治疗皮肤溃疡的方法

专利名称：治疗皮肤溃疡的方法
专利说明治疗皮肤溃疡的方法 发明领域 总的来说，本发明的实施方案涉及使用抑制Lp-PLA2蛋白的表达和/或活性的药剂，治疗和/或预防皮肤溃疡的方法。

背景技术：
脂蛋白结合的磷脂酶A2(Lp-PLA2)，在本技术领域中以前也被称为血小板活化因子乙酰水解酶(PAF乙酰水解酶)，是参与脂蛋白脂类或磷脂水解的磷脂酶A2酶超家族的成员。它由几种在对损伤的全身性炎症应答中发挥重要作用的细胞所分泌，所述细胞包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞和肥大细胞。
在LDL向其氧化形式转化的过程中，Lp-PLA2负责水解氧化修饰的磷酯酰胆碱的sn-2酯，产生溶血磷脂酰胆碱和氧化修饰的脂肪酸。Lp-PLA2水解与氧化的LDL结合的截短的磷脂的sn2位置。结果，产生了两种炎性细胞寻靶介导物(home mediator)(非酯化脂肪酸(NEFA)和LYSO PC)。NEFA和LYSO PCs二者都是循环系统中单核细胞的化学吸引剂，在巨噬细胞的活化中发挥重要作用，增加氧化胁迫并影响T淋巴细胞的功能性和即时应答。在人类和猪中，Lp-PLA2通过脂蛋白B与LDL分子结合，一旦进入动脉壁后，氧化的LDL易受Lp-PLA2的水解。
Lp-PLA2作用的这些产物都是循环系统中单核细胞的有力的化学吸引剂。因此，该酶被认为造成了带有胆固醇酯的细胞在动脉中的聚集，引起了与动脉粥样硬化的早期阶段相关的特征性的“脂纹(fattystreak)”，抑制Lp-PLA2酶可用于防止该指纹的沉积(通过抑制溶血磷脂酰胆碱的形成)，并可用于动脉粥样硬化的治疗。
此外，已经提出Lp-PLA2在LDL氧化中发挥了直接的作用。这是由于Lp-PLA2作用的源自多不饱和脂肪酸的脂类过氧化物产物，有助于并增强了总体氧化过程。与这种想法一致的是，Lp-PLA2抑制剂抑制了LDL的氧化。因此，Lp-PLA2抑制剂可能在任何涉及与酶活性和/或激活的炎症应答相关的脂类过氧化的疾病中，具有广泛的应用，例如除了动脉粥样硬化和糖尿病这些病症之外，其它的病症例如类风湿性关节炎、心肌梗塞和再灌注损伤。
皮肤是人体的最大器官。这指的是外表面，因为它覆盖了身体，表现出具有所有器官最大的表面积。此外，这也指的是重量，因为它的重量超过任何单独的内部器官，占体重的大约15％。对于普通成年人来说，皮肤的表面积在1.5-2.0平方米之间，大部分厚度在2-3mm之间。平均每平方英寸皮肤含有650个汗腺、20条血管、60,000个黑素细胞，以及超过1000个神经末梢。
作为器官，皮肤是由多层上皮组织构成的外皮系统表皮、真皮和防护其下的肌肉和器官的下皮。作为与环境的分界面，通过提供防水的、阻挡感染的层，它在针对病原体的防护中发挥了重要作用。它的其它主要功能是隔热和温度调控、感觉以及维生素D和B的合成。通过皮肤也可以实现尿素的少量分泌以及氧气和药物的吸收。因此，皮肤被认为是身体最重要的部分之一。
当皮肤的完整性受到损害时，例如在擦伤或割伤时，上皮层的多个层发生了中断，因此局部丧失了皮肤的保护功能。人体引发了局部伤口愈合应答，主要目的在于封堵上皮的断点并防止病原体侵入。伤口愈合应答涉及增加流向伤口的血液，动员大量免疫细胞(吞噬细胞的巨噬细胞)和炎性应答以清除任何病原体和细胞碎片，向伤口位点调集成纤维细胞并分泌细胞外基质，以及通过再生真皮和表皮层封住伤口。
有时，由于各种医学状况和/或重复的创伤及其组合，该伤口愈合应答受到破坏或阻碍，使得伤口在皮肤中保持为开放的疮口或溃疡。这种开放的疮口易受周围区域的病原体的感染。皮肤溃疡可以从感染和异常炎症增大而来。脓(死亡的免疫细胞、皮肤细胞和感染因子)积累在皮肤溃疡的孔腔中，形成了脓肿。大多数身体部分中的脓肿很少自身愈合，因此在第一次察觉脓肿时需要进行及时的医学关注。
由于皮肤是对抗我们周围环境中任何病原体的第一道防线，因此患有慢性溃疡意味着非常严重和危险的医学状况，需要进行及时和积极的治疗，如果不能及时解决问题，可能导致可怕的后果，例如坏疽、由于截肢导致的失去附肢、败血症，甚至死亡。
慢性皮肤伤口在患有糖尿病、循环系统疾病、癌症、免疫系统疾病、神经疾病或因活动能力受限而受困于轮椅或卧床的人群中，是非常常见的问题。活动能力受限可以源自受伤或疾病导致的瘫痪，或者出生时的缺陷例如脑性麻痹和脊柱裂。慢性皮肤溃疡是著名演员Christopher Reeve死亡的主要原因，他在一次骑马事故中瘫痪。皮肤溃疡的流行程度在四肢麻痹患者中可以高达60％，在由于股骨骨折入院的老年患者中高达66％(参见健康护理政策与研究局的“临床实践准则”第3期(″The Agency for Health Care Policy and Research″ClinicalPractice Guideline Number 3)，AHCPR Pub.No.92-0047)。对于糖尿病患者来说，有15％在其一生中将发生至少一次对感染高度易感的皮肤溃疡。事实上，每年进行的糖尿病截肢中有85％是从溃疡开始的(GloverJ.L.等，1997，Adv.Wound Care 1033-38)。
据估计，仅仅在美国，就有5-7百万人患有慢性皮肤溃疡(Petrie N等，2003，Surgical Clinics of North America 83(3)194-9)。在美国，每年用于慢性伤口的总的直接花费，包括伤口诊断和外科手术过程、药物、伤口闭合装置以及医院和医生的费用，合计约为200亿美元(Frykberg R等，2000，J Foot Ankle Surg 39(5Suppl)1-60；Harding K等，2002，BMJ 324(7330)160-3)。慢性溃疡的间接花费，例如误工时间和生活质量的损失，没有包含在该估算值中，并且难以定量，但是可以想象是非常巨大的。
当前的慢性伤口处理包括药物、例如抗细菌和抗真菌药物、溶解血栓的药剂或疏通血栓的药剂例如组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)，使用压迫绷带，生物工程化的皮肤代用品(培养的表皮同种异体移植物)，电刺激，高级药物投送系统例如基于离子电渗透的透过真皮投送系统，组织修复物质例如血小板衍生的和自体生长因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(G-M CSF)和间质聚糖(mesoglycan)的投送，负压伤口疗法和超声。然而，尽管存在着治疗和促进慢性皮肤溃疡愈合的多学科方法，进行了积极的感染处理并改善血液循环，但慢性皮肤溃疡仍继续成为主要的临床问题。大多数情况下，医生没有办法较早地确定哪些伤口可能需要这些高级的和昂贵的步骤。因此，在处于发展慢性皮肤溃疡的高风险群体中的人中，对于治疗以及预防皮肤溃疡的新进展，仍然存在着需求。此外，对于在有风险人群中预防皮肤溃疡的复发性发作的新进展，存在着迫切的需求。
发明概述 本发明涉及在对象中治疗和/或预防皮肤溃疡的方法，包括给需要的对象施用药物组合物，该药物组合物含有抑制Lp-PLA2蛋白的活性和/或表达的药剂。
本发明的一个实施方案是治疗和/或预防皮肤溃疡的方法，包括确定所述对象是否患有或有风险患有皮肤溃疡，以及给患有皮肤溃疡或有发展皮肤溃疡风险的对象施用药物组合物，该药物组合物含有抑制Lp-PLA2蛋白的活性和/或表达的药剂。
能够通过本发明的方法治疗的皮肤溃疡选自褥疮溃疡、烫伤溃疡、冻疮溃疡、血管溃疡、代谢溃疡、神经病变性溃疡、伴随结缔组织疾病的溃疡、医原性溃疡、人为溃疡、创伤性溃疡、肿瘤溃疡、伴随免疫疾病和病症以及自体免疫疾病的溃疡、伴随血液疾病的溃疡、伴随白细胞病症的溃疡、异常蛋白血症溃疡、由病原体感染引起的溃疡、由寄生虫侵袭引起的溃疡以及伴随着病因未知的疾病或病症的溃疡。
发展皮肤溃疡的风险因子包括以前有过与倾向于引起皮肤溃疡的疾病或病症或创伤相关的皮肤溃疡急性发作；年老；卧床不起；坐轮椅；营养不良；缺少身体活动；过量饮酒；尿失禁；肠失禁；皮肤薄脆；智力减退；吸烟；已被诊断有或患有糖尿病；高血压；高半胱氨酸含量高；体重过重；静脉曲张家族史；患有脉管炎；已被诊断患有凝血病症；从事需要长时间站立的职业；患有镰刀细胞贫血症；服用含有溴化物的药物；进行基于羟脲的化疗；肾衰竭；麻疯病；烧伤；以及冻疮。
在一个实施方案中，对象具有至少一种风险因子。在另一个实施方案中，对象具有至少两种风险因子。
在一个实施方案中，抑制Lp-PLA2蛋白活性的药剂是小分子、核酸、核酸类似物、蛋白、抗体、肽、适体或其变体或片段。
在某些实施方案中，抑制Lp-PLA2蛋白活性的药剂是小分子，例如但不限于Lp-PLA2蛋白的小分子可逆或不可逆抑制剂。在某些实施方案中，这样的小分子是基于嘧啶酮的化合物。在某些实施方案中，Lp-PLA2的小分子抑制剂是例如但不限于1-(N-(2-(二乙基氨基)乙基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)-氨基羰基甲基)-2-(4-氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮(也被称为SB480848)，或其盐。在某些实施方案中，Lp-PLA2的小分子抑制剂是例如但不限于N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)乙酰胺，或其盐。在某些实施方案中，Lp-PLA2的小分子抑制剂是例如但不限于N-(1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫基)-4-氧-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺，或其盐。在某些实施方案中，Lp-PLA2的小分子抑制剂是例如但不限于2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸甲酯，或其盐。
其它形式的抑制剂包括是RNAi药剂的核酸药剂，例如siRNA、shRNA、miRNA、dsRNA或核酶，或其变体。
在一个实施方案中，抑制Lp-PLA2蛋白活性的药剂可以与其它治疗药剂一起给药于对象。这些其它治疗药剂选自抗微生物疗法、抗寄生虫疗法、抗肥胖疗法、糖尿病疗法、心血管疾病疗法、肾衰竭疗法、脉管炎疗法、静脉机能不全疗法、动脉机能不全疗法、癌症疗法、免疫抑制疗法、免疫缺陷疗法、甾族类化合物疗法、烧伤疗法和精神疗法。
在另一个实施方案中，抑制Lp-PLA2蛋白活性的药剂与其它治疗药剂和标准的伤口护理处理一起施用于对象。
在另一个实施方案中，抑制Lp-PLA2蛋白活性的药剂与生物工程化的皮肤代用品一起施用于对象。
附图简述

图1、用Lp-PLA2抑制剂SB480848治疗的糖尿病/高胆固醇血症(DM/HC)猪和没有用Lp-PLA2抑制剂治疗的DM/HC猪中，脓肿(溃疡中聚集的脓)发生和溃疡治疗的时间线(天数)。在未治疗的对照组中有21只DM/HC猪，用SB480848治疗的实验组中有22只DM/HC猪。#948和#963猪用Lp-PLA2抑制剂治疗。这些猪在开始抑制剂治疗前发生了脓肿。对脓肿进行了治疗，它们平均在1-2周的时间内痊愈。在开始每日施用单剂SB480848抑制剂治疗后，没有发生进一步的脓肿。#975、#1024、#949、#947、#1007和#15猪没有用Lp-PLA2抑制剂SB480848治疗。所有这些猪都发生了脓肿，其中两只猪有复发性脓肿发生，一只猪患有慢性溃疡，持续了超过两个月。
发明详述 本发明的实施方案是基于下面的发现，即DM/HC猪，当用抑制Lp-PLA2酶的药剂进行治疗时，没有发展出任何皮肤溃疡。DM/HC猪模型在表现型上显示出许多与高风险人类糖尿病患者相似之处。一个关键的相似处是倾向于发生皮肤脓肿——感染性皮肤溃疡，它由葡萄球菌、人类糖尿病型感染最通常分离到的微生物、引起。作为并发症例如神经病、外周血管病和通常与不受控制的升高的血糖相关的愈合不良的结果，人类糖尿病患者非常倾向于足部溃疡。当用Lp-PLA2酶抑制剂SB480848对猪进行为期6个月的治疗时，没有猪发生任何皮肤脓肿。此外，已经发现，在治疗开始时患有活动的皮肤脓肿的猪，一旦最初的脓肿治愈后，保持没有皮肤脓肿，并且猪不会发生皮肤脓肿的复发性发作。
因此，本发明的一个实施方案是通过抑制Lp-PLA2蛋白的表达和/或活性，在需要治疗的对象中治疗皮肤溃疡。本发明的另一个实施方案包括在以前患过皮肤溃疡的对象中预防皮肤溃疡，方法包括抑制Lp-PLA2蛋白的表达和/或活性。在另一个实施方案中，发明包括通过抑制Lp-PLA2蛋白的表达和/或活性，在有发生皮肤溃疡的风险的对象中预防皮肤溃疡。
定义 除非在本文中另有定义，使用的与本申请相关的科学和技术术语将具有本技术领域的普通专业人员所通常理解的意义。此外，除非上下文需要，单数术语将包含复数形式，复数术语将包含单数形式。
本文中使用的术语“皮肤溃疡”是指皮肤上缺少表皮的开放疮口。其下的真皮或下皮可能暴露并可见。周围的皮肤可能发红并发炎。任何种类的炎症过程的主要症状和征兆是发红、热、肿胀、疼痛和失去功能。这样的开放疮口易于受到病原体例如细菌、真菌和病毒的感染。在后期情况下，疮口可以渗出流体脓。脓(死亡的免疫细胞、皮肤细胞、细胞流体和感染因子)聚集在皮肤溃疡的孔腔中，形成了脓肿。
在本文中，术语“疾病”或“病症”可以互换使用，是指身体或某些器官的状态的任何变化，妨碍或扰乱了功能的履行，和/或在患病或与其接触的人中引起症状例如不适、机能障碍、痛苦或甚至死亡。疾病或病症也可以称为失调(distemper)、不适(ailing)、小病(ailment)、疾病(malady)、紊乱(disorder)、疾病(sickness)、生病(illness)、身体不适(complaint)、inderdisposion或affectation。
术语“药剂”是指通常不存在或不以被给药的水平存在于细胞中的任何实体。药剂可以选自化学物质，小分子，核酸序列，核酸类似物，蛋白，肽，适体(aptamer)、抗体或其片段。核酸序列可以是RNA或DNA，可以是单链或双链的，可以选自编码目标蛋白的核酸，寡核苷酸，核酸类似物例如肽核酸(PNA)、假互补PNA(pc-PNA)、锁核酸(LNA)等。这样的核酸序列包括例如但不限于编码蛋白、例如用作转录阻遏物的蛋白的核酸序列，反义分子，核酶，小抑制核酸序列例如但不限于RNAi、shRNAi、siRNA、微RNAi(mRNAi)，反义寡核苷酸等。蛋白和/或肽或其片段可以是任何目标蛋白，例如但不限于突变蛋白；治疗性蛋白和截短的蛋白，其中蛋白通常不存在于或以较低水平表达在细胞中。蛋白也可以选自突变蛋白，遗传工程改造的蛋白，肽，合成肽，重组蛋白，嵌合蛋白，抗体，中型抗体(midibodies)，微型抗体(minibodies)，三链抗体(triabodies)，人源化蛋白，人源化抗体，嵌合抗体，修饰蛋白及其片段。可选地，作为将核酸序列导入细胞中及其转录，从而导致在细胞中产生Lp-PLA2的核酸和/或蛋白抑制剂的结果，药剂可以是细胞内的。在某些实施方案中，药剂是任何化学物质、实体或基团，包括但不限于合成的和天然存在的非蛋白实体。在某些实施方案中，药剂是具有化学基团的小分子。例如，化学基团包括未取代的或取代的烷基、芳香族或杂环基团，包括大环内酯、细霉素(leptomycin)和相关的天然产物或其类似物。药剂可以已知具有所需的活性和/或性质，或者可以从多样化合物文库中筛选。
本文使用的术语“抑制”，当涉及pL-PLA2蛋白或多肽或其变体或同源物的表达或活性时，不是必需意味着表达和/或活性的完全抑制。相反，是指蛋白、多肽或多核苷酸的表达或活性被抑制到一定程度、和/或一段时间，使得足以产生所需效应。具体来说，可以使用Lp-PLA2抑制的分析方法来测定Lp-PLA2的抑制，例如但不限于使用本文公开的Lp-PLA2蛋白的生物分析方法。抑制Lp-PLA2的药剂是将Lp-PLA2蛋白和/或Lp-PLA2的功能抑制至少10％的药剂。在某些实施方案中，Lp-PLA2抑制剂是将Lp-PLA2蛋白或Lp-PLA2的表达抑制至少10％的药剂。
本文使用的术语“Lp-PLA2”是指通过本文公开的方法所抑制的蛋白靶。Lp-PLA2可以与Lp-PLA2和脂蛋白结合的磷脂酶A2互换使用，在本技术领域中以前也被称为血小板活化因子乙酰水解酶(PAF乙酰水解酶)。人类Lp-PLA2由登记号U20157(SEQ ID NO1)或Ref Seq IDNM_005084(SEQ ID NO2)所对应的核酸编码，或者人类Lp-PLA2对应于登记号NP_005075(SEQ ID NO3)所对应的蛋白序列，它们公开在美国专利申请5,981,252中，在此特意以其全文引为参考。
本文中使用的“基因沉默”或“沉默的基因”，在指称n RNAi分子、例如siRNA或miRNA的活性时，是指细胞中靶基因的mRNA水平，与不存在miRNA或RNA干扰分子的细胞中发现的mRNA水平相比，降低了至少大约5％、大约10％、大约20％、大约30％、大约40％、大约50％、大约60％、大约70％、大约80％、大约90％、大约95％、大约99％、大约100％。在一个优选实施方案中，mRNA水平降低了至少大约70％、大约80％、大约90％、大约95％、大约99％、大约100％。
本文使用的术语“RNAi”是指任何类型的干扰RNA，包括但不限于siRNAi、shRNAi、内源微RNA和人造微RNA。例如，它包括以前被鉴定为siRNA的序列，而不论RNA的下游加工机制如何(即尽管siRNAs据信具有特定的导致mRNA裂解的体内加工方法，但这样的序列在本文描述的侧翼序列的情况下可以整合在载体中)。
本文使用的“siRNA”是指形成双链RNA的核酸，当siRNA与靶基因例如Lp-PLA2存在或表达于相同的细胞中时，该双链RNA具有降低或抑制基因或靶基因表达的能力。双链RNA siRNA可以通过互补链形成。在一个实施方案中，siRNA是指能够形成双链siRNA的核酸。siRNA的序列可以对应于全长靶基因或其部分序列。典型情况下，siRNA的长度为至少大约15-50个核苷酸(例如双链siRNA的每个互补序列长度为大约15-50个核苷酸，双链siRNA的长度为大约15-50个碱基对，优选为大约19-30碱基核苷酸，优选为大约20-25个核苷酸长，例如长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸)。
本文使用的“shRNA”或“小发夹RNA”(也称为茎环)是一种类型的siRNA。在一个实施方案中，这些shRNAs由短的、例如大约19到大约25个核苷酸的反义链，其后跟着大约5到9个核苷酸的核苷酸环以及类似的正义链构成。可选地，正义链可以在核苷酸环结构前面，反义链可以跟在后面。
术语“微RNA”或“miRNA”在本文中可以互换使用，是指内源的RNAs，其中某些已知可以在转录后水平上调控蛋白编码基因的表达。内源微RNA是基因组中天然存在的小RNAs，能够调节mRNA的生产利用。术语人造微RNA包括除了内源微RNA之外，任何类型的能够调节mRNA的生产利用的RNA序列。微RNA序列已经描述在出版物中，例如Lim等，Genes & Development，17，p.991-1008(2003)；Lim等，Science 299，1540(2003)；Lee和Ambros，Science，294，862(2001)；Lau等，Science 294，858-861(2001)；Lagos-Quintana等，Current Biology，12，735-739(2002)；Lagos Quintana等，Science 294，853-857(2001)；以及Lagos-Quintana等，RNA，9，175-179(2003)，在此引为参考。多种微RNAs也可以整合到前体分子中。此外，miRNA类的茎环可以在细胞中表达，作为投送人造miRNAs和短干扰RNAs(siRNAs)的载体，用于通过miRNA和或RNAi途径调节内源基因的表达。
本文使用的“双链RNA”或“dsRNA”是指含有两条链的RNA分子。双链分子包括由单个RNA分子自身折回形成双链结构的分子。例如，单链miRNA所源自的祖分子，被称为前miRNA(Bartel等，2004.Cell116281-297)，其茎环结构含有dsRNA分子。
术语“对象”、“个体”和“患者”在本文中可以互换使用，是指被提供以本发明的药物组合物进行治疗的动物，例如人类。本文使用的术语“对象”是指人类或非人类动物。术语“非人类动物”或“非人类哺乳动物”在本文中可以互换使用，包括了所有脊椎动物，例如哺乳动物，例如非人类灵长动物(特别是高等灵长动物)、绵羊、狗、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛，以及非哺乳动物例如鸡，两栖动物，爬行动物等。在一个实施方案中，对象是人类。在另一个实施方案中，对象是作为疾病模型的实验动物或动物替代物。
本文使用的术语“基因”可以是含有转录和/或翻译调控序列和/或编码区和/或非翻译序列(例如内含子，5′-和3′-非翻译序列和调控序列)的基因组基因。基因的编码区可以是为氨基酸序列或功能性RNA，例如tRNA、rRNA、催化RNA、siRNA、miRNA和反义RNA编码的核苷酸序列。基因也可以是对应于编码区(例如外显子和miRNA)的mRNA或cDNA，任选地含有连接在其上的5′-或3′-非翻译序列。基因也可以是体外生产的扩增的核酸分子，包含所有或部分编码区和/或连接在其上的5′-或3′-非翻译序列。
本文使用的术语“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”可以是指至少两个共价连接在一起的核苷酸。正如本领域技术人员所认识到的，对单一链的描述也定义了互补链的序列。因此，核酸也包含了所描述的单链的互补链。正如本领域技术人员也将认识到的，核酸的许多变体也可用于与给定的核酸相同的目的。因此，核酸也包含了基本上相同的核酸及其互补体。正如本领域技术人员还将认识到的，单一链提供了探针，用于可以在严紧杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸也包含了在严紧杂交条件下杂交的探针。
核酸可以是单链的或双链的，或者可以同时含有双链和单链序列部分。核酸可以是DNA、既可以是基因组DNA也可以是cDNA，RNA，或杂合体，其中核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤的组合。核酸可以通过化学合成方法或通过重组方法获得。
一般来说，核酸含有磷酸二酯键，尽管可以包含可以具有至少一个不同键合、例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基氨基磷酸酯键合和肽核酸骨架和键合的核酸类似物。其它核酸类似物包括具有正电骨架、非离子骨架和非核糖骨架的核酸类似物，包括在美国专利Nos.5,235,033和5,034,506中描述的，该专利引为参考。含有一个或多个天然存在的或修饰的核苷酸的核酸，也包含在核酸的一个定义中。修饰的核苷酸类似物可以位于例如核酸分子的5′-末端和/或3′-末端。核苷酸的代表性的例子可以选自糖或骨架修饰的核糖核苷酸。但是，应该指出，核苷酸碱基修饰的核糖核苷酸，即含有非天然存在的核苷酸碱基代替了天然存在的核苷酸碱基的核糖核苷酸，例如在5-位修饰的尿苷或胞苷，例如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；在8-位修饰的腺苷和鸟苷，例如8-溴鸟苷；去氮核苷酸，例如7-去氮腺苷；O-和N-烷基化的核苷酸，例如N6-甲基腺苷，也是适合的。2′OH基团可以被选自H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团取代，其中R是C-C6烷基、链烯基或烷炔基，卤素是F、Cl、Br或I。可以出于各种不同原因修饰核糖-磷酸骨架，例如增加这些分子在生理环境中的稳定性和半衰期，或在生物芯片上用作探针。可以制造天然存在的核酸与类似物的混合物；可选地，可以制造不同核酸类似物的混合物，以及天然存在的核酸与类似物的混合物。
本文使用的术语“载体”是指含有复制起点的核酸序列。载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，或整合到宿主基因组中的载体。
本文中使用的术语“治疗”包括减轻或缓解与皮肤溃疡有关的病症、疾病或紊乱的至少一种不利效应或症状。
一般来说，如果在用Lp-PLA2抑制剂治疗后，实现了在病变或溃疡严重性的临床可接受规模上至少一个分类等级或水平的改善，那么治疗被认为是“有效地”。可选地，或此外，治疗后皮肤病变的尺寸(面积和/或深度)降低了至少25％，被认为是“有效的”治疗。
通过在用Lp-PLA2抑制剂开始治疗后，对有风险发生皮肤病变的对象的皮肤进行评估，来监测预防的效率。在有风险个体中不存在皮肤病变，被认为是“有效地”预防的征兆。同样地，当个体具有皮肤病变史时，不存在新的病变，或甚至任何新的病变的频率或严重性降低了例如50％或以上，表明本文描述的方法“有效地”预防了皮肤溃疡。
本文使用的术语“有效量”是指药物组合物的治疗药剂的量，提供了本文中所定义的“有效”治疗。本文中使用的有效量也包括足以阻止或延迟疾病症状的发生、改变症状疾病的过程(例如但不限于减慢疾病症状的进展)、或逆转疾病的症状的量。
本文中使用的术语“给药”和“导入”可以互换使用，是指通过导致药剂至少部分定位于所需位点的方法或途径，将本文公开的抑制Lp-PLA2的药剂放置到对象中。本发明的化合物，可以通过任何适合的、在对象中产生有效治疗的途径进行给药。
术语“载体”可以与“质粒”互换使用，是指能够运输与其连接的另一个核酸的核酸分子。能够指导与其可操作连接的基因和/或核酸序列的表达的载体，在本文中被称为“表达载体”。一般来说，在重组DNA技术中使用的表达载体通常采取“质粒”的形式，它是指环状双链DNA环，在其载体形式中不与染色体结合。其它表达载体可以用于本发明的不同实施方案中，例如但不限于质粒、游离体、噬菌体或病毒载体，这样的载体可以整合到宿主的基因组中，或在特定细胞中自主复制。也可以使用其它本领域技术人员已知的具有同样功能的表达载体形式。表达载体包括用于稳定或短暂表达编码DNA的表达载体。
在本文中使用的不带数量词的表达方式是指一个或一个以上(即至少一个)冠词的语法宾语。例如，元件是指一个元件或一个以上元件。
本文使用的“医原性的”是指在患者中由医生的活动、方式或疗法所诱导的。例如，由用于某种疾病或紊乱的药物疗法所诱导的。
Lp-PLA2总论 Lp-PLA2在本技术领域也被称为别名Lp-PLA2、LDL-PLA2、脂蛋白结合的磷脂酶A2、PLA2G7、磷脂酶A2(VII型)或血小板活化因子乙酰水解酶(PAF乙酰水解酶或PAFAH)。人类Lp-PLA2由对应于GenBank登记号U20157(SEQ ID NO1)或Ref Seq IDNM_005084(SEQID NO2)的核酸编码，人类Lp-PLA2对应于GenBank登记号NP_005075(SEQ ID NO3)所对应的蛋白序列，它们公开在美国专利申请5,981,252中，在此特意以其全文引为参考。
磷脂酶A2酶脂蛋白结合的磷脂酶A2(Lp-PLA2)，其序列、分离和纯化，编码酶的分离的核酸，以及用编码酶的DNA转化的重组宿主细胞，公开在WO 95/00649(SmithKline Beecham plc)中，在此特意以其全文引为参考。来自同一个研究组的后续出版物进一步描述了该酶(Tew D等，Arterioscler Thromb Vas Biol 199616；591-9)，其中它被称为LDL PLA2，晚些时候的专利申请(WO 95/09921，Icos Corporation)和《自然》杂志(Nature)中的相关出版物(Tjoelker等，vol 374，6 April1995，549)描述了与Lp-PLA2具有基本上相同序列的酶PAF-AH。
已经显示，Lp-PLA2在低密度脂蛋白(LDL)向其氧化形式转变过程中，负责磷脂酰胆碱向溶血磷脂酰胆碱的转化。已知酶水解氧化型磷脂酰胆碱的sn-2酯，给出溶血磷脂酰胆碱和氧化修饰的脂肪酸。Lp-PLA2作用的两种产物都具有生物学活性，特别是溶血磷脂酰胆碱，有几种前致动脉粥样化活性归因于它，包括单核细胞趋化性和内皮细胞机能障碍的诱导，这两者都促进了动脉壁中源自单核细胞的巨噬细胞积累。
抑制Lp-PLA2的药剂 在某些实施方案中，本发明涉及了Lp-PLA2的抑制。在某些实施方案中，抑制是编码Lp-PLA2的核酸转录本的抑制，例如信使RNA(mRNA)的抑制。在可选实施方案中，Lp-PLA2的抑制是Lp-PLA2的表达的抑制和/或其基因产物，例如Lp-PLA2多肽或蛋白、或其同工型的活性的抑制。本文中使用的术语“基因产物”是指从基因转录的RNA，或基因编码的或从RNA翻译的多肽。
在某些实施方案中，Lp-PLA2的抑制是通过药剂。人类可以使用任何药剂，例如但不限于核酸、核酸类似物、肽、噬菌体、噬粒、多肽、肽模拟物、核糖体、适体(aptamers)、抗体、小的或大的有机或无机分子，或其任何组合。在某些实施方案中，用于本发明的方法的药剂包括用作Lp-PLA2表达抑制剂的药剂，例如编码Lp-PLA的mRNA的抑制剂。
用于本文公开的方法的药剂也可以抑制基因表达(即抑制和/或阻遏基因的表达)。在本技术领域中，这样的药剂被称为“基因沉默物”，对于本领域技术人员来说是熟知的。例子包括但不限于核酸序列，例如RNA、DNA或核酸类似物，可以是单链的或双链的，可以选自编码目标蛋白的核酸、寡核苷酸、核酸、核酸类似物，例如但不限于肽核酸(PNA)、假性互补PNA(pc-PNA)、锁核酸(LNA)及其衍生物等。核酸药剂也包括例如但不限于用作转录阻遏蛋白的蛋白的编码核酸序列、反义分子、核酶、小抑制性核酸分子，例如但不限于RNAi、shRNAi、siRNA、微小RNAi(miRNA)、反义寡核苷酸等。
本文中使用的在方法中用作Lp-PLA2表达的抑制剂和/或抑制Lp-PLA2蛋白功能的药剂，可以是任何类型的实体，例如但不限于化学物质、核酸序列、核酸类似物、蛋白、肽或其片段。在某些实施方案中，药剂是任何化学物质、实体或基团，包括但不限于合成的和天然存在的非蛋白的实体。在某些实施方案中，药剂是具有化学基团的小分子。例如，在某些实施方案中，化学基团是例如本文公开的基于嘧啶二酮的化合物。
在可选实施方案中，可用于本文公开的方法的药剂，是抑制Lp-PLA2的基因表达或Lp-PLA2蛋白的功能的蛋白和/或肽或其片段。这样的药剂包括例如但不限于蛋白变异体、突变的蛋白、治疗性蛋白、截短的蛋白和蛋白片段。蛋白药剂也可以选自突变蛋白、遗传工程改造的蛋白、肽、合成的肽、重组蛋白、嵌合蛋白、抗体、中型抗体(midibodies)，微型抗体(minibodies)，三链抗体(triabodies)，人源化蛋白，人源化抗体，嵌合抗体，修饰蛋白及其片段。
可选地，可用于本文公开的方法中作为Lp-PLA2的抑制剂的药剂可以是化学物质、小分子、大分子或实体或基团，包括但不限于合成的和天然存在的非蛋白实体。在某些实施方案中，药剂是具有本文公开的化学基团的小分子。
小分子 在某些实施方案中，抑制Lp-PLA2的药剂是小分子。Lp-PLA2的不可逆或可逆抑制剂可用于本发明的方法中。
Lp-PLA2的不可逆抑制剂公开在专利申请WO 96/13484、WO96/19451、WO 97/02242、WO97/217675、WO97/217676、WO97/41098和WO97/41099(SmithKline Beecham plc)中，在此特别以其全文引为参考，其中尤其是公开了各种不同系列的4-亚硫酰/亚硫酰/磺酰氮杂环丁酮化合物，它们是酶Lp-PLA2的抑制剂。这些是不可逆的酰化抑制剂(Tew等，Biochemistry，37，10087，1998)。
在人类中有效的Lp-PLA2抑制剂为普通技术人员所熟知，包括正经历评估、例如临床前期和临床评估，包括II期临床试验的抑制剂。SmithKline Beecham及其后继者GlaxoSmithKline已经提交和出版了许多申请。受让于它们的相关已出版公开的名单是WO01/60805，WO02/30904，WO03/016287，WO00/66567，WO03/042218，WO03/042206，WO03/042179，WO03/041712，WO03/086400，WO03/087088，WO02/30911，WO99/24420，WO00/66566，WO00/68208，WO00/10980和WO2005/021002，在此特意以其全文引为参考。此外，也参考美国临时专利申请60/829,328和60/829,327，二者已经在2006年10月13日提交，在此也特意以其全文引为参考。
可用于本文公开的方法的其它Lp-PLA2抑制剂描述在已出版的专利申请中，例如WO2006063791-A1、WO2006063811-A1、WO2006063812-A1和WO2006063813-A1，都在Bayer Healthcare的名下；以及受让于韩国Res.Inst.Bioscience & Biotechnology的US2006106017-A1，在此特意以其全文引为参考。Lp-PLA2抑制剂也包括已知药剂，例如但不限于包括使用具有烟酸(参见www.genengnews.com/news/bnitem.aspx？name＝6724568)和非诺贝特(fenofibrate)(参见www.genengnews.com/news/bnitem.aspx？name＝14817756&taxid＝19)的菌株。
所有上述段落中提出的申请，在此引为参考。据信，这些文献中公开的任何或所有化合物，都可用于预防或治疗皮肤溃疡。本技术领域的普通专业人员，可以使用在本文中描述并在实施例中示例的糖尿病皮肤溃疡的猪模型，来确定哪些公开的化合物或其它Lp-PLA2抑制剂，例如抗体、小分子或RNAi，对本文宣称的皮肤溃疡的治疗或预防有效。
在具体的实施方案中，在此特意以其全文引为参考的美国专利6,649,619和7,153,861(以及国际专利申请WO 01/60805)，和在此以其全文引为参考的美国专利7,169,924(以及国际专利申请WO 02/30911)中公开的Lp-PLA2抑制剂，可以在本文公开的方法中用于皮肤溃疡的预防或治疗。在某些实施方案中，在此以其全文引为参考的美国专利公开2005/0033052A1，以及国际专利申请WO 02/30904、WO 03/042218、WO 03/042206、WO03/042179、WO 03/041712、WO 03/086400和WO03/87088中公开的Lp-PLA2抑制剂，是可逆的Lp-PLA2抑制剂。
式(I)人们可以使用一组公开在国际专利申请WO 01/60805中公开的可逆Lp-PLA2抑制剂，从该专利申请产生了美国专利6,649,619和7,153,861，在此以其全文引为参考，其公开内容尽管已经在本文献中提出，仍在此全文引用。较狭窄的一组目标化合物是在WO 01/60805中描述的、在美国专利6,649,619和7,153,861中要求权利的式(I)的化合物，即
其中 Ra和Rb与它们连接的嘧啶环碳原子一起，形成了稠合5元碳环； R2是由一到三个氟原子取代的苯基； R3是甲基或由NR8R9取代的C(1-3)烷基；或 R3是Het C(0 2)烷基，其中Het是具有N的5元或7元杂环，其中N是未取代的，或由C(1 6)烷基取代； R4和R5一起形成了4-(4-三氟甲基苯基)苯基基团； R8和R9可以是相同的或不同的，选自氢或C(1 6)烷基； X是S，或其可药用的盐。
其中更感兴趣的是下列化合物，它们都在式(I)的范围内，并在上面提到的申请和专利中公开 1-(N-(2-(二乙基氨基)乙基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)-氨基羰基甲基)-2-(4-氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮，用于本文描述的猪的研究中； 1-(N-(2-(二乙基氨基)乙基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)-氨基羰基甲基)-2-(2，3-二氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮； 1-(N-(2-(二乙基氨基)乙基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)氨基-羰基甲基)-2-(3，4-二氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮； 1-(N-(2-(二乙基氨基)乙基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)氨基-羰基甲基)-2-(2，3，4-三氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮； 1-(N-(2-(二乙基氨基)乙基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)氨基-羰基甲基)-2-(2-氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮； 1-(N-甲基-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)氨基羰基甲基)-2-(4-氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮； 1-(N-(2-(1-哌啶基)乙基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)氨基-羰基甲基)-2-(4-氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮； 1-(N-(1-乙基哌啶-4-基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)氨基-羰基甲基)-2-(4-氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮； 1-(N-(2-乙基氨基-2-甲基丙基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)-氨基羰基甲基)-2-(4-氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮； N-(2-叔丁基氨基乙基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)氨基-羰基甲基)-2-(4-氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮； 1-(N-(1-甲基哌啶-4-基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)-氨基羰基甲基)-2-(4-氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮 1-(N-(1-异丙基哌啶-4-基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)-氨基羰基甲基)-2-(4-氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮； 1-(N-(1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)-氨基羰基甲基)-2-(4-氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮； 1-(N-(2-(乙基氨基)乙基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)-氨基羰基甲基)-2-(4-氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮；或这些化合物的可药用的盐。
用于制备这些化合物的方法公开在提到的文献中。
用于制造1-(N-(2-(二乙基氨基)乙基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)-氨基羰基甲基)-2-(4-氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮的第二种方法可以在申请WO 03/016287(美国公开号20050014793A1)中发现，在此以其全文引为参考。
式(II) 另一组可用于本发明方法的实施的化合物公开在WO 02/30911中；美国专利7,169,924对应于该国际申请。二者都以其全文引用。在该案子中的通式，在本文中用式(II)代表，如下
其中 R1是芳基，被1、2、3或4个取代基任选取代，取代基可以是相同的或不同的，选自C(1-6)烷基、C(1-6)烷氧基、C(1-6)硫代烷基、羟基、卤素、CN和单或全氟-C(1 4)烷基； R2是卤素、C(1 3)烷基、C(1 3)烷氧基、羟基C(1 3)烷基，C(1 3)硫代烷基、C(1 3)烷基亚磺酰基、氨基C(1-3)烷基、单或二-C(1-3)烷基氨基C(1-3)烷基、C(1 3)烷基羰基氨基C(1-3)烷基、C(1 3)烷氧基C(1 3)烷基羰基氨基C(1-3)烷基、C(1 3)烷基磺酰基氨基C(1-3)烷基、C(1 3)烷基羧基、C(1 3)烷基羧基C(1 3)烷基，并且 R3是氢、卤素、C(1-3)烷基或羟基C(1-3)烷基；或 R2和R3与它们连接的嘧啶酮环碳原子一起，形成稠合5元或6元碳环；或 R2和R3与它们连接的嘧啶酮环碳原子一起，形成了稠合苯并或杂芳环的环，被1、2、3或4个取代基任选取代，取代基可以是相同的或不同的，选自卤素、C(1 4)烷基、氰基、C(1-6)烷氧基、C(1-6)硫代烷基或单或全氟-C(1-4)烷基； R4是氢或C(1-6)烷基，它可以是未取代的或由1、2或3个取代基取代，取代基选自羟基、卤素、OR7、COR7、羧基、COOR7、CONR9R10、NR9R10、NR7COR8、单或二(羟基C(1 6)烷基)氨基和N羟基C(1-6)烷基-NC(1-6)烷基氨基；或 R4是Het-C(0-4)烷基，其中Het是含有N以及可选的O或S的5元到7元杂环，其中N可以被COR7、COOR7、CONR9R10，或可选地被选自羟基、卤素、OR7、COR7、羧基、COOR7、CONR9R10或NR9R10例如哌啶-4-基、吡咯烷-3-基取代的C(1 6)烷基取代； R5是芳基或杂芳环，被1、2、3或4个取代基任选取代，取代基可以是相同的或不同的，选自C(1-6)烷基、C(1-6)烷氧基、C(1 6)硫代烷基、芳基C(1-6)烷氧基、羟基、卤素、CN、COR7、羧基、COOR7、NR7COR8、CONR9R10、SO2NR9R10、NR7SO2R8、NR9R10、单到全氟代-C(1 4)烷基和单到全氟代-C(1 4)烷氧基； R6是芳基或杂芳环，进一步被1、2、3或4个取代基任选取代，取代基可以是相同的或不同的，选自C(1-18)烷基、C(1-18)烷氧基、C(1 6)硫代烷基、C(1 6)烷基磺酰基、芳基C(1-6)烷氧基、羟基、卤素、CN、COR7、羧基、COOR7、CONR9R10、NR7COR8、SO2NR9R10、NR7SO2R8、NR9R10、单到全氟代-C(1 4)烷基和单到全氟代-C(1 4)烷氧基，或C(5-10)烷基； R7是氢或C(1-12)烷基，例如C(1-4)烷基(例如甲基或乙基)； R8是氢、OC(1-6)烷基或C(1-12)烷基，例如C(1-4)烷基(例如甲基或乙基)； R9和R10可以是相同的或不同的，各选自氢或C(1 12)烷基，或R9和R10与它们连接的氮一起，形成了5元到7元杂环，任选地含有一个或多个其它的选自氧、氮和硫的杂原子，并任选地被一个或两个选自羟基、氧代、C(1-4)烷基、C(1-4)烷基羧基、芳基例如苯基，或芳烷基例如苯甲基的取代基取代，例如吗啉或哌嗪；以及 X是C(2-4)亚烷基，任选地被1、2或3个选自甲基和乙基的取代基取代，或CH＝CH。
同样地，式(II)的所有盐，也可用于本发明的治疗方法中。
特别感兴趣的是本文的式(II)的化合物，在WO 02/30911中作为式(I)被提到，其中RI可以是任选地被1、2、3或4个取代基取代的苯基，取代基可以是相同的或不同的，选自卤素、C1-C6烷基、三氟甲基或C1-C6烷氧基。更具体来说，苯基是未取代的或被1、2、3或4个卤素取代基取代，特别是被1到3个氟基团，更具体为2，3-二氟、2，4-二氟或4-氟取代。
本文的式(II)的另一个实施方案，其中Y是-CH2CH2-。
此外，感兴趣的是式(II)的化合物，其中R2缺省为氢，或者是卤素、C1-C6烷基、单到全氟代-C1-C4烷基、单到全氟代C1-C46烷氧基或C1-C6烷氧基；特别是单到全氟代-C1-C4烷基、单到全氟代-C1-C4烷氧基或C1-C6烷氧基。特别感兴趣的是式(II)的化合物，其中R2不是氢，(R2)n中的n是1、2或3，取代类型是间和/或对位，特别是对位，即4-位取代基。也参见其中R2是4-三氟甲基或4-三氟甲氧基的化合物。
R3和R4可以是相同的或不同的，是甲基、乙基、正丙基或正丁基。特别感兴趣的是其中R3和R4是相同的并且是甲基或乙基的式(II)的化合物；甲基是特别感兴趣的。
R5可以是氢、直链或支链的C(1-6)烷基。特别感兴趣的是甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基或正己基。
应该认识到，在本文的式(II)的化合物中，还存在化合物的其它亚组，其中 R1是被2，3-二氟取代的苯基； R2和R3与它们连接的嘧啶环碳原子一起，形成了稠合5元环戊烯基环； R4是2-(二乙基氨基)乙基； R5是苯基； R6是在4-位被三氟甲基取代的苯基，或在5-位被三氟甲基取代的噻吩-2-基；以及 X是(CH2)2。
本文的特别感兴趣的式(II)的化合物是 N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙酰胺； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-乙基氨基-2-甲基-丙基)-2-(2-(2-(2，3-二氟苯基)-乙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基)-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-叔丁基氨基乙基)-2-(2-(2-(2，3-二氟苯基)-乙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基)-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-乙基-哌啶-4-基)-2-(2-(2-(2，3-二氟苯基)-乙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基)-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-(2-(2-(4-氟-2-(三氟甲基)苯基)-乙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基)-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-(2-(2-(4-氟-3-(三氟甲基)苯基)-乙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基)-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-(2-(2-(3-氯-4-氟苯基)-乙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基)-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； (+/-)-N-(2-二乙基氨基乙基)-2-(2苯基-丙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基)-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-(2-(2-(2，4-二氟苯基)-乙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基)-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-(2-(2-(2，5-二氟苯基)-乙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基)-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-(2-(2-(3，4-二氟苯基)-乙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基)-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙酰胺； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-(2-(2-(2-氟苯基)-乙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基)-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙酰胺； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-(2-(2-(3-氟苯基)-乙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基)-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-(2-(2-(3-氯苯基)-乙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基)-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙酰胺； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-(2-(2-(4-氯苯基)-乙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基)-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙酰胺； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-(2-(2-(4-甲基苯基)-乙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基)-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙酰胺； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-(2-(2-(4-(三氟甲基)苯基)-乙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基)-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙酰胺； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-(2-(2-(4-甲氧基苯基)-乙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基)-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-(2-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)-乙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基)-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； 或任何酒石酸氢盐的游离碱，或另外的可药用的盐。
此外，感兴趣的是公开在WO 02/30904中的式(III)的化合物
其中 R1是芳基，被1、2、3或4个取代基任选取代，取代基可以是相同的或不同的，选自C(1-6)烷基、C(1-6)烷氧基、C(1-6)硫代烷基、羟基、卤素、CN、单到全氟代-C(1 4)烷基、单到全氟代-C(1 4)烷氧基芳基和芳基C(1 4)烷基； R2是卤素、C(1 3)烷基、C(1 3)烷氧基、羟基C(1 3)烷基、C(1 3)硫代烷基、C(1 3)烷基亚磺酰基、氨基C(1-3)烷基、单或二-C(1-3)烷基氨基C(1-3)烷基、C(1 3)烷基羰基氨基C(1-3)烷基、C(1 3)烷氧基C(1 3)烷基羰基氨基C(1-3)烷基、C(1 3)烷基磺酰基氨基C(1-3)烷基、C(1 3)烷基羧基、C(1 3)烷基羧基C(1 3)烷基，以及 R3是氢、卤素、C(1-3)烷基或羟基C(1-3)烷基；或 R2和R3与它们连接的吡啶酮环碳原子一起，形成了稠合5元或6元碳环；或者 R2和R3与它们连接的吡啶酮环碳原子一起，形成了稠合苯并或杂芳环，被1、2、3或4个相同或不同的取代基任选取代，取代基选自卤素、C(1 4)烷基、氰基、C(1-3)烷氧基C(1-3)烷基、C(1 4)烷氧基或C(1 4)硫代烷基或单到全氟代-C(1-4)烷基； R4是氢、C(1-6)烷基，可以是未取代的，或被1、2或3个取代基取代，取代基选自羟基、卤素、OR7、COR7、羧基、COOR7、CONR9R10、NR9R10、NR7COR8、单或二(羟基C(1 6)烷基)氨基和N羟基C(1-6)烷基-NC(1-6)烷基氨基；或 R4是Het-C(0-4)烷基，其中Het是含有N以及可选的O或S的5元到7元杂环，其中N可以被COR7、COOR7、CONR9R10，或为可选地被选自羟基、卤素、OR7、COR7、羧基、COOR7、CONR9R10或NR9R10例如哌啶-4-基、吡咯烷-3-基取代的C(1 6)烷基取代； R5是芳基或杂芳环，可选地被1、2、3或4个取代基取代，取代基可以是相同的或不同的，选自C(1-6)烷基、C(1-6)烷氧基、C(1 6)硫代烷基、芳基C(1-6)烷氧基、羟基、卤素、CN、COR7、羧基、COOR7、NR7COR8、CONR9R10、SO2NR9R10、NR7SO2R8、NR9R10、单到全氟代-C(1 4)烷基和单到全氟代-C(1 4)烷氧基； R6是芳基或杂芳环，进一步可选地被1、2、3或4个取代基取代，取代基可以是相同的或不同的，选自C(1-6)烷基、C(1-6)烷氧基、C(1 6)硫代烷基、C(1 6)烷基磺酰基、芳基C(1-6)烷氧基、羟基、卤素、CN、COR7、羧基、COOR7、CONR9R10、NR7COR8、SO2NR9R10、NR7SO2R8、NR9R10、单到全氟代-C(1 4)烷基和单到全氟代-C(1 4)烷氧基，或C(5-10)烷基； R7和R8各自独立地是氢或C(1-12)烷基，例如C(1-4)烷基(例如甲基或乙基)； R9和R10可以是相同的或不同的，各选自氢或C(1 12)烷基，或R9和R10与它们连接的氮一起，形成了5元到7元杂环，可选地含有一个或多个其它的选自氧、氮和硫的杂原子，并可选地被一个或两个选自羟基、氧代、C(1-4)烷基、C(1-4)烷基羧基、芳基例如苯基，或芳烷基例如苯甲基的取代基取代，例如吗啉或哌嗪；以及 X是C(2-4)亚烷基，(可选地被1、2或3个选自甲基和乙基的取代基取代)，CH＝CH，(CH2)nS或(CH2)nO，其中n是1、2或3； 或其可药用的盐。
特别感兴趣的是式(III)的化合物，其中R2和R3与它们连接的吡啶酮环碳原子一起，形成了稠合苯并或杂芳环，可选地被1、2、3或4个相同的或不同的取代基取代，取代基选自卤素、C(1 4)烷基、氰基、C(1 4)烷氧基或C(1 4)硫代烷基，或单到全氟代-C(1-4)烷基。优选情况下，R1是苯基，可选地被卤素、C(1-6)烷基、三氟甲基、C(1-6)烷氧基取代，优选情况下被1到3个氟、更优选被2，3-二氟取代。R4的代表性例子包括在1-位被甲基、异丙基、1-(2-甲氧基乙基)、1-(2-羟基乙基)、叔丁基羰基或乙氧基羰基甲基取代的哌啶-4-基；在2-位被氨基乙基取代的乙基；1-乙基哌啶基甲基；哌啶-4-基；3-二乙基氨基丙基；4-吡咯烷-1-基丁基和1-乙基吡咯烷-3-基。优选的R4是1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基、1-甲基哌啶-4-基或1-乙基吡咯烷-3-基。R5的代表性的例子包括苯基和吡啶基。优选情况下，R5是苯基。R6的代表性的例子包括苯基，可选地被卤素或三氟甲基优选在4-位上取代，以及己基。优选情况下，R6是被三氟甲基在4-位取代的苯基。R6的其它代表性的例子包括被1个或多个C(1-3)烷基取代的苯基。优选情况下，R6是在4-位被乙基取代的苯基。优选情况下，R5和R6一起形成了4-(苯基)苯基或2-(苯基)吡啶取代基，其中远端的苯环可选地可以被卤素或三氟甲基取代，优选在4-位上。优选的X是C(2-4)亚烷基，更优选为C(2-3)亚烷基，最优选为(CH2)2或CH2S。
应该认识到，在包含式(III)的化合物组中存在化合物的亚组，其中 R1是2，3-二氟取代的苯基； R2和R3与它们连接的吡啶酮环碳原子一起，形成了稠合苯并或吡啶并环。
R4是1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基； R5和R6一起形成了4-(苯基)苯基取代基，其中远端苯环被三氟甲基优选在4-位取代；以及 X是CH2S或(CH2)2。
下面的式(III)的化合物是感兴趣的 N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-5，6-三亚甲基-吡啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺； N-(1-甲基哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-甲基哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-[1，8]萘啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-[1，8]萘啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺； N-(1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-[1，8]萘啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-乙基哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-乙基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-乙基哌啶-4-基)-2-[5-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-2-甲基-7-氧代-7H-噻唑[4，5-b]吡啶-4-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐 (±)-N-(1-乙基吡咯烷-3-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； (±)-N-(1-乙基吡咯烷-3-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺二盐酸酯； N-(1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺单对甲苯磺酸酯； N-(1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-[1，8]萘啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-[1，8]萘啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺单盐酸酯； N-(1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-[1，8]萘啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺二盐酸酯； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(4-氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(4-氟苯甲基硫代)-4-氧代-5，6-三亚甲基吡啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-5，6-三亚甲基吡啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(4-氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(3，4-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(2-氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(3-氯苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-[1，8]萘啶-1-基)]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-乙基哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-[1，8]萘啶-1-基)]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺； N-(1-乙基哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-q喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-吡咯烷-1-基乙基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-异丙基哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟-甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-哌啶-1-基乙基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-7-氟-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-5-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-2-甲基-7-氧代-7H-噻吩并[3，2-b]吡啶-4-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-5，6-二甲基-4-氧代-4H-吡啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-5-乙基-4-氧代-4H-吡啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-甲基哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-噻吩并[3，4-b]吡啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-乙基哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-吡咯烷-1-基乙基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-乙基哌啶-4-基)-2-[6-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-2-甲基-4-氧代-4H-吡唑并[3，4-b]吡啶-7-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-异丙基哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-乙基哌啶-4-基甲基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(3-二乙基氨基丙基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(4-吡咯烷-1-基丁基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(3-二乙基氨基丙基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(4-吡咯烷-1-基丁基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-乙基哌啶-4-基)-2-[5-(2，3-二氟苯甲基硫代)-7-氧代-7H-噻吩并[3，2-b]吡啶-4-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[5-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-2-甲基-7-氧代-7H-噻唑并[4，5-b]吡啶-4-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-乙基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-乙基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-异丙基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-异丙基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-[1，8]萘啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-乙基哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-[1，8]萘啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-乙氧基羰基甲基哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-异丙基哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-[1，8]萘啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(3′，4′-二甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-[1，8]萘啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(3′，4′-二氟联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[6-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-噻吩并-[2，3b]吡啶-7-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-甲基哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-[1，8]萘啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-乙基哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3，4-三氟苯基乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[6-(2，3-二氟苯甲基硫代)-2-甲基-4-氧代-2，4-二氢吡唑并[3，4 b]吡啶-7-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-乙基哌啶-4-基)-2-[6-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-2-乙基-4-氧代-2，4-二氢吡唑并[3，4 b]吡啶-7-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-乙基哌啶-4-基)-2-[6-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-2-异丙基-4-氧代-2，4-二氢吡唑并[3，4 b]吡啶-7-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-乙基哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-乙基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-异丙基哌啶-4-基)-2-[5-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-2-甲基-7-氧代-7H-噻唑并[4，5-b]吡啶-4-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基)-2-[5-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-2-甲基-7-氧代-7H-噻唑并[4，5-b]吡啶-4-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-乙基哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-5，6-三亚甲基吡啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-甲基哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-5，6-三亚甲基吡啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-5，6-三亚甲基吡啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-异丙基哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-5，6-三亚甲基吡啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-乙基哌啶-4-基)-2-[5-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-2-甲基-7-氧代-2，7-二氢吡唑并[3，4 b]吡啶-4-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐 N-(1-乙基哌啶-4-基)-2-[5-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-1-甲基-7-氧代-1，7-二氢吡唑并[3，4 b]吡啶-4-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-乙基哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-5，6-三亚甲基-吡啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-乙基哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-7-甲基-4-氧代-4H-[1，8]萘啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-7-甲基-4-氧代-4H-[1，8]萘啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-甲基哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-7-甲基-4-氧代-4H-[1，8]萘啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-异丙基哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-7-甲基-4-氧代-4H-[1，8]萘啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-7-甲基-4-氧代-4H-[1，8]萘啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-甲基哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-5，6-三亚甲基吡啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-乙基哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-5，6-三亚甲基吡啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-异丙基哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-5，6-三亚甲基吡啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-5，6-三亚甲基吡啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-5，6-四亚甲基吡啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-甲基哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-氯联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-甲基哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-氯联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-乙基哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-氯联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-氯联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-异丙基哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-氯联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[6-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-2-甲基-4-氧代-4H-吡唑并-[3，4-b]吡啶-7-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-[1，8]萘啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺； N-(1-乙基哌啶-4-基)-2-[6-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-2-(2-甲氧基乙基)-4-氧代-4H-吡唑并-[3，4-b]吡啶-7-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[4-氧代-2-(2-(2，3，4-三氟苯基)乙基)-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(2，4-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(3-氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-5，6-三亚甲基吡啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-[1，8]萘啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐； N-(哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-[1，8]萘啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺三氟乙酸酯； N-(2-乙基氨基乙基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺； N-(2-乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺； N-(1-(2-羟基乙基)哌啶-4-基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺酒石酸氢盐；或其游离碱，或另一种可药用的盐。
式(IV) 还感兴趣的是式(IV)的化合物
其中 R1是芳基，未取代的或被1、2、3或4个相同或不同的取代基取代，取代基选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6硫代烷基、芳基C1-C6烷氧基、羟基、卤素、CN、COR6、COOR6、NR6COR7、CONR8R9、SO2NR8R9、NR6SO2R7、NR8R9、卤代C1-C4烷基和卤代C1-C4烷氧基； W是CH，X是N，或者W是N而X是CH，W和X都是CH，或W和X都是N； Y是C2-C4烷基； R2是氢、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6硫代烷基、芳基C1-C6烷氧基、羟基、卤素、CN、COR6、羧基、COOR6、NR6COR7、CONR8R9、SO2NR8R9、NR6SO2R7、NR8R9、单到全氟代C1-C6烷基，或单到全氟代C1-C6烷氧基； n是0-5； R3是C1-C4烷基； R4是C1-C4烷基； R5是氢、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、卤代C1-C4烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C4烷基、C5-C8环烷烯基、C5-C8环烷烯基C1-C4烷基、3-8元杂环烷基、3-8元杂环烷基C1-C4烷基、C6-C14芳基、C6-C14芳基C1-C10烷基、杂芳基、或杂芳基C1-C10烷基；其中每个基团可选地被相同的和/或不同的基团取代一次或多次，取代基是C1-C6烷氧基、C1-C6硫代烷基、芳基C1-C6烷氧基、羟基、卤素、CN、NR8R9或卤代C1-C4烷氧基； R6和R7独立地是氢或C1-C10烷基； R8和R9是相同的或不同的，是氢或C1-C10烷基，或R9和R10与它们连接的氮一起形成5到7元环，可选地含有一个或多个选自氧、氮和硫的其它杂原子，并可选地被一个或两个取代基取代，取代基选自羟基、氧代、C1-C4烷基、C1-C4烷基羧基、芳基和芳基C1-C4烷基； 或其可药用的盐。
尽管不打算从式(IV)的范围中排除任何定义的取代基和/或它们列举的自由基，但下面的R基团和相关的自由基是特别感兴趣的 对于R1来说，它可以是苯基，可选地被1、2、3或4个可以相同也可以不同的取代基取代，取代基选自卤素、C1-C6烷基、三氟甲基或C 1-C6烷氧基。更具体来说，苯基是未取代的，或被1、2、3或4个卤素取代基取代，特别是1到3个氟基，更具体为2，3-二氟、2，4-二氟或4-氟取代。
式(I)的另一个实施方案是其中Y为-CH2CH2-。
本发明还提供了式(I)的化合物，其中R2缺省为氢，或者是卤素、C1-C6烷基、单到全氟代C1-C4烷基、单到全氟代C1-C46烷氧基、或C1-C6烷氧基；特别是单到全氟代C1-C4烷基、单到全氟代C1-C4烷氧基、或C1-C6烷氧基。特别感兴趣的是化合物，其中R2不是氢，(R2)n中的n是1、2或3，取代的形式是间和/或对位，特别是对位，即4-位的取代基。示例性的化合物包括其中R2是4-三氟甲基或4-三氟甲氧基的化合物。
R3和R4可以是相同或不同的，是甲基、乙基、正丙基或正丁基。特别感兴趣的是式(I)的化合物，其中R3和R4是相同的，是甲基或乙基；甲基是特别感兴趣的。
R5可以是氢、直链或支链的C(1-6)烷基。其中特别感兴趣的是甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基或正己基。
本文上面描述的任何化合物可以制备成晶体或非晶体形式，如果是晶体，可以被溶剂化，例如作为水合物。本发明在其范围内包括了化学计量的溶剂化物(例如水合物)。
本文描述的某些化合物可以包含一个或多个手性原子，或者能够以两种对映异构体存在。在本文描述的方法中使用的化合物包括对映异构体的混合物，或纯化的对映异构体或对映异构富集的混合物。在本发明的范围内还包含了由式(I)-(IV)所表示的化合物的单独的异构体，及其任何完全或部分平衡的混合物。本发明还覆盖了宣称的化合物的异构体作为与其异构体的混合物，其中一个或多个手性中心是相反的。此外，应该理解，宣称的化合物的任何互变异构体和互变异构体的混合物也包含在式(I)-(IV)的化合物的范围之内。不同的异构体形式可以通过常规的方法彼此分离或拆分，或者任何给定的异构体可以通过常规的合成方法或通过立体特异性或不对称合成来获得。
式(I)、(II)、(III)和(IV)的化合物的合成 用于制备式(I)、(II)和(III)和(IV)的化合物的方法已经发表在专利文献中。例如，用于制造式(I)的方法可以在WO 01/60805和WO03/016287中发现。用于制造式(II)的化合物的方法已经在WO02/30911中提出。用于制造式(III)的化合物的方法可以在WO 02/30904中发现。本文献提供了用于制造式(IV)的化合物的方法，方法从美国临时专利申请60/829,328和60/829,327拷贝，在此特意引为参考。
下面提供了一些合成的例子。为了区分在本文的例子中的几种通用类型的化合物，与式(I)相关的材料将被标为“合成方法例(I)-1”及以下的，对于式(II)来说标为“合成方法例(II)-1”及以下的，对于式(III)来说标为“合成方法例(III)-1”及以下的，对于式(IV)来说标为“合成方法例(IV)-1”及以下的. 式(I)的合成 式(I)的化合物可以通过如同在WO 01/60805中公开的方法流程I来制备 流程I
其中 L3是C(1-6)烷基，例如甲基； R15是C(1-6)烷基，例如乙基或叔丁基，并且 L1、L2、Ra、Rb、Rc、R2、R3、R4、R5、n、X、Y和Z如WO 01/60805中所定义的。
用于制造目标式(I)化合物的示例性反应如下 合成方法例(I)-1(a) 1-(N-(2-(二乙基氨基)乙基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)氨基羰基-甲基)-2-(4-氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮
将WO 01/60805的中间体B69(87.1g，0.26mol.)悬浮在二氯甲烷(2.9升)中。加入1-羟基苯并三唑水合物(35.2g，0.26mol.)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(99.7g，0.52mol.)，将悬浮液搅拌45分钟，在此期间获得了完全的溶液。将WO 01/60805的中间体A30(91.2g，0.26mol.)作为在二氯甲烷(100ml)中的溶液在5分钟内加入，将溶液搅拌4小时。加入饱和氯化铵溶液∶水混合物(1∶1，1升)，将溶液搅拌10分钟。分离有机相，并用饱和氯化铵溶液∶水混合物(1∶1，1升)萃取，萃取液pH6。将有机相分离，用含有乙酸(10ml)的水(1升)萃取，萃取液pH5。分离二氯甲烷层，用pH10.5的饱和的碳酸钠溶液∶水∶饱和的盐水混合物(1∶3∶0.2，1升)萃取，然后用饱和的盐水∶水混合物(1∶1，1升)萃取。将棕色溶液在无水硫酸钠上，在存在脱色木炭(35g)的情况下干燥，过滤，并在真空中除去溶剂，得到深棕色的泡沫物。将泡沫物溶解在乙酸异丙酯(100ml)中，在真空中移除溶剂。将深棕色的胶状残留物溶解在沸腾的乙酸异丙酯(500ml)中，冷却到室温，接入种晶并搅拌过夜。将产生的浅奶油色固体滤出，用乙酸异丙酯(100ml)清洗。将固体在烧结漏斗中抽干1小时，然后从乙酸异丙酯(400ml)重结晶。在搅拌过夜后，滤出形成的固体，用乙酸异丙酯(80ml)洗涤，在真空中干燥，得到了标题化合物110g，产率为63.5％。1H NMR(CDCl3，大约1.9∶1旋转异构体混合物)δ0.99(6H，t)，2.10(2H，m)，2.50(4H，q)，2.58/2.62(2H，2x t)，2.70/2.82(2H，2x t)，2.86(2H，t)，3.28/3.58(2H，2x t)，4.45/4.52(2H，2x s)，4.68/4.70(2H，2x s)，4.93(2H，s)，6.95(2H，m)，7.31(2H，d)，7.31/7.37(2H，2x m)，7.48/7.52(2H，d)，7.65(2H，m)，7.72(2H，m)；MS(APCI)(M+H)+667；mp 125℃(通过DSC-不对称吸热)。
合成方法例(I)-1(b) 1-(N-(2-(二乙基氨基)乙基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)氨基羰基-甲基)-2-(4-氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮酒石酸氢盐 从通过WO 01/60805中实施例1的方法制备的WO 01/60805中的中间体A30和B69制备。1H-NMR(d6-DMSO，大约1∶1旋转异构体混合物)，δ0.92/0.99(6H，2x t)，1.99(2H，m)，2.54(6H，m)，2.68/2.74(4H，m)，3.36(2H，m)，4.21(2H，s)，4.37/4.44(2H，2x s)，4,63/4.74(2H，2x s)，4,89/5.13(2H，2x s)，7.08/7.14(2H，2x m)，7.36-7.50(4H，m)，7.64/7.70(2H，2x d)，7.83(4H，m)；MS(APCI+)发现(M+1)＝667；C36H38F4N4O2S计算分子量666。
合成方法例(I)-1(c) 1-(N-(2-(二乙基氨基)乙基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)氨基羰基-甲基)-2-(4-氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮盐酸盐 将来自实施例(I)-1(a)的游离碱(3.00g，0.0045mol)悬浮在异丙醇(30ml)中并搅拌，加热到45℃，给出透明的溶液。然后将该溶液冷却到环境温度，并加入浓盐酸(0.40ml，0.045mol)。然后将得到的浆液在环境温度搅拌35分钟，然后冷却到0℃35分钟。然后过滤浆液，用异丙醇(10ml)、然后用庚烷(30ml)洗涤，然后在真空下干燥，给出作为白色固体的标题化合物(3.00g，95％)。1H NMR(CDCl3)δ1.38(6H，t)，2.08(2H，m)，2.82(2H，t)，2.99(2H，t)，3.19(4H，m)，3.35(2H，m)，3.97(2H，s)，4.42(2H，s)，4.81(2H，s)，4.99(2H，s)，6.87(2H，t)，7.26(2H，t)，7.33(2H，d)，7.41(2H，d)，7.53(2H，d)，7.71(2H，d)，11.91(1H，s)。
式(II)的合成 关于如何制造式(II)的化合物以及上面提到的化合物的中间体和终产物的例子的描述，可以在已公开的国际专利申请WO 02/30911中发现，在此引为参考。用于制造可用于本发明的化合物的最后一步方法是实施例(II)-1。
合成方法例(II)-1 N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)乙酰胺酒石酸氢盐
将N，N-二乙基-N’-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)-乙烷-1，2-二胺(WO 02/30911中的Int D4)(0.50g，1.44mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(0.56g，1.45mmol)、1-羟基苯并三唑水合物(0.12g)和2-(2-[2-(2，3-二氟苯基)-乙基]-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基)-乙酸(WO 02/30911中的Int C1)(0.48g，1.44mmol)在二氯甲烷(10ml)中，在环境温度搅拌过夜，然后用二氯甲烷(30ml)稀释，用碳酸氢钠水溶液洗涤，并蒸发。残余物通过层析纯化(10g硅胶柱，乙酸乙酯-丙酮)，给出作为黄色泡沫物的标题化合物(游离碱)(0.50g，52％)。1H-NMR(DMSO，旋转异构体混合物)δ0.83-0.89(6H，m)，1.98(2H，m)，2.40(4H，m)，2.45-2.82(10H，m)，3.02(2H，m)，4.64/4.75(2H，2x s)，4.96/5.19(2H，2x s)，7.11-7.40(5H，m)，7.65(2H，m)，7.84(4H，m)；MS(APCI+)发现(M+1)＝667； 37H39F5N4O2计算分子量666。
将d-酒石酸(0.09g，0.60mmol)一边搅拌一边加入到游离碱(0.40g，0.60mmol)的甲醇溶液中(10ml)。将得到的溶液蒸发，获得了盐(0.49g)。1H-NMR(DMSO，旋转异构体混合物)δ0.85-0.97(6H，m)，1.91-2.00(2H，m)，2.40-2.49(4H，m)，2.54-2.82(10H，m)，3.02-3.46(2H，m)，4.20(2H，s)，4.64/4.75(2H，2x s)，4.97/5.18(2H，2x s)，7.11-7.40(5H，m)，7.65(2H，m)，7.84(4H，m)；MS(APCI+)发现(M+1)＝667；C37H39F5N4O2计算分子量666。
在该步骤或可选的WO 02/30911中描述的其它步骤之后，人们可以制备上面列出的具有式(II)的结构的其它化合物。
式(III)的合成 式(III)的化合物的全面合成显示在下面的流程III中，正如在WO02/30904中提出的 流程III
参考该流程，酯(IV)通常通过使用(VI)对(V)进行N-1烷基化来制备，其中R11如前文定义，例如，(VI)是溴乙酸叔丁酯或溴乙酸乙酯，在存在碱例如THF中的BuLi或N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的氢化钠的情况下(步骤c)。
当X是CH2S时，关键中间体(IV)的合成，可以通过将(XX)与通过用氢化钠在低温下处理三甲基碘化亚砜而产生的二甲基氧代亚甲基锍反应，产生硫叶立德(sulfur ylid)(XXII)(步骤q)。随后在存在二异丙基胺的情况下用二硫化碳处理(XXII)，然后用R1CH2-L4进行处理，其中L4是离去基团，产生了中间体(IV)(步骤r)。
可选地，当X是CH2S时，R1X取代基可以通过在吡啶(VIII)或吡啶N-氧化物(XIV)上用离去基团L2(例如Cl)进行置换(步骤e)来导入，给出2-取代吡啶(VII)和(XV)。通过将4-氧去保护(例如，在乙醇水溶液中使用(Ph3P)3RhCl，其中R12＝烯丙基)(步骤d)，将(VII)或(XV)转化成4-吡啶酮(V)，然后，通过使用氢在存在Pd/C乙酸溶液的情况下除去N-氧化物取代基(步骤k)，获得(XVI)。吡啶(VIII)或吡啶N-氧化物(XIV)可以通过步骤(i)、(h)、(g)、(f)和(j)来制备，其中 (j)用间氯过苯甲酸在二氯甲烷中处理(VIII)； (f)用R12OH(X)和氢化钠在DMF中处理(IX)，其中R12是烯丙基； (g)用磷酰氯处理(XI)； (h)用HCl水溶液加热处理(XII)； (i)用丙二酸二低级烷基酯和醇钠的醇溶液处理(XIII)(其中R13为C(1-6)烷基，典型的R13＝乙基)；以及 R1-CH2SH(XIX)典型情况下从硫代乙酸酯制备，从相应的烷基溴化物R1-CH2Br形成。
可选地，当X是CH2S，并且R2和R3与它们连接的吡啶酮环碳原子一起形成稠合苯并环时，中间体(IV)可以从已知的起始材料通过步骤(s)、(c)和(v)合成，其中 (s)用氢化钠在低温下处理Meldrum′s酸(XXIII)，然后与异硫氰酸苯酯反应，随后用R1CH2-L4处理； (c)如同本文前面讨论的； (v)用三氟乙酸处理(XXV)。
当X是亚烷基时，优选使用步骤(m)和(h)(中间体(XVII)、(XVIII))或步骤(n)和(p)(中间体(XIX)、(XX)、(XXI))，其中 (h)将4-取代吡啶转化成4-吡啶酮，例如通过用HCl水溶液和二噁烷处理(XVII)，R14＝Cl，或者去保护R14＝OR12，例如使用步骤(d)的条件。
(m)2-烷基吡啶的链延伸，例如当X＝YCH2CH2时，通过用R1-Y-CH2-L4(XVI)和强碱例如THF中的BuLi处理2-甲基吡啶(XVIII)，其中L4是离去基团。
在可选路线中，通过在二苯基醚中加热将3-酯基团从中间体(XIX)R15＝C(1-6)烷基上除去，其中R15＝tBu(步骤n)；中间体(XIX)从2，6-二氧代-1，3-噁嗪(XX)和酯(XXI)，通过用碱例如DMF中的NaH或二氯甲烷中的1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯处理而形成。
从已知起始材料合成(XX)可以经过步骤(w)和(c)或步骤(y)和(c)来实现，其中 (w)用THF中的叠氮基三甲基硅烷处理(XXVII)； (y)用碳酰氯处理(XXVI)； (c)如本文前面所描述； 对于如何制造式(III)的化合物的其它详细情况和解释，参见WO02/30904，在此引为参考。
合成方法例(III)-1 N-(1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)乙酰胺
游离碱通过WO 02/30904中实施例1的方法从Int.E1和Int.A42制备，除了使用DMF代替二氯甲烷作为溶剂之外。将1.97g该材料从乙酸正丁酯(10ml)结晶，给出标题化合物(1.35g)。1H-NMR(CD3OD)δ1.7-2.05(4H，m)，2.05-2.3(2H，2xt)，2.5-2.65(2H，m)，2.95-3.1(2H，m)，3.3(3H，s)，3.45-3.55(2H，m)，3.9-4.05+4.4-4.5(1H，2xm)，4.37+4.48(2H，2xs)，4.71+4.87(2H，2xbr s)，5.31+5.68(2H，2xs)，6.44+6.52(1H，2xs)，6.95-7.3(3H，m)，7.35-7.85(HH，m)，8.2-8.35(1H，m)；MS(APCI+)发现(M+1)736；C40H38F5N3O3S计算值735。
式(IV)的合成 下面的流程图说明了用于制造本发明的化合物的工艺过程。

此外，关于在本流程图中提出的某些中间体的制备中可以使用的化学物质，读者可以参考已公开的PCT申请WO 03/016287。那些化学物质，在其可用于本案的范围内，在此引为参考，尽管在本文中也已完全显示了。此外，可以参考在公开的PCT申请WO 01/60805、WO02/30911、WO 02/30904、WO 03/042218、WO 03/042206、WO03/041712、WO 03/086400和WO 03/87088，以及上面提到的2006年10月12日提交的共同待决的美国临时专利申请60/829,328和60/829,327中提出的合成。如果读者希望通过使用前面篇幅的路线中没有涉及的其它中间体、反应试剂、溶剂、时间、温度等来制备式(IV)的化合物，这些已公开的PCT申请和共同待决的美国申请在某种程度上可以提供有用的指导。对于这些申请中与制造本发明的化合物有关的化学物质来说，那些材料在此引为参考。
中间体(IV)-A1{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}胺
该化合物的制备描述在WO 02/30911中作为中间体D7。
中间体(IV)-A2({4′-[(三氟甲基)氧基]-4-联苯基}甲基)胺盐酸盐
将4′-[(三氟甲基)氧基]-4-联苯腈(按照与WO 02/30911的中间体D6、4′-三氟甲基类似物所述的类似的方法，从{4-[(三氟甲基)氧基]苯基}硼酸制备)(66.6g)的乙醇溶液(2000ml)和浓盐酸(100ml)，在Pearlman′s催化剂(10g)上，在25psi下进行氢化，直到还原完成。通过硅藻土过滤除去催化剂，然后在真空中除去溶剂，获得了所需产物。
LCMS Rt＝2.212分钟；m/z[M+H]+＝251.0 用于制造式(IV)的中间体 中间体(IV)-A3 2-甲基-2-(4-氧代-1-哌啶基)丙酸甲酯
将2-溴-2-甲基丙酸甲酯(80.87ml，5当量)、单水4-哌啶酮盐酸盐(19.6g，1当量)、乙腈(200ml)和碳酸钾(69.1g，4当量)的混合物，在氮气下、使用机械搅拌、加热回流17.5小时，然后在冰浴中冷却，然后加入二乙醚(100ml)。通过硅藻土过滤，然后急骤层析(二氧化硅，10-50％乙酸乙酯在己烷中)，将产物级份蒸发，产生了作为黄色油状物的目标产物(14.28g)。
1H NMR(CDCl3)δ1.41(6H，s)，2.47(4H，m)，2.88(4H，m)，3.73(3H，s)。
中间体(IV)-A4 2-甲基-2-(4-氧代-1-哌啶基)丙酸乙酯
将2-溴-2-甲基丙酸乙酯(48.3ml，5当量)、单水4-哌啶酮盐酸盐(100g，1当量)、乙腈(1216ml)和碳酸钾(353g，4当量)的混合物，在氮气下、使用机械搅拌、加热回流20小时，然后在冰浴中冷却，然后加入二乙醚(大约1400ml)。将混合物通过硅藻土过滤，在真空中蒸发，然后蒸发掉过量的溴代酯(顶部温度50℃/10Torr)。急骤层析(二氧化硅，3-30％乙酸乙酯在己烷中)，将产物级份蒸发，产生了作为黄色油状物的粗产物(14.28g)。为了除去某些残留的溴代酯污染物，将粗产物在乙酸乙酯和2M盐酸水溶液之间分配。舍弃有机层，将水层用碳酸钠碱化，用氯化钠饱和，用乙酸乙酯萃取。将有机萃取物干燥并蒸发，给出作为黄色油状物的目标产物(54.7g)。
1H NMR(CDCl3)δ1.27(3H，t)，1.40(6H，s)，2.47(4H，m)，2.90(4H，m)，4.20(2H，q)。
中间体(IV)-A5 2-甲基-2-(4-氧代-1-哌啶基)丙酸1，1-二甲基乙基酯
将2-溴-2-甲基丙酸1，1-二甲基乙基酯(8.0g，1.1当量)、4-哌啶酮盐酸盐(5.0g，1当量)、丙酮(50ml)和碳酸钾(13.0g，3当量)的混合物，搅拌加热回流24小时，然后过滤并将滤液蒸发。粗残留物不用纯化，用于下一个步骤中。
ES+MS m/z[M+H-tBu]+＝186.1 中间体(IV)-B1 2-甲基-2-[4-({[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基)丙酸甲酯
将2-甲基-2-(4-氧代-1-哌啶基)丙酸甲酯(Int.A3)(14.28g，1当量)、{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}胺(Int.A1)(19.6g，0.85当量)、DCE(300ml)、乙酸(3.8ml，0.90当量)和三乙酸基硼氢化钠(20.7g，1.25当量)的混合物，在氮气下、在室温搅拌17.5小时。加入碳酸钠水溶液(2M溶液，过量)，搅拌4小时，然后将混合物用二乙醚和THF的混合物萃取。将有机萃取物用水和盐水回洗，在硫酸钠上干燥，通过硅胶垫片过滤，用2.5％甲醇的DCM溶液洗涤。在真空中蒸发后，粗产物最终在冰浴温度下从乙醚/己烷中结晶，干燥后产生白色固体(20.9g)。
LCMS Rt＝2.070分钟；m/z[M+H]+＝435.2 1H NMR(d6-DMSO)δ1.15-1.32(8H，m)，1.75-187(2H，m)，1.97-2.12(2H，m)，2.27-2.40(1H，m)，2.77-2.90(2H，m)，3.60(3H，s)，3.76(2H，s)，7.46(2H，d，J＝8.03Hz)，7.67(2H，d，J＝8.28Hz)，7.80(2H，d，J＝8.53Hz)，7.88(2H，d，8.03Hz)。
中间体(IV)-B2 2-甲基-2-[4-({[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基)丙酸乙酯
将2-甲基-2-(4-氧代-1-哌啶基)丙酸乙酯(Int.A4)(25.6g，1.2当量)、{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}胺(Int.A1)(31.1g，1.0当量)、DCE(400ml)和乙酸(6.3ml，1.1当量)的混合物在氮气下、在室温搅拌。加入三乙酸基硼氢化钠(33.5g，1.5当量)，继续搅拌19小时。加入碳酸钠水溶液(2M溶液，过量)，搅拌1.5小时，然后将混合物用二乙醚和THF的混合物萃取。将有机萃取物用水和盐水回洗，通过硅胶垫片过滤，在硫酸钠上干燥，在真空中蒸发。获得了作为白色固体的目标产物(44.2g)，不用进一步纯化就可以使用。
LCMS Rt＝2.194分钟；m/z[M+H]+＝449.3 1H NMR(d6-DMSO)δ1.06-1.32(11H，m)，1.74-1.89(2H，m)，1.99-2.14(2H，m)，2.25-2.39(1H，m)，2.69-2.89(2H，m)，3.75(2H，s)，4.01-4.12(2H，m)，7.45(2H，d，J＝7.55Hz)，7.67(2H，d，J＝7.81Hz)，7.79(2H，d，J＝8.06Hz)，7.88(2H.d，J＝8.06Hz)。
中间体(IV)-B3 2-甲基-2-{4-[({4′-[(三氟甲基)氧基]-4-联苯基}甲基)氨基]-1-哌啶基}丙酸乙酯
将2-甲基-2-(4-氧代-1-哌啶基)丙酸乙酯(Int.A4)(1.09g，1.2当量)、({4′-[(三氟甲基)氧基]-4-联苯基}甲基)胺盐酸盐(Int.A2)(1.28g，1.0当量)、DCE(21ml)和乙酸(0.27ml，1.1当量)的混合物在氮气下、在室温搅拌。加入三乙酸基硼氢化钠(1.42g，1.5当量)，继续搅拌3小时。加入碳酸钠水溶液(2M溶液，过量)，搅拌45分钟，然后将混合物用二乙醚/THF和水的混合物分配。将有机萃取物用水和盐水回洗，在硫酸钠上干燥，在真空中蒸发。获得了作为微黄色固体的目标产物(2.14g)，不用进一步纯化就可以使用。
LCMS Rt＝2.244分钟；m/z[M+H]+＝465.3 中间体(IV)-B4 2-甲基-2-[4-({[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]丙酸1，1-二甲基乙酯
将2-甲基-2-(4-氧代-1-哌啶基)丙酸1，1-二甲基乙酯(Int.A6)(370mg，1.2当量)、{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}胺(Int.A1)(397mg，1当量)、三乙酸基硼氢化钠(400mg，1.5当量)、DCM(10ml)和乙酸(0.076ml，1当量)的混合物，在室温混合并搅拌，直到LCMS证实胺起始原料已经消失(大约18小时)。加入碳酸钠水溶液，然后用DCM萃取。将有机相在硫酸钠上干燥，浓缩，得到了固体(420mg)，不用进一步纯化就可以使用。
LCMS Rt＝2.24分钟；m/z[M+H]+＝477.3 中间体(IV)-C1 [2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酸
该化合物的制备描述在WO 02/30911中作为中间体C43。
中间体(IV)-C2 [2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1，8-萘啶-1(4H)-基]乙酸
该化合物的制备描述在WO 02/30904中作为中间体E21。
中间体(IV)-C3 [2-[2-(2，4-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酸
该化合物的制备描述在WO 02/30911中作为中间体C45。
中间体(IV)-C4 [2-[2-(2，4-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酸乙酯
将(2，4-二氧代-3，4-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(2H)-基)乙酸乙酯(WO02/30911，中间体B52)(40.8g，1.2当量)和3-(2，4-二氟苯基)丙酰亚胺酰胺(通过与WO 02/30911的中间体A1到A3、2，3-二氟异构体所描述的类似的方法制造)(30.0g，1当量)混合物，在油浴中在150℃熔化25分钟，然后在水浴中快速冷却到室温。层析(二氧化硅，将粗产物装载在DCM中，用50-100％乙酸乙酯己烷溶液洗脱)，给出目标产物(43.56g)。
LCMS Rt＝2.521分钟；m/z[M+H]+＝374.1 1H NMR(CDCl3)δ1.31(3H，t)，3.13(2H，m)，3.26(2H，m)，4.28(2H，q)，5.27(2H，s)，6.82(2H，m)，7.34(1H，m)，7.50(IH，m)，8.65(1H，m)，8.74(1H，m)。
中间体(IV)-C5 [2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酸
该化合物的制备描述在WO 02/30911中作为中间体C35。
中间体(IV)-C5 [2-[2-(2，4-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酸
将[2-[2-(2，4-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酸乙酯(Int.C1)(32.76g，1当量)溶解在乙醇(350ml)和水(70ml)中，在冰上冷却，然后加入氢氧化锂水溶液(2M溶液，43.42ml，0.99当量)。在室温继续搅拌2小时。将溶液在真空中浓缩，将残留物重新溶解在水(700ml)和饱和碳酸氢钠水溶液(50ml)中，然后用乙酸乙酯(200ml)清洗。将水层从2M盐酸酸化到pH2，将沉淀滤出，用冰水(50ml)洗涤，在真空中干燥(50℃，16小时)，获得了目标产物(23.2g)。
1H NMR(d6-DMSO)δ2.4-2.6(4H，m)，5.24(2H，s)，7.04(1H，m)，7.22(1H，m)，7.48(1H，m)，7.60(1H，m)，8.47(1H，m)，8.84(1H，m)。
实施例(IV)-1 2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸甲酯2，3-二羟基丁二酸(盐)
将[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酸(Int.C1)(100mg，1当量)、2-甲基-2-[4-({[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]丙酸甲酯(Int.B1)(130mg，1.03当量)、DIPEA(0.1ml，3.6当量)、乙腈(2ml)和HATU(130mg，1.4当量)的混合物，在室温搅拌1小时，然后蒸发，并重新溶解在乙腈中。通过反向HPLC(制备方法A)纯化，给出2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸甲酯(128mg)。
LCMS Rt＝2.686分钟；m/z[M+H]+＝761.3 1H NMR(CDCl3)δ1.33(3H，s)，1.36(3H，s)，1.83-2.02(4H，m)，2.36-2.48(2H，m)，2.87-2.91(1H，m)，3.06-3.09(2H，m)，3.16-3.20(2H，m)，3.26-3.29(1H，m)，3.71-3.73(3H，m)，4.02/4.51(1H，2x br m)，4.74(1H，s)，4.92(1H，s)，5.12(1H，s)，5.56(1H，s)，7.00-7.19(3H，m)，7.32-7.37(1H，m)，7.48-7.62(5H，m)，7.72-7.81(5H，m)，8.22-8.28(1H，m)。
通过在一部分中加入L-酒石酸(1.675g，1.0当量)，并在室温搅拌30分钟，将游离碱转化成酒石酸氢盐。将溶液在真空中浓缩，将灰白色粉末在真空箱中在室温干燥。
合成方法例(IV)-2 2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1，8-萘啶-1(4H)-基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸甲酯2，3-二羟基丁二酸(盐)
将[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1，8-萘啶-1(4H)-基]乙酸(Int.C2)(100mg，1当量)、羰基二咪唑(50mg，1.05当量)和二甲基乙酰胺(4ml)的混合物，在60℃搅拌30分钟，然后加入2-甲基-2-[4-({[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]丙酸甲酯(Int.B1)(132mg，1.05当量)，将温度升高到80℃，2小时。加入另一部分羰基二咪唑(0.5当量)，在80℃继续搅拌15小时。冷却后，将粗产物进行反向HPLC(制备方法A)，以获得2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1，8-萘啶-1(4H)-基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸甲酯(99mg)。
LCMS Rt＝2.845分钟；m/z[M+H]+＝761.3 1H NMR(CDCl3)δ1.28(3H，s)，1.31(3H，s)，1.73-2.05(4H，m)，2.25(1H，t)，2.39-2.46(1H，m)，2.96-2.99(1H，m)，3.00-3.12(4H，m)，3.19(1H，s)，3.68-3.73(3H，m)，4.11/4.41(1H，2x br m)，4.73(1H，s)，4.97(1H，s)，5.51(1H，s)，6.29-6.34(1H，m)，7.06-7.20(2H，m)，7.35-7.41(1H，m)，7.48-7.58(2H，m)，7.68-7.84(6H，m)，8.60-8.68(1H，m)，8.87-8.91(1H，m)。
通过与合成方法例(I)中描述的类似的方法，将它转化成酒石酸氢盐。
合成方法例(IV)-3 2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸乙酯2，3-二羟基丁二酸(盐)
将[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酸(Int.C1)(115mg，1当量)、2-甲基-2-[4-({[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]丙酸乙酯(Int.B2)(150mg，1当量)、HATU(151mg，1.2当量)、DMF(2.7ml)和DIPEA(0.17ml，3当量)的混合物，在室温摇动5小时。将反应混合物在乙酸乙酯/甲醇和碳酸氢钠水溶液之间分配，然后将有机层用盐水洗涤并干燥。急骤层析(二氧化硅，3-4％的甲醇DCM溶液)给出了作为白色固体的2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸乙酯(190mg)。
LCMS Rt＝2.55分钟，m/z[M+H]+＝775.3 1H NMR(CDCl3)δ1.18-1.40(9H，m)，1.61-2.09(4H，m)，2.22-2.45(2H，m)，2.75-2.85(1H，m)，2.90-3.34(5H，m)，3.71/4.66(1H，2x m)，4.12-4.26(2H，m)，4.70-4.85(3H，m)，5.08(1H，s)，6.80-6.88(1H，m)，6.95-7.13(3H，m)，7.27-7.33(1H，m)，7.34-7.52(3H，m)，7.56-7.62(1H，m)，7.63-7.77(4H，m)，8.29-8.44(2H，m)。
通过与合成方法例(I)中描述的类似的方法，将它转化成酒石酸氢盐。
合成方法例(IV)-4 2-{4-[{[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酰基}({4′-[(三氟甲基)氧基]-4-联苯基}甲基)氨基]-1-哌啶基}-2-甲基丙酸乙酯2，3-二羟基丁二酸(盐)
将[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酸(Int.C1)(124mg，1.2当量)、2-甲基-2-{4-[({4′-[(三氟甲基)氧基]-4-联苯基}甲基)氨基]-1-哌啶基}丙酸乙酯(Int.B3)(139mg，1当量)、DMF(1.2ml)和DIPEA(0.16ml，3当量)的混合物，在室温摇动30分钟，然后加入HATU(176mg，1.5当量)，继续摇动4小时。反向HPLC(制备方法B)给出了作为白色固体的2-{4-[{[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酰基}({4′-[(三氟甲基)氧基]-4-联苯基}甲基)氨基]-1-哌啶基}-2-甲基丙酸乙酯(174mg)。
LCMS Rt＝2.77分钟；m/z[M+H]+＝791.3 1H NMR(CDCl3)特征峰δ1.21-1.42(9H，m)，1.58-2.08(4H，m)，2.20-2.48(2H，m)，2.71-5.1(13H，br m)，6.79-6.87(1H，d)，6.92-7.11(3H，m)，7.30-7.46(5H，m)，7.48-7.63(5H，m)，8.26-8.40(1H，m)。
通过与合成方法例(I)中描述的类似的方法，将它转化成酒石酸氢盐。
合成方法例(IV)-5 2-[4-({[2-[2-(2，4-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸甲酯2，3-二羟基丁二酸(盐)
将[2-[2-(2，4-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酸(Int.C3)(100mg，1当量)、2-甲基-2-[4-({[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]丙酸甲酯(Int.B1)(130mg，1.03当量)、DIPEA(0.1ml，2当量)、乙腈(2ml)和HATU(130mg，1.4当量)的混合物，在室温搅拌1小时，然后蒸发并重新溶解在乙腈中。通过反向HPLC纯化(制备方法B)，给出了2-[4-({[2-[2-(2，4-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸甲酯(126mg)。
LCMS Rt＝2.698分钟；m/z[M+H]+＝761.3 1H NMR(CDCl3)δ1.30(3H，s)，1.34(3H s)，1.81-2.03(4H，m)，2.29-2.35(1H，m)，2.39-2.45(1H，m)，2.82-2.87(1H，m)，3.00-3.14(4H，m)，3.19-3.24(1H，m)，3.70-3.73(3H，m)，4.00/4.51(1H，2x br m)，4.74(1H，s)，4.91(1H，s)，5.10(1H，s)，5.54(1H，s)，6.77-6.84(1H，m)，6.87-6.98(1H，m)，7.28-7.43(2H，m)，7.48-7.61(5H，m)，7.73-7.81(5H，m)，8.23-8.29(1H，m)。
通过与合成方法例(I)中描述的类似的方法，将它转化成酒石酸氢盐。
合成方法例(IV)-6 2-[4-({[2-[2-(2，4-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸乙酯2，3-二羟基丁二酸(盐)
将[2-[2-(2，4-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酸(Int.C3(120mg，1当量)、2-甲基-2-[4-({[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]丙酸乙酯(Int.B2)(204mg，1.3当量)、DMF(1.4ml)和DIPEA(0.183ml，3当量)的混合物，在室温摇动，然后加入HATU(206mg，1.5当量)，剧烈搅拌，并继续摇动1.5小时。加入另一部分中间体D5(12mg，0.1当量)，然后继续摇动2天。反向HPLC(制备方法B)给出了作为白色固体的2-[4-({[2-[2-(2，4-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸乙酯(173mg)。
LCMS Rt＝2.751分钟；m/z[M+H]+＝775.3 1H NMR(CDCl3)δ(旋转异构体的混合物)特征峰1.22-1.47(9H，m)，1.63-2.10(4H，m)，2.16-5.11(15H，br m)，6.75-6.88(2H，m)，7.14-7.80(12H，m)，8.26-8.40(1H，m)。
通过与合成方法例(I)中描述的类似的方法，将它转化成酒石酸氢盐。
合成方法例(IV)-7 2-{4-[{[2-[2-(2，4-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酰基}({4′-[(三氟甲基)氧基]-4-联苯基}甲基)氨基]-1-哌啶基}-2-甲基丙酸乙酯2，3-二羟基丁二酸(盐)
将[2-[2-(2，4-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酸(Int.C3)(114mg，1.1当量)、2-甲基-2-{4-[({4′-[(三氟甲基)氧基]-4-联苯基}甲基)氨基]-1-哌啶基}丙酸乙酯(Int.B3)(139mg，1当量)、DMF(1.2ml)和DIPEA(0.16ml，3当量)的混合物，在室温摇动，然后加入HATU(176mg，1.5当量)，剧烈搅拌，并继续摇动30分钟。加入另一部分中间体D5(21mg，0.2当量)，1小时后再加入HATU(23mg，0.2当量)，然后继续摇动18小时。反向HPLC(制备方法B)给出了作为白色固体的2-{4-[{[2-[2-(2，4-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酰基}({4′-[(三氟甲基)氧基]-4-联苯基}甲基)氨基]-1-哌啶基}-2-甲基丙酸乙酯(149mg)。
LCMS Rt＝2.793分钟；m/z[M+H]+＝791.3 1H NMR(CDCl3)特征峰δ1.20-1.45(9H，m)，1.58-2.12(4H，m)，2.14-2.48(2H，m)，2.620-5.11(11H，m)，6.59-6.72(1H，m)，6.73-6.90(2H，m)，7.16-7.64(11H.m)，8.25-8.40(1H，m)。
通过与合成方法例(II)中描述的类似的方法，将它转化成酒石酸氢盐。
合成方法例(IV)-8 2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1，8-萘啶-1(4H)-基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸三氟乙酸盐
将2-甲基-2-[4-({[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]丙酸1，1-二甲基乙酯(Int.B4)(1当量)、[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1，8-萘啶-1(4H)-基]乙酸(Int.C2)(1.2当量)、DIPEA(3当量)和DMF(1.0ml)的混合物在室温搅拌5分钟。在1部分中加入HATU(1.5当量)，继续搅拌5分钟。将粗反应混合物浓缩，通过二氧化硅塞过滤，用丙酮洗脱，蒸发以获得粗的2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1，8-萘啶-1(4H)-基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸1，1-二甲基乙酯。
将未分离的丙酸酯溶解在TFA和DCM的1∶1的混合物中，在室温搅拌4小时。蒸发，并进行制备HPLC(方法A)，给出了阳离子化合物。
其它的盐可以通过常规方法制备。游离碱也可以通过常规方法制备。
合成方法例(IV)-9 2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸三氟乙酸酯
将2-甲基-2-[4-({[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]丙酸1，1-二甲基乙酯(Int.B4)(1当量)、[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酸(Int.C1)(1.2当量)、DIPEA(3当量)和DMF(1.0ml)混合物在室温搅拌5分钟。在1部分中加入HATU(1.5当量)，继续搅拌5分钟。将粗反应混合物浓缩，通过二氧化硅塞过滤，用丙酮洗脱，蒸发以获得粗的2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸1，1-二甲基乙酯。
将未分离的丙酸酯溶解在TFA和DCM的1∶1的混合物中，在室温搅拌4小时。蒸发，并进行制备HPLC(方法A)，给出了阳离子化合物。
合成方法例(IV)-10 2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]-乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸甲酯
将[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酸(Int.D1)(20.7g，1.3当量)、2-甲基-2-[4-({[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]丙酸甲酯(Int.B1)(20.0g，1.3当量)、DIPEA(24.0ml，3当量)和DMF(184ml)的混合物机械搅拌，然后在一部分中加入HATU(27.1g，1.5当量)，继续搅拌2小时。将反应混合物在二乙醚/THF(1∶1)和碳酸钠(1M，过量)之间分配。将有机层用水和盐水洗涤，干燥并蒸发。在3根二氧化硅柱上相继进行层析(第一个是3∶1EtOAc/己烷；第二个是2％MeOH的DCM溶液；第三个是1∶1EtOAc/己烷到100％EtOAc)。将产物级份蒸发，获得了作为无定形的粉红色固体的目标产物(27.5g)。
LCMS Rt＝2.702分钟；m/z[M+H]+＝762.3 结晶将2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]-乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸甲酯(8.0g)和乙醇(200ml)的混合物加温直到完全溶解。将溶液在室温磁力搅拌24小时，然后过滤，收集到7.5g固体。将这些溶剂化的晶体置于60℃真空烤箱中，使用氮气抽取将真空维持在大约630Torr，进行24小时，以提供未溶剂化的晶体标题化合物(7.15g)，m.p.150℃。
1H NMR(CD3OD)δ1.25(3H，s)，1.30(3H，s)，1.63-1.99(4H，m)，2.16-2.28(1H，m)，2.3-2.43(1H，m)，2.89-2.98(1H，m)，2.98-3.08(2H，m)，3.16-3.30(3H，m)，3.66-3.69(3H，m)，4.02/4.38(1H，2x br m)，4.69(1H，s)，4.87(1H，s)，5.4/5.73(2H，2x s)，6.99-7.19(3H，m)，7.29-7.35(1H，m)，7.50-7.61(3H，m)，7.64-7.82(5H，m)，8.48-8.57(1H，m)，8.80-8.89(1H，m)。参见下面的图1。
合成方法例(IV)-11 2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]-乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸甲酯2，3-二羟基丁二酸(盐)
将2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸甲酯(8.5g，1当量)悬浮在甲醇(100ml)中，并加温到50℃，直到固体溶解。在一部分中加入L-酒石酸(1.675g，1.0当量)，在室温搅拌30分钟。将溶液在真空中浓缩，给出在室温下在真空烘箱中干燥的灰白色粉末。
LCMS Rt＝2.697分钟；m/z[M+H]+＝762.3 1H NMR(d6-DMSO)δ1.17(3H，s)，1.23(3H，s)，1.47-1.91(4H，m)，1.98-2.41(1H，m)，2.16-2.33(1H，m)，2.80-3.26(6H，m)，3.50-3.67(3H，m)，3.95/4.17(1H，2x br m)，4.61(1H，s)，4.85(1H，s)，5.39/5.69(2H，2x s)，7.08-7.39(4H，m)，7.53-7.70(3H，m)，7.72-7.97(5H，m)，8.42-8.54(1H，m)，8.85-8.95(1H，m)。
合成方法例(IV)-12 2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]-乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸乙酯2，3-二羟基丁二酸(盐)
将[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]-乙酸(Int.D1)(116mg，1当量)、2-甲基-2-[4-({[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]-甲基}氨基)-1-哌啶基]丙酸乙酯(Int.B2)(150mg，1当量)、HATU(151mg，1.2当量)、DMF(2.72ml)和DIPEA(0.17ml，3当量)的混合物在室温摇动3.25小时。将反应化合物在乙酸乙酯/甲醇和碳酸氢钠水溶液之间分配，将有机层用盐水洗涤，干燥，并用活性炭(250mg)处理。急骤层析(二氧化硅，3-4％甲醇的DCM溶液)给出了作为白色固体的2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]-乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸乙酯(178mg)。
LCMS Rt＝2.58分钟；m/z[M+H]+＝776.3 1H NMR(CDCl3)δ1.20-1.40(9H，m)，1.56-2.02(4H，m)，2.19-2.44(2H，m)，2.88-3.20，(4H，m)，3.22-3.40(2H，m)，3.81/4.58(1H，2x m)，4.11-4.27(2H，m)，4.69/4.84(2H，2x s)，5.17/5.49(2H，2x s)，6.95-7.14(3H，m)，7.25-7.31(1H，m)，7.38-7.54(3H，m)，7.54，7.61(1H，m)，7.62-7.79(4H，m)，8.57-8.75(2H，m)。
通过与合成方法例(II)描述的类似的方法将它转化成酒石酸氢盐。
合成方法例(IV)-13 2-{4-[{[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酰基}({4′-[(三氟甲基)氧基]-4-联苯基}甲基)氨基]-1-哌啶基}-2-甲基丙酸乙酯2，3-二羟基丁二酸(盐)
[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]-乙酸(Int.D1)(114mg，1当量)、2-甲基-2-{4-[({4′-[(三氟甲基)氧基]-4-联苯基}甲基)氨基]-1-哌啶基}丙酸乙酯(Int.B4)(139mg，1当量)、DMF(1.2ml)和DIPEA(0.16ml，3当量)的混合物在室温摇动30分钟，然后加入HATU(176mg，1.5当量)，继续摇动3小时。反向HPLC(制备方法B)给出了做为白色固体的2-{4-[{[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代-1(4H)-喹唑啉基]乙酰基}({4′-[(三氟甲基)氧基]-4-联苯基}甲基)氨基]-1-哌啶基}-2-甲基丙酸乙酯(166mg)。
LCMS Rt＝2.87分钟；m/z[M+H]+＝792.3 1H NMR(CDCl3)δ1.18-1.42(9H，m)，1.54-2.04(4H，m)，2.12-2.46(2H，m)，2.86-3.21(4H，m)，3.21-3.41(2H，m)，3.79/4.57(1H，2x m)，4.10-4.27(2H，m)，4.68(1H，s)，4.82(1H，s)，5.17(1H，s)，5.47(1H，s)，6.94-7.16(3H，m)，7.20-7.36(3H，m)，7.37-7.48(3H，m)，7.48-7.61(3H，m)，8.56-8.76(2H，m)。
通过与合成方法例(II)描述的类似的方法将它转化成酒石酸氢盐。
合成方法例(IV)-14 2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸1-甲基乙酯2，3-二羟基丁二酸(盐)
将2-甲基-2-[4-({[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]丙酸1-甲基乙酯(Int.B3)(420mg，1当量)、[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酸(Int.D1)(300mg，1当量)、HATU(396mg，1.2当量)、DIPEA(0.22ml，1.5当量)和DMF(3.0ml)的混合物在室温搅拌30分钟。将粗反应混合物直接进行反向HPLC(制备方法A)，获得了2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸1-甲基乙酯(171mg)。
LCMS Rt＝2.837分钟；m/z[M+H]+＝790.3 1H NMR(CD3OD)δ1.16-1.37(12H，m)，1.62-2.01(4H，m)，2.27-2.55(2H，m)，2.95-3.12(3H，m)，3.12-3.29(3H，m)，4.06/4.40(1H，2x br m)，4.71(1H，s)，4.89(1H，s)，4.92-5.07(1H，m)，5.43/5.76(2H，2xs)，7.00-7.21(3H，m)，7.29-7.38(1H，m)，7.49-7.65(3H，m)，7.65-7.87(5H，m)，8.48-8.58(1H，m)，8.81-8.90(IH，m)。
通过与合成方法例(II)描述的类似的方法将它转化成酒石酸氢盐。
合成方法例(IV)-15 2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酰基}{[4′-[(三氟甲基)氧基]-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸1-甲基乙酯2，3-二羟基丁二酸(盐)
将2-甲基-2-{4-[({4′-[(三氟甲基)氧基]-4-联苯基}甲基)-氨基]-1-哌啶基}丙酸1-甲基乙酯(Int.B5)(80mg，1当量)、[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酸(Int.D1)(67mg，1当量)、HATU(400mg，5当量)、DIPEA(0.22ml，1.5当量)和DMF(2.0ml)的混合物在室温搅拌30分钟。将粗反应混合物直接进行反向HPLC(制备方法A)，获得了2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酰基}{[4′-[(三氟甲基)氧基]-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸1-甲基乙酯(25mg)。
LCMS Rt＝2.952分钟；m/z[M+H]+＝806.4 1H NMR(DMSO-d6)δ1.09-1.25(12H，m)，1.47-1.91(4H，m)，2.05-2.20(1H，m)，2.21-2.38(1H，m)，2.87-3.07(3H，m)，3.08-3.22(3H，m)，3.95/4.17(1H，2x br m)，4.59(1H，s)，4.75-4.97(2H，m)，5.38/5.68(2H，2x s)，7.90-7.21(1H，m)，7.21-7.36(3H，m)，7.42-7.55(3H，m)，7.55-7-64(2H，m)，7.66-7.77(2H，m)，7.77-7.85(1H，m)，8.43-8.52(1H，m)，8.86-8.95(1H，m)。
通过与合成方法例(II)描述的类似的方法将它转化成酒石酸氢盐。
合成方法例(IV)-16 2-[4-({[2-[2-(2，4-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸甲酯2，3-二羟基丁二酸(盐)
将[2-[2-(2，4-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酸(Int.D2)(100mg，1当量)、2-甲基-2-[4-({[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}-氨基)-1-哌啶基]丙酸甲酯(Int.B1)(130mg，1.03当量)、DIPEA(0.16ml，3当量)、乙腈(2ml)和HATU(130mg，1.2当量)的混合物在室温搅拌1小时，然后蒸发，重新溶解在乙腈中。通过反向HPLC(制备方法B)纯化，给出了2-[4-({[2-[2-(2，4-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸甲酯(145mg)。
LCMS Rt＝2.716分钟；m/z[M+H]+＝762.3 1H NMR(CDCl3)δ1.27(3H，s)，1.33(3H，s)，1.69-1.98(4H，m)，2.22-2.29(IH，m)，2.36-2.43(1H，m)，2.96-3.08(3H，m)，3.13-3.24(3H，m)，3.69-3.72(3H，m)，4.04/4.41(1H，2x br m)，4.72(1H，s)，4.91(1H，s)，5.41/5.73(2H，2x s)，6.84-6.97(2H，m)，7.34-7.44(2H，m)，7.54-7.63(3H，m)，7.69-7.83(5H，m)，8.55-8.60(1H，m)，8.86-8.91(1H，m)。
通过与合成方法例(II)描述的类似的方法将它转化成酒石酸氢盐。
合成方法例(IV)-17 2-[4-({[2-[2-(2，4-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸乙酯2，3-二羟基丁二酸(盐)
将[2-[2-(2，4-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酸(Int.D2)(120mg，1当量)、2-甲基-2-[4-({[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]-甲基}氨基)-1-哌啶基]丙酸乙酯(Int.B2)(198mg，1.3当量)、DMF(1.4ml)和DIPEA(0.178ml，3当量)的混合物在室温摇动1.5小时，然后加入HATU(200mg，1.5当量)，剧烈搅拌，并继续摇动1.5小时。加入另一部分中间体D2(12mg，0.1当量)，然后继续摇动2天。反向HPLC(制备方法B)给出了作为白色固体的2-[4-({[2-[2-(2，4-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸乙酯(170mg)。
LCMS Rt＝2.827分钟；m/z[M+H]+＝776.3 1H NMR(CDCl3)特征峰δ1.14-1.43(9H，m)，1.57-2.05(4H，m)，2.10-2.46(2H，m)，2.84-3.11(3H，m)，3.12-3.34(3H，m)，3.65/3.85(1H，m)，4.06-4.27(2H，m)，4.65/4.85(2H，s)，5.15/5.45(2H，s)，6.62-6.89(2H，m)，7.18-7.34(1H，m)，7.37-7.82(9H，m)，8.59-8.77(2H，m)。
通过与合成方法例(II)描述的类似的方法将它转化成酒石酸氢盐。
合成方法例(IV)-18 2-{4-[{[2-[2-(2，4-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酰基}({4′-[(三氟甲基)氧基]-4-联苯基}甲基)氨基]-1-哌啶基}-2-甲基丙酸乙酯2，3-二羟基丁二酸(盐)
将2-甲基-2-[4-({[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]丙酸1，1-二甲基乙酯(Int.B7)(150mg，1当量)、[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酸(Int.D1)(130mg，1.2当量)、DIPEA(0.164ml，3当量)和DMF(1.0ml)的混合物在室温搅拌5分钟。在一部分中加入HATU(180mg，1.5当量)，继续搅拌5分钟。将粗反应混合物浓缩，通过二氧化硅塞过滤，用丙酮洗脱，蒸发，获得了粗的2-{4-[{[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸1，1-二甲基乙酯。
LCMS Rt＝2.823分钟，m/z[M+H]+＝804.4 将该未分离的中间体溶解在TFA和DCM的1∶1混合物中，在室温搅拌4小时。蒸发并进行制备HPLC(方法A)，给出了所需的2-[4-({[2-[2-[2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸三氟乙酸盐(70mg)。
LCMS Rt＝2.554分钟；m/z[M+H]+＝748.2 1H NMR(d6-DMSO)δ1.44(3H，s)，1.51(3H，s)，1.70-2.30(4H，m)，2.41-2.56(2H，m)，2.94-3.54(6H，m)，4.44-4.95(3H，m)，5.42/5.76(2H，2x br s)，7.07-7.38(4H，m)，7.54-7.75(3H，m)，7.76-7.99(5H，m)，8.42-8.54(1H，m)，8.85-8.98(1H，m)。
其它的盐可以通过常规方法制备。游离碱也可以通过常规方法制备。
在某些实施方案中，可用于本文公开的方法中作为Lp-PLA2抑制剂的化合物是 1-(N-(2-(二乙基氨基)乙基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)-氨基羰基甲基)-2-(4-氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮，也被称为“SB480848”，或USAN名称“darapladib”，它是基于嘧啶酮的化合物，是Lp-PLA2的可逆抑制剂，在本文的实施例中使用， N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)乙酰胺； N-(1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)乙酰胺；以及 2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]-乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸甲酯。
用在本文的实施例中的1-(N-(2-(二乙基氨基)乙基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)-氨基羰基甲基)-2-(4-氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮，AKA SB480848；N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧代-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)乙酰胺；N-(1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧代-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)乙酰胺；以及2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸甲酯的可药用的盐，也可以作为Lp-PLA2的抑制剂用于本文描述的方法中。
Lp-PLA2的核酸抑制剂 在某些实施方案中，抑制Lp-PLA2的药剂是核酸。Lp-PLA2的核酸抑制剂是例如但不限于RNA干扰诱导分子，例如但不限于siRNA、dsRNA、stRNA、shRNA及其修饰的版本，其中RNA干扰分子使Lp-PLA2的基因表达沉默。在某些实施方案中，Lp-PLA2的核酸抑制剂是反义寡核酸，或核酸类似物，例如但不限于DNA、RNA、肽核酸(PNA)、假互补PNA(pc-PNA)或锁核酸(LNA)等。在可选实施方案中，核酸是DNA或RNA，以及核酸类似物，例如PNA、pcPNA和LNA。核酸可以是单链或双链的，可以选自编码目标蛋白的核酸、寡核苷酸、PNA等。这样的核酸序列包括例如但不限于编码用作转录阻遏蛋白的蛋白的核酸序列、反义分子、核酶、小抑制核酸序列，例如但不限于RNAi、shRNAi、siRNA、微小RNAi(mRNAi)、反义寡核苷酸等。
在某些实施方案中，单链RNA(ssRNA)，一种在真核细胞中内源发现的RNA形式，可用于形成RNAi分子。细胞的ssRNA分子包括信使RNAs(以及前信使RNAs前体)、小核RNAs、小核仁RNAs、转移RNAs和核糖体RNAs。双链RNA(dsRNA)诱导尺寸依赖性的免疫应答，使得大于30bp的dsRNA激活干扰素应答，而较短的dsRNAs将进入Dicer酶下游的细胞内源RNA干扰机制中。
Lp-PLA2可以通过抑制Lp-PLA2多肽的表达、或者通过本技术领域的普通专业人员通常了解的“基因沉默”方法来降低。
RNA干扰(RNAi)为抑制选定的靶多肽的表达，提供了有力的方法。RNAi使用靶向编码靶多肽的信使RNA的小干扰RNA(siRNA)双链体，进行选择性降解。基因表达的siRNA依赖性转录后沉默，包括在siRNA指导的位点处切割靶信使RNA分子。
RNA干扰(RNAi)是一种进化上保守的过程，由此使与靶基因相同和高度相似的RNA的序列的表达或导入，引起了从被靶向的基因转录的信使RNA(mRNA)的序列特异性降解或特异性转录后基因沉默(PTGS)(参见Coburn，G.和Cullen，B.，(2002)J.of Virology76(18)9225)，由此抑制了靶基因的表达。在一个实施方案中，RNA是双链RNA(dsRNA)。该过程已经在植物、脊椎动物和哺乳动物细胞中进行了描述。在自然界中，RNAi由dsRNA特异性核酸内切酶Dicer启动，该酶促进了长的dsRNA持续不断地裂解成被称为siRNAs的双链片段。siRNAs被整合到蛋白复合物(被称为“RNA诱导的沉默复合物”，或“RISC)中，该复合物识别并裂解靶mRNAs。也可以通过引入抑制或沉默靶基因的表达的核酸分子、例如合成的siRNAs或RNA干扰剂，来启动RNAi。本文中使用的”靶基因表达的抑制“，包括与没有诱导RNA干扰的情况下相比，靶基因或靶基因编码的蛋白的表达或蛋白活性或水平的任何降低。降低可以是与还没有被RNA干扰剂靶向的靶基因的表达、或靶基因编码的蛋白的活性或水平相比，至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或以上的降低。
“短干扰RNA”(siRNA)，在本文中也被称为“小干扰RNA”，被定义为其功能是通过例如RNAi来抑制靶基因的表达的药剂。siRNA可以是化学合成的，可以通过体外转录生产，或者可以在宿主细胞中生产。在一个实施方案中，siRNA是双链RNA(dsRNA)分子，其长度为大约15到大约40个核苷酸，优选为大约15到大约28个核苷酸、更优选为大约19到大约25个核苷酸长，更优选大约19、20、21、22或23个核苷酸长，可以在每条链上含有3′和/或5′突出端，其长度为大约0、1、2、3、4或5个核苷酸。突出端的长度在两条链之间是独立的，即一条链上突出端的长度不依赖于第二条链上突出端的长度。优选情况下，siRNA能够通过靶信使RNA(mRNA)的降解或特异性转录后基因沉默(PTGS)促进RNA干扰。
siRNAs还包括小发夹(也称为茎环)RNAs(shRNAs)。在一个实施方案中，这些shRNAs包含短的(例如大约19到大约25个核苷酸)反义链，其后跟着大约5到大约9个核苷酸的核苷酸环，以及类似的正义链。可选地，正义链可以在核苷酸环结构前面，反义链可以跟在后面。这些shRNAs可以包含在质粒、逆转录病毒和慢病毒中，可以从例如pol III U6启动子或另一种启动子表达(参见例如Stewart等，(2003)RNA Apr；9(4)493-501，在此以其全文引为参考)。
RNA干扰药剂的靶基因或序列，可以是细胞基因或基因组序列，例如Lp-PLA2序列。siRNA可以与靶基因或基因组序列或其片段基本上同源。当在本文中使用时，术语“同源的”被定义为是与靶mRNA或其片段基本上相同的、足够互补的或相似的，能够执行靶的RNA干扰。除了天然RNA分子之外，适合于抑制或干扰靶序列的表达的RNA，还包括RNA衍生物和类似物。优选情况下，siRNA与其靶相同。
优选情况下，siRNA只靶向一个序列。每种RNA干扰药剂、例如siRNAs，可以通过例如表达情况分析来筛选其潜在的降低靶的效应。这样的方法对于本领域技术人员来说是已知的，描述在例如Jackson等，Nature Biotechnology 6635-637，2003中。除了表达情况分析之外，人们也可以在序列数据库中筛选潜在的靶序列的相似序列，以鉴定能够具有降低靶的效应的潜在的序列。例如，按照Jackson等(同上)，15个、或者可能少至11个连续的核苷酸序列一致，就足以指导非靶向转录本的沉默。因此，人们可以一开始就通过使用任何已知的序列比对方法，例如BLAST进行序列一致性分析，筛选提出的siRNAs，以避免可能的降低靶的沉默效应。
siRNA分子不是必需限于只含有RNA的分子，而是例如进一步包含了化学修饰的核苷酸和非核苷酸，也包括了其中核糖分子被另一种糖分子或具有类似功能的分子所取代的分子。此外，可以使用核苷酸残基之间的非天然键合，例如硫代磷酸酯键合。例如，含有D-阿拉伯糖呋喃糖苷结构代替在RNA中发现的天然存在的D核糖糖苷的siRNA，可以用于本发明的RNAi分子中(美国专利No.5,177,196)。其它例子包括在核苷的糖和杂环碱基之间含有o-键合的RNA分子，它赋予了核酸酶抗性以及与寡核苷酸分子的紧密的互补链结合，与含有2′-O-甲基核糖、阿拉伯糖以及特别是D-阿拉伯糖的寡核苷酸相似(美国专利No.5,177,196)。
RNA链可以使用报告基团例如荧光团的反应性官能团进行衍生。特别有用的衍生物是在RNA链的一个或多个末端进行修饰，典型为正义链的3’末端。例如，3’末端的2’-羟基可以用各种基团容易地、选择性地衍生。
其它有用的RNA衍生物包括具有修饰的糖部分的核苷酸，例如2’O烷基化残基或2’-O-甲基核糖基衍生物和2’-O-氟代核糖基衍生物。RNA碱基也可以被修饰。可以使用任何可用于抑制或干扰靶序列的表达的修饰碱基。例如，可以掺入卤化的碱基，例如5-溴尿嘧啶和5-碘尿嘧啶。碱基也可以被烷基化，例如可以掺入7-甲基鸟嘌呤来代替鸟嘌呤残基。也可以掺入能够产生成功抑制的非天然碱基。
最优选的siRNA修饰包括2’-脱氧-2’-氟代尿苷或锁核酸(LNA)核苷酸，以及含有磷酸二酯键或不同数量的硫代磷酸酯键的RNA双链体。这样的修饰对于本领域技术人员来说是已知的，并描述在例如Braasch等，Biochemistry，427967-7975，2003中。对siRNA分子进行的大部分有用的修饰，可以使用为反义寡核苷酸技术建立的化学方法来导入。优选情况下，修饰包含最少的2′-O-甲基修饰，优选完全不含这样的修饰。修饰也优选不含siRNA的游离5’-羟基的修饰。
siRNA和miRNA分子具有与它们的3’-或它们的5’-末端共价连接的各种“尾”，这在本技术领域中是已知的，它们可用于使通过本发明的方法投送的siRNA和miRNA分子稳定。总的来说，连接到RNA分子的3’或5’末端的插入基团、各种类型的报告基团以及亲脂基团，对于本领域技术人员来说是熟知的，并可用于本发明的方法。3’-胆固醇或3’-吖啶修饰的寡核苷酸可用于制备可用于本发明的修饰的RNA分子，关于它们的合成的描述，可以在例如下面的文章中发现Gamper，H.B.，Reed，M.W.，Cox，T.，Virosco，J.S.，Adams，A.D.，Gall，A.，Scholler，J.K.和Meyer，R.B.(1993)Facile Preparation and Exonuclease Stability of3′-Modified Oligodeoxynucleotides.(3’-修饰的寡脱氧核苷酸的方便制备和核酸外切酶稳定性)，Nucleic Acids Res.21 145-150；以及Reed，M.W.，Adams，A.D.，Nelson，J.S.和Meyer，R.B.，Jr.(1991)Acridine andCholesterol-Derivatized Solid Supports for Improved Synthesis of3′-Modified Oligonucleotides.(用于改进3’-修饰的寡核苷酸的合成的吖啶和胆固醇衍生化的固相支持物)，Bioconjugate Chem.2 217-225(1993)。
其它可用于靶向Lp-PLA2表达的siRNAs可以容易地设计和测试。因此，可用于本文描述的方法的siRNAs，包括长度为大约15到大约40、或大约15到大约28个核苷酸的siRNA分子，它们与Lp-PLA2基因同源。优选情况下，靶向Lp-PLA2的siRNA分子的长度为大约19到大约25个核苷酸。更优选情况下，靶向Lp-PLA2的siRNA分子的长度为大约19、20、21或22个核苷酸。靶向Lp-PLA2的siRNA分子也可以含有3’羟基。靶向Lp-PLA2的siRNA分子可以是单链的或双链的；这样的分子可以是平末端的，或者含有突出的末端(例如5’、3’)。在具体实施方案中，RNA分子是双链的，具有平末端或含有突出末端。
在一个实施方案中，靶向Lp-PLA2的至少一条链的RNA分子具有长度为大约0到大约6个核苷酸(例如嘧啶核苷酸、嘌呤核苷酸)的3’突出末端。在其它实施方案中，3’突出端的长度从大约1到大约5个核苷酸，从大约1到大约3个核苷酸，从大约2到大约4个核苷酸。在一个实施方案中，靶向Lp-PLA2的RNA分子是双链的，一条链具有3’突出端，另一条链可以是平末端的或具有突出端。在靶向Lp-PLA2的RNA分子是双链的，并且两条链都含有突出端的实施方案中，每条链的突出端的长度可以是相同的或不同的。在具体实施方案中，本发明的RNA含有大约19、20、21或22个配对的核苷酸，并在RNA的两个3’末端具有从大约1到大约3、特别是大约2个核苷酸的突出端。在一个实施方案中，3’突出端可以被稳定化以对抗降解。在优选实施方案中，RNA通过包含嘌呤核苷酸例如腺嘌呤和鸟嘌呤核苷酸被稳定化。可选地，用修饰的类似物取代嘧啶核苷酸，例如用2’-脱氧胸腺嘧啶核苷取代尿苷2核苷酸3’突出端，是耐受的，并且不影响RNAi的效能。2’羟基的缺少，显著地增加了突出端在组织培养基中的核酸酶抗性。
使用siRNAs已经成功地对Lp-PLA2 mRNA进行了定靶，这样的siRNA或用于制备它们的载体是可商购的，例如从Invitrogen购得。在某些实施方案中，使用这样的Lp-PLA2 siRNAs评估Lp-PLA2蛋白的表达和/或降低，可以使用可商购的试剂盒来测定，例如但不限于来自diaDexus的PLAC分析测试。其它的可以由本领域技术人员根据靶mRNA的已知序列容易地制备。为了避免怀疑，人类Lp-PLA2的cDNA序列提供在例如GenBank登记号Nos.U20157(SEQ ID NO1)或NM_005084(SEQ ID NO2)中。U20157中的序列如下(SEQ ID NO1)
1 gctggtcgga ggctcgcagt gctgtcggcg agaagcagtc gggtttggagcgcttgggtc 61 gcgttggtgc gcggtggaac gcgcccaggg accccagttc ccgcgagcagctccgcgccg 121 cgcctgagag actaagctga aactgctgct cagctcccaa gatggtgccacccaaattgc 181 atgtgctttt ctgcctctgc ggctgcctgg ctgtggttta tccttttgactggcaataca 241 taaatcctgt tgcccatatg aaatcatcag catgggtcaa caaaatacaagtactgatgg 301 ctgctgcaag ctttggccaa actaaaatcc cccggggaaa tgggccttattccgttggtt 361 gtacagactt aatgtttgat cacactaata agggcacctt cttgcgtttatattatccat 421 cccaagataa tgatcgcctt gacacccttt ggatcccaaa taaagaatatttttggggtc 481 ttagcaaatt tcttggaaca cactggctta tgggcaacat tttgaggttactctttggtt 541 caatgacaac tcctgcaaac tggaattccc ctctgaggcc tggtgaaaaatatccacttg 601 ttgttttttc tcatggtctt ggggcattca ggacacttta ttctgctattggcattgacc 661 tggcatctca tgggtttata gttgctgctg tagaacacag agatagatctgcatctgcaa 721 cttactattt caaggaccaa tctgctgcag aaatagggga caagtcttggctctacctta 781 gaaccctgaa acaagaggag gagacacata tacgaaatga gcaggtacggcaaagagcaa 841 aagaatgttc ccaagctctc agtctgattc ttgacattga tcatggaaagccagtgaaga 901 atgcattaga tttaaagttt gatatggaac aactgaagga ctctattgatagggaaaaaa 961 tagcagtaat tggacattct tttggtggag caacggttat tcagactcttagtgaagatc 1021 agagattcag atgtggtatt gccctggatg catggatgtt tccactgggtgatgaagtat 1081 attccagaat tcctcagccc ctctttttta tcaactctga atatttccaatatcctgcta 1141 atatcataaa aatgaaaaaa tgctactcac ctgataaaga aagaaagatgattacaatca 1201 ggggttcagt ccaccagaat tttgctgact tcacttttgc aactggcaaaataattggac 1261 acatgctcaa attaaaggga gacatagatt caaatgtagc tattgatcttagcaacaaag 1321 cttcattagc attcttacaa aagcatttag gacttcataa agattttgatcagtgggact 1381 gcttgattga aggagatgat gagaatctta ttccagggac caacattaacacaaccaatc 1441 aacacatcat gttacagaac tcttcaggaa tagagaaata caattaggattaaaataggt 1501 ttttt 选择siRNA序列使得siRNA的反义(引导)链最大化地摄入到RISC中，从而最大化RISC靶向人类Lp-PLA2 mRNA以进行降解的能力。这可以通过扫描在反义链的5’-末端具有最低的结合自由能的序列来实现。较低的自由能导致siRNA双链体反义链的5’-末端的增加的解链，从而确保反义链将被RISC吸纳，并指导人类Lp-PLA2 mRNA的序列特异性裂解。
在优选实施方案中，siRNA或修饰的siRNA在可药用载体中进行投送。其它的载体试剂例如脂质体，可以添加到可药用载体中。
在另一个实施方案中，siRNA的投送，是通过将编码小发夹RNA(shRNA)的载体，在可药用载体中投送到个体器官中的细胞。在转录后，shRNA被细胞转变成能够靶向例如Lp-PLA2的siRNA。在一个实施方案中，载体可以是可调控的载体，例如可以用四环素诱导的载体。
在一个实施方案中，在本文描述的方法中使用的RNA干扰药剂，在不使用载体的情况下进行静脉内注射例如水力注射后，在体内被细胞主动摄入，这表明了RNA干扰药剂，例如在本发明的方法中使用的siRNAs的有效的体内投送。
也可以使用其它的策略来投送RNA干扰药剂，例如在本发明的方法中使用的siRNAs或shRNAs，这些策略例如通过载体、例如质粒，或病毒载体、例如慢病毒载体进行投送。可以使用的这样的载体描述在例如Xiao-Feng Qin等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，100183-188中。其它的投送方法包括使用碱性肽投送RNA干扰药剂，例如本发明的siRNAs或shRNAs，例如通过将RNA干扰药剂与碱性肽、例如TAT肽的片段结合或混合，也可以通过与阳离子脂类混合或配制在颗粒中来投送。
正如提到的，dsRNA、例如siRNA或shRNA，可以使用可诱导的载体进行投送，例如可用四环素诱导的载体。可以使用例如在Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.1005103-5106，using pTet-On vectors(使用pTet-On载体)(BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA)中描述的方法。在某些实施方案中，载体可以是质粒载体、病毒载体，或任何其它适用于插入片段和外源序列并用于导入到真核细胞中的适合载体。载体可以是表达载体，能够指导激动物或拮抗物核酸分子的DNA序列转录成RNA。病毒表达载体可以选自例如基于逆转录病毒、慢病毒、EpsteinBarr病毒、牛乳头状瘤病毒、腺病毒和腺相关病毒的载体，或任何上述病毒的杂交病毒。在一个实施方案中，载体是染色体外的。使用适合的染色体外载体，为在对象中将拮抗核酸分子在染色体外维持在高拷贝数下，提供了一种手段，从而消除了染色体整合的潜在的影响。
可用于本文公开的方法的RNA干扰分子和核酸抑制剂，可以使用任何已知的技术法来生产，例如直接化学合成，通过暴露于重组Dicer蛋白或果蝇胚胎裂解物将较长的双链RNAs进行加工，通过源自于S2细胞的体外系统，使用噬菌体RNA聚合酶，RNA依赖性RNA聚合酶，以及基于DNA的载体。使用细胞裂解物或体外加工，还可以包括随后从裂解物等中分离短的、例如21-23个核苷酸的siRNAs。化学合成通常通过制造两个单链RNA寡聚物，然后将两个单链RNA寡聚物退火成双链RNA来进行。其它的例子包括在WO 99/32619和WO 01/68836中公开的方法，其中讲述了siRNA的化学和酶法合成。此外，大量的商业化服务机构可用于设计和制造特异性siRNAs(参见例如QIAGEN Inc.，Valencia，CA和AMBION Inc.，Austin，TX)。
在某些实施方案中，药剂是抑制Lp-PLA的表达和/或Lp-PLA2蛋白活性的蛋白或多肽或RNAi药剂。在这样的实施方案中，细胞可以被修饰(例如通过同源重组)，以提供这样的药剂的增加的表达，例如用全部或部分异源启动子替代全部或部分天然存在的启动子，以便使细胞以较高水平表达Lp-PLA2的天然抑制剂药剂，例如Lp-PLA2的蛋白或miRNA抑制剂。异源启动子的插入方式，使得它与编码药剂的目标核酸可操作地连接。参见例如Transkaryotic Therapies，Inc.的PCT国际公开No.WO 94/12650，Cell Genesys，Inc.的PCT国际公开No.WO 92/20808，以及Applied Research Systems的PCT国际公开No.WO 91/09955。细胞也可以被工程化，以在可诱导调控的元件控制下表达含有药剂的内源基因，在这种情况下内源基因的调控序列可以通过同源重组来替换。基因活化技术描述在Chappel的美国专利No.5,272,071，Sherwin等的美国专利No.5,578,461，Selden等的PCT/US92/09627(W093/09222)，以及Skoultchi等的PCT/US90/06436(WO91/06667)中。药剂可以通过在适合于表达miRNA的培养条件下培养转化的宿主细胞来制备。然后可以从这样的培养物(即从培养基或细胞提取液)中，使用已知的纯化技术例如凝胶过滤和离子交换层析，来纯化得到的表达的药剂。Lp-PLA2的肽或核酸药剂抑制剂的纯化也可以包括含有将与蛋白结合的试剂的亲和柱；一个或多个在亲和树脂上的柱步骤，例如伴刀豆球蛋白A-琼脂糖、肝素-toyopearlTM或Cibacrom blue 3GA琼脂糖凝胶；一个或多个涉及疏水相互作用层析的步骤，使用的树脂例如苯基醚、丁基醚或丙基醚；免疫亲和层析，或互补cDNA亲和层析。
在一个实施方案中，Lp-PLA2的核酸抑制剂可以通过合成获得，例如通过专业技术人员已知的任何合成方法化学合成核酸。然后可以通过本技术领域任何已知的方法纯化合成的Lp-PLA2的核酸抑制剂。用于核酸的化学合成的方法包括但不限于使用磷酸三酯、磷酸酯或亚磷酰胺化学方法和固相技术的体外化学合成，或通过脱氧核苷H-膦酸酯中间体(参见Bhongle的美国专利No.5,705,629)。
在某些情况下，例如当需要增加核酸酶稳定性时，带有核酸类似物和/或修饰的核苷间键合的核酸可能是优选的。含有修饰的核苷间键合的核酸，也可以使用本技术领域熟知的反应试剂和方法来合成。例如，合成含有膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲氧基乙基氨基磷酸酯、甲乙缩醛、硫代甲乙缩醛、二异丙基甲硅烷、乙酰胺、氨基甲酸酯、二亚甲基硫醚(-CH2-S-CH2)、二甲亚砜(-CH2-SO-CH2)、二甲砜(-CH2-SO2-CH2)、2′-O-烷基和2′-脱氧-2′-氟硫代磷酸酯核苷间键合的核酸的方法，在本技术领域中是熟知的(参见Uhlmann等，1990，Chem.Rev.90543-584；Schneider等，1990，Tetrahedron Lett.31335，及其引用的参考文献)。Cook等的美国专利Nos.5,614,617和5,223,618，Acevedo等的5,714,606，Cook等的5,378,825，Buhr等的5,672,697和5,466,786，Cook等的5,777,092，De Mesmacker等的5,602,240，Cook等的5,610,289以及Wang的5,858,988，也描述了用于增强核酸酶稳定性和细胞摄取的核酸类似物。
合成的siRNA分子、包括shRNA分子，可以使用多种本领域技术人员已知的技术来获得。例如，siRNA分子可以使用本技术领域已知的方法化学合成或重组生产，例如使用适当保护的核糖核苷氨基磷酸酯和常规的DNA/RNA合成仪(参见例如Elbashir，S.M.等，(2001)Nature411494-498；Elbashir，S.M.，W.Lendeckel和T.Tuschl(2001)Genes &Development 15188-200；Harborth，J.等，(2001)J.Cell Science1144557-4565；Masters，XR.等，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA988012-8017；以及Tuschl，T.等，(1999)Genes & Development133191-3197)。可选地，有几个商业化RNA合成供应商可用，包括但不限于Proligo(Hamburg，Germany)、Dharmacon Research(Lafayette，CO，USA)、Pierce Chemical(Perbio Science的分部，Rockford，IL，USA)、Glen Research(Sterling，VA，USA)、ChemGenes(Ashland，MA，USA)和Cruachem(Glasgow，UK)。因此，siRNA分子不是非常难以合成，并且可以适合于RNAi的质量容易地提供。此外，由质粒载体、反转录病毒和慢病毒编码的dsRNAs可以被表达成茎环结构(Paddison，P.J.等，(2002)Genes Dev.16948-958；McManus，M.T.等，(2002)RNA8842-850；Paul，CP.等，(2002)Nat.Biotechnol.20505-508；Miyagishi，M.等，(2002)Nat.Biotechnol.20497-500；Sui，G.等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 995515-5520；Brummelkamp，T.等，(2002)Cancer Cell2243；Lee，N.S.等，(2002)Nat.Biotechnol.20500-505；Yu，J.Y.等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 996047-6052；Zeng，Y.等，(2002)Mol.Cell 91327-1333；Rubinson，D.A.等，(2003)Nat.Genet.33401-406；Stewart，S.A.等，(2003)RNA 9493-501)。这些载体一般在dsRNA上游具有polIII启动子，可以分别表达正义和反义RNA链和/或作为发夹结构。在细胞中，Dicer将短的发夹RNA(shRNA)加工成有效的siRNA。
本发明的siRNA分子的靶向区域，可以选自给定的靶基因序列例如Lp-PLA2编码序列中，从起始密码子开始的下游从大约25到50个核苷酸，从大约50到75个核苷酸，或从大约75到100个核苷酸。核苷酸序列可以包含5′或3′UTRs，以及起始密码子附近的区域。设计本发明的siRNA的一种方法包括鉴定23个核苷酸的基序AA(N19)TT(其中N可以是任何核苷酸)，并选择具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％G/C含量的命中序列。序列的“TT”部分是可选的。可选地，如果不能发现这样的序列，搜索可以扩展到使用基序NA(N21)，其中N可以是任何核苷酸。在这种情况下，正义siRNA的3′末端可以被转变成TT，以允许相对于正义和反义3’突出端的序列组成产生对称的双链体。然后可以合成反义siRNA分子，它与23个核苷酸的序列基序的1到21位核苷酸互补。使用对称的3’TT突出端可能是有利的，以确保形成的小干扰核糖核蛋白颗粒(siRNPs)含有大约相等比例的正义和反义靶RNA裂解siRNPs(Elbashir等，(2001)，同上，和Elbashir等，2001，同上)。序列数据库、包括但不限于NCBI、BLAST、Derwent和GenSeq的分析，以及可商购的寡核苷酸合成软件如

也可用于针对EST文库筛选siRNA序列，以确保只有一个基因被定靶。
RNA干扰药剂的投送将RNA干扰药剂例如siRNA、或含有RNA干扰药剂的载体，投送到靶细胞(例如脑细胞或其它目标靶细胞，例如中枢和外周神经系统的细胞)的方法，可以包括(i)注射含有RNA干扰药剂例如siRNA的组合物，或(ii)将细胞、例如脑细胞，与含有RNA干扰药剂例如siRNA的组合物直接接触。在一个实施方案中，RNA干扰药剂可以靶向骨髓，表达Lp-PLA2的淋巴细胞在那里制造。在另一个实施方案中，RNA干扰药剂例如siRNA，可以通过例如水力注射或导管插入术，直接注射到任何血管中，例如静脉、动脉、微静脉或微动脉中。在另一个实施方案中，RNA干扰药剂可以直接地局部注射或施加到皮肤溃疡的位点处。
给药可以通过单次注射或两次或多次注射。RNA干扰药剂在可药用载体中进行投送。一种或多种RNA干扰药剂可以同时使用。RNA干扰药剂、例如靶向Lp-PLA2 mRNA的siRNAs，可以单独投送，或与其它RNA干扰药剂例如siRNAs、例如针对其它细胞基因的siRNAs组合投送。Lp-PLA2 siRNAs也可以与其它用于治疗或预防神经变性疾病或病症的药剂组合给药。
在一个实施方案中，特定的细胞被定向进行RNA干扰，以限制由RNA干扰的非特异性定靶所引起的RNA干扰的潜在的副作用。方法可以使用例如包括细胞定向部分和用于将RNA干扰有效投送到细胞中的RNA干扰结合部分的复合物或融合分子。例如，抗体-鱼精蛋白融合蛋白，当与siRNA混合时，结合siRNA，并将siRNA选择性投送到表达抗体所识别的抗体的细胞中，导致只在表达抗原的细胞中引起基因表达的沉默。siRNA或RNA干扰诱导性分子结合部分是蛋白或核酸结合结构域或蛋白的片段，结合部分与定靶部分的一部分融合。定靶部分的位置可以在构建物的羧基末端或氨基末端，或在融合蛋白的中间。
也可以使用病毒介导的投送机制将siRNAs体外和体内投送到细胞，如在Xia，H.等，(2002)Nat Biotechnol 20(10)1006中描述的。shRNA的质粒或病毒介导的投送机制也可用于将shRNAs体外和体内投送到细胞，如同在Rubinson，D.A.等，((2003)Nat.Genet.33401-406)和Stewart，S.A.，等((2003)RNA 9493-501)中描述的。
RNA干扰药剂、例如siRNA，也可以经过血管或血管外循环、血液或淋巴系统以及脑脊液，导入到细胞中。
具体的RNA干扰药剂的剂量，是实现特定靶基因的RNA干扰、例如翻译后基因沉默(PTGS)，从而导致靶基因表达的抑制或靶基因编码的蛋白的活性或水平的抑制所必需的量。
还已了解，RNAi分子不是必须与它们的靶序列完全匹配。但是，优选情况下，siRNA反义(引导)链的5’和中间部分与靶核酸序列完全互补。
因此，在本发明中起到Lp-PLA2的核酸抑制剂作用的RNAi分子式例如但不限于未修饰的和修饰的双链(ds)RNA分子，包括短的临时RNA(short-temporal RNA)(stRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、双链RNA(dsRNA)(参见例如Baulcombe，Science 2972002-2003，2002)。dsRNA分子例如siRNA，也可以含有3’突出端，优选为3’UU或3’TT突出端。在一个实施方案中，本发明的siRNA不包括含有超过大约30-40个碱基、大约40-50个碱基、大约50个碱基或以上的ssRNA的RNA分子。在一个实施方案中，本发明的siRNA分子在它们的长度中，有超过大约25％、超过大约50％、超过大约60％、超过大约70％、超过大约80％、超过大约90％是双链的。在某些实施方案中，Lp-PLA2的核酸抑制剂是任何结合并抑制Lp-PLA2mRNA的表达的药剂，其中Lp-PLA2 mRNA或由SEQ ID NO1或2编码的核酸的转录产物的表达，被抑制了。
在本发明的另一个实施方案中，抑制Lp-PLA2的药剂是催化性核酸构建物，例如核酶，它们能够裂解RNA转录本，从而阻止野生型蛋白的产生。核酶利用位于核酶催化位点两侧的两个与靶互补的序列区域，靶向特定的序列并与其退火。在结合后，核酶以位点特异性方式裂解靶。特异性识别和裂解本文描述的基因产物的序列、例如裂解Lp-PLA2或其同源物或变体的核酶，其设计和测试可以通过本领域技术人员熟知的技术来完成(例如Lleber和Strauss，(1995)Mol Cell Biol 15540.551，其公开内容在此引为参考)。
Lp-PLA2的蛋白和肽抑制剂 在某些实施方案中，抑制Lp-PLA2的药剂是蛋白和/或肽抑制剂或Lp-PLA2抑制剂的片段，例如但不限于突变的蛋白、治疗性蛋白和重组蛋白。蛋白和肽抑制剂也可以包括例如突变蛋白、遗传修饰蛋白、肽、合成的肽、重组蛋白、嵌合蛋白、抗体、人源化蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、修饰蛋白及其片段。
在某些实施方案中，抑制Lp-PLA2的药剂是Lp-PLA2的显性失活变异体，例如Lp-PLA2的无功能的变异体。
抗体 在某些实施方案中，可用于本发明的方法的基因和/或基因产物的抑制剂，包括例如抗体，包括单克隆的、嵌合的、人源化的和重组抗体，及其抗原结合片段。在某些实施方案中，可以使用中和抗体作为Lp-PLA2酶的抑制剂。抗体可以通过用抗原免疫接种动物，例如兔或小鼠，来容易地产生。免疫的小鼠对于提供用于制造杂交瘤的B细胞源来说，是特别有用的，杂交瘤可以被培养以产生大量的单克隆抗体。
在本发明的一个实施方案中，本文鉴定的基因产物的抑制剂，可以是抗体分子或抗体分子的表位结合部分等。抗体提供了对广泛的靶抗原和半抗原的高的结合亲和性和独特的特异性。可用于本发明的实践的单克隆抗体包括完整抗体及其片段，它们是按照常规的技术产生的，例如杂交瘤合成、重组DNA技术和蛋白合成。
可用的单克隆抗体和片段可以源自于任何物种(包括人类)，或者可以形成为使用了来自一个以上物种的序列的嵌合蛋白。人类单克隆抗体或“人源化”鼠抗体，也可用于本发明。例如，可以通过将编码鼠Fv区域(即含有抗原结合位点)或其互补决定区的核苷酸序列，与编码人类恒定区结构域和Fc区的核苷酸序列遗传重组，将鼠单克隆抗体“人源化”。人源化的靶向部分被识别，从而降低了抗体或多肽在宿主受体中的免疫反应性，以与欧洲专利申请No.0,411,893 A2中公开的相似的方式，使得半衰期增加，不利的免疫反应的可能性降低。优选情况下，鼠单克隆抗体应该以人源化形式使用。抗原结合活性由6个互补决定区(CDRs)的氨基酸的序列和构象决定，它们位于抗体的轻链和重链的可变部分(Fv)(各三个)。25-kDa的单链Fv(scFv)分子，由轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)通过短的肽连接序列连接而成，是到目前为止开发的最小的抗体片段。已经开发了将scFv分子展示在含有scFv基因的丝状噬菌体表面上的技术。在单个scFv-噬菌体文库的大的合并体中可以存在具有广泛抗原特异性的scFv分子。可用于本发明的方法的高亲和性单克隆抗体及其嵌合衍生物的一些例子，描述在欧洲专利申请EP 186,833、PCT专利申请WO 92/16553和美国专利No.6,090,923中。
嵌合抗体是免疫球蛋白分子，其特征为两个或多个片段或部分源自于不同动物物种。一般来说，嵌合抗体的可变区源自于非人类哺乳动物抗体，例如鼠单克隆抗体，免疫球蛋白恒定区源自于人类免疫球蛋白分子。优选情况下，当常规测定时，两个区域及组合具有低的免疫原性。
scFv分子的一个局限是与靶抗原相互作用的单价性。改进scFv与其靶抗原的结合的最简单的方法之一是通过产生多聚体增加其功能亲和性。相同的scFv分子结合形成的二体、三体和四体，可以包含多个相同的Fv模块。因此，这些反应试剂是多价的，但是单特异性的。两个不同的scFv分子，各含有源自不同亲本Ig的VH和VL结构域，它们的联合形成了功能完整的双特异性二体。双特异性scFvs的一种独特的应用，是通过两个(相邻的)表面表位，同时结合在同一个靶分子的两个位点上。这些反应试剂与单个scFv或Fab片段相比，优点是显著的亲和性增加。已经工程化了多种多价的基于scFv的结构，包括例如微型抗体(miniantibodies)、二聚微型抗体、微体(minibodies)、(scFv)2、二体和三体。这些分子具有不同的价(2到4个结合位点)、尺寸(50到120kDa)、灵活性和生产容易性。单链Fv抗体片段(scFvs)主要是单体，其中VH和VL结构域通过至少12个残基的多肽连接序列连接。具有12和25个氨基酸长度的连接序列的单体scFv，在所有条件下都是热力学稳定的。非共价的二体和三体分子，可以通过缩短连接单个scFv分子的可变重链和可变轻链的肽连接序列，容易地工程化和生产。scFv二聚体通过提供高度灵活性的两亲性螺旋来连接，而微型抗体结构可以被修饰，以产生二聚体双特异性(DiBi)微型抗体，其中含有通过双螺旋连接的两个微型抗体(4个scFv分子)。基因融合或二硫键合的scFv二聚体提供了中等程度的灵活性，可以通过直接克隆技术添加C-末端Gly4Cys序列来产生。scFv-CH3微体含有两个scFv分子，它们直接地(LD微体)或通过非常灵活的铰链区(Flex微体)与IgG CH3结构域相连。这些双价构建物分子量为大约80kDa，能够显著地结合抗原。Flex微体在小鼠中显示出令人印象深刻的肿瘤定位。双和三特异性多聚体可以通过将不同的scFv分子连接而形成。当Fab或单链Fv片段(scFv)被复合形成二体、三体或更大的集合体时，可以实现功能亲和性的增加。多价scFvs与单价scFv和Fab片段相比，最重要的优点是与靶抗原的功能性结合亲和性(亲和力)的增加。高的亲和性要求scFv多体能够同时结合不同的靶抗原。scFv二体与scFv单体相比，功能性亲和性的增加是显著的，主要可以从解离率的降低看出，这种降低是由于与两个或以上靶抗原的多重结合、以及当一个Fv解离时重新结合而引起的。当这样的scFv分子连接成多体时，它们可以被设计成对单一靶抗原具有高度亲和性，或对不同靶抗原具有多重特异性。与抗原的多重结合依赖于Fv模块中的正确排列和定向。对于多价scFVs靶中的全部亲和性来说，抗原结合位点必须指向同样的方向。如果多重结合在空间上不可能，那么功能性亲和性的显著增加，可能是由于增加的重新结合的效应，它依赖于扩散速度和抗原浓度。在本发明中，也考虑到了将抗体与改进它们的性质的部分结合。例如，抗体与增加它们的体内半衰期的PEG的结合物，可用于本发明。通过对来自未接触抗原或免疫接种过的动物或患者的B淋巴细胞的编码可变抗体片段的基因进行PCR扩增，制备了免疫文库。使用了特异性针对免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因家族的寡核苷酸的组合。免疫球蛋白种系基因可用于制备半合成的抗体所有组成部分，具有使用简并引物通过PCR扩增的可变片段的互补决定区。这些单一部分的文库的优点在于，可以从单一文库中分离出针对大量抗原的抗体片段。噬菌体展示技术可用于增加抗体片段的亲和性，其中从已经存在的抗体片段，通过随机的、基于密码子的或定点突变，通过将每个结构域与来自未接触抗原的全部组成成分的片段的结构域进行改组，或通过使用细菌增变株，制备了新的文库。
可选地，SCID-hu小鼠、例如由Genpharm开发的模型小鼠，可用于产生抗体或其片段。在一个实施方案中，考虑到了一种通过利用多价相互作用效应而产生的、被称为peptabody的新型高亲和性结合分子。将短的肽配体通过半刚性的铰链区，与软骨寡聚基质蛋白的螺旋卷曲组件结构域融合，产生了五聚体多价结合分子。在本发明的优选实施方案中，配体和/或嵌合抑制剂，可以通过使用双特异性抗体来靶向组织或肿瘤特异性靶，例如通过将抗配体抗体(Ab)和针对特定靶的Ab进行化学连接而产生的双特异性抗体。为了避免化学结合的局限性，抗体的分子结合物可用于在细胞表面分子上生产针对配体的重组双特异性单链Abs和/或嵌合抑制剂。可选地，可以给药两种或以上与靶向部分连接的活性药剂和/或抑制剂，其中每种结合物包含靶向部分，例如不同的抗体。每种抗体与不同的靶位点表位(与相同的或不同的靶位点抗原相关)反应。不同的抗体和与其相连的药剂附加地积累在目标靶位点处。基于抗体或不基于抗体的靶向部分，可用于将配体或抑制剂投送到靶位点。优选情况下，不受调节的或疾病相关的抗原的天然结合药剂用于此目的。
用于鉴定Lp-PLA2抑制剂的生物分析方法 Lp-PLA2蛋白抑制的筛选 在某些实施方案中，本发明的方法涉及使用Lp-PLA2抑制剂治疗皮肤溃疡。在需要时，使用生物分析方法评估抑制Lp-PLA2蛋白的药剂，例如在美国专利5,981,252中公开的，在此以其全文引为参考。一种这样的分析方法是测试药剂对重组Lp-PLA2蛋白的作用。例如在一种分析方法中，使用锌螯合柱、蓝色琼脂糖凝胶亲和层析和阴离子交换柱，从杆状病毒感染的Sf9细胞将重组Lp-PLA2纯化至均质。在纯化超滤后，酶可以6mg/ml的浓度储存在4℃下。分析缓冲液含有Tris-HCl(50mM)、NaCl(150mM)和1mM CHAPS，在室温下pH 7.4。活性通过N-((6-(2，4-二硝基苯基)氨基)己酰基)-2-(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-吲丹烯-3-戊酰基)-1-十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺三乙胺盐(PED6，Molecular Probes目录号D-23739)作为底物水解时在535nm处发射的增加来测量，使用了带有384孔微量滴定板的荧光测量读板器。反应通过向抑制剂中加入酶(以重量计最终为大约400pM)和底物(最
(PED6) 终5μM)来起始，总体积为10微升。
对本文公开的化合物、例如在标题为？合成例的章节中公开的化合物进行了测试，发现其IC50值在0.1到10nM的范围内。
皮肤溃疡 皮肤溃疡是皮肤中的开放疮口。皮肤溃疡可以由各种事件造成，例如外伤、暴露于热或冷(烧伤和冻伤)、血液循环问题、磨损或暴露于腐蚀性物质的刺激。压力性溃疡、也称为褥疮溃疡或褥疮，是在由于长时间压迫而导致血液供应减少的身体区域上发生的皮肤溃疡；它们可能发生在受限于床或椅子上的人群中，或必须佩带硬的支架或石膏铸件的人群中。皮肤溃疡可能变得感染，具有严重的健康后果。其它可能导致皮肤溃疡的健康状况包括口腔溃疡(口疮)、慢性静脉机能不全、糖尿病、感染和外周血管疾病。皮肤溃疡通常伴随有发炎、感染和/或妨碍愈合的医学病症，并通常伴有发炎组织的脱落。
无论是什么原因，皮肤溃疡具有下列的显著特征(1)皮肤区域失去完整性，(2)位点被细菌、真菌或病毒二次感染，(3)普遍使患者虚弱，以及(4)延迟愈合。使用了分类系统来表示溃疡的严重性和深度。这是一种表示向更好或更糟情况变化的容易的方法。
Merck手册分类等级1-6的范围 1级皮肤发红。下面的组织变软。施加微小压力时红色消失。
2级在区域周围存在发红、膨胀和发硬的皮肤。有时存在起泡。有时存在表层皮肤的丧失。
3级皮肤变得坏死。可能出现皮肤下脂肪的暴露。皮肤可能失去其所有的层。
4级失去更多的脂肪和更多的皮肤坏死，直到下方的肌肉。
5级继续失去脂肪，以及下方的肌肉坏死。
6级骨骼破坏，从骨骼发炎开始，骨骼皮层腐烂，发展到骨髓炎——骨骼的感染。可能存在关节脓毒症、病理性骨折或普遍的身体感染、败血症。
另一种皮肤溃疡分类系统是由国家压力性溃疡顾问委员会(National Pressure Ulcer Advisory Panel(NPUAP))开发的，用于对压力性溃疡的严重性进行分级的压力性溃疡愈合等级(Pressure UlcerScale for Healing)(PUSH Tool))。它被用作快速可靠的工具来监测压力性溃疡状态随时间的变化。在使用中，第一步是观察和测量压力性溃疡。然后根据(1)表面积，(2)流出物-渗出的脓，以及(3)伤口组织的类型，对溃疡进行分类。对分类后的溃疡的严重性给出分值。例如，在类别3类型的伤口组织中4分——坏死组织(焦痂)黑色、棕色或黄棕色组织，牢固粘附于伤口床或溃疡边缘，可以比周围的皮肤更坚固或更软；3分——死肉(slough)成串或成浓密的丛粘附于溃疡床上或粘液状的黄色或白色组织；2分——颗粒组织粉红色或牛肉样红色组织，具有发亮、潮湿、颗粒状外观；1分——上皮组织表层溃疡，从溃疡边缘长出的或作为溃疡表面上的小岛的新的粉红色或发亮的组织(皮肤)；以及0分——封闭的/重新表面化的伤口被上皮(新的皮肤)完全覆盖。然后记录这些溃疡特征中的每种的子项分值。最后将子项分值相加，得到总分值。总分值越小，溃疡越好。对随着时间测量到的总分值的比较，为压力性溃疡愈合的改善或变坏提供了指示。因此，逐渐朝向越来越小的总分值的趋势，是溃疡正在愈合的好的指示。PUSH工具3.0版可以在www.npuap.org/push3-0.htm获得。
压力性溃疡的NPUAP分级如下 1级——存在完整皮肤上的红斑，压后不变白。它可能是皮肤溃疡的预兆性损伤。
2级——失去部分皮肤，包括表皮、真皮或二者。溃疡是表层的，表现为擦破、起泡、或中间浅的伤口。
3级——这是皮肤整个厚度的丧失。它可以包括皮下组织的损伤或坏死，可以向下延伸到下方的筋膜，但是不穿过它们。溃疡表现为深的环形口，对邻近完整组织有或没有底部破坏。
4级——这里存在着皮肤整个厚度的丧失，对于肌肉、骨骼或支持结构具有更大范围的破坏、组织坏死或损伤。腱和关节也可能暴露或参与其中。在该级别，可能存在与溃疡相关的底部破坏和/或窦道。
第三种分类是用于对糖尿病患者足部溃疡的严重性进行分级的Wagner′s分类。
0级——具有以前愈合的溃疡疤痕的皮肤，其压力区域有时被称为前溃疡性损伤，或存在骨变形，在没有防备的点上施加压力。
1-A级——伤口在本质上是表层的，涉及部分或全部厚度的皮肤，但是不包括腱、被膜或骨。
1-B级——与上述相同，伤口在本质上是表层的，涉及部分或全部厚度的皮肤，但是不包括腱、被膜或骨；然而，伤口受到感染。该伤口的定义是指表层感染，不涉及下面的结构。如果伤口显示出明显的化脓或波动，进一步探查以暴露出较高分类等级的感染，是符合规定的。
1-C级——与上述相同，但是具有血管损伤。
1-D级——与上述相同，但是具有局部缺血。因为局部缺血是一种类型的血管损伤，在这两种级别之间通常难以作出分辨。
2-A级——透过皮下组织暴露出腱或韧带，但是不包括骨。
2-B级——透过深层组织包括腱或韧带，甚至关节囊，但是不包括骨。
2-C级——与上述2B相同，但是包括局部缺血。
2-D级——与上述2C相同，但是包括感染。
3-A级——伤口可以探到骨，但是没有显示出局部感染或全身感染的征兆。
3-B级——伤口可以探到骨，并且感染。
3-C级——伤口可以探到骨，感染，并且局部缺血。
3-D级——伤口可以探到骨，特征为活跃的感染、局部缺血的组织和暴露的骨。
4级——前足坏死 5级——整个足部坏死 德克萨斯大学对糖尿病溃疡的分类显示如下。
皮肤溃疡的病因 皮肤溃疡可以直接或间接源自于许多疾病、病症和创伤，经常可以由于疾病、病症和创伤的组合而发生。皮肤溃疡的病因可以是血管性的(静脉、动脉、淋巴、脉管炎)，神经病理性的(例如糖尿病、脊柱裂、麻风病)，代谢性的(例如糖尿病、痛风)，结缔组织疾病(例如类风湿关节炎、硬皮病、系统性红斑狼疮)，血液疾病(血红细胞病症(例如镰刀细胞病)，白细胞病症(例如白血病)，血小板病症(例如血小板增多症))，免疫性的(例如自体免疫疾病和其它炎性病症类风湿关节炎、硬皮病、系统性红斑狼疮；免疫应答异常坏疽性脓皮病)，异常蛋白血症(例如冷球蛋白血症、淀粉样变性病)，免疫缺陷(例如HIV、免疫抑制性疗法)，肿瘤性(例如基底细胞癌、鳞状细胞癌、肿瘤转移疾病)，感染性(细菌、真菌、病毒)，寄生虫感染(皮肤利什曼病(cutaneous leishmaniasis))，脂膜炎(例如脂性渐进性坏死——一种病症，有时与糖尿病相关，其中在腿上发生闪亮的萎缩损伤)，创伤性(例如压力性溃疡、辐射损伤)，医原性的(例如药物/疗法)，人为的(例如自我伤害、“人为性皮炎”和精神疾病)，以及病因未知的疾病和病症(例如肉状瘤病——一种慢性的、渐进性的、普遍的肉芽肿性网状细胞增多症，涉及几乎任何器官或组织，其特征为存在于非干酪化上皮样细胞结核的所有患病组织中)(Grey，J.E.等，2006，BMJ 332285-288)。
静脉溃疡由血管阻塞性或静脉疾病引起，它们起因于通过腿的血流不足，引起血液集中在腿部静脉中。然后，静脉和毛细血管中的压力增加。增加的压力引起流体从血管渗漏到周围组织中，发生了肿胀。最后，肿胀干扰了氧和营养物质从毛细血管向组织中的运动。组织由于缺乏氧和营养物质，并由于渗漏的流体对它们施加了压力而损伤。结果，可能形成了静脉溃疡。在腿中的静脉已经受损之后，静脉溃疡主要发生在下肢中。这些溃疡可以深深透入到皮肤中。
任何引起血液集中在腿部静脉中的病症都可以引起静脉溃疡。静脉曲张或静脉被血凝块阻塞(深部静脉血栓形成)可以变成损伤，引起血液集中。这种对腿部静脉的损伤被称为慢性静脉机能不全。例子包括但应该被解释为不限于充血性心力衰竭、肥胖症、肾衰竭、抗磷脂抗体综合症、青斑样血管病、静脉郁滞、小血管阻塞性动脉疾病、I型冷球蛋白血症或瓦尔登斯特伦(

)巨球蛋白血症，以及Klippel-Trénaunay-Weber综合症。
静脉溃疡在老年人中相当常见。静脉溃疡容易感染。有时，如果静脉溃疡持续较长时间，在边缘会发生皮肤癌。静脉溃疡易感性区域是足和腿，由其下的血管机能不全引起。由于重复的创伤，皮肤破裂或不能愈合。即使是指甲的压力也可能导致指甲下溃疡。这些在具有非常低的从受伤愈合的能力的糖尿病人中，最经常看到。
脉管炎(Vasculitis(复数为vasculitides))是一类疾病，其特征为血管壁由于白细胞迁移和产生的损伤而发生炎症。所有尺寸的血管，从身体中最大的血管(主动脉)到皮肤中最小的血管(毛细血管)，都可能患病。患病血管的尺寸随着脉管炎的具体类型而变化。受损的血管导致组织局部缺血，然后引起组织坏死。
可以产生皮肤溃疡的脉管炎的例子包括Wegener′s肉芽肿、多发性结节性动脉炎、冷球蛋白血症(复合性)脉管炎、Takayasu′s动脉炎，以及白细胞分裂性脉管炎。
在许多癌症中已经观察到了慢性非愈合性皮肤溃疡基底细胞癌-腿部溃疡(Phillips TJ等，1991，J Am Acad Dermatol.Jul；25(1 Pt1)47-9；Conde-Taboada A等，2006 J Eur Acad Dermatol Venereol.Mar；20(3)359)，淋巴瘤-血管中心性T-细胞淋巴瘤、间变性大细胞性T-细胞淋巴瘤和大疱性蕈样肉芽肿、皮肤白血病和朗格汉斯细胞组织细胞增多病。
由各种不同病原体引起的皮肤感染也可以导致皮肤溃疡。例子包括深层真菌感染孢子丝菌病(Sporotrichosis)、曲霉病(Aspergillosis)、隐球菌病(Cryptococcosis)、接合菌病(Zygomycosis)、马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)感染；2型单纯性疱疹病毒、皮肤结核病和皮肤阿米巴病。
皮肤利什曼病是由白蛉的叮咬，在叮咬位点留下的寄生虫热带利什曼原虫(Leishmania tropica)或硕大利什曼原虫(Leishmania major)引起的皮肤溃疡。热带利什曼原虫主要发现在城市地区，而硕大利什曼原虫是在干旱沙漠地区。
糖尿病是一种其特征为高血糖症(血糖高)的代谢病症。糖尿病可以引起许多并发症，其中神经损伤(神经病)(有几种)、微血管损伤和愈合不力，通常在腿部和足部引起皮肤溃疡的发生。在糖尿病人中，足底特别易于发生皮肤溃疡。
血糖水平的慢性升高导致血管的损伤。在糖尿病中，导致的问题被分类为“微血管疾病”(由于小血管的损伤)和“大血管疾病”(由于动脉的损伤)。
糖尿病性神经病、感觉异常和减退，通常以“戴手套和袜子”式的分布从足部开始，但是也可以在其它神经中，随后通常蔓延到手指和手。当与受损的血管组合时，这可以导致糖尿病足。
糖尿病足，通常由神经病和动脉病组合引起，可以导致皮肤溃疡和感染，在严重的情况下，导致坏死和坏疽。在发展中国家，它是最常见的成年人截肢原因，通常是脚趾和/或足。
伤口愈合不良，特别是足部的伤口愈合不良，可以导致可能需要截肢的坏疽，这在发达国家是成年人中非创伤性截肢的主导因素。对糖尿病的足够的治疗、以及对血压控制和生活方式因素(例如)的增加的强调，可以改善大多数上面提到的并发症的风险情况。(NathanDM等，N Engl J Med 2005；3532643-53.PMID 16371630)。
自身引起的皮肤溃疡可能在发生精神疾病的情况下发生，例如压抑、米肖森(Munchausen′s)综合症和人工(人为的)病症。患有人工病症的人经历人为性皮炎，使得人们通过任何方法伤害他们自己的皮肤。他们可能通过下列方式伤害他们的皮肤用他们的手指甲或刀或其它锋利器具搔划皮肤；用火例如香烟、火柴或蜡烛烧皮肤；用苛性化学物质例如漂白剂烧皮肤。他们可能意识到也可能没有意识到他们导致了自己的伤害，但是他们一般都否认故意遭受伤害。
皮肤溃疡也可能与某些药物有关(医源性溃疡)，例如羟基脲诱导的溃疡(羟基脲属于一大类被称为抗代谢物的化疗药剂)、溴疹(由于对抗惊厥药物中的溴过敏而引起的丘疹状或肉芽肿状出疹)，以及药物诱导的狼疮。它被用于治疗慢性粒细胞性白血病和血液疾病例如镰刀细胞贫血症。
有几种炎性病症与皮肤溃疡有关。例如皮肤性克罗恩(Crohn′s)病、溃疡性脂性渐进性坏死、坏疽性脓皮病、系统性红斑狼疮和大疱性硬斑病。
皮肤溃疡也可能与外部组织损伤(创伤)有关，例如接触性外阴炎(外阴炎是女性外生殖器(外阴)的炎症)、注射-药物滥用导致的二次感染、棕花蛛咬中毒(loxoscelism)(棕花蛛的叮咬)、通常在坏疽性脓皮病中看到的过敏反应性(皮肤创伤后诱导的炎性应答)，以及压力性溃疡，这是到目前为止在与皮肤溃疡相关的所有创伤中在医学上最重要的。高热(烧伤)和极冷暴露(冻伤)也可以导致皮肤溃疡。
压力性溃疡，也被称为褥疮或褥疮溃疡，是当人们太长时间呆在一个位置而不移动体重时皮肤的损坏区域。这在人们使用轮椅或卧床不起时经常发生，即使只是短期时间，例如在手术或受伤后。作用于皮肤上的恒定压力减少了向该区域的血液供应，阻力表面例如床的摩擦刺激了具有减少的血流的区域，使得受影响的组织死亡。
压力性溃疡开始时皮肤发红，但是逐渐变得更糟，形成了泡，然后是开放疮肿，最后是环形疮口。压力性溃疡最常见的部位是骨骼突起部上方，那里肌肉和脂肪的填塞最少，例如肘部、足跟、髋部、脚踝、肩膀、背部以及头的后部。
不能移动的患者，当以同样的卧姿保持长时间的躺卧时，易于形成压力疮口。这样的有发生皮肤溃疡的风险的患者的例子包括但不限于糖尿病人、半身麻痹患者、四肢麻痹患者、老年人、移动和/或协调障碍的个体，例如患有神经缺陷、例如大脑麻痹和脊柱裂的个体，患有神经肌肉疾病例如肌萎缩性侧索硬化(ALS)和多发性硬化(MS)的个体，患有自体免疫疾病例如硬皮病的个体，以及烧伤患者。
涉及皮肤溃疡的疾病和病症的治疗 目前脉管炎的治疗使用甾族类化合物(例如甲基氢化泼尼松、可的松和环磷酰胺)靶向炎症。也可以使用免疫抑制剂例如环磷酰胺和氮杂硫代嘌呤。此外，免疫抑制剂也使用在炎性疾病的治疗中。
己酮可可碱是用于静脉皮肤溃疡的标准药物。与标准的使用弹力袜的疗法组合，口服己酮可可碱被用于改进静脉皮肤溃疡的愈合。己酮可可碱降低血液的粘度或“粘性”，改善血液循环。己酮可可碱也降低身体中的炎症，也可以帮助溃疡愈合。
1型糖尿病的治疗使用胰岛素，2型糖尿病口服抗糖尿病药物或口服降血糖药。药物一般通过降低血液中的葡萄糖水平起作用。
磺酰脲是第一种广泛使用的口服降血糖药物。它们是胰岛素的促分泌素，通过直接作用于胰腺β细胞的KATP通道，触发胰岛素的释放。促分泌素是导致另一种物质被分泌的物质。磺酰脲只可用于II型糖尿病，因为它们通过刺激胰岛素的内源释放起作用。磺酰脲的例子包括但不限于甲糖宁(甲苯磺丁脲)、乙酰苯磺酰环己脲(Dymelor)、甲磺吖庚脲(甲磺氮卓脲)、氯磺丙脲(氯磺丙脲)、格列甲嗪(Glucotrol)、优降糖(Diabeta、Micronase、Glynase)、格列美脲(Amaryl)、格列齐特(Diamicron)。
支链淀粉类似物，例如普兰林肽，二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂(维格列汀，西他列汀)，肠促胰岛素模拟物GLP类似物、例如艾塞那肽(Exendin)-4，α-葡萄糖苷酶抑制剂米格列醇(Glyset)和阿卡波糖(Precose/Glucobay)，双胍类化合物-二甲双胍(Glucophage)，氯茴苯酸-瑞格列奈(Prandin)和那格列奈(Starlix)，PPARα/γ/配体(木拉格力他扎(muraglitazar)，特萨格力他扎(tesaglitazar)和噻唑烷二酮类-罗格列酮(Avandia)，吡格列酮(Actos)和曲格列酮(Rezulin))，SGLT(钠依赖性葡萄糖转运蛋白1)抑制剂，以及FBPase(果糖1，6-二磷酸酶)抑制剂(参见Lebovitz HE.，《糖尿病和相关病症的疗法》(第四版)，Therapy for Diabetes Mellitus and Related Disorders.4thedition.AlexandriaAmerican Diabetes Association，2004)。
用于基底细胞癌的疗法包括光动力疗法(将肿瘤用霜剂(例如美特维克(Metvix))或洗剂中的光敏性化学物质处理，几小时后暴露于光下)。使用表面咪喹莫特(imiquimod)霜剂、冷冻疗法(冷冻)和放射疗法(X-射线治疗)，高达85％的表层基底细胞癌可以治愈，并且美容结果极好。
皮肤利什曼病的标准疗法是五价锑。其它药物包括两性霉素B(Fungizone)(保留用于五价锑无效时)、喷他脒羟乙磺酸盐(Pentam300)，以及局部使用巴龙霉素。
压力性溃疡的护理和治疗可以在Brillhart B.Rehabil Nurs.2005；30(3)85-91；de Laat EH.等，J Clin Nurs.2005；14(4)464-472；和Cole L与Nesbitt C.Ostomy Wound Manage.2004；50(11)32-40中发现。
本发明的一个实施方案包括了在需要的人群中治疗和/或预防皮肤溃疡，包括与抗微生物疗法、抗寄生虫疗法、抗肥胖症疗法、糖尿病疗法、心血管疾病疗法、肾衰竭疗法、脉管炎疗法、静脉机能不全疗法、动脉机能不全疗法、癌症疗法、免疫抑制性疗法、免疫缺陷疗法、甾族类化合物疗法和精神病疗法组合，抑制Lp-PLA2蛋白的活性和/或表达。
本发明的一个实施方案包括在卧床不起或坐轮椅的人群中治疗和/或预防压力性溃疡，包括抑制Lp-PLA2蛋白的活性和/或表达。
本发明的一个实施方案包括在烧伤或冻伤的人群中治疗和/或预防皮肤溃疡，包括抑制Lp-PLA2蛋白的活性和/或表达。
皮肤溃疡的治疗 皮肤溃疡处理包括但不限于药物例如抗细菌、抗真菌、抗寄生虫和抗病毒药物，溶血栓药剂或血块破裂药剂例如组织型纤溶酶原活化剂(tPA)，使用压迫绷带，生物工程化的皮肤代用品(例如培养的表皮同种异体移植物-Apligraf)，电刺激，改进的药物投送系统例如基于离子电渗透的透过真皮投送系统，局部投送促进组织修复的物质例如血小板衍生的和自体生长因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(G-MCSF)和间质聚糖(mesoglycan)，负压伤口疗法，以及超声。
本发明的一个实施方案是在患有皮肤溃疡的对象中治疗皮肤溃疡，包括抑制Lp-PLA2蛋白的活性和/或表达，并组合了伤口处理，包括但不限于抗病原体药物、溶血栓药剂、使用压迫绷带、生物工程化的皮肤代用品、电刺激、改进的药物投送系统、局部投送组织修复促进疗法、负压伤口疗法，以及超声。
发生皮肤溃疡的风险因子 本发明的一个实施方案是在有发生皮肤溃疡的风险的人群中预防皮肤溃疡。对于谁具有发生皮肤溃疡的风险作出判断，需要鉴定可能造成皮肤溃疡的风险因子。
因为皮肤溃疡可以由大量疾病、病症和创伤及其组合引起，因此有许多因素增加发生皮肤溃疡的风险。这些因素包括但不限于以前与上述公开的疾病或病症或创伤相关的皮肤溃疡急性发作，年老，不能不需帮助移动身体的某些部位，例如在脊椎或脑损伤后卧床不起或坐轮椅，或者患有神经肌肉疾病(例如多发性硬化)，营养不良(特别是蛋白质不足)，缺少身体活动，过量饮酒，患有上述公开的阻止身体的区域接收适合的血流的病症例如糖尿病；尿失禁或肠失禁(水分长时间贴近皮肤可以引起刺激，可能导致皮肤破裂)，皮肤薄脆，由于病症例如阿茨海默氏病引起的智力丧失(患者可能不能适合地预防或治疗压力性溃疡)，吸烟，已被诊断患有糖尿病、高血压和/或高半胱氨酸含量高，体重过重(体重超过理想体重30％)，静脉曲张家族史，特别是如果还患有流向大腿内侧的隐静脉逆向血流，已被诊断患有凝血病症例如凝固性过高状态或太多血液倾向于凝结的血栓形成倾向，从事需要长时间站立的职业，患有镰刀细胞贫血症，以及服用含有溴化物的药物，例如用于抗惊厥疗法的溴化钾，以及肾衰竭。
关于预测和预防压力性溃疡的完整的指导可以在卫生护理政策与研究局(Agency for Health Care Policy and Research(AHCPR))的《临床实践指导准则》(Clinical Practice Guideline Number 3，1992，AHCPRPub.No.92-0047)中发现。
尽管具有一个风险因子并不意味着对象将发生皮肤溃疡，从而需要用抑制Lp-PLA2蛋白的活性和/或表达的药剂进行治疗，但是具有风险因子组合肯定将增加对象在其一生中最终发生至少一次皮肤溃疡的机会。具有两种或以上或三种或以上风险因子的组合的对象，应该被他们的医生考虑为使用本文公开的方法进行治疗和/或预防的候选者。例如，年老的、患有糖尿病的智力减退的对象，或肥胖的不能移动的对象，都是按照本文的公开进行治疗的候选者。
但是，有几种风险因子，它们本身就是皮肤溃疡将在具有相应风险因子的对象中最可能发生的非常好的指征。这些被当作“高风险”因子。它们包括糖尿病、脉管炎、卧床不起或坐轮椅、烧伤或冻伤、进行基于羟基脲的化学疗法，以及与皮肤溃疡相关的疾病/病症的既往史。到目前为止，最显著的风险因子是糖尿病、脉管炎(自身免疫疾病)、动脉粥样硬化、卧床不起以及坐轮椅，其中在皮肤的一个部分上存在着恒定的压力。具有这些因子的对象应该被他们的医生考虑作为用本文描述的方法进行治疗和/或预防的候选者。
组合物配方 化合物，例如本文公开的抑制Lp-PLA2的药剂，可以作为药物使用，或用于配制具有一种或多种本文公开的用途的药物组合物。它们可以体外给药于培养的细胞、体内给药于身体中的细胞，或离体给药于个体外部的细胞，然后可以将细胞返回到同一个个体或另一个个体的身体中。这样的细胞可以是分散的，或者作为实体组织提供。
化合物，例如本文公开的抑制Lp-PLA2的药剂，可用于生产药物或其它药物组合物。还含有可药用的载体的抑制Lp-PLA2的药剂，以及还含有可用于将组合物投送到个体的成分的组合物，它们的使用在本技术领域中是已知的。向本文公开的药剂中加入这些载体和其它成分，属于本技术领域的技术范畴。
药物组合物可以作为适用于通过血脑屏障或与内皮细胞直接接触的制剂给药。在某些实施方案中，组合物可以作为适用于全身投送的制剂给药。在某些实施方案中，组合物可以作为适用于投送到具体器官，例如但不限于肝脏、脾脏、骨髓和皮肤的制剂给药。
可选地，药物组合物可以添加到离体细胞培养基中。除了活性化合物之外，这样的组合物可以包含可药用的载体，以及其它已知有助于给药和/或增加吸收的成分(例如盐水，二甲亚砜，脂类，聚合物，基于亲和性的细胞特异性靶向系统)。组合物可以掺入到凝胶、海绵或其它可通透的基质中(例如形成颗粒或碟片)，放置在内皮附近，用于持续的、局部的释放。组合物可以单剂形式给药，或者以多剂形式在不同时间给药。
药物组合物可以任何已知的途径给药。例如，组合物可以通过粘膜、肺部、局部或其它定点或全身性途径(例如肠内或肠胃外)给药。本文使用的词组“肠胃外给药”或“在肠胃外给药”是指肠内和局部给药之外的给药方式，通常通过注射进行，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、脑脊髓内以及膜内注射、灌注和其它注射或灌注技术，对此没有限制。本文使用的词组“全身给药”、“全身地给药”、“外周给药”和“外周地给药”，是指给药本文公开的药剂，使得它进入动物的系统，从而进行代谢和其它类似的过程，例如皮下给药。
词组“可药用的”使用在本文中是指那些化合物、材料、组合物和/或剂型，在合理的医学判断的范围内，适合于与人类和动物的组织相接触，而不具有过份的毒性、刺激、过敏性应答或其它问题或并发症，相称地具有合理的利益/风险比。
本文使用的词组“可药用载体“是指可药用的材料、组合物或介质，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或囊封材料，参与将目标药剂从一个器官或身体部分，携带或运输到另一个器官或身体部分。每种载体在与制剂的其它成分相容的意义上必须是“可接受的”，例如载体不降低药剂对治疗的影响。换句话说，载体是药物学惰性的。
对于药剂的量和使用时间、制剂、给药途径可以进行适合的选择，目的是在具有皮肤病变或对其具有风险的对象中获得有利的响应(即效力)，并且避免对其的过度毒性或其它伤害(即安全性)。因此，“有效的”是指使用常规操作条件获得所需效果的这种选择。
将丸剂制剂每天一次在短时间内给药于个体，是方便的给药方案。可选地，可以将有效的每日药剂分成多份药剂用于给药，例如每天2到12剂。药物组合物中活性成分的剂量水平也可以变化，以便获得化合物或其衍生物在个体中的暂时或维持的浓度，导致所需的治疗响应或保护。但是，开始剂量低于获得所需疗效所需要的水平，然后逐渐增加剂量直到获得所需效果，也在本技术领域的范围内。
给药的抑制Lp-PLA2的药剂的量，依赖于本领域技术人员已知的多种因素，例如化合物的生物活性和生物可利用性(例如体内半衰期、稳定性和代谢)，化合物的化学性质(例如分子量、疏水性和溶解性)，给药途径和方案，等等。也应该理解，对于任何特定个体获得的特定剂量水平，可能依赖于多种不同因素，包括年龄、性别、健康状况、医疗史、体重、与一种或多种药物的组合，以及疾病的严重性。
在某些实施方案中，本文公开的抑制Lp-PLA2的药剂可以与其它药剂组合，例如用于预防和/或治疗皮肤溃疡的治疗药剂，或用于治疗与皮肤溃疡相关的疾病和病症的治疗药剂。例如，药剂包括使用己酮可可碱(静脉皮肤溃疡)和磺酰脲(糖尿病)。
因此，可以实施一种或多种抑制Lp-PLA2的药剂与一种或多种其它治疗程序的组合治疗。
此外，治疗也可以包括多种抑制Lp-PLA2表达或活性的药剂。例如，其它药剂包括使用抑制素(statin)与烟酸(参见http://www.genengnews.com/news/bnitem.aspx？name＝6724568)和非诺贝特(参见http://www.genengnews.com/news/bnitem.aspx？name＝14817756&taxid＝19)。
给药于对象的量，优选为诱导的毒性效应不超过给药它所产生的优点的量。其它目标是与已了解的标准护理相比，在个体中减少疾病的数量、降低严重性，和/或缓解疾病的症状。
按照目前的法规，化合物的生产受到政府机构(例如美国食品和药品管理局)的优质实验室标准(GLP)和优质生产规范(GMP)的管制。这要求准确和完整的记录保管，以及QA/QC的监控。也设想了由机构或管理委员会监督患者的原始记录，以确保获得知会同意；安全性、生物活性、适合的剂量以及产品的效能，分阶段研究；结果是统计学显著的；服从伦理准则。使用动物模型以及使用有毒化学物质同样需要监督原始记录，并服从法规。
旨在抑制Lp-PLA2的表达和/或活性的剂量、制剂、剂量体积、方案以及结果分析方法，是可变的。因此，最小和最大有效剂量根据给药方法而变化。皮肤损伤的症状或严重性的抑制，可以在特定的剂量范围内发生，但是将根据接受药剂的生物体、给药的途径、抑制Lp-PLA2的药剂是否与其它辅助刺激性分子一起施用，以及Lp-PLA2抑制剂给药的具体方案而变化。例如，一般来说，局部或鼻部给药需要比口服、肠内、直肠或阴道给药更小的剂量。
对于用于本发明的口服或肠内制剂来说，可以按照常规的步骤使用本技术领域熟知的固体载体来配制片剂。用于本发明的方法的口服制剂的胶囊，可以从任何可药用材料制成，例如明胶或纤维素衍生物。也考虑到了缓释口服投送系统和/或用于口服剂型的肠溶衣，例如在1987年11月3日出版的美国专利No.4,704,295“肠溶薄膜包衣组合物”(Enteric Film-Coating Compositions)，1985年12月3日出版的美国专利No.4,556,552“肠溶薄膜包衣组合物”(Enteric Film-CoatingCompositions)，1982年1月5日出版的美国专利No.4,309,404“缓释的药物组合物”(Sustained Release Pharmaceutical Compositions)，以及1982年1月5日出版的美国专利No.4,309,406“缓释的药物组合物”(Sustained Release Pharmaceutical Compositions)中描述的。
固体载体的例子包括淀粉、糖、膨润土、二氧化硅，以及其它常用的载体。可用于本发明的制剂中的载体和稀释剂的其它非限制性的例子包括盐水、糖浆、葡萄糖和水。
肠溶包衣剂型 对于用于给药类似本文公开的式(I)-(IV)的Lp-PLA2抑制剂的小的化学实体的制剂来说，一种特别有用的实施方案是含有Lp-PLA抑制剂、带有肠溶聚合物外壳的片剂。这样的制剂的例子可以在WO2005/021002中发现。核心中的活性物质可以微粉化或溶解的形式存在。除了活性物质之外，核心可以含有压缩片剂技术领域中常见的添加剂。在这样的片剂中适合的添加剂可以包括稀释剂例如无水乳糖、单水乳糖、碳酸钙、碳酸镁、磷酸二钙或其混合物；粘合剂例如微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、预胶化淀粉或阿拉伯胶或其混合物；崩解剂例如微晶纤维素(实现粘合剂和崩解剂双重功能)、交联的聚乙烯吡咯烷酮、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠或其混合物；润滑剂例如硬脂酸镁或硬脂酸，助流剂或流动性助剂例如胶态二氧化硅、滑石粉或淀粉，以及稳定剂例如干燥的无定形二氧化硅，着色剂，香料等。优选情况下，片剂含有乳糖作为稀释剂。当粘合剂存在时，优选为羟丙基甲基纤维素。优选情况下，片剂含有硬脂酸镁作为润滑剂。优选情况下，片剂含有交联羧甲基纤维素钠作为崩解剂。优选情况下，片剂含有微晶纤维素。
稀释剂可以占核心重量的10-80％。润滑剂可以占核心重量的0.25-2％。崩解剂可以占核心重量的1-10％。微晶纤维素，如果存在的话，可以占核心重量的10-80％。
优选情况下，活性成分占核心重量的10％到50％之间，更优选为核心重量的15％到35％之间(以游离碱当量计算)。核心可以含有任何治疗适合剂量水平的活性成分，但是优选含有最多150mg作为游离碱的活性成分。特别优选情况下，核心含有20、30、40、50、60、80或100mg作为游离碱的活性成分。活性成分可以作为游离碱存在，或作为任何可药用的盐。如果活性成分以盐的形式存在，对重量进行调整，使得片剂含有根据盐的游离碱计算的所需量的活性成分。优选情况下，活性成分以盐酸盐形式存在。
核心可以从其成分的压缩混合物制成。成分可以被直接压缩，或者可以在压缩之前成粒。这样的颗粒可以通过本技术领域已知的常规成粒工艺形成。在可选的实施方案中，颗粒可以用肠溶衣单独包衣，然后封装在标准的胶囊衣中。
核心被含有肠溶聚合物的衣围绕。肠溶聚合物的例子是醋酸邻苯二甲酸纤维素、醋酸琥珀酸纤维素、邻苯二甲酸甲基纤维素、邻苯二甲酸乙基羟基纤维素、邻苯二甲酸聚乙酸乙烯酯、醋酸聚乙烯丁酸酯、乙酸乙烯酯-马来酸酐共聚物、苯乙烯-马来酸单酯共聚物、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物或甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸-丙烯酸辛酯共聚物。它们可以单独或组合使用，或与上面没有提到的其它聚合物一起使用。衣也可以包含在活的生物体中既不分解也不溶解的不溶性物质，例如烷基纤维素衍生物、例如乙基纤维素，交联的聚合物例如苯乙烯-二乙烯苯共聚物，具有羟基的多糖例如葡聚糖，用双功能交联剂例如表氯醇、二氯丙醇或1，2-，3，4-二氧桥丁烷处理过的纤维素衍生物。衣也可以包含淀粉和/或糊精。
优选的肠溶包衣材料是可商购的

肠溶聚合物，例如

和

NE，可以单独使用或与增塑剂一起使用。这样的包衣通常使用液体介质施加，增塑剂的本质取决于介质是水性的还是非水性的。与水性介质一起使用的增塑剂包括丙二醇、柠檬酸三乙酯、柠檬酸乙酰三乙酯或

或

非水性增塑剂包括这些，还包括邻苯二甲酸二乙酯和二丁酯，以及癸二酸二丁酯。优选的增塑剂是柠檬酸三乙酯。包含的增塑剂的量对于本领域技术人员来说是显而易见的。
衣也可以包含防粘剂例如滑石粉、二氧化硅或单硬脂酸甘油酯。优选的防粘剂是单硬脂酸甘油酯。典型情况下，衣可以包含大约5-25wt％的增塑剂和最多大约50wt％的防粘剂，优选1-10wt.％的防粘剂。
如果需要，可以包含表面活性剂以帮助形成聚合物的水性悬浮液。对于本领域技术人员来说，许多可能的表面活性剂的例子是已知的。表面活性剂的优选例子是聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20或月桂酸基硫酸钠。如果存在，表面活性剂可以占衣的0.1-10％，优选0.2-5％，特别优选0.5-2％。
在一个实施方案中，在核心和肠溶包衣之间包含了封闭涂层。封闭涂层是可用于保护肠溶外壳免于核心中任何碱性成分的可能的化学攻击的涂层材料。封闭涂层也可以提供较光滑的表面，从而允许肠溶外壳更容易地附着。本领域技术人员将会认识到适合的涂层。优选情况下，封闭涂层由Opadry涂层制成，特别优选情况下，它是Opadry WhiteOY-S-28876。
在一个实施方案中，药物活性成分是1-(N-(2-(二乙基氨基)乙基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)氨基羰基甲基)-2-(4-氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮，或其盐。
这种肠溶包衣制剂的一个例子，正如在WO2005/021002中所述，包含不同量的作为盐酸盐的1-(N-(2-(二乙基氨基)乙基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)氨基羰基甲基)-2-(4-氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮(在该实施例中称为“活性的”)。
在该实施例中，将单水乳糖、微晶纤维素、活性成分、羟丙基甲基纤维素和一半的交联羧甲基纤维素钠，过筛到10升Fielder高剪切力混合器中(可以使用任何适合的高剪切力混合器)，在切碎机关闭的情况下以300rpm混合5分钟。然后通过加入大约750ml水并继续混合，使混合物成粒。将颗粒在Glatt 3/5流化床干燥器上干燥，通过Comil过筛到Pharmatec 5升槽混合器中，然后与制剂中给出的任何无水乳糖和剩余的交联羧甲基纤维素钠，以20rpm混合5分钟。将硬脂酸镁过筛到混合器中，将混合过程以10rpm继续进行1分钟。使用配有9.5mm圆形正常凸起冲头的Riva Piccolla旋转压片机(可以使用任何适合的压片机)对润滑过的混合物进行压片。通过在Manesty 10喷涂机中喷洒包层成分的水性悬浮液，施加了密封涂层和随后的肠溶包衣，涂层工艺使用的参数按照涂层聚合物制造商的推荐(同样地，可以使用任何喷涂机)。
本领域技术人员，使用这些材料或它们的等价物，可以制备其它的这种类型的肠溶包衣制剂。
局部应用 本发明可用于皮肤溃疡的局部应用。这样的组合物包括溶液、悬浮液、洗液、凝胶、霜剂、软膏、乳液、皮肤贴片等。所有这些剂型，以及它们的制备方法，在药物和美容学领域中是熟知的。《HARRY′S美容学》(HARRY′S COMSETICOLOGY(Chemical Publishing，第七版，1982)；《REMINGTON′S药物学》(REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Publishing Co.，第十八版，1990)。典型情况下，这样的局部制剂含有的活性成分浓度在0.001到10mg/ml的范围内，与适合的介质混合。其它所需成分包括防腐剂、辅助溶剂、增粘剂、载体等。载体本身或溶解在载体中的成分，可以具有它们自身的缓和或治疗性质，包括润湿、清理、促进伤口愈合或抗炎性质。本施用方法的Lp-PLA2抑制剂，可以与治疗有效量的抗炎药例如皮质甾族类化合物，杀真菌剂，抗生素，润湿剂或伤口愈合促进化合物例如血小板衍生的和自体生长因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(G-M CSF)，以及间质聚糖相组合。
穿透增强剂可以是例如表面活性剂；某些有机溶剂，例如二甲亚砜和其它亚砜，二甲基乙酰胺和吡咯烷酮；某些杂环胺的酰胺，二醇(例如丙二醇)；碳酸丙烯酯；油酸；烷基胺和衍生物；各种不同的阳离子、阴离子、非离子和两性表面活性剂，等等。
适合的药膏基材包括例如凡士林、石蜡、聚乙烯、天然加氢的或合成的甘油三酯、聚乙二醇、聚乙二醇(macrogoles)、碳蜡、纤维素及其衍生物、高分散性二氧化硅、膨润土、淀粉、支链淀粉及其衍生物、藻酸盐、黄蓍胶、聚丙烯酸、聚乙烯醇和/或聚乙烯吡咯烷酮(polyorylvinylpyrrolidone)。适合的乳化剂是例如十六十八醇、十六酯醇(cetylesteralcohol)、月桂基硫酸钠、鲸蜡基硫酸钠、硬脂基硫酸钠、失水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯和聚氧乙烯甘油醇醚。适合的稳定剂的例子是乙醇、异丙醇、山梨酸、对羟苯甲酸(4-羟基苯甲酸)、对羟苯甲酸酯(4-羟基苯甲酸酯)、对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、六氯酚、苯扎溴铵、十六烷基氯化吡啶和抗坏血酸。适合的促进剂(也包括通透增强剂、吸收加速剂等)是例如肉豆蔻酸异丙酯、二甲基亚砜、2-吡咯烷酮、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、1，2-丙二醇、油酸、月桂基硫酸钠、脲、水杨酸、透明质酸酶、油醇和乙二醇。
在本发明中使用的活性药剂的剂量方式取决于待治疗的疾病或病症，根据患者的体重和年龄、患者的个体状况、以及可使用的技术和与最佳技术状态的差距来确定。
药物学有效量的局部给药可以利用本技术领域众所周知的经皮投送系统。经皮投送系统的制备描述在美国专利No.4626539、4,405,616、4,416,886、4655766，以及Stanley Scheindlin，Molecular Interventions4308-312，(2004)中。
本领域技术人员也可以将离子电渗投送系统与经皮投送系统一起使用。这样的应用的一个例子可以在Kazuhiro A等“使用具有微针的装置进行胰岛素的离子电渗”(Iontophoresis of insulin using a device withmicroneedles.Int J Pharm Fed World Cong.20026227)中发现。
治疗效能 术语“治疗”，对于皮肤溃疡的治疗来说，是指控制和根除开放疮口中的感染，使得开放疮口被清理(没有脓)。它也指开放疮口的逐渐愈合，正如通过开放疮口的尺寸缩小和开口最终完全关闭所评估的。它还包括局部炎症、疼痛、触痛和溃疡周围区域中的发红的减轻。治疗也意味着溃疡不随时间变大。
预防性方法(例如阻止或减少复发的发生)也被当作治疗。
治疗效力可以使用本文描述的任何一种等级标准，或其它临床接受的度量皮肤溃疡严重性的标准来监测。因此，Merck手册分类(1-6级)、PUSH工具和NPUAP记分，和/或Wagner分类等级，每种都可以使用。如果在使用Lp-PLA2抑制剂治疗后，获得了至少一个分类等级或水平的改善，治疗通常被认为是“有效的”。可选地或此外，在治疗后皮肤溃疡的尺寸(面积和/或深度)减少至少25％，被认为是“有效的”治疗。
预防效力通过在Lp-PLA2抑制剂治疗开始后，评估对象发生皮肤损伤的风险的皮肤来监测。在有风险个体中不存在皮肤损伤，被认为是“有效的”预防的标志。同样地，当个体具有皮肤损伤史时，不出现新的损伤，或者甚至相对于治疗前的频率或严重性来说，任何新的损伤的频率或严重性降低了例如50％或以上，表明本文描述的方法“有效地”预防了皮肤溃疡。
应该理解，本发明不限于本文描述的方法、方案和反应试剂，因此可以改变。在本文中使用的术语目的仅仅是描述具体的实施方案，不打算限制本发明的范围，本发明的范围只由权利要求书定义。
除了在操作例中或指明之外，所有表示本文使用的成分的量或反应条件的数字，都应该被理解为在所有情况下被术语“大约”所修饰。术语“大约”在与百分率结合使用时，可以是指±1％。
实施例 本文提出的实施例涉及了通过抑制Lp-PLA2预防和/或治疗皮肤溃疡、例如但不限于糖尿病性皮肤溃疡的方法和组合物。这整个本申请中，参考了各种不同的出版物。所有出版物以及在那些出版物中引用的参考文献的公开内容，在本申请中以其全文引为参考，以便更全面地描述本发明所属领域的技术状态。下面的实施例不打算限制本发明的权利要求的范围，而是打算对某些实施方案进行示例。本领域技术人员在示例方法中进行的任何改变，打算包含在本发明的范围内。
动物模型开发了糖尿病/糖尿病型高胆固醇血症猪模型(DM/HC)，用于模拟类似人类的糖尿病和类似人类的动脉粥样硬化。通过对大约4月龄的、体重为25-30kg的养猪场猪单次静脉内注射125mg/kg链脲菌素(Sicor Pharmaceuticals，Irvine，CA)，对其造成糖尿病。在稳定1-2周后，给血浆葡萄糖水平升高(＞150mg/dl)的动物喂食表1中显示的致动脉粥样化(高脂肪)饲料(Animal Specialties，Quakertown，PA)，获得了大约250-800mg/dl的胆固醇水平。胆固醇水平的维持通过表2中显示的方法来确定。
表1、2.0％胆固醇饲料的成分是 *Purina Mills，LLC，Checkerboard Square，St.Louis，Missouri，63164，USA。这些饲料由Animal Specialties and Provisions公司(LLC，Quakertown，PA USA)制备。
对于0.5％胆固醇饲料来说，除了含有0.5％胆固醇和20％猪油之外，成分是相同的。动物是3-5月龄的阉割雄性约克夏猪，从Archer农场(Darlington，MD)获得。这些饲料由Animal Specialties and Provisions公司(LLC，Quakertown，PA USA)制备。
在第1-2天，动物被喂食正常食物，然后在第3-14天，给动物喂食0.5％胆固醇、2％猪油的饲料，在第14天测量胆固醇水平，如果胆固醇＜300mg/dl，将饲料相应调整，增加到2％胆固醇、10％猪油。在诱导DM/HC后，测量胆固醇，直到胆固醇水平稳定在300到800mg/dl之间，在胆固醇稳定后，每月测量胆固醇。如果在最初的稳定期后，胆固醇水平不稳定，将动物的饲料回复到最初的两周测量日程表的饲料。每个月测量胆固醇水平，包括总胆固醇、LDL、HDL、VLDL和甘油三酯水平。调整动物的饲料，以便按照表2中显示的提纲确定稳定的胆固醇水平。
表2、胆固醇和饮食调整


在胆固醇稳定在250-800mg/dl后一个月，将动物随机分成两个实验组，未治疗的和治疗(10mg/kg/天的SB-480848，也称为1-(N-(2-(二乙基氨基)乙基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)-氨基羰基甲基)-2-(4-氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮)的DM/HC(高血糖症和高胆固醇血症)组。然后将动物放置在两个分离的房间中，对照动物在一个房间，治疗动物在另一个房间，以便确保在对照动物中不会发现药物。每天两次目测检查动物，目测检查相隔8-10个小时，检查皮肤的脓肿、特别是在腿部和足部。被当作是脓肿的，最小脓肿尺寸为1mm，并且周围区域中发红。当检测到脓肿时，进行治疗。治疗包括评估脓肿的尺寸和深度，排出和清理死组织和细胞脓肿，用优碘(Betadine)清洗，干燥，并用无菌敷料包扎，并口服抗生素。治疗每日进行，直到开放疮口中的感染被清除(没有脓)，开放疮口通过尺寸缩小而愈合，开口完全闭合。进行脓肿的培养以确定造成感染的病原体。对动物的研究持续6个月，然后在6个月结束时处死动物，立即收获组织。动物方案得到了宾夕法尼亚大学试验动物护理和使用委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committee of University of Pennsylvania)的批准。
对两个糖尿病/高胆固醇血症组进行了评估1.DM/HC组，以及2.接受了Lp-PLA2抑制剂的DM/HC动物。实验包括对照组(DM/HC组-21口猪)，实验组(接受了Lp-PLA2抑制剂的DM/HC动物-22口猪)。此外，在实验动物中将血液胆固醇水平维持在300到800mg/dl之间，该范围已被确定能够提供更好的试验模型。每两个月检测所有动物中的血液胆固醇水平，如表4中所示，并按照表2中所示对相应饲料中的脂肪含量进行调整。胆固醇和猪油的百分含量分别在0.5-2％和10-25％的范围内，所有动物都接受含有此范围内的胆固醇和猪油浓度的饲料。在6个月的实验期间在DM/HC动物中鉴定到的和治疗的腿部脓肿的时间线显示在图1中。腿部脓肿发生的概要可以在表4中发现。
动物的数量选择满足了证实统计学有效性的最低要求，是每个实验如下两组动物1.对照组(n＝21)；糖尿病和高血脂；2.实验组(n＝22)，糖尿病，高血脂，接受10mg/kg Lp-PLA2抑制剂，如表3所示。
家猪约克夏公猪，体重在25-35kg之间，从当地农场购买，在兽医的护理之下放置在室内场所。它们在研究开始日期前3-5天被阉割。试验猪通过在30分钟时间内静脉内灌注一剂链脲霉素(125mg/kg)被造成糖尿病。如果动物没有变成糖尿病，给药第二剂(50mg/kg)。为了避免可能发生的起始的低血糖，前两天在饲料中添加20g葡萄糖粉。前14天，每天在喂食前使用葡萄糖仪测量血液葡萄糖，然后每周测量一次。
试验动物与对照动物分开饲养，以避免由于colcophagia造成动物之间的药物转移。所有动物每天两次喂食致动脉粥样化的饲料，并可自由进水。定制的饲料含有0.5到2％胆固醇，以及10到25％猪油，其成分显示在表1中。
表3、动物的时间表和程序(分成两组) 表4、脓肿发生的概述 每日剂量在第29天开始，在这时对每只试验动物每天给药10mg/kg SB-480848(以相当于狗粮中的浓注形式给药)。
脓肿的培养显示出葡萄球菌(Staphylococcus)是引起感染的主要病原体。该病原体也是在人类糖尿病感染中分离到的最常见的细菌。
DM/HC猪模型是研究Lp-PLA2抑制剂对皮肤脓肿的发生、形成、治疗和预防的效应的理想模型。这是因为这些猪与高风险人类糖尿病患者共有许多表型相似之处，例如倾向于发生足部溃疡或脓肿。
在用Lp-PLA2抑制剂治疗的22只DM/HC猪中，#948和#963猪在它们的足部有可见的脓肿。每只猪有一个脓肿。这些猪在开始Lp-PLA2抑制剂治疗之前就发生了脓肿(图1)。对脓肿进行了治疗，它们平均在1-2周内愈合。在开始每日施用单剂抑制剂治疗后，没有发生进一步的脓肿。对于剩余的20只使用Lp-PLA2抑制剂治疗的猪来说，在6个月的治疗期间没有一只发生任何脓肿。
在没有用Lp-PLA2抑制剂治疗的21只DM/HC猪中(对照组)，6只猪发生了脓肿#975、#1024、#949、#947、#1007和#15猪。所有这些猪都发生了脓肿，其中两只猪发生了复发的脓肿(在以前的脓肿愈合后发生了新的脓肿)，一只猪具有持续超过2个月的慢性溃疡(尽管进行了积极的伤口护理，但脓肿没能愈合)。
尽管不希望受到理论的束缚，但建议Lp-PLA2酶的抑制降低了全身性炎症，导致了皮肤感染风险的降低。
总起来说，数据表明，抑制Lp-PLA2酶可以在糖尿病患者中有效防止脓肿形成，有效预防复发性脓肿形成，并有效预防慢性脓肿发生。
此外，在研究期间发现，给药Lp-PLA2抑制剂的动物对外部刺激更具反应性，证实了与对照动物相比，在笼子中更加活跃，倾向于对喂食和看护反应更敏捷。此外，尽管具有相似的血清葡萄糖和胆固醇水平，但使用Lp-PLA2抑制剂治疗的动物与对照动物相比，被证明从分别的基线值26.9kg和30.3kg体重具有更多的体重增加(62.5kg对对照动物的50.9kg)。给药Lp-PLA2抑制剂的动物的体重直接反映了它们的整体良好状态，因为病情更严重的动物(即对照动物)不进食。观察到了通过抑制Lp-PLA2来抑制炎症，在全身性炎症的情况下产生了更好的状态和健康状况。
在本文和整个说明书中引用的参考文献，在此引为参考。
权利要求
1.一种在对象中治疗和/或预防皮肤溃疡的方法，包括确定所述对象是否患有或有风险患有皮肤溃疡，以及给患有皮肤溃疡或有发生皮肤溃疡风险的对象施用药物组合物，该药物组合物含有抑制Lp-PLA2蛋白的活性和/或表达的药剂。
2.权利要求1的方法，其中对象是哺乳动物。
3.权利要求2的方法，其中哺乳动物是人类。
4.权利要求1的方法，其中风险因素选自以前有过皮肤溃疡的发作；患有糖尿病；卧床不起或限制在轮椅上；以及患有脉管炎。
5.权利要求1的方法，其中药剂是小分子、核酸、蛋白、抗体或其抗原结合片段。
6.权利要求5的方法，其中核酸是RNAi药剂。
7.权利要求6的方法，其中RNAi药剂是siRNA、shRNA、miRNA、dsRNA或核酶，或其变体。
8.权利要求5的方法，其中小分子是1-(N-(2-(二乙基氨基)乙基)-N-(4-(4-三氟甲基苯基)苯甲基)-氨基羰基甲基)-2-(4-氟苯甲基)硫代-5，6-三亚甲基嘧啶-4-酮或SB480848，或其可药用的盐或酯。
9.权利要求5的方法，其中小分子是N-(2-二乙基氨基乙基)-2-[2-(2-(2，3-二氟苯基)乙基)-4-氧-4，5，6，7-四氢-环戊并嘧啶-1-基]-N-(4′-三氟甲基-联苯-4-基甲基)乙酰胺，或其可药用的盐或酯。
10.权利要求5的方法，其中小分子是N-(1-(2-甲氧基乙基)哌啶-4-基)-2-[2-(2，3-二氟苯甲基硫代)-4-氧-4H-喹啉-1-基]-N-(4′-三氟甲基联苯-4-基甲基)-乙酰胺，或其可药用的盐或酯。
11.权利要求5的方法，其中小分子是2-[4-({[2-[2-(2，3-二氟苯基)乙基]-4-氧吡啶并[2，3-d]嘧啶-1(4H)-基]乙酰基}{[4′-(三氟甲基)-4-联苯基]甲基}氨基)-1-哌啶基]-2-甲基丙酸甲酯，或其可药用的盐或酯。
12.权利要求1的方法，还包括给对象施用其它治疗药剂。
13.权利要求12的方法，其中所述其它治疗药剂选自抗微生物疗法、抗寄生虫疗法、抗肥胖疗法、糖尿病疗法、心血管疾病疗法、肾衰竭疗法、脉管炎疗法、静脉机能不全疗法、动脉机能不全疗法、癌症疗法、免疫抑制疗法、免疫缺陷疗法、甾族类化合物疗法和烧伤疗法。
14.权利要求1的方法，还包括给对象施用标准的伤口护理处理。
15.权利要求1的方法，还包括给对象施用生物工程化的皮肤代用品。
全文摘要
本申请提供了用于治疗和/或预防皮肤溃疡的方法，其特点为给患有皮肤溃疡或具有发展皮肤溃疡风险的患者施用含有Lp-PLA2蛋白的活性或表达抑制剂的药物组合物。
文档编号A61K38/00GK101687009SQ200880024065
公开日2010年3月31日 申请日期2008年5月9日 优先权日2007年5月11日
发明者罗伯特·维莱恩斯基, 达米尔·哈马姆德齐克, 哈里拉·普罗夫卡 申请人:宾夕法尼亚大学理事会