专利名称：附加糖链的glp-1肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种附加糖链的GLP-1肽。
背景技术：
GLP-1 (胰高血糖素样肽-1 glucagon-like peptide-1)为与糖的体内平衡的控制
有很深的关系的起源于肠的肽。GLP-1在胰高血糖素前体胰高血糖素前原的组织特异性 翻译后，通过加工处理在肠的L细胞中合成，并响应进食而被释放到循环中。这些肽为 肠-胰岛轴的主要介质，其通过与特定的受体结合而起作用。已知，GLP-1主要与胰脏作用，葡萄糖浓度依赖性地促进由0细胞的胰岛素释 放。另外，具有抑制胰高血糖素的分泌、使胃的空洞化延迟、提高末梢的葡萄糖处理的 可能性。通过给药GLP-1，可以使胰岛素非依赖型糖尿病患者的餐后的葡萄糖水平正常 化，因此提示，GLP-1具有作为治疗药的可能性。另外，GLP-1也具有改善胰岛素依赖 型糖尿病患者的血糖控制的作用。此外，由于GLP-1的胰岛素释放促进作用依赖于血浆 葡萄糖浓度，因此，在低的血浆葡萄糖浓度下，GLP-1介导的胰岛素释放少，有不会导 致严重的低血糖症的优点。因此认为，通过根据需要控制血中GLP-1量，可以进行安全 性高的糖尿病治疗。但存在如下问题GLP-1在血中的半衰期非常短，为2 6分钟， 这限定了其作为治疗剂的可能性。作为解决这样的问题的方法，进行了改变GLP-1的尝试。例如，在专利文献1 中公开了一种聚乙二醇化GLP-1化合物，其为含有共价结合在至少1个聚乙二醇(PEG) 分子上的GLP-1化合物的聚乙二醇化GLP-1化合物，其中，各PEG通过Cys或Lys氨基 酸与GLP-1化合物结合，或与羧基末端氨基酸结合，聚乙二醇化GLP-1化合物具有至少 1小时的排出半衰期。根据专利文献1，与未聚乙二醇化(unPEGylated)肽相比，可得到半衰期延长、 清除延迟化的生物活性肽。另外，公开有这些聚乙二醇化(PEGylated)GLP-l化合物及组 合物对糖尿病、肥胖、肠易激综合征以及血糖降低、抑制胃和/或肠运动性及抑制胃和/ 或肠内容物排出或抑制食物摄取等健康状态的治疗是有用的(例如非专利文献1)。但是，PEG为在生物体内不代谢的化合物，因此，持续给药聚乙二醇化GLP-1 化合物时，存在PEG蓄积在生物体内、对生物体产生药害的危险性(非专利文献1)。另外，作为为类似于GLP-1的结构、具有同样的活性且血中稳定性高的化合 物，从毒蜥蜴(Heloderma)的唾液发现的艾塞那肽_4 (exendin-4)(非专利文献2)在美国 上市，但艾塞那肽_4为非人型序列，长期给药时，担心会出现中和抗体或随之的药效减 弱(非专利文献3 5)。另一方面，可知糖链在生物体内担负着各种各样的作用，虽然认识到其研究的 重要性，但因其结构的复杂性及多样性而导致研究落后。也尝试了用于得到组成一定的 糖肽的方法(专利文献2)，但从简便性或大量生产的观点考虑，不能说是充分的制造方法，另外，特别是对于存在于生物体内的长的糖链，不能说是实用的制造方法。专利文献1专利文献2非专利文献1非专利文献2非专利文献3非专利文献4非专利文献5
日本特表2006-520818号公报 日本再表2005-095331号公报 Toxicological Science, 42，152-157(1998)。 J Biol Chem.267.402-5 (1992)
Vascular Health and Risk Management 2，69-77 (2006) JAMA.298.194-206 (2007) Endocrine Reviews 28，187– ； 218(2007)
发明内容
发明要解决的技术课题本发明的课题在于，提供一种附加糖链的GLP-1肽，所述附加糖链的GLP-1肽 与GLP-1相比，血中稳定性增大，更理想的是显示高的血糖值抑制活性。解决课题的技术方案为了解决以上的课题，本发明可以具有以下的特征。即，本发明可以为一种具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于， 在(a)GLP-l ； (b)GLP-l中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的肽；或(c)GLP-l的类 似物中，至少1个氨基酸被附加糖链的氨基酸取代。另外，本发明可以为一种具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在 于，在(a)GLP-l;或(b) GLP-1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸且具有GLP-1活性 的肽中，至少1个氨基酸被附加糖链的氨基酸取代。本发明可以为一种具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，为(a)在GLP-1的C末端(37位)上进一步附加有1或数个氨基酸的肽中，该被附 加的氨基酸的至少一个被附加糖链的氨基酸取代的附加糖链的GLP-1肽；或(b)在由(a)定义的附加糖链的GLP-1肽中，缺失、取代或附加1或数个附加糖 链的氨基酸以外的氨基酸的附加糖链的GLP-1肽。另外，本发明可以为一种具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在 于，为(a)在GLP-1的N末端(7位)上进一步附加有1或数个氨基酸的肽中，该被附 加的氨基酸的至少一个被附加糖链的氨基酸取代的附加糖链的GLP-1肽；或(b)在由(a)定义的附加糖链的GLP-1肽中，缺失、取代或附加1或数个附加糖 链的氨基酸以外的氨基酸的附加糖链的GLP-1肽。另外，本发明可以为一种具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在 于，为(a)GLP-l的选自18、20、22、26、30、34及36位中的1个以上部位的氨基酸 被附加糖链的氨基酸取代的附加糖链的GLP-1肽；或(b)在由(a)定义的附加糖链的GLP-1肽中，缺失、取代或附加1或数个附加糖 链的氨基酸以外的氨基酸的附加糖链的GLP-1肽。另外，本发明可以为一种具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，在(a)GLP-l; (b)GLP-l中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的肽；或(c)GLP-l的 类似物中，至少2个氨基酸被附加糖链的氨基酸取代。另外，本发明可以为一种具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在 于，在(a)GLP-l ；或(b)GLP-l中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的肽中，至少2个 氨基酸被附加糖链的氨基酸取代。另外，本发明可以为一种具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在 于，在(a)GLP-l;或(b) GLP-1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸且具有GLP-1活性 的肽中，至少2个氨基酸被附加糖链的氨基酸取代。在本发明中，根据实施方式，附加糖链的氨基酸优选可以为附加糖链的Asn或 附加糖链的Cys，但并不限定于这些。另外，在本发明中，在附加糖链的氨基酸中，糖链和氨基酸可以通过接头结 合，也可以不通过接头结合，根据实施方式，优选不通过接头(直接)结合。另外，在本发明中，糖链一般优选为由4个以上糖构成的糖链，进而，根据实 施方式，有时优选为由5个 11个糖构成的糖链。另外，在本发明中，根据实施方式，糖链有时优选为选自二唾液酸糖链、单唾 液酸糖链、去唾液酸糖链、二 N-乙酰葡萄糖胺糖链及二甘露糖糖链的糖链，但并不限定 于这些。另外，在本发明中，根据实施方式，糖链有时优选下式表示的糖链，但并不限 定于这些。[化1]
权利要求
1.具有GLP-I活性的附加糖链的GLP-I肽，其特征在于，下列肽中的至少1个氨基 酸被附加糖链的氨基酸取代(a)GLP-I ；(b)GLP-I中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的肽；或(c)GLP-l的类似物。
2.具有GLP-I活性的附加糖链的GLP-I肽，其特征在于，下列肽中的至少1个氨基 酸被附加糖链的氨基酸取代(a)GLP-I ；或(b)GLP-I中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的肽。
3.具有GLP-I活性的附加糖链的GLP-I肽，其特征在于，下列肽中的至少1个氨基 酸被附加糖链的氨基酸取代(a)GLP-I ；或(b)GLP-l中缺失、取代或附加1或数个氨基酸，且具有GLP-I活性的肽。
4.权利要求1 3中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述附加糖链的氨基酸为 附加糖链的Aot或附加糖链的Cys。
5.权利要求1 3中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述附加糖链的氨基酸为 附加糖链的Asn。
6.权利要求1 3中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述附加糖链的氨基酸为 附加糖链的Cys。
7.权利要求1 5中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其特征在于，在所述附加糖链 的氨基酸中，糖链和氨基酸不通过接头结合。
8.权利要求1 7中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述糖链为由4个以上的 糖构成的糖链。
9.权利要求1 8中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述糖链为由5 11个糖 构成的糖链。
10.权利要求1 9中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述糖链为选自二唾液酸 糖链、单唾液酸糖链、去唾液酸糖链、二 N-乙酰葡萄糖胺糖链及二甘露糖糖链的糖链。
11.权利要求1 9中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述糖链为下式表示的糖链[化1]
12.权利要求1 11中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述糖链基本上均一。
13.具有GLP-I活性的附加糖链的GLP-I肽，其特征在于，为(a)在GLP-I的C末端(37位)上进一步附加有1或数个氨基酸的肽中，该被附加的 氨基酸的至少一个被附加糖链的氨基酸取代的附加糖链的GLP-I肽；或(b)在由(a)定义的附加糖链的GLP-I肽中，缺失、取代或附加1或数个附加糖链的 氨基酸以外的氨基酸的附加糖链的GLP-I肽。
14.具有GLP-I活性的附加糖链的GLP-I肽，其特征在于，为(a)在GLP-I的C末端(37位)上进一步附加有1个氨基酸的肽中，该被附加的氨基 酸被附加糖链的氨基酸取代的附加糖链的GLP-I肽；或(b)在由(a)定义的附加糖链的GLP-I肽中，缺失、取代或附加1或数个附加糖链的 氨基酸以外的氨基酸的附加糖链的GLP-I肽。
15.具有GLP-I活性的附加糖链的GLP-I肽，其特征在于，为(a)在GLP-I的N末端(7位)上进一步附加有1或数个氨基酸的肽中，该被附加的 氨基酸的至少一个被附加糖链的氨基酸取代的附加糖链的GLP-I肽；或(b)在由(a)定义的附加糖链的GLP-I肽中，缺失、取代或附加1或数个附加糖链的 氨基酸以外的氨基酸的附加糖链的GLP-I肽。
16.具有GLP-I活性的附加糖链的GLP-I肽，其特征在于，为(a)在GLP-I的N末端(7位)上进一步附加有1个氨基酸的肽中，该被附加的氨基 酸被附加糖链的氨基酸取代的附加糖链的GLP-I肽；或(b)在由(a)定义的附加糖链的GLP-I肽中，缺失、取代或附加1或数个附加糖链的 氨基酸以外的氨基酸的附加糖链的GLP-I肽。
17.具有GLP-I活性的附加糖链的GLP-I肽，其特征在于，为(a)GLP-l的选自18、20、22、26、30、34及36位中的1个以上部位的氨基酸被附 加糖链的氨基酸取代的附加糖链的GLP-I肽；或(b)在由(a)定义的附加糖链的GLP-I肽中，缺失、取代或附加1或数个附加糖链的 氨基酸以外的氨基酸的附加糖链的GLP-I肽。
18.权利要求13 17中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述附加糖链的氨基酸 为附加糖链的Asn或附加糖链的Cys。
19.权利要求13 18中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其特征在于，在所述附加糖 链的氨基酸中，糖链和氨基酸不通过接头结合。
20.权利要求13 19中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述糖链为由4个以上 的糖构成的糖链。
21.权利要求13 20中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述糖链为选自二唾液酸糖链、单唾液酸糖链、去唾液酸糖链、二 N-乙酰葡萄糖胺糖链及二甘露糖糖链的糖 链。
22.权利要求13 20中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述糖链为下式表示的 糖链[化3]
23.权利要求13 22中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述糖链99%以上均
24.权利要求13 17中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中， 所述附加糖链的氨基酸为附加糖链的Aot，在所述附加糖链的氨基酸中，糖链和氨基酸不通过接头结合，所述糖链为由4个以上的糖构成的糖链，所述糖链为选自二唾液酸糖链、单唾液酸糖链、去唾液酸糖链、二 N-乙酰葡萄糖胺 糖链及二甘露糖糖链的糖链，所述糖链基本上均一。
25.权利要求1 24中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其具有比GLP-I增大的血中稳定性。
26.权利要求1 24中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其具有与GLP-I相比为10倍 以上的在OGTT( 口服葡萄糖耐量实验)中的血糖值抑制活性。
27.权利要求1 24中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其具有与GLP-I相比为30倍 以上的DPP-IV耐受性。
28.医药组合物，其特征在于，含有权利要求1 27中任一项的附加糖链的GLP-I肽 作为有效成分。
29.权利要求28的医药组合物，其中所述糖链90%以上均一。
30.权利要求28的医药组合物，其用于治疗或预防GLP-I相关疾病。
31.权利要求28的医药组合物，其中所述GLP-I相关疾病为糖尿病。
32.GLP-1相关疾病的治疗或预防方法，其特征在于，给予有效量的权利要求1 27 中任一项的附加糖链的GLP-I肽。
33.具有GLP-I活性的附加糖链的GLP-I肽，其特征在于，下列肽中的至少2个氨 基酸被附加糖链的氨基酸取代(a)GLP-I ；(b)GLP-I中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的肽；或(c)GLP-l的类似物。
34.具有GLP-I活性的附加糖链的GLP-I肽，其特征在于，下列肽中的至少2个氨 基酸被附加糖链的氨基酸取代(a)GLP-I ；或(b)GLP-I中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的肽。
35.具有GLP-I活性的附加糖链的GLP-I肽，其特征在于，下列肽中的至少2个氨 基酸被附加糖链的氨基酸取代(a)GLP-I ；或(b)GLP-I中缺失、取代或附加1或数个氨基酸，且具有GLP-I活性的肽。
36.权利要求33 35中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述附加糖链的氨基酸 为附加糖链的Aot和/或附加糖链的Cys。
37.权利要求33 35中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述附加糖链的氨基酸 均为附加糖链的Asn。
38.权利要求33 35中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述附加糖链的氨基酸 均为附加糖链的Cys。
39.权利要求33 37中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其特征在于，在所述附加糖 链的氨基酸中，糖链和氨基酸不通过接头结合。
40.权利要求33 39中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述糖链均为由4个以上的糖构成的糖链。
41.权利要求33 40中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述糖链均为由5 11 个糖构成的糖链。
42.权利要求33 41中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述糖链均独立地为选 自二唾液酸糖链、单唾液酸糖链、去唾液酸糖链、二 N-乙酰葡萄糖胺糖链及二甘露糖糖 链的糖链。
43.权利要求33 41中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述糖链均独立地为下 式表示的糖链[化5]
44.权利要求33 43中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述糖链基本上均一。
45.具有GLP-I活性的附加糖链的GLP-I肽，其特征在于，为(a)在GLP-I中，2个以上的氨基酸被附加糖链的氨基酸取代，且至少一个取代部位 为18、20、22、26、30、34及36位的附加糖链的GLP-1肽；或(b)在由(a)定义的附加糖链的GLP-I肽中，缺失、取代或附加1或数个附加糖链的 氨基酸以外的氨基酸的附加糖链的GLP-I肽。
46.具有GLP-I活性的附加糖链的GLP-I肽，其特征在于，为(a)在GLP-I中，2以上的氨基酸被附加糖链的氨基酸取代，且全部取代部位均选自. 18、20、22、26、30、34及36位的附加糖链的GLP-1肽；或(b)在由(a)定义的附加糖链的GLP-I肽中，缺失、取代或附加1或数个附加糖链的 氨基酸以外的氨基酸的附加糖链的GLP-I肽。
47.权利要求45或46的附加糖链的GLP-I肽，其中所述附加糖链的氨基酸为附加糖 链的Asn和/或附加糖链的Cys。
48.权利要求45 47中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其特征在于，在所述附加糖 链的氨基酸中，糖链和氨基酸不通过接头结合。
49.权利要求45 48的附加糖链的GLP-I肽，其中所述糖链均为由4个以上的糖构 成的糖链。
50.权利要求45 49中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述糖链均独立地为选自二唾 液酸糖链、单唾液酸糖链、去唾液酸糖链、二 N-乙酰葡萄糖胺糖链及二甘露糖糖 链的糖链。
51.权利要求45 49中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中所述糖链均独立地为下 式表示的糖链[化7]
52.权利要求45 51中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其中，其中所述糖链99%以上均一。
53.权利要求45或46的附加糖链的GLP-I肽，其中， 所述附加糖链的氨基酸为附加糖链的Asn，在所述附加糖链的氨基酸中，糖链和氨基酸不通过接头结合， 所述糖链为由4个以上的糖构成的糖链，所述糖链为选自二唾液酸糖链、单唾液酸糖链、去唾液酸糖链、二 N-乙酰葡萄糖胺 糖链及二甘露糖糖链的糖链， 所述糖链基本上均一。
54.权利要求33 53中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其具有比GLP-I增大的血中稳定性。
55.权利要求33 53中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其具有与GLP-I相比为10 倍以上的在OGTT( 口服葡萄糖耐量实验)中的血糖值抑制活性。
56.权利要求33 53中任一项的附加糖链的GLP-I肽，其具有与GLP-I相比为30 倍以上的DPP-IV耐受性。
57.医药组合物，其特征在于，含有权利要求33 56中任一项的附加糖链的GLP-I 肽作为有效成分。
58.权利要求57的医药组合物，其中所述糖链90%以上均一。
59.权利要求57的医药组合物，其用于治疗或预防GLP-I相关疾病。
60.权利要求57的医药组合物，其中所述GLP-I相关疾病为糖尿病。
61.GLP-1相关疾病的治疗或预防方法，其特征在于，给予有效量的权利要求33 57 中任一项的附加糖链的GLP-I肽。
全文摘要
本发明涉及附加糖链的GLP-1肽，所述附加糖链的GLP-1肽与GLP-1相比，血中半衰期长，且优选显示高的血糖值抑制活性。本发明涉及一种具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，在(a)GLP-1；(b)GLP-1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的肽；或(c)GLP-1的类似物中，至少1个氨基酸被附加糖链的氨基酸取代。
文档编号A61K38/00GK102015761SQ20088002539
公开日2011年4月13日 申请日期2008年6月17日 优先权日2007年6月19日
发明者南部由利, 坂本泉, 手塚克成, 朝井洋明, 梶原康宏, 深江一博, 辻孝 申请人:大塚化学株式会社