专利名称：：G-csf的液体制剂的制作方法G-CSF的液体制剂本发明的目的是稳定的G-CSF水性液体制剂，主要由G-CSF和糖醇、表面活性剂、pH值为大约4.1到4.4的缓冲物质，以及任选的氨基酸和/或甘油和/或糖类和/或防腐剂组成。许多目前已知的用于蛋白药剂的剂型具有缺点。例如，某些制剂含有从医学观点来看不能被毫不犹豫地归类为无害的药物添加剂或赋形剂。由于它们的来源和物理化学性质，聚合物和蛋白在作为药物添加剂的适合性方面具有一定的潜在风险。人类或动物来源的蛋白以及从细胞培养获得的蛋白，具有潜在的病毒污染残留风险。由于它们的抗原性质，其他难以通过分析检测的蛋白类污染物，也可能在人类中引发免疫反应。此外，动物来源的蛋白，由于它们通常的物种特异性性质，可能在人类中引发免疫反应。一旦在之后的时间点再次使用这些蛋白，也可能发生长期反应。具有高分子量的化合物的混合物也可能有问题。由于其高分子量，聚合物可以在体内积累，因此，在没有生物降解的情况下可能在体内长时间存留。这在皮下给药的情况下尤其令人害怕，因为与静脉内给药相比，经过血流移除和分布要延迟许多。取决于摩尔质量，聚合物也可能具有抗原性。此外，由于用于生产的催化剂或由于单体或其他聚合物片段的存在，难以保证聚合物的纯度。因此，应该尽可能避免在液体药物剂型中使用聚合物，特别是对于可皮下使用的剂型来说。此外，从文献得知，特别是非糖基化形式的G-CSF，与从CHO细胞获得的糖基化的G-CSF相比，由于氧化和/或聚集，是极其不稳定的。因此，使非糖基化形式的G-CSF稳定是极其困难的，为了将所述分子配制成稳定的剂型，需要特别选择的措施。从医学观点来说，使用表面活性剂稳定G-CSF在原则上应该避免，因为所述表面活性剂可能引发局部剌激。具有非常低pH值的剂型，特别是在皮下给药的情况下，也可能在患者中引起局部不相容性，例如疼痛和局部组织剌激，因为所述PH值位于组织中存在的从pH7.0到7.5的生理范围之下。最近出版的国际专利申请WO2005/042024，与EP373679的教导相似，教导了获得G-CSF的稳定的药物组合物的方法，这是通过保持所述组合物尤其是不含表面活性剂，并且根据实施例中描述的组合物，通过提供非常低浓度的缓冲液来获得的。关于其中描述的药物的可接受性，没有给出说明。在欧洲专利申请EP1129720中，描述了pH值在5到8范围内的G-CSF制剂，其中提出硫酸盐以稳定制剂中包含的G-CSF。关于其中描述的G-CSF制剂的可接受性，仍然没有给出说明。本发明面对的问题是提供不显示上述当前已知剂型的缺点的G-CSF液体剂型。具体来说，药物制剂应该在长时间内稳定，并且是生理可接受的。特别是，它应该适合于患者自己使用，其特点应该是能够避免在通过注射或注入自己使用药物时通常发生的不希望的皮肤剌激和注射位点的疼痛。该问题通过在权利要求中定性的实施方案得到了解决，并在下面的实施方案中进行了说明。具体来说，本发明涉及G-CSF的稳定水性液体制剂，主要由G-CSF和糖醇组成，浓度为大约0.04到0.06mg/ml的表面活性剂，浓度为大约5到20mM的乙酸盐作为缓冲物质，PH值为大约4.1到4.4。任选地，可以使用氨基酸和/或甘油和/或糖类和/或防腐剂。此外，本发明的液体制剂可以含有其他的常用药物赋形剂。但是，优选不含所述和/或其他赋形剂。在国际专利申请WO94/14466中，总的来说，要求保护储存稳定的G-CSF水性药物制剂，并指出该制剂在使用不同缓冲系统时，在3.5到5和7到8的pH值范围内是稳定的。但是，只对使用磷酸盐缓冲液的液体G-CSF制剂的储存稳定性进行了试验，而对使用其他缓冲液的每个实验制剂，只在短时间机械应力后进行了测试，即样品中出现浑浊时的浊度。在本发明的范围内进行的实验过程中，必须评估在WO94/14466的实施例中指出的，具有乙酸盐缓冲液的G-CSF溶液，特别是含有10mM乙酸盐、pH值为4.5的剂型4，不具有所需的稳定性，因为已经确定了G-CSF的聚集和氧化形式存在的关键值。因此，正如已经在EP0373679中说明的，首先假定超过4.0的pH值将导致聚集物的形成，并且除非使用优选的乙酸盐缓冲系统，否则不能获得具有改进的生理可接受性的pH值的G-CSF液体制剂。在国际专利申请WO2005/039620中，使用了组成为0.6mg/mlG-CSF、10mM乙酸盐缓冲液、0.004%(w/v)Tween80和5%(w/v)D-山梨糖醇，pH值为4.0和4.2的G-CSF液体制剂作为比较制剂，研究了含有pH值为5.0的琥珀酸缓冲液和O.02%(w/v)Tween20的G-CSF制剂，在机械应力的影响下和冷冻与融化后的G-CSF制剂稳定性。根据这些研究，具有乙酸盐缓冲液的G-CSF制剂的稳定性较低，以至于进一步研究这种乙酸盐缓冲的组合物似乎没有意义，更不用说考虑将它们用作候选药物。与此相反，在本发明的范围内进行的实验过程中，令人吃惊地发现了pH>4.0的乙酸盐缓冲的G-CSF制剂，在冰箱中和4(TC、即体温范围内的储存温度下的稳定性方面的有利性质，以及在患者中好得惊人的可接受性，因为与可商购药物相比发生较少的皮肤剌激。具体来说，已经发现，在本发明的意义上，通过分别以各自特定的浓度将作为缓冲物质的乙酸和乙酸盐与表面活性剂例如聚山梨酸酯80，在存在糖醇例如山梨糖醇的情况下混合，并通过将pH值调整到大约4.2±0.15，获得了稳定的G-CSF液体制剂，它赋予G-CSF分子以适合作为药物的稳定性，具有良好的可耐受性，此外，还允许几乎完全防止了当给予药物时通常可以在注射位点处观察到的症状。这使得本发明的G-CSF液体制剂适合并有利地用于即用型注射器和与其一起提供的试剂盒中，特别适合于家庭使用。本发明的液体制剂还具有优选不含其使用从医学观点来看可能有问题的蛋白类或聚合物赋形剂的优点。正如实施例中描述的临床研究所显示的，它们还具有良好的可接受性和可以以基本上无痛的方式使用的优点。此外，本发明的G-CSF液体制剂优选不含氨基酸和/或其他蛋白，例如血清白蛋白。在一个实施方案中，本发明的液体制剂不含甲硫氨酸。另一个优点是，在生物化学实验和临床研究中表明，由于选择了特定浓度范围内的缓冲物质并存在糖醇，因此大约0.04到0.06mg/ml的少量表面活性剂，一方面足以稳定G-CSF，另一方面不在患者中引发显著的皮肤剌激或其他不相容性。在打算用于皮下给药的这种液体制剂中，这是特别有利的。此外，利用本发明的手段，特别是不稳定的、非糖基化的G-CSF分子可以被足够稳定化，以用于药物组合物。定向选择的赋形剂共同提供了具有非常好的可接受性的含有G-CSF的液体剂型，它在蛋白质稳定性方面是高质量的制剂，特别适合作为即用型注射或灌注溶液。在本发明的液体制剂中，使用的表面活性剂的量为0.05到0.06mg/ml，特别优选为大约0.06mg/ml。使用的表面活性剂优选为聚山梨酸酯，特别优选为聚山梨酸酯80，也称为Tween80。本发明的含有G-CSF的剂型包含的药剂的量足以获得治疗效果。一般来说，使用的药剂浓度为0.01到5mg/ml，优选为0.1到lmg/ml，0.3到0.8mg/ml，使用的特别优选的浓度为大约0.6mg/ml。具体来说，在皮下给药的情况下，特别优选的剂量变为0.3mg/0.5ml和0.48mg/0.8ml。根据本发明，使用了乙酸作为缓冲物质。在本发明的液体制剂的制备中，缓冲物质以其游离酸的形式提供。溶液的所需PH值通过加入碱来调整，例如碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物或氢氧化铵。为此，优选使用氢氧化钠。在即用型液体制剂中，缓冲物质乙酸的浓度为大约5到20mMol/l。为了简便起见，在下文中它被称为所述酸的阴离子浓度，即乙酸盐。术语乙酸盐打算也包含未解离的乙酸。优选情况下，使用下面的缓冲液浓度和pH值7.5到15mMol、特别优选为lOmMol乙酸盐，pH4.1到4.4，优选pH4.15到4.3，特别是pH4.2。在本发明的液体制剂中使用的G-CSF，基本上涉及所有通过重组方法生产的G-CSF分子及其变体。根据本发明，术语G-CSF或G-CSF变体包括所有天然存在的G-CSF变体，以及从其衍生和通过重组DNA技术修饰的G-CSF蛋白，特别是除了G-CSF部分之外还含有其他蛋白序列的融合蛋白。就此而言，特别优选的是在1位上具有N-末端Met残基的G-CSF突变蛋白，它由在原核细胞中表达产生。可以按照W091/11520产生的重组的不含甲硫氨酸的G-CSF变体，也是适合的。术语"G-CSF变体"被理解为是指其中一个或多个氨基酸可以被缺失或被其他氨基酸取代的G-CSF分子，其中G-CSF的基本性质在很大程度上得以维持。适合的G-CSF突变蛋白描述在例如EP0456200中。特别优选情况下，本发明的液体制剂中存在的G-CSF是没有糖基化的。为了制备可接受性良好的肠胃外剂型，等渗化赋形剂的混合物是适合的，除非利用药剂和用于稳定化的赋形剂的渗透性质已经可以获得等渗性。就此而言，使用尤其是非离子化的、可接受性良好的赋形剂，例如甘露糖醇、甘油或其他糖醇。在G-CSF的情况下，优选使用山梨糖醇，它对于本发明的液体制剂的可接受性是特别有利的。优选情况下，液体制剂中存在的糖醇的浓度为大约2.5到7.5%(w/v)，特别优选的浓度为大约5%(w/v)。用于调节等渗性的盐的混合物是不利的，因为高浓度的盐或离子增加了G-CSF聚集物的形成。因此，有利情况下，盐以较少的量混合。计算缓冲液的浓度，使得在将离子强度保持在最低可能水平的同时实现pH稳定效应。优选情况下，缓冲液浓度在最高达20mMol的范围内，尤其是低于15mMol。此外，即用型注射溶液可以进一步含有常规的赋形剂或添加剂。可以混合抗氧化剂例如谷胱甘肽、抗坏血酸或类似物质，离液序列高的赋形剂例如尿素，或氨基酸例如甲硫氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等。在特别优选的实施方案中，本发明的G-CSF水性液体制剂被制备成注射或灌注溶液的形式，并主要由浓度为大约0.6mg/ml的人类未糖基化甲硫氨酰-G-CSF和浓度为大约55%(w/v)的山梨糖醇，浓度为大约0.06mg/ml的聚山梨酸酯80，以及作为缓冲物质的浓度为大约10mM的乙酸盐组成，pH值为大约4.2。在其他方面，在同样的剂量强度下，本发明的G-CSF液体制剂可以按照Neupogen②的产品信息进行使用，特别是在剂量、给药和医学适应症方面，因为在本发明的液体制剂中，使用在实验室E.coliK12菌株中生产的高度纯化的未糖基化G-CSF蛋白，如非格司亭，也是优选的。有利情况下，本发明的液体制剂被用作药物，用于治疗已知可以通过给药G-CSF治疗的疾病，例如癌症，由细胞毒性化学疗法导致的不利副作用，其中需要动员外周血前体细胞的疾病的伴随疗法，严重慢性中性粒细胞减少(SCN)，HIV感染等。因此，具体来说，本发明涉及含有上面描述的G-CSF液体制剂之一的药物。在一个实施方案中，本发明的G-CSF组合物打算被用于制备药物，用来治疗神经适应症，例如在急性脑血管事故后中枢神经系统的损伤，其中通过例如以丸剂的形式早期给药，可以缓解或预防严重的二次损伤。在其他方面，本发明的液体制剂打算用作药物，优选用于皮下或静脉内给药，例如在需要长期连续给药G-CSF的情况下，通过预先装填的注射器进行注射或通过灌注。正如上面已经举例说明的，本发明的G-CSF液体制剂在长时期内是稳定的，基本上可以储存在任何适合的容器中。因此，本发明还涉及了含有上面或实施例中描述的G-CSF液体制剂之一的容器。优选情况下，容器的至少一个与液体制剂接触的表面涂有由聚四氟乙烯或乙烯-四氟乙烯(ETFE)构成的材料。典型情况下，容器是常规情况下用于储存和/或给药液体药物的容器，例如玻璃小瓶、注射器、安瓿、卡氏瓶或灌注容器，其中特别有利情况下，本发明的G-CSF液体制剂在即用型注射器和安瓿中使用。在优选实施方案中，注射器或安瓿中存在的液体制剂的浓度，以G-CSF的浓度计，为O.5ml中O.3mg或0.8ml中0.48mg。因为在本发明的G-CSF液体制剂给药前，与其他赋形剂混合或采取进一步制备措施例如过滤、混合等可以被有利地省略，因此本发明的G-CSF液体制剂可以制备在例如试剂盒中用于立即给药。因此，在对于医生、药剂师和特别是对于患者特别有利的实施方察中，本发明还涉及了用于G-CSF的肠胃外给药的试剂盒，包含一个或多个上面描述的容器，优选还带有关于储存和/或给药的说明书。通常情况下，将提供以5到30iig/kg体重的剂量进行的G-CSF给药，但是，取决于医学适应症和疾病的阶段，可以标出更高或更低的剂量。优选情况下，在本发明的试剂盒中提供5个注射器或安瓿，任选地，在例如打算每日给药并持续一周的情况下，提供更多、例如7个注射器或安瓿。出于安全操作的原因，有利情况下，本发明的试剂盒具有分别用于注射器和用于注射和/或灌注针头的安全隔舱。在这里，也考虑到了用于针头和准备好的或预先安装的密封盖的拆卸辅助工具。正如在实施例中描述的，本发明的G-CSF液体制剂在长时间内稳定，特别是在大约5t:下，优选在至少4周的时间内稳定。因此，本发明的液体制剂、容器和试剂盒可以有利地储存在常规冰箱中。由本发明产生的这些以及其他实施方案，被权利要求书所涵盖。在上面和下文中提到的现有技术文献的公开内容，在此引入本申请作为参考，特6别是在G-CSF的重组生产、缓冲液、注射器和试剂盒方面。公开了这些和其他实施方案，它们对于本
技术领域：
的专业人员是明显的，由本发明的说明书和实施例所涵盖。其他关于上面提到的可用于本发明的赋形剂之一以及电子手段的文献，可以从现有技术获得，例如使用电子手段从例如公共图书馆获得。此外，其他的公共数据库可以通过英特网容易地获得，例如"PubMed，，(http://www.pubmed.gov)。用于执行本发明的技术对于本
技术领域：
的专业人员来说是公知的，可以从相关的文献获得，参见例如《分子克隆实验指南》(第二版)(MolecularCloningALaboratoryMa皿al，2ndEd.，Sambrook，Fritsch禾口Maniatis主编(ColdSpringHarborLaboratoryPress:1989));《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》(ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology)(Mayer禾口Walker主编，AcademicPress,London,1987);《实验免疫学手册》(I-IV巻)(HandbookOfExperimentalImmunology,VolumesI-IV)(D.M.Weir和C.C.Blackwell主编，1986)。实施例下面，将通过优选实施方案对本发明进行进一步说明，但是，这些实施方案不打算以任何方式限制本发明的目的。实施例1:液体G-CSF剂型的制备通过以下方式制备在实施例中使用的G-CSF溶液，将上述赋形剂溶解在用于注射目的的水中，添加指示量的G-CSF，以及如果需要，使用少量缓冲成分将pH值精确调整到所需值。在制备本发明的G-CSF制剂时，应该指出，为了调整乙酸盐缓冲液，需要首先提供乙酸，然后使用Na0H溶液调整pH值，而在以前进行的实验过程中则是使用乙酸钠，然后使用HC1调整pH值，这可能导致蛋白聚集物的形成，这可能是由于增加的离子浓度所致。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>。鄉Hds务蹈妇s^t餘^as+紧ao寸+坩；一歉泰搶紫s歸讽/一ss.o二s/ss9.0*nG\o￡K鹏^酬「l歉"l琳实施例2:本发明的G-CSF制剂的生物化学稳定性将实验级G-CSF制剂在密封和巻边的小瓶中、在特定储存温度下避光保存，然后使用标准技术测试蛋白纯度和氧化形式、聚集物和二聚体的存在，这些技术例如UV光谱术、使用C4和C18固定相的反相HPLC，或尺寸排阻色谱(SECHPLC)，等点聚焦，在巯基还原和未还原条件下的SDS-PAGE，然后进行银染和Western免疫印迹分析；关于上面提到的技术的信息，参见例如WO94/14466的实施例，其公开内容在此引为参考。对于在实施例1的表l中指出的G-CSF液体制剂，按照指示测试了它们的长期稳定性。对于表面活性剂含量>0.006%的制剂来说，只示例性标出了具有0.008%的制剂，作为具有较高表面活性剂含量的制剂表现出明显更差的长期稳定性。在关于实验组合物中G-CSF的生物化学稳定性的实验中，结果是使用低至以及包括O.008%的含量的较高表面活性剂浓度时，可以观察到大量的氧化形式的G-CSF的聚集。因此，在本发明的范围内进行的实验中，发现与国际专利WO94/14466中的教导相反，不但较低的表面活性剂浓度，而且在任何情况下高浓度的表面活性剂，对G-CSF在溶液中的氧化曲线有负面影响。此外，已经确定，表1列出的本发明的G-CSF制剂的特征在于氧化物质的相对含量低于1%，而在表面活性剂含量为0.008%及以上的对照样品中超过了该阈值，这导致了结论，即这样的溶液不能考虑用作候选药物。实验组合物中G-CSF的生物化学稳定性的其他实验，显示出本发明的制剂能够显著防止G-CSF的聚集和氧化，而不需要另外混入赋形剂例如氨基酸和/或抗氧化剂。实施例3:G-CSF剂型的可接受性在癌症患者的三相(threephase)III期临床研究中，测试了一种本发明的液体制剂，其中，尤其检查了在注射位点附近的患者反应。在这里，对注射位点处发生的肿胀、发红、皮肤流血、对压力敏感和其他症状，进行了检查。对于临床研究来说，根据表l中实验制剂1Ia(XM02)的指示选择了本发明的G-CSF制剂，并以每天5yg/kg体重的剂量进行处理。幸运的是，在这些实验的过程中，结果是在总共356位患者中，只有一位患者报告了不希望的反应，即仅仅为0.3%的情况。在使用可商购的G-CSF制剂Neupogen^进行的对照实验中，可以证实，本发明的G-CSF制剂在患者注射位点处的副作用方面，显示出提高了4倍的可接受性。这些结果概述在下面的表中。药物pH总数阳性阳性％XM024.235610.3Neupogen4.024931.2安慰剂7.07200.0表2:在三相III期临床研究中在注射位点处反应的频率。乳腺癌、非Hodgkin's淋巴瘤和肺癌第一个化疗周期的评估。上述的检测得到的结果表明，通过分别以各自特定的浓度将作为缓冲物质的乙酸和乙酸盐与表面活性剂例如聚山梨酸酯80，在存在糖醇例如山梨糖醇的情况下混合，并将pH值调整到大约4.2±0.15，获得了稳定的G-CSF液体制剂，它赋予G-CSF分子以适合作为药物的稳定性，具有良好的可耐受性，此外，还允许几乎完全防止了当使用药物时通常可以9在注射位点处观察到的症状。这使得本发明的G-CSF液体制剂，以及与其一起提供的试剂盒，分别特别适合并有利地用于即用型注射器和与其一起提供的试剂盒中，特别适合于家庭使用。权利要求包含G-CSF水性液体制剂的药物，主要含有G-CSF和糖醇，浓度为0.04到0.06mg/ml的表面活性剂，作为缓冲物质的浓度为5到20mM、pH值为4.1到4.4的乙酸盐，以及任选的氨基酸和/或甘油和/或糖类和/或防腐剂。2.权利要求1的药物，其中G-CSF是未糖基化的。3.权利要求1或2的药物，其中存在的G-CSF的浓度为0.6mg/ml。4.权利要求1到3任何一项的药物，其中表面活性剂是聚山梨酸酯。5.权利要求1到4任何一项的药物，其中糖醇是山梨糖醇。6.权利要求1到5任何一项的药物，其中存在的糖醇的浓度为5%(w/v)。7.权利要求1到6任何一项的药物，其中乙酸盐存在的浓度为大约10mM。8.权利要求1到7任何一项的药物，基本上不含氨基酸和/或附加的蛋白。9.权利要求1到8任何一项的药物，是注射或灌注溶液。10.含有G-CSF的水性液体制剂作为注射或灌注溶液的药物，由浓度为0.6mg/ml的人类未糖基化甲硫氨酰-G-CSF和浓度为5%(w/v)的山梨糖醇，浓度为0.06mg/ml的聚山梨酸酯80，以及作为缓冲物质的浓度为大约10mM的乙酸盐组成，pH值为4.2±0.15。11.权利要求1到io任何一项的药物，用于治疗癌症，严重慢性中性粒细胞减少(SCN)，HIV感染，中枢神经系统损伤，由细胞毒性化学疗法导致的不利副作用，或其中需要动员外周血前体细胞的疾病的伴随疗法。12.用于液体药物给药的容器，含有权利要求1到10任何一项的液体药物制剂。13.权利要求12的容器，其中所述容器的至少一个与液体制剂接触的表面，涂有由硅酮或聚四氟乙烯或乙烯-四氟乙烯(ETFE)共聚物组成的材料。14.权利要求12或13的容器，是注射器、安瓿、卡氏瓶或灌注容器。15.权利要求14的注射器或安瓿，其中存在的液体制剂的浓度，以G-CSF的浓度计，为0.5ml中0.3mg或0.8ml中0.48mg。16.用于G-CSF的肠胃外给药的试剂盒，包含权利要求12到15任何一项的容器，以及用于储存和/或给药的说明书。17.权利要求16的试剂盒，其中G-CSF的给药以5到30yg/kg体重的剂量提供。18.权利要求16或17的试剂盒，其中在所述试剂盒中提供5个注射器或安瓿。19.权利要求16到18任何一项的试剂盒，其中分别提供了用于注射器和注射和/或灌注针头的安全隔舱。20.权利要求16到19任何一项的试剂盒，其中打算储存在5°C。全文摘要提供了长时间稳定并基本上不含赋形剂的G-CSF液体药物制剂，以及含有这种制剂的即用型注射器和相应的试剂盒。文档编号A61K38/19GK101795670SQ200880105177公开日2010年8月4日申请日期2008年8月27日优先权日2007年8月27日发明者沃尔特·因德雷尔,海因茨·卢贝瑙申请人:百奥杰诺瑞克斯股份有限公司