溶液不含对抗外源胁迫的稳定剂。13.权利要求12所述的方法，其中所述外源胁迫是机械胁迫。14.权利要求13所述的方法，其中所述机械胁迫是振荡。15.权利要求1至14中任意一项所述的方法，其中所述外源胁迫发生在0-40。C的温度下。16.权利要求1至15中任意一项所述的方法，其中所述水性蛋白溶液包含水和蛋白。17.权利要求1至15中任意一项所述的方法，其中所述水性蛋白溶液还包含可药用的赋形剂。18.权利要求1至17中任意一项所述的方法，其中所述水性蛋白溶液在振荡时基本没有显著的浑浊和/或聚集物和/或可见的颗粒。19.权利要求1至18中任意一项所述的方法，其中所述容器不是注射装置。20.权利要求1至19中任意一项所述的方法，其中所述容器不是注射器。21.权利要求1至20中任意一项所述的方法，其中所述容器包含与开关装置相连的容纳器部分。22.权利要求1至21中任意一项所述的方法，其中所述容器由与开关装置相连的容纳器构成。23.权利要求1至22中任意一项所述的方法，其中所述容器由与打开和密封关闭装置相连的容纳器构成。24.包含与开关装置相连的容纳器部分的容器用于使水性蛋白溶液对抗外源胁迫而稳定的用途。25.权利要求24所述的用途，其中所述外源胁迫是机械胁迫。26.权利要求25所述的用途，其中所述机械胁迫是振荡。27.权利要求24至26中任意一项所迷的用途，其用于权利要求1至25中^壬意一项所述的方法中。28.如上所述的本发明。全文摘要本发明涉及使水性蛋白溶液对抗外源胁迫而稳定的方法，该方法包括将所述溶液填装进容器以使所述容器在封闭时基本没有气体顶部空间的步骤。还提供了容器用于稳定水性蛋白溶液的用途。文档编号A61K39/395GK101674847SQ200880014420公开日2010年3月17日申请日期2008年4月22日优先权日2007年5月2日发明者A·帕彭博格,H-C·马勒,S·基泽,W·弗里斯申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司