专利名称：：抗微生物构建体的制作方法抗微生物构建体对相关申请的交叉参考本申请要求于2007年7月16日提交的美国临时专利申请号60/950，080的益处。关于联邦资助的研究或开发的声明本发明是由全国卫生研究所在基金号为1R43DK072560-01的美国政府支持下进行的。政府在本发明中具有特定的权利。
背景技术：
：1.本领域中已知的问题生物材料工程的进展已经在心血管医药和手术、整形外科、眼科和牙科中产生许多高度显著和成功的技术。尽管生物材料的应用已经改善了数百万人的生活质量，但是仍存在与当前可用的材料相关的血液凝聚、纤维化、感染、炎症反应、降解和排斥的问题。其中，控制与材料的生物学相互作用对于设计永久以及再吸收的植入物、细胞和组织构架、和诊断探针是非常重要的。控制材料和细菌之间的相互作用的能力尤其重要。医学装置中所用的大部分材料易受细菌黏附的影响。一旦细菌黏附到固体表面上，它们产生且变得包埋在多糖基质内以形成生物膜(biofilm)，在其中它们非常难以消灭。由于穿过生物膜基质和/或灭活的困难性，宿主免疫系统和抗微生物剂均对细菌较不有效。另外，生物膜中的细菌具有更大的发展针对抗微生物剂的抗性的能力。为了减少由于装置相关的感染引起的发病率和死亡率，防止生物膜形成是关键的。导管通常植入在血流、尿道、胸、颈、腹部、腿和脊髓中，且它们特别容易受可能在植入的数小时内开始的微生物感染、血液凝结、和闭塞的影响。估计1/3的导管由于感染而失效，且约1/3由于闭塞导管的血纤蛋白形成而失效。在每种情形中，目前最有效的治疗是用相似的装置替换。植入物相关的感染可以导致全身感染，其在最坏的病例情形中，可能导致多器官衰竭和死亡，尽管成功解决了最初的医学病症。这样的感染的成本是巨大的。例如，已经预计中心静脉导管相关的菌血症的单次事件花费为$3，700-S50,000,由此引起的死亡率为4-35%。在美国每年使用约三百万中心静脉导管，并且在多于200，000名患者中发生导管相关的血流感染(CR-BSI)，多于80，000例是发生在加护病房(ICU)中。仅ICU感染成本就为两亿九百六十万美元至二十三亿美元，每年2，400-20，000例死亡。感染也是透析患者的主要问题。仅在美国，多于450，000人患有晚期肾衰竭，并且需要长期的血液透析。对于这些患者，血管进入过程是发病率和死亡率的主要原因。AV植入物在约42%的患者中使用，感染率为11-20%。由于这些植入物感染引起的死亡率为12-22%。已经评价了一些导管改进方法，评价它们减少导管相关的血流感染(CR-BSI)发生的能力。所述方法可以分成两类。在一类中，改良表面以防止细菌黏附。这些方法中的许多包括通过空间排斥最小化吸附和黏附和/或最小化界面能。在导管的情形中，蛋白吸附，特别是凝血因子I吸附，通常引起血栓形成或发展血纤蛋白鞘和最终的闭塞。血栓的一些蛋白成分增加细菌对导管的黏附，且与血栓形成和CR-BSI存在相关性。在疏水材料的表面，熵驱动的、疏水性相互作用主导蛋白吸附，且多个研究小组已经表明用PEO植入的表面显著较不倾向于吸附和黏附。尽管亲水性涂层已经表现出减少细菌黏附，但是感染问题仍然发生。在第二类中，改良表面或装置材料浸透活性主动或防止细菌生长的试剂。已经表明适合该类的两种商购短期导管减少感染率，一种是氯己定-银磺胺嘧啶-浸透的(CSI)，另一种是米诺环素-利福平浸透的(MRI)。然而，这些产品引起发展耐药性细菌的显著风险。该风险对于杀菌的CSI导管较低，但是在体外研究中已经发现暴露于氯己定可能导致细菌对其和其它治疗抗微生物剂的增加的耐受性。此外，如果需要在原位长于三周，CSI就无效了，其比MRI较不有效，并且在日本已经报道过与这些导管的使用相关的严重过敏反应。尽管抗微生物导管比标准导管成本更高，但是研究已经表明，由于治疗CR-BSI的高成本，在高危患者中使用它们具有整体的成本益处。抗微生物导管的附加成本为每个导管$25-$34，但是对于CSI，每个导管的整体成本益处为约$200。基于成本益处和改进的患者护理，对于使用抗微生物导管存在强烈的动力。然而，这些产生加重发展抗性细菌的非常严重的风险，且目前仅推荐在高危患者中使用(在I⑶中，在完全父母营养，或免疫抑制的)。不幸的是，这些目前已知的技术尚未解决本领域的需要。相反，所需要的是这样的材料改良(1)其在与装置接触时杀死细菌，以致抗菌剂不必释放到血流或周围组织中，(2)其是生物相容的，且在直接与患者连接时，将不会不利地影响患者，(3)其可以易于涂抹到各种材料和不规则形状的物体上，⑷其防止血栓形成和闭塞，且(5)其不刺激在细菌中引起抗性的变化，并且因此可以在不影响临床抗生素的效用的条件下广泛使用。2.目前已知的嵌段共聚物已经开发了不同类型的使用PLURONIC的表面活性剂的技术。PLURONIC的表面活性剂通常为水溶性高分子量聚氧化烯醚化合物。这些嵌段共聚物化合物已经用来在界面上固定生物活性实体，取得了良好的成功。这些方法利用三嵌段共聚物(聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷)，其已在聚环氧乙烷链的末端进行修饰，以允许偶联到生物分子上。这些修饰的共聚物通常称为末端基团活化的聚合物或“EGAP”。关于这些类型的产品已经提交了许多专利和专利申请，包括美国专利号6，087，452，美国专利号6，284，503，美国专利号6，670，199，美国专利申请公布号2004/0219541，美国专利申请公布号2004/0142011，美国专利申请公布号2005/0244456和美国专利申请公布号2005/0106208(所述专利/申请通过引用清楚地结合于本文中)。因此，对于关于这些产品的其它信息，读者应该参考这些专利。EGAP分子在来自水性溶液的疏水材料上自我装配。这些疏水性聚环氧丙烷(“ΡΡ0”)中心嵌段与所述材料形成强疏水键，而聚环氧乙烷(“ΡΕ0”)末端嵌段保持在流体相中自由移动。使用该方法，在材料表面形成厚的PEO刷样层，其作用为两个重要的目的。第一，所述PEO层作用为肽和基底之间的衬垫，防止可能另外由于表面相互作用导致的任何对肽的变性，且保持肽的移动性。第二，所述PEO层防止对所述表面在随后的应用中可能暴露于其的蛋白或细胞的非特异性吸附。先前的研究已经表明，EGAP技术比其它基于PEO的索链技术具有优点其通过浸涂技术非常简单地涂覆到材料上，其可以涂覆到各种不同类型的材料和不规则形状的物体上，并且其提供系统性改变蛋白表面浓度的机制。由于不同的应用所需要的不同机械性、电、和光学特性，医学装置、植入物、和组织工程支架由多种不同的材料类型制备。对于给定的应用表现出最佳堆积(bulk)性能的大部分材料不具有足够的生物相容性。对材料进行提高生物相容性的直接的化学修饰是复杂的，且可能改变材料特性。在一些情形中，基于材料类型或不规则的物体形状，直接的化学修饰是不可行的。直接将生物分子吸附在所述表面上通常导致该生物分子的变性。EGAP技术为这些挑战提供简单而通用的解决方案，因为它可以通过简单的浸涂方法应用到多种不同的材料上，并且可以用来固定蛋白和肽并保留活性。3.抗微牛物肽关于杀死或减缓微生物如细菌、真菌、病毒、或寄生虫的生长的抗微生物肽，已经进行了其它的研究。已经研究的抗微生物肽包括防卫素、杀菌肽、细菌素、和其它天然或合成的阳离子肽。羊毛硫抗生素是一类细菌素。它们包括抗微生物肽乳链菌肽，并且是包括一个或多个羊毛硫氨酸环的抗生素化合物。目前已知四十多种羊毛硫抗生素，并且每年发现更多种。还正在开发具有提高的活性或稳定性的抗微生物肽类似物[1]。羊毛硫抗生素的独特的物理结构，(例如，双键，硫醚环，和不常见的氨基酸残基)，使得这些抗微生物肽是高度反应性的，并且与传统抗生素的作用模式不同。这表明它们可以保持有效，而不管抗性细菌菌株的世界性增加。羊毛硫抗生素还在它们的抑制谱中表现出广泛的可变性。一些羊毛硫抗生素，(例如，乳链菌肽和枯草菌素)针对革兰氏-阳性细菌有活性，而另一些羊毛硫抗生素(例如，肉桂霉素)仅针对革兰氏-阴性杆菌有活性。另外，一些羊毛硫抗生素具有抗病毒活性，(例如，羊毛硫肽)，一些作用为免疫抑制剂，(例如，mersacidin)，并且一些(例如，耐久霉素和血管紧张肽转化酶抑制肽)可以抑制生物医学重要的酶。乳链菌肽的结构示意性地显示在图1中，乳链菌肽是目前为止关于生物材料应用最广泛研究的羊毛硫抗生素。具体地，图1显示N端结构域(残基1-19)包括标记为A、B和C的三个羊毛硫氨酸环。图1还显示，C端结构域(残基23-34)包括两个羊毛硫氨酸环，表示为D和E。另外，图1显示柔软的铰链区(残基20-22)连接这两个结构域。(在图1中，Abu是指2-氨基丁酸；Dha是指脱氢丙氨酸；Dhb是指脱氢丁酸甘油酯；Ala-S-Ala是指羊毛硫氨酸；且Abu-S-Ala是指β-甲基羊毛硫氨酸)。乳链菌肽作为有效和安全的食品防腐剂已经具有长久的历史。已经表明，乳链菌肽可以吸附到合成的表面上，保持活性，并且杀死已在体外附着的细胞。尽管乳链菌肽已经表现出仅针对革兰氏-阳性细菌的活性，但是，当与其它化合物如螯合剂组合使用时，它可以是某些革兰氏-阴性细菌的有效抑制剂。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)是最常遇到的生物材料相关的病原体，并且二者均为革兰氏-阳性细菌。乳链菌肽已经表现出在体外防止微生物黏附在气管内吸引导管上(使用金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，和屎肠球菌(Enterococcusfaecalis)(屎链球菌(Streptococcusfaecalis))作为指示生物)，这促进在体内评估绵羊中的乳链菌肽-处理的静脉内(IV)导管和小马中的气管切开管的进一步研究。用乳链菌肽预处理的用于长期(7天)放置的导管不保留抗微生物活性，而短期(3-5小时)IV导管保留。在IV导管上乳链菌肽活性的准确持续时间尚是未知的。在实验期间，对绵羊的临床检查没有异常，并且在每组中没有动物发展导管-相关的感染或静脉血栓。与对照相比，使用短期导管的静脉还表现出较少且较不严重的组织学异常，这表明对血管内皮的可能的保护作用。作为乳链菌肽_处理的植入材料的最初的临床前试验，该研究代表开发用于植入医学装置的蛋白抗微生物膜的重要一步。羊毛硫抗生素具有许多使得它们有效用于生物医学应用的特点。与典型的肽不同，羊毛硫抗生素包含具有亲电子中心的脱水氨基酸残基，其容易与亲核基团如细菌DNA和酶起反应。与二硫键相比，在所有羊毛硫抗生素中存在的硫醚环使得该分子更加热稳定，更加不受还原剂的影响，且更不与自由基反应。羊毛硫抗生素可以提供防止产生抗性微生物的手段，且由于它们的作用机制与传统临床抗生素的作用机制如此不相似，以致交叉抗性是高度不可能的。存在这样一些报道，重复暴露于乳链菌肽可能在细菌中导致可能赋予其一些弱抗性的变化。然而，与它们的非抗性对应物相比较，发生的变化似乎还使得细菌较弱，并且对抗生素或免疫反应更敏感。多年来，乳链菌肽已被广泛大量地用在食品产品中，没有由于抗性的发展而产生的问题。存在一些不同的机制，通过这些机制羊毛硫抗生素发挥实施它们的抗微生物作用。A型羊毛硫抗生素(如乳链菌肽)是强阳离子线性分子。它们是高度表面活性的，且通过使得细胞的磷脂双层不稳定且产生瞬时的孔的多步步骤杀死敏感细菌。通过离子和细胞质溶质如氨基酸和核苷酸的流出、和随后膜电势的耗散而快速杀死靶向的细菌。细胞质膜的去极化导致所有生物合成过程的立即终止。结构分析已经表明，乳链菌肽的亲水基团与磷脂头基团相互作用，且疏水侧链包埋在膜的疏水核中。“楔形”孔形成模型考虑这些数据，但是提议肽插入到膜中，而不失去与膜表面的相互作用，这导致形成短期限(即，持续数毫秒至数秒)的孔。在该楔形模型中，提议孔形成由脂双层的局部扰动引起，由此肽的疏水残基浅浅插入到脂双层的外部小叶中。另一方面，“桶-板”模型提议乳链菌肽作为单体结合且插入到脂双层中。然后，所插入的单体横向聚集形成孔。在存在许多关于细胞表面因子的参与、孔的寿命、和孔形成需要的分子数目的问题的时候，提议这些模型的任一种。这些尚未完全得到解答，但是最近的研究已经揭示细胞壁前体“脂质II”在孔形成中的重要性，和乳链菌肽分子的特定片段在孔形成中的功能重要性。发明简述本发明产生结合蛋白抗性成分和活性抗微生物剂成分的表面、凝胶、泡沫、溶液和其它产品。还包括生产表面活性、抗菌的化合物。所述蛋白抗性成分是包含一个或多个亲水结构域和至少一个疏水结构域的共聚物，如PLURONIC表面活性剂。所述蛋白抗性成分可以包括末端基团活化的聚合物(EGAP)，其中在所述聚合物上的末端基团活化位点提供必要的连接，以偶联抗微生物成分，如羊毛硫抗生素。然后，抗微生物剂成分，如乳链菌肽或另一种羊毛硫抗生素，链接到EGAP中，并且加入到产品中，以产生抗菌表面。该方法还可以用来将具有有限特性的来自相对较小的实体的抗微生物化合物转化成具有可能增强吸附、清除和可溶性的潜力的两亲性、表面活性特性的抗微生物化合物。这一新方法解决了现有方法的问题，且提供下述重要的优点(1)它结合天然抗菌成分，以杀死细菌或其它微生物，其中所述成分不可能刺激细菌抗性，(2)它组合将帮助防止血纤蛋白形成和闭塞的表面特性，(3)它是生物相容性的，且可以与组织直接接界，(4)它可以容易地应用于各种材料和不规则形状的物体，(5)基于在实例中提供的出乎意料的结果，PEO链，在抑制自发洗脱以及包埋的肽与血液蛋白的交换的同时，还赋予针对构象重排的某种程度的稳定性，认为其转化成提高的活性保持性，和(5)通过利用天然的、备选的抗生素，它不产生降低有限形式的临床抗生素的功效的危险。这些优点将允许更广泛的应用、增加的安全性、和降低的医药成本。本发明是基于这样的认识，即，通过以形成柔性的索链(tether)和/或包埋肽的方式，连接肽与嵌段共聚物，如PLURONICF108或EGAP，可以使已知的具有抗微生物活性的肽如乳链菌肽形成持续长久的抗微生物表面涂层、添加剂、凝胶或泡沫剂。所包埋的肽通过从包埋物早期释放而提供抗微生物作用，而索链化的肽提供持续更长久的抗微生物保护作用。一个实施方案是一类具有下式的化合物<image>imageseeoriginaldocumentpage8</image>其中所述共聚物包括一个或多个亲水结构域和至少一个疏水结构域。本发明所形成的新型的抗微生物产品将具有多种不同的应用和用途。具体地，所述抗微生物产品可以被涂覆/吸附到基底上，以致所述嵌段共聚物将附着到所述基底上。(在本领域中，这些嵌段共聚物粘附到所述基底的表面的方式是已知的)。因此，一旦被涂覆，所述基底将在其表面上具有抗微生物涂层。在一些实施方案中，这种基底将是可以插入到患者中的医学装置。医学装置是任何类型的医学装置，包括导管等，其可以插入到患者中，或其可以用于身体外治疗。在另一些实施方案中，所述基底可以是将由患者摄取的食品包装材料或食品产品。由于联邦药物管理局(FDA)已经核准乳链菌肽和其它羊毛硫抗生素在食品工业中的应用，该食品产品对于消费是安全的，但是将保留其抗菌特性。在其它实施方案中，按照本发明形成的抗微生物产品将放置在乳膏剂、泡沫、粉末、或凝胶中，由此产生可以应用到皮肤、伤口、手术部位或应用到基底/产品表面等的局部抗微生物产品。在一些实施方案中，具有抗微生物涂层的基底将以两步方法形成。在第一步中，基底将暴露(例如，浸渍)在包含嵌段共聚物、末端基团活化的嵌段共聚物、或两种的混合物的溶液中，持续足以使得所述嵌段共聚物或末端基团活化的嵌段共聚物吸附/结合到基底表面的时间。第二步将包括将嵌段共聚物包被的基底暴露(例如，浸渍)在包含抗微生物肽或该肽的官能化形式的溶液中，持续足以使该肽与所述嵌段共聚物结合的时间。附图简述下述描述可以依据几幅附图进行更好地理解，其中图1示意性举例说明乳链菌肽结构的代表性实施方案；图2包含描述在未用PLURONICF108,EGAP-NTA,乳链菌肽，F108+乳链菌肽，或乳链菌肽+NTA涂覆或用其涂覆的IV导管上细菌生长和附着的实验结果的图；图3包含描述在用乳链菌肽，F108-乳链菌肽，或EGAP+乳链菌肽涂覆且还暴露于标准的细菌溶液中1天然后再用新鲜细菌刺激3或7天的基底上细菌生长和附着的实验结果的图；图4包含描述在仅用乳链菌肽，F108+乳链菌肽，或EGAP+乳链菌肽涂覆的基底上细菌附着和生长的实验结果的图；对照包括未涂覆的聚苯乙烯和仅用MRS肉汤处理的未涂覆的聚苯乙烯；所述基底还暴露于标准细菌溶液1天，然后是MRS肉汤3或7天；图5包含描述与乳链菌肽接触且在马血清中温育7天的微球体的抗微生物活性的实验结果；图6包含描述在裸露的疏水和F108-涂覆的表面上乳链菌肽吸附和洗脱动力学的比较的实验结果；图7包含描述在已通过疏水缔合、和通过共价附着用F108涂覆的疏水表面上记录的乳链菌肽吸附和洗脱动力学的实验结果；图8包含在SATA交联的各个阶段乳链菌肽的抗菌活性的实验结果；图9举例说明连接乳链菌肽与嵌段共聚物的代表性方式；图10包含所提议的通过索链化乳链菌肽形成脂质II-介导的孔的模型的示例；图11包含显示EGAP-乳链菌肽共聚物和对照的抗细菌活性的实验结果；图12包含显示包含乳链菌肽的嵌段聚合物和对照在DTT处理之后的抗菌活性的实验结果；图13A包含显示在存在MRS肉汤的条件下24小时，在涂覆和未涂覆的PU管上细菌黏附的实验结果；图13B包含显示在聚氨基甲酸酯表面上对乳链菌肽涂覆和乳链菌肽结合共聚物的细菌黏附之间的比较的实验结果；图14包含显示在存在MRS肉汤的条件下3天，在聚氨基甲酸酯管上的细菌黏附的实验结果；图15包含显示在与乳链菌肽接触且在25%马血清中温育后导管片段保持的抗微生物活性的实验结果；图16包含显示关于PLURONICF108涂层的稳定性的辐射作用的实验结果；图17包含显示在裸露的疏水和PLURONICF108-涂覆的表面上由乳链菌肽展现的连续吸附和洗脱动力学的实验结果。在第一个吸附周期过程中记录的数据覆盖在第二个吸附周期上，以比较以相同初始质量密度但是在不同的形成历史后记录的吸附速率；图18显示在不含纳米颗粒的溶液中温育2小时和1周的乳链菌肽的CD光谱。乳链菌肽浓度是0.5mg/mL。“lx”是指0.85mg/mL的PEG浓度或2.08mg/mL的F108浓度；“5x，，是指4.25mg/mL的PEG浓度或10.4mg/mL的F108浓度；图19A和19B显示与F108-涂覆和未涂覆的疏水硅石纳米颗粒接触且在25°C在IOmM磷酸钠缓冲液(pH7)中温育(a)4小时(图19A)、和(b)1周(图19B)的乳链菌肽的⑶光谱。乳链菌肽浓度为0.5mg/mL；和图20A和20B显示与(a)未涂覆的疏水硅石纳米颗粒(图20A)；和(b)F108_涂覆的硅石纳米颗粒(图20B)接触的乳链菌肽的CD光谱。每种情形下温育时间为4小时。乳链菌肽浓度为0.5mg/mL。“lx”是指2.19mg/mL的纳米颗粒浓度和1.35mg/mL的F108浓度(图20B)；“5x”是指11.Omg/mL的纳米颗粒浓度和6.75mg/mL的F108浓度(图20B)；综合下述描述，附图可以辅助表明和解释所述方法和组合物的原理。发明详述将通过本文的描述更好地理解本发明目前优选的实施方案。应该易于理解，本发明的成分、特征和结构，如概述那样，可以以宽范的不同的构型进行排列和设计。因此，下述本发明实施方案的更详细描述不易于限制所要求的本发明的范围，但是仅代表本发明目前优选的实施方案。本发明涉及以形成柔性的索链和/或包埋肽的方式组合抗微生物肽与嵌段共聚物和/或末端基团活化的嵌段共聚物。所述肽通过从包埋物早释放而提供抗微生物作用，且通过索链化的肽获得持续长久的活性。一个实施方案包括与抗微生物肽连接的共聚物的构建体，其具有下式抗微生物肽-共聚物另一个实施方案组合抗微生物肽与未修饰的共聚物，其中所述肽由所述共聚物的聚合物链物理包埋。另一个实施方案组合抗微生物-共聚物构建体与未修饰的共聚物和/或抗微生物肽，其中所述肽由所述聚合物的聚合物链物理包埋。另一个实施方案组合抗微生物_共聚物构建体与末端基团活化的共聚物，其中所述末端基团活化位点是金属螯合基团，诸如氨三乙酸基团。在该实施方案中，可以添加另外的抗微生物肽，其中所述肽由所述共聚物的聚合物链通过物理包埋暂时保留。在优选实施方案中所用的共聚物包含一个或多个亲水嵌段和至少一个疏水嵌段。用于形成优选实施方案的共聚物涂层的优选的共聚物单元包括，但不限于，聚环氧乙烷(PEO)和聚环氧丙烷(PPO)，PEO和聚环氧丁烷，PEO和聚丁二烯，PEO和聚(N-乙酰乙烯亚胺)，PEO和苯基硼酸，PEO和聚氨基甲酸酯，PEO和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，PEO和聚(ε-己内酯)，PEO和聚丙交酯酸，PEO和聚(丙交酯-共_乙交酯)，PEO和聚二甲亚砜，聚磷酸酯(PPE)和聚环氧丙烷(PPO)，PPE和聚环氧丁烷，PPE和聚丁二烯，PPE和聚(N-乙酰乙烯亚胺)，ΡΡΕ和苯基硼酸，PPE和聚氨基甲酸酯，PPE和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，PPE和聚(ε-己内酯)，PPE和聚丙交酯酸，PPE和聚(丙交酯-共_乙交酯)与PPE和聚二甲亚砜。在前述共聚物单元对中，优选地，亲水结构域包括ΡΕ0。先前已经描述了使用这种类型的共聚物单元的共聚物以及它们涂敷材料以防止蛋白吸附的应用[2；3；4；5；6；7；8；9；10]。在特定实施方案中，所述共聚物包括悬垂或摇摆亲水结构域，如聚(环氧乙烷)(PEO)链。所述共聚物的其它结构域(s)包括疏水结构域，如聚(环氧丙烷)(PPO)链。另夕卜，在某些实施方案中，连接基团(R)附着在共聚物邻近亲水结构域的一个末端，以形成末端基团活化的聚合物。例如，所述末端基团活化的聚合物可以采用PEO和PPO嵌段的任何排列，其具有通式(R-PEO)a(PPO)b(1)其中a和b是整数，是相同的或不同的，且至少为1，优选地a为1_6，且b为1-3，更优选地a是1-2，且b是1。所述聚合的嵌段共聚物具有IOwt%-SOwt%，优选50wt%-80wt%，更优选70wt%PEO(-C2H4-O-)含量。所述PEO链或嵌段为下述通式-(-C2H4-O-)u(2)其中对于该分子中的不同PEO嵌段，u是相同的或不同的。典型地，u大于50，优选为50-150，更优选为80-130。PPO嵌段为下述通式-(-C3H6-O-)v(3)其中对于该分子中的不同PPO嵌段，ν可以是相同的或不同的。典型地，ν大于25，优选为25-75，更优选为30-60。所述共聚物可以是支链结构，且包括其它结构(例如，桥接结构，或分支结构)和取代基，其不实质性影响所述共聚物吸附在其上和覆盖疏水表面的能力。实例包括在下述段落中所述的下述共聚物。在另一个实施方案中，优选实施方案的末端基团活化的聚合物是具有悬垂R基团的聚合的三-嵌段共聚物的衍生物，如在下述式(4)中。例如，这些三-嵌段共聚物具有聚环氧丙烷的疏水中心嵌段和具有末端R基团的聚环氧乙烷的亲水末端嵌段，并且可以由下式表不<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>其中y为25-75，优选为30-60，且χ和ζ优选是相同的，但是可以是不同的，且为50-150，优选为80-130。某些类型的聚合物表面活性剂在商业上称为"PLURONIC"或〃P0L0XAMERS"，且是可获得的，例如，从BASF获得。另一类合适的聚合的嵌段共聚物是二_嵌段共聚物，其中a=1和b=1，且可以由下式表示R-PEO-PPO-H(5)其中PEO和PPO为上文所定义。另一类合适的聚合的嵌段共聚物由商购的TETR0NIC表面活性剂(购自BSAF)所代表，其由下式表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>当用于本文时，术语EGAP或EGAPs是指化学方程式(1)中定义的嵌段共聚物，其包括如定义的末端基团活化形式的PLURONICS三_嵌段共聚物表面活性剂、二_嵌段表面活性剂、TETRONIC表面活性剂、以及其它嵌段共聚物表面活性剂。如先前所公开的，特定官能团附着到亲水结构域的游离末端，以形成末端基团活化的聚合物。所述特定官能团(R)可以包含反应基成员，如对-硝基苯酚基团，N-羟基琥珀酰亚胺基团，胼基团，马来酰亚胺基团，硫代吡啶基，酪氨酰残基，乙烯砜基团，碘乙酰亚胺基团，二硫化物基团或任何其它适于与抗微生物肽或衍生的抗微生物肽反应的反应基。在某些实施方案中，所述反应基还选自已知在水性环境中稳定的官能团，如胼基团，马来酰亚胺基团，硫代吡啶基团，酪氨酰残基，乙烯砜基团，碘乙酰亚胺基团，二硫化物基团。R还可以包括能够与蛋白形成离子相互作用的官能团，例如氨三乙酸(NTA)基团，其在与金属离子结合时，与组氨酸标记的肽形成强键合，或者在不存在金属离子的条件下，可以结合带正电荷的肽。NTA修饰的PLUR0NICS记述在Steward等的美国专利号6，987，452中，其通过引用结合于此。R还可以包括可以结合寡核苷酸标记的蛋白的寡核苷酸。寡核苷酸修饰的PLUR0NICS记述在Neff等的国际公开号W002/077159中，其通过引用结合于此。在一个优选的实施方案中，所述R基团包括R’-S-S基团，其中R’被取代以用于固定抗微生物肽。在一个实施方案中，取代基R’可以选自由下列各项组成的组(1)2-苯并噻唑基，(2)5-硝基-2-吡啶基，(3)2-吡啶基，(4)4-吡啶基，(5)5-羧基-2-吡啶基，和(6)(2)至(5)任一项的N-氧化物。优选的末端基团包括2-吡啶基二硫化物(PDS)。这些基团与蛋白和多肽的反应性在Carlsson等的美国专利号4，149，003和Axen等的美国专利号4，711，951中讨论，所有这些通过引用结合于此。如上文提及，末端基团活化的聚合物(EGAP)s通常是一类包括嵌段共聚物骨架和活性或反应性基团的合成物。优选实施方案包括使用共聚物_抗微生物构建体和/或共聚物与抗微生物肽的组合来抑制细菌和/或其它微生物剂如病毒和真菌的生长或存活力。在优选实施方案中，用来形成所述共聚物-抗微生物构建体或与共聚物组合的所述抗微生物剂可以选自下组杀死或减缓微生物如细菌、真菌、病毒、或寄生虫的生长的肽，其包括防御素，杀菌肽，细菌素，以及其它天然的或合成的阳离子肽。优选的肽组是羊毛硫抗生素，其是一类细菌素，且包括乳链菌肽，枯草菌素，肉桂霉素，羊毛硫肽，mersacidin，耐久霉素和血管紧张肽转化酶抑制肽。本申请集中在抗微生物肽如乳链菌肽(和衍生物)与嵌段共聚物组合用于产生抗微生物材料的应用。所述材料可以应用到疏水表面上，以产生抗微生物表面。所述产品还可以用来形成凝胶、泡沫、乳剂等，或添加到凝胶、泡沫、乳剂等中。本领域的技术人员应该认识到其它类型的抗微生物肽也可以用来与乳链菌肽组合和/或取代乳链菌肽。在特定实施方案中，使用EGAP材料，可以将多于一种抗微生物肽固定在一个表面上。Caldwell和他人先前已经描述了EGAP用于蛋白固定的应用。然而，Caldwell和他人使用EGAP制备这样的表面，目的是评估或促进特定蛋白_蛋白相互作用和细胞对表面的黏附[11；12；13；14；15]。羊毛硫抗生素可从多种不同来源获得。例如，生产乳链菌肽的乳酸乳球菌菌株(Lactococcuslactis)可从Jos印hMcGuire博士在美国俄勒冈州Corvallis的俄勒冈州州立大学管理的实验室获得。用于这种产物的有效的纯化方法包括通过疏水相互作用层析处理不含细胞的上清，然后使用水性乙腈和0.三氟乙酸作为洗脱剂进行反相HPLCjB别处所述。通过离心、PH调节和膜过滤，获得用于该目的的培养物上清(在30°C在MRS肉汤中生长24小时后)。通常，羊毛硫抗生素的生产和纯化充分记录在文献中，包括发酵培养基的增强(例如，补充磷酸、丝氨酸、和苏氨酸，偶联广谱蛋白酶抑制剂)以提高产量。乳链菌肽也是商业可获得的。例如，NISAPLIN(其由美国密苏里州圣路易斯的SIGMA-ALDRICH公司(西格玛-奥德里奇公司)销售)可作为食品级的防腐剂获得，具有下述组成乳链菌肽(2.5%)；NaCl(77.5%)；蛋白(主要是变性的乳蛋白，12%)；碳水化合物(6%)；水(2%)。抗微生物肽与嵌段共聚物的偶联可以使用多种方法实现。如本文所解释的，羊毛硫抗生素可以通过二硫键连接附着在末端基团活化的嵌段共聚物上。因此，可以修饰羊毛硫抗生素以包括巯基，以致可以进行这种二硫键连接。关于乳链菌肽，这种修饰可以通过向乳链菌肽肽的N-端异亮氨酸化学引入巯基而发生。本领域的技术人员应该认识到，在其它抗微生物肽中，可以对肽的N-端胺或其它胺进行类似的修饰，例如，在赖氨酸残基上。所述嵌段共聚物还包含活化的末端基团，其中PEO基团的一个或多个羟基末端基团已用吡啶基二硫化物结构部分取代。因此，然后，通过使乳链菌肽的巯基键合(通过二硫键连接)到嵌段共聚物的吡啶二硫化物结构部分，可以将硫醇化的乳链菌肽与嵌段共聚物连接。另一种方法包括使用重组蛋白工程技术，来引入可以用来键合抗微生物肽与EGAP的结构部分。例如，可以产生重组形式的乳链菌肽，其包含C-端或η-端半胱氨酸残基。在一些情形中，半胱氨酸残基可以通过甘氨酸间隔体与肽的天然序列分开。因此，然后，可以将以半胱氨酸为末端的肽通过二硫化物交换而连接到吡啶基二硫化物活化的嵌段共聚物中。另一种方法包括选择能够直接与天然形式的乳链菌肽反应的末端基团活化的共聚物形式。该方法可以通过使对硝基苯酚活化的共聚物或N-羟基琥珀酰亚胺活化的共聚物与乳链菌肽的N-端胺反应而实现。另一种方法包括重组加工产生具有末端组氨酸标记的肽形式的乳链菌肽的生产。然后，在存在二价金属离子的条件下，可以通过非常强的离子相互作用将组氨酸标记的抗微生物肽连接到具有活化的末端基团的嵌段共聚物上，其中PEO基团的一个或多个羟基末端基团已用氨三乙酸基团取代。然后，可以通过层析或透析从任何未反应的乳链菌肽分离这些抗微生物构建体，并且可以用作针对细菌或其它微生物的抗微生物剂。可以使用用于引入巯基基团或其它反应基的其它方式和/或方法，且(部分)取决于所用的具体的羊毛硫抗生素。此外，关于可以引入到嵌段共聚物中的其它类型的活化的末端基团，可以向羊毛硫抗生素中添加其它修饰/化学基团，以确保这两种分子之间的偶联，这是本领域的技术人员所公知的。本文将提供关于键合和/或结合嵌段共聚物和羊毛硫抗生素的反应条件(例如，在所述嵌段共聚物和包含巯基的羊毛硫抗生素之间产生二硫键连接所需要的反应条件)的具体实例。然而，一旦已经形成该连接，将形成具有各种不同应用和用途的抗微生物产品。这些涂层还有效防止表面上的血栓形成。对于血管装置，血栓形成和抗细菌活性是存在的两种最重要的问题，并且这些问题通常联合出现。因此，下文给出本实施方案的涂层的一些可能的应用。例如，医学装置可以用这种抗细菌涂层涂覆，其包括药物递送泵，药物贮藏库，包封装置(用于细胞、药物、或生物制剂)，血管进入装置，经皮装置，神经刺激装置，神经干预装置，插管，缝合线和其它伤口闭合装置，分流的通管(shunt)，引流管，饲管，整形外科装置，牙科装置，体外循环装置和过滤装置，管道，装配(fittings)，Iuer锁紧套口，光学装置，和/或插入到患者体内或与身体或体液接触的其它医学装置。已经表明PLUR0NICS可以涂覆到某些细胞或组织上，例如，PLUR0NICS已经涂覆到红细胞上，以制备通用的血液捐赠供应。在组织产品上的这些EGAP-乳链菌肽或F108-乳链菌肽抗细菌涂层可以提供益处。一个实例是涂覆的心脏瓣膜。现在，细菌感染是与心脏瓣膜置换术相关的主要问题。因为此，在植入瓣膜之前，许多外科医生在手术室(“OR”)中将组织心脏瓣膜浸没在万古霉素溶液中。这是有问题的，因为(1)不存在一致性，(2)在手术室中它添加了步骤，(3)它产生发展针对万古霉素的细菌抗性的潜力，万古霉素是世界上最重要的临床抗生素中的一种，和(4)它不能使得在患者的结果方面，患者能够追踪确定将所述抗细菌剂应用到瓣膜上的实际益处。用EGAP-乳链菌肽预先涂覆的瓣膜是克服这些问题的优越产品。此外，所述涂层的PEO成分还可以提供关于减少瓣膜钙化的益处。这些益处还可以潜在地应用到多种其它类型的组织产品上。在另一些情形中，构建具有EGAP-乳链菌肽的涂层贮藏容器以⑴在不向产品添加抗生素的条件下，减少细菌感染的机会，(2)减少血液中或生物制剂中蛋白变性的程度(用于研究或药物应用)，和(3)减少由于由细菌释放的蛋白酶发生的蛋白降解。所述贮藏容器可以用于食品包装、血液袋、蛋白或药物。用于清洁医学装置的溶液，杀菌或消毒环境中的产品(items)，或食品制备装置/环境(清洁和短期保护)，也是所述抗细菌涂层的可能的应用。用于涂覆个人产品或工业产品的溶液是另一种类型潜在的应用。例如，用于体育运动的护口器、正牙装置(固定器(retainer)、牙垫(dentalmouthpieces)(护口器以防止牙齿咬紧))面罩或呼吸面具、橡皮奶头、隐形眼镜、成人用品、食品制备物表面、食品、食品包装、再使用水容器(如用于露营、运动水系统、水瓶等)、计算机键盘、电话、出租汽车方向盘(steeringwheel)、保健俱乐部装备、涡流温泉区(whirlpoolspas)、加湿器、装饰的喷泉、和热水箱均可以用本实施方案的产品涂覆，以提供抗微生物特性。旅馆、健身房或温泉中心的冷却塔、涡流温泉区或蒸汽浴、以及过滤装置和水线(特别是用于牙科门诊、透析中心、医院、和无菌或消毒制造业或包装区(例如，重组蛋白制备、生物制药制备或药物包装)的那些)。此外，由于PLURONICF108和乳链菌肽核准为食品添加剂，本实施方案可以用于食品工业，与其它方法相比较，如用醇洗涤，用漂白水漂洗或用肥皂洗涤，包含乳链菌肽的嵌段共聚物将提供持久的抗微生物活性。对于护牙合器(nightguards)和固定器，因为人们通常整夜佩戴这些产品，抗细菌涂层甚至可以帮助防止牙齿腐蚀。使用本发明的一种方法包括获得包括嵌段共聚物和乳链菌肽或EGAP-乳链菌肽构建体的干粉。使用者将所述干粉添加到水中，然后将需要的产品或表面温育在所述溶液中给定的时间阶段(所述时间阶段可能是30秒-30分钟)，并且然后用水漂洗。本实施方案还包括制备包含嵌段共聚物_乳链菌肽构建体或嵌段共聚物和乳链菌肽的混合物的溶液，使用者将产品浸没在其中某一时间段(例如，30秒-30分钟)，然后用水漂洗。伤口愈合凝胶是所述嵌段共聚物-乳链菌肽产品的另一种应用。例如，PLUR0NICS关于溶胶凝胶转换具有非常有用的特性。在特定浓度，特定的PLUR0NICS或PLUR0NICS混合物将形成胶态溶液或凝胶。疏水实体如乳链菌肽通常将截留在所述凝胶的所述胶态或聚合物结构的疏水核心内。所述凝胶是生物相容性的，且具有高水含量，因此它们将非常适合用于保护伤口。这些凝胶可以与生长因子组合，以促进愈合，同时提供对伤口的保护。这些凝胶可以与消炎剂组合，以防止瘢痕形成，同时提供对伤口的保护。所述凝胶将特别有用于糖尿病性溃疡和烧伤。泡沫清洁溶液也可以受益于包含所述抗微生物化合物。具体地，如果如本文教导那样修饰PLUR0NICS，这些化合物可以添加到清洁溶液中，以为所述产品提供抗微生物特性。此外，PLURONICS早先已经用来防止手术粘连。此外，如果这些PLUR0NICS如本文教导那样进行修饰，将获得抗菌特性。向牙膏或漱口剂中添加嵌段共聚物-乳链菌肽构建体可以提供持久的防牙齿腐蚀保护(取决于人们何时刷牙或使用漱口剂和吃饭，可能为1-10小时)。还应该注意，所述嵌段共聚物-抗微生物化合物还可以与金属螯合剂联合使用。具体地，一种或多种嵌段共聚物，而不包含抗微生物剂，可以另外在其末端包含金属螯合齐U。在美国专利号6，087，452(其已经通过引用结合于此)中教导了这些类型的金属螯合嵌段共聚物。当羊毛硫抗生素(乳链菌肽)与其它化合物如螯合剂组合使用时，对乳链菌肽和其它羊毛硫抗生素敏感的生物体(细菌)的谱可以拓宽至其它物种。一些螯合剂可以使细菌对羊毛硫抗生素和/或其它抗生素更敏感。抗菌嵌段共聚物和螯合剂的这种组合可以通过用EGAP-乳链菌肽和EGAP-NTA组合涂覆表面获得，其中NTA是强金属螯合剂，氨三乙酸。该方法的优点在于，所述金属螯合剂链接到基底上，因此不释放到周围环境中，其可能是血液或组织。在许多情形中，抗血栓形成和抗增殖功能，以及抗感染功能，是生物材料的理想特征。因此，在一些实施方案中，与金属螯合剂的组合可能是理想的。对于需要更长期的稳定性的某些应用，可能需要在涂覆过程中结合另外实用的步骤，以产生更长期稳定的层，如下文所述，所述层物理包埋或共价结合在表面上。先前已经描述的一种方法包括用硅烷预处理和随后的辐射以使EGAP共价结合到金属或玻璃基底上的应用。使用用十二烷基硫酸钠(SDS)严格洗涤的研究表明，该方法增加表面上的EGAP和PIAJRONIC涂层的稳定性，同时保留所述涂层的PEO成分的蛋白排斥益处。这种植入技术还易用于宽泛种类的生物材料，有机的和无机的。另一种方法包括使用共吸附的热或UV活化交联剂，如过氧化二枯基(DCP)，以通过交联所述共聚物和其下面的基底而产生更持久的涂层。他人已对DCP进行了研究，用于将PLUR0NICS结合在用于血袋材料的本体聚合物中，取得了良好的成功。另一种方法将包括在挤压或成型之前将所述EGAP-抗微生物构建体和制备装置的本体聚合物基质化(matrixing)。抗微生物嵌段共聚物可以依据多种不同的方法制备。例如，可以构建一些实施方案，其中基底表面首先用末端基团活化的嵌段共聚物涂覆。这可以通过将所述基底暴露(如通过浸渍)在所述末端基团活化的嵌段共聚物的溶液中进行。然后，在第二步，将所述基底表面暴露于(即，喷雾或浸渍)在抗微生物肽或衍生的抗微生物肽溶液中，持续足以使得所述肽与所述末端基团活化的共聚物共价键合的时间。在另一些实施方案中，所述抗微生物涂层可以首先通过将所述末端基团活化的嵌段共聚物与所述抗微生物肽或衍生的抗微生物肽反应而产生。取决于反应条件，后续处理步骤，和最终产品应用，纯化包含羊毛硫抗生素的嵌段共聚物的步骤可以或可以不是必需的。在已经形成包含羊毛硫抗生素的嵌段共聚物后，然后，将该产品的溶液应用到基底的表面上(通过将所述底物浸渍在溶液中，将包含羊毛硫抗生素的嵌段共聚物的溶液喷雾到表面的顶部，等等)。尽管本发明的许多讨论集中在共价连接羊毛硫抗生素和嵌段共聚物，其它研究已经表明，所述共价连接不是严格必需的。研究已经表明，当表面用PLURONICF108涂覆且用乳链菌肽温育时，PLURONIC:F108将所述乳链菌肽保留在表面上，并且随着洗涤缓慢将其释放。尽管不受该理论的限制，据信一些乳链菌肽临时包埋在该聚合物的PEO链中，且在乳链菌肽和PEO链之间可能存在促进包埋的特异性物理相互作用。此外，这样的层可以“防止”乳链菌肽与血液蛋白的可能的表面交换，且还可以帮助防止由于变性引起的活性损失。事实上，圆二色谱数据表明，与直接吸附的乳链菌肽相比较，PEO包埋的乳链菌肽保留更大的活性。所包埋的乳链菌肽随着时间(和通过洗涤)从所述嵌段共聚物缓慢释放。所包埋的乳链菌肽的这种缓慢释放为该表面提供抗菌特性，一旦所有的乳链菌肽都从所述表面释放且不再存在于装置的附近，将失去所述抗菌特性。因此，使用这一知识，对于某些应用，与仅用PLURONICF108(或其它嵌段共聚物)和乳链菌肽共价结合的乳链菌肽相比较，可以制备在相对短时间阶段具有抗菌活性的表面。这一方法还将需要更少的步骤和更少的试剂来将涂层应用到表面上，并且因此还将提供关于制备成本、时间和设备需求的优点。应该注意，PLURONIC包埋乳链菌肽的能力是高度出乎意料的，且与本领域中的常识相反。公知的是PEO抵抗蛋白相互作用，且已经表明PEO和PLURONICF108涂覆的表面防止蛋白吸附。因此，在申请人的研究之前，据信，除了在末端基团活化的PLURONICS上的反应位点之外，乳链菌肽不与PLURONIC相互作用。因此，乳链菌肽以除反应末端位点之外的位置包埋在PLURONIC:表面涂层中的发现是出乎意料的。其他研究已经表明，当使用UV或e-束辐射来将三嵌段共聚物“永久性”结合到表面上时，EGAP涂覆的基底可以具有比PLURONICF108涂覆的基底更好的蛋白排斥特性。尽管不受这一理论限制，可能的是，在聚合物本身或聚合物和表面之间的某种程度的交联(通过末端基团活性位点)导致更有效的蛋白排斥层。如果在表面上存在交联的网络，可能的是，与单独的F108相比较，该层可以作用为抗微生物剂更好的包埋层，并且将提高所述表面包埋抗微生物剂的能力。嵌段共聚物包埋乳链菌肽和其它羊毛硫抗生素的能力意指可以构建这样的实施方案，其具有大量包埋的羊毛硫抗生素和另外共价附着到嵌段共聚物上的一些羊毛硫抗生素。这些表面由所包埋的乳链菌肽(或其它抗微生物剂)提供早期释放和抗生素保护作用，以及由表面附着的乳链菌肽提供长久作用的保护作用。本领域的技术人员应该认识到，除了乳链菌肽之外，其它分子，包括肽、药物、治疗齐U、或其它生物化合物可以包埋在嵌段共聚物内。例如，可以进行这样的实施方案，其中肽、药物、DNA序列、SiRNA等可以包埋在嵌段共聚物中，并且然后缓慢释放。如果基底的表面是插入到人患者中的医学装置，可以理想地使这些化合物将所述化合物缓慢地释放到患者体内，因为它提供一种新的改进的方式将药物、治疗剂等引入到患者内。现在将提供关于已经使用乳链菌肽和/或一种或多种嵌段共聚物进行的制备和研究的非限制性实施例。如上文所述，本领域的技术人员应该认识到，除乳链菌肽之外，其它类型的羊毛硫抗生素可以以相同的方式反应。实施例1涂覆的IV导管的制备和分析基底涂层将IV导管(24GX3/4”，Terumo)在底部切割，然后在两端使用本生灯(Bunsenburner)热封。可用于研究的长度是1.9cm。如所示制备样品，η=4。对照(1.)没有细菌的样品，(2.)未涂覆的样品，(3.)消毒的磷酸缓冲液，IOmM,pH6.O(PB)处理的样品，(4.)F108(l%w/v)涂覆的，(5.)EGAP-NTA(l%w/v)涂覆的样品。(除1外，所有其它的均有细菌培养物)。研究中的样品乳链菌肽涂覆的，F108和乳链菌肽涂覆的与EGAP-NTA和乳链菌肽涂覆的。乳链菌肽浓度为0.5mg/ml。所有样品均用IXH2O漂洗，且将适当的样品在无菌水中w/v的溶液中用各自的聚合物涂覆过夜。然后，将用乳链菌肽进一步处理的样品和对照用PB漂洗3次。乳链菌肽制备将乳链菌肽溶解在磷酸二氢钾中。然后，加入磷酸氢二钾，以获得6.0的终pH和10mg/ml的浓度。然后，用0.2μm、低蛋白结合滤器过滤乳链菌肽储液，并且用PB稀释至需要的浓度。将乳链菌肽溶液加入到适当的样品中，并且涂覆过夜。然后，不管涂覆/处理形式，用PBS(20mMPB,150mMNaCl)将所有样品漂洗3次。细菌培养物和与样品的温育戊糖片球菌(PediococcusPentosaceus)FBB61-2，其为一种革兰氏阳性细菌，用作敏感指示菌株。将戊糖片球菌的甘油储液划线在琼脂平板上，并且在37°C培养箱中生长24小时。挑取单个细菌菌落，且接种在2个分开的在50ml聚苯乙烯管中的IOmlMRS(deMan,Rogosa和Sharpe)肉汤溶液的等分试样中。还仅用在表面上划线的环线制备对照平板，其已经进行了同细菌所需要的相同的灭菌步骤。对照也接种在IOmlMRS肉汤中。将对照和两份样品在摇动平板上以250rpm生长过夜。进行样品和对照的分光光度计分析，并且使用MRS肉汤稀释各份样品，以获得在600nm处0.1的吸光度。将来自两份稀释的细菌培养物样品和对照的Iml等分试样加入到在1.5ml聚苯乙烯管中的涂覆的样品中。生物膜分析在37°C在静态条件下，将细菌培养物与样品和对照温育24小时。取出培养物溶液，并且将所有样品用PBS漂洗3次，并置于新的、无菌的1.5ml聚苯乙烯管中。将ImlMRS肉汤加入到所有包含样品的管中，然后将所述样品超声处理25分钟。超声处理后，将样品置于37°C培养箱中。温育4小时后取出样品，并且置于4°C冰箱中，以延迟细菌生长。然而，在该时间点，发现在用和不用细菌处理的未涂覆的对照之间不存在测量上的差异。因此，将所有样品放回到37°C培养箱中，以在更长的时间阶段后进行研究。第二次温育的时间阶段持续14小时，之后，将样品置于4°C冰箱中，以延迟细菌生长。用空白溶液进行分光光度计分析，所述空白溶液是4°C的MRS肉汤。结果实施例1中的实验结果显示在图2中，并且表明较少的细菌附着和生长在用乳链菌肽、F108和乳链菌肽、或EGAP+NTA和乳链菌肽涂覆的基底上。具体地，图2举例说明戊糖片球菌在未涂覆的(PB处理的)，F108(F108涂覆的)、EGAP-NTA、乳链菌肽、F108+乳链菌肽、和EGAP-NTA加乳链菌肽(乳链菌肽+NTA)涂覆的聚氨基甲酸酯IV导管上的附着和生长。实施例2涂覆的基底的活性持续时间基底涂层在该实验中评估3个变量1.组合聚合物涂层和乳链菌肽的作用2.随时间用新鲜细菌培养物重复刺激表面相对于仅用细菌培育然后在MRS中培育的作用3.培育时间(3或7天)聚合物涂层将聚苯乙烯24孔板(无菌的、无组织培养物)(Falcon，BectonDickenson)用无菌diH20漂洗，并且在适当的孔中加入1%w/v无菌过滤的F108或EGAP-NTA溶液。将板放置在250rpm摇动器部件上过夜。乳链菌肽溶液制备将在0.1%三氟乙酸(TFA)中浓度为10mg/ml的乳链菌肽储液溶解在0.IM磷酸二氢钾、0.IM磷酸氢二钾、IOmMEDTA和diH20的溶液中，以获得pH6.8U00yg/ml的终浓度。乳链菌肽涂层将用乳链菌肽涂覆的孔用diH20漂洗3次，且向指定的孔中加入350μ1乳链菌肽溶液。将板置于250rpm的板摇动器上在黑暗条件下环境温度下过夜。细菌培养物制备将戊糖片球菌的甘油储液划线到两个琼脂平板上，并且在37°C培养箱中生长24小时。从两个琼脂平板的每一个上挑取单个菌落，并且接种到两份独立的在50ml聚苯乙烯管中的15mlMRS肉汤溶液等分试样中。还仅用划线在表面上的环线制备对照板，其已经进行了同细菌所需要的相同的灭菌步骤。对照也接种在15mlMRS肉汤中。将对照和两份样品在摇动板上以250rpm生长过夜。使用分光光度计测量戊糖片球菌培养物和对照的吸光度。用MRS肉汤稀释培养物，以获得在600nm处0.1的吸光度。以这种方式制备和稀释的细菌样品称为标准细菌溶液。在本实验中，在多个时间点，用新鲜的细菌处理一组样品。对于每个时间点，如上述制备新鲜的标准细菌溶液。样品处理用细菌进行的初始处理去除涂覆溶液，且向孔中加入350μ1标准细菌溶液的等分试样。对于特定的对照样品，加入MRS，而不是标准细菌溶液。次级处理-细菌在初始细菌处理后，去除先前的培养物，并且不漂洗，向样品孔中加入新鲜的标准细菌溶液。在指定的时间点，将细菌培养物从孔中去除，并且用Iml无菌diH20漂洗3次。然后，向孔中加入新鲜的MRS(350μ1)，并且温育24小时。从样品中去除肉汤，并且用新鲜的MRS肉汤稀释至1/10，1/20和1/40，并且在600nm处测量每份稀释液的吸光度。次级处理-MRS:在初始细菌处理后，去除细菌培养物，并且用无菌diH20(lml)漂洗3次。向这些孔中加入新鲜的MRS肉汤(350μ1)。在指定的时间点，将MRS肉汤从孔中去除，并且样品用diH20洗涤3次。然后，加入新鲜的MRS肉汤(350μ1)，并且与所述样品一起温育24小时。从样品中去除MRS肉汤，并且用新鲜的MRS肉汤稀释至1/10，1/20和1/40，并且在600nm处测量每份稀释液的吸光度。结果图3显示关于用细菌进行次级处理的样品的结果。特别地，如上述讨论那样，图3显示在暴露于标准细菌溶液1天然后用新鲜细菌再刺激3或7天的基底上戊糖片球菌的附着和生长。在图3中，仅用乳链菌肽涂覆的PS称为(乳链菌肽)，用F108和乳链菌肽涂覆的PS称为(F108+乳链菌肽)，和用EGAP-NTA和乳链菌肽涂覆的PS称为(EGAP+乳链菌肽)。图4显示关于用MRS进行次级处理的样品的结果。如所述，图4显示在暴露于标准细菌溶液1天然后是MRS肉汤3或7天的基底上戊糖片球菌的附着和生长。在图4中，仅用乳链菌肽涂覆的PS称为(乳链菌肽)，用F108和乳链菌肽涂覆的PS称为(F108+乳链菌肽)，和用EGAP-NTA和乳链菌肽涂覆的PS称为(EGAP+乳链菌肽)。未涂覆的聚苯乙烯(未处理的)和仅用MRS肉汤处理的未涂覆的聚苯乙烯(处理的无细菌)用作对照。对于对照样品，仅显示关于第3天时间点的数据。实施例3在存在血清的K牛下，乳链Ifjfe^^妊求体上射舌个牛在用马血清温育7天后，比较乳链菌肽涂覆的微球体的抗微生物活性与用PLURONICFlOS和乳链菌肽的组合涂覆的微球体的抗微生物活性。制备F108-涂覆的表面将聚苯乙烯微球体(1.247μm直径，PartNo.81002497100290,Seradyn)与F108(5mg/mL)混合，并且在磷酸缓冲液中在旋转器上温育过夜。F108分子的疏水PPO嵌段吸附在聚苯乙烯表面上，以致亲水PEO链延伸至溶液相中。通过在磷酸缓冲液中重复洗涤，包括涡旋和超声处理，离心和重悬，将未结合的F108从涂覆的微球体上去除。乳链菌肽负载和温育将F108-涂覆的和裸露的微球体样品分别与8X10_3mg/ml乳链菌肽混合，并且在室温下在管旋转器上，在磷酸缓冲液中温育1小时。然后，通过重复洗涤(超声处理、离心和重悬在磷酸缓冲液中)去除未结合的乳链菌肽。通过在接种戊糖片球菌的平板上使用琼脂平板扩散测定法[3，4]验证在上清中不存在未结合的乳链菌肽。琼脂扩散测定法是最常见的乳链菌肽活性测定类型。简言之，在接种了戊糖片球菌的营养琼脂平板上无菌打孔，并且将上清样品放置在孔中。温育后，记录在每个孔附近的抑制圈。仅在最后一次洗涤步骤后在上清中没有检测到乳链菌肽活性(即，在孔周围没有可见的抑制圈)后，使用微球体混悬液。还在不含微球体的磷酸缓冲液(IOmM)和F108(5mg/mL)溶液中温育乳链菌肽(8X10_3mg/mL)，以用于对照比较。然后，将负载乳链菌肽的微球体和对照样品在磷酸缓冲液中或在需要稀释度的马血清(10，50和100%血清)中在37°C温育需要的时间阶段(0，1，4，和7天)。戊糖片球菌的培育和抗菌活件测量使用MRS肉汤来培育乳链菌肽-敏感的戊糖片球菌菌株FBB61_2。将MRS(52.2g，目录号1.10661，EMD化学公司(EMDChemicals，Inc.))溶解在IL的DI水中，并且在121°C高压灭菌30分钟。将戊糖片球菌在37°C温育过夜(20小时)，并且置于220rpm的定轨振荡器上。测量过夜培养物、和过夜培养物的100-倍稀释液的光学密度(0D_)，以确保细胞密度一致。在将样品在缓冲液或马血清中温育后，将微球体洗涤两次，然后用过夜戊糖片球菌培养物的100-倍稀释液在37°C混合4小时。这些是取样的，且稀释了100倍。然后，用基于MRS的熔融琼脂(44°C)将培养物样品(0.5mL)平均分布到培养皿上。将该培养皿在37°C温育48小时，直到细菌菌落变得明显可见。在48小时后记录的菌落数目视为在用戊糖片球菌悬浮期间乳链菌肽涂层功效的指示。图5显示在与乳链菌肽接触且在37°C用马血清温育7天后在未涂覆的和F108-涂覆的微球体之间抗微生物活性的比较结果。尽管在每种情形中，血清蛋白浓度的增加降低了在微球体上保留的乳链菌肽的活性，但是当由血液蛋白刺激时，F108-涂覆的微球体明显比裸露的微球体保留了更多的乳链菌肽活性。如上述，这些结果表明F108涂层抑制血清蛋白对乳链菌肽的交换。实施例4在棵露的或PLURPNICF108涂覆的硅烷化玻璃上的乳链菌肽吸附和洗脱利用椭圆对称法来测量来自裸露的疏水或PLURONICF108涂覆的硅烷化的、硅石表面的乳链菌肽的吸附和洗脱的相对速率。椭圆对称法按下述进行将硅石样品(用F108涂覆或未涂覆的)置于熔融石英、梯形小杯(HellmaCells,德国)中，其被紧固在自动原位椭圆计(L-104SA型，Gaertner科学公司(GaertnerScientificCorp.))的样品台上，所述自动原位椭圆计被改进允许搅拌和流动。在将4.5mLIOmM磷酸缓冲液(pH7.0)注射到小杯中后，调整椭圆计台以获得反射光强度的最大值和稳定的光学特性。在将0.5mL蛋白或F108溶液注射到所述小杯中以产生0.50mg/mL的终蛋白浓度或0.5%(w/v)的终F108浓度之前，每15秒记录表面光学特性，记录30分钟。允许吸附发生需要的时间阶段，之后用IOmM磷酸钠缓冲液以31.6mL/分钟的流速原位漂洗该表面5分钟。然后，监测膜特性需要的“温育”时间阶段。在给定实验中进行的任何额外的蛋白吸附和漂洗_温育步骤均以上述相同的方式进行。使用单膜型椭圆对称法程序(one-film-modelellipsometryprogram)[19]来由按照Cuypers等[20]椭圆对称法确定的膜厚度和折光指数值(这些光学特性在每次测量中同时确定)确定蛋白的吸附质量。使用3.837mL/g的微分比容和0.729g/mL的分子量与摩尔折射率的比率。每个实验在每种类型的表面上进行至少两次，对平均值的平均偏差约为0.005μg/cm2。图6所示的结果提供在裸露的疏水和F108-涂覆的表面上乳链菌肽吸附和洗脱动力学的代表性比较。在每种情形中，乳链菌肽吸附没有达到稳定值，并且基于乳链菌肽在溶液中的尺寸(如果建模为圆柱体，约2X5nm)，“侧面”(S卩，在等于2X5=IOnm2的面积上)和“底面”(即，在等于2X2=4nm2的面积上)吸附的分子单层将分别导致0.058和0.145μg/cm2的吸附质量。因此，图6所示的模式与每种情形中的多层吸附一致。乳链菌肽对F108-涂覆的表面的吸附通常比对裸露的疏水表面的吸附更缓慢，这可能是由于悬垂的PEO链的空间抑制作用。开始时，在每种表面上，乳链菌肽在不含蛋白的缓冲液中的洗脱是相似的，但是仅在裸露的疏水表面上观察到洗脱的继续。这大概是由于对在吸附至未涂覆的表面的情形中松散地保留在外层中的乳链菌肽更大的溶剂可及性，而整合至PEO“刷”中的乳链菌肽将表现出更大的洗脱抗性。实施例5乳链菌肽关于涂覆在硅烷化玻璃表面上的PLURONICF108(共价的或非共价附着)的吸附和洗脱PLURONICF108三嵌段作为与硅石表面的疏水缔合而涂覆，并且在不同组的硅石表面上，通过经由PPO链的共价附着而涂覆F108三嵌段。出于这一目的，将硅石样品用十八烷基三甲氧基硅烷进行硅烷化，表面-聚合物共价附着由UV辐射诱导。椭圆对称法如实施例4所述那样进行，以获得乳链菌肽在通过疏水缔合和通过共价附着用F108涂覆的疏水表面上的吸附和洗脱动力学。如图7所示，在每种表面上，乳链菌肽吸附和洗脱动力学非常相似，这表明通过PPO嵌段和硅烷化表面之间的疏水缔合制备的F108层以基本上与通过PPO嵌段和硅烷化表面之间的共价附着制备的F108层相似的方式起作用。实施例6使用SATA制备硫醇化的乳链菌肽和活性测量使用SATA制备硫醇化的乳链菌肽N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)(皮尔斯生物技术(PierceBiotechnology)，罗克福德，伊利诺斯州)用来在乳链菌肽的η-端结合保护的巯基。按下述进行典型的硫醇化。制备在三氟乙酸(TFA)中含有lOmg/mL的乳链菌肽溶液。通过加入含有乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾缓冲液升高乳链菌肽溶液的pH，以获得在PH7.0，IOmMEDTA的20mM磷酸钾缓冲液中0.5mg/mL乳链菌肽的最终组合物。在反应前立即将SATA以需要的浓度如20mM溶解在二甲亚砜(DMSO)中。将SATA溶液的等分试样与乳链菌肽溶液混合，以获得所需要的SATA对于乳链菌肽的摩尔过量。在该实施例中，SATA对于乳链菌肽的摩尔过量在2.51-51之间变化。将反应混合物包装在铝箔中，以避光，并且允许反应在室温下进行30分钟。之后，通过透析或通过将反应混合物通过脱盐或凝胶过滤柱而去除过量的SATA。通常，填充SEPHADEXG-IO(MWC0800Da)的柱使用20mM磷酸钾缓冲液的洗脱剂。收集和合并包含乳链菌肽的级分。然后，通过加入羟胺-HCl(0.5M羟胺-HCL(皮尔斯生物技术(PierceBiotechnology)),25mMEDTA，在磷酸缓冲液中，PH7.8)溶液而将修饰的乳链菌肽脱乙酰基。允许脱乙酰反应在室温下进行2小时。然后，通过将反应混合物通过填充了SEPHADEXG-10的柱并用20mM磷酸钾缓冲液洗脱硫醇化的乳链菌肽，而回收硫醇化的乳链菌肽。使用Ellman's测定法[16]确定使用SATA的乳链菌肽衍生程度。使用SATA、或其它包含N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯的交联剂的硫醇化反应将用蛋白上任何充分可用的伯胺进行。在乳链菌肽的情形中(参见上述图1中的结构)，反应可能在N端胺、Lys12,Lys22、和C端残基Lys34发生。据信通过残基12或22的硫醇化和最后与PEO的连接将形成无活性形式的乳链菌肽。结构分析显示，Lys34(以及Ile1)比残基12和22更加溶剂可及和移动。在这一点上，如果允许赖氨酸进行硫醇化，我们将预计末端残基比内部残基优先硫醇化。如果通过Lys34索链化(tethered)，参考孔形成的桶-板模型，人们将预测无活性的形式，因为C端结构域透入和通过脂双层将受到损害。参考楔形模型，人们可以预测一些活性，因为亲水PEO链将不必被“牵引”通过双层的疏水核。在任何事件中，N端残基的优先硫醇化通过利用N端胺和赖氨酸上的胺的pKa的不同而实现。N端胺典型地具有6.8-8的pKa，而赖氨酸上的氨基基团的pKa约为11.1。在中性pH下，大部分赖氨酸将处于它们的电离形式，且因此不是反应性的。当PH增加时，赖氨酸将变得具有增加的反应性，并且SATA试剂的水解将更快地发生。在这一点上，选择较低的反应pH、时间、和/或浓度将确保大部分反应发生在N端结构域。检测所述硫醇化的乳链菌肽以及数种对照样品的活性。对照包括在每个处理步骤结束时取出的乳链菌肽样品[即，(i)在加入SATA/DMS0后温育30分钟；(ii)凝胶过滤；(iii)加入羟胺-HCl/pH7.8，然后温育2小时和(iv)凝胶过滤)和用pH7.0的磷酸缓冲液稀释至在最终凝胶过滤柱流出物中所预测的肽浓度]，和暴露于上述反应条件但是不存在SATA的乳链菌肽样品。硫醇化的乳链菌肽的活性测量使用革兰氏阳性细菌戊糖片球菌FBB61-2(ATCC，Manassas，VA)作为指示菌株，通过琼脂孔扩散测定，确定修饰的乳链菌肽的抗菌活性。按照供应商的使用说明，通过高压灭菌，灭菌IOml52.2g/l的deMan-Rogosa-Sharpe肉汤，MRS(EMD化学(EMDChemicals)，德国)溶液。解冻戊糖片球菌培养物储液，且用无菌接种环将10μ1添加到高压灭菌的MRS肉汤中。然后，将接种的肉汤在37°C温育过夜，以形成约107CFU/ml的细胞计数。将粉末状的琼脂(Becton-Dickinson，Sparks，MD，美国)分散在52.2g/lMRS肉汤中，并且通过高压灭菌液化。将其冷却至40°C，并且用上述制备的片球菌过夜培养物接种，且倒在几个培养皿(IOOmm直径X15mm深度)上达到约5mm的深度，且允许固态化。使用木塞穿孔器在每个琼脂平板上无菌钻3个洞，且向每个孔中加入10μ1硫醇化的乳链菌肽溶液或对照溶液。在所有情形中，用磷酸缓冲液稀释所述溶液，以在检测的每份溶液中提供近似相等的乳链菌肽浓度。盖上平板，且在37°C温育24小时，并且测量在每个孔周围的抑制圈的直径。结果显示在图8中。具体地，图8举例说明与仅加入DMSO的“对照乳链菌肽”相比，SATA交联对乳链菌肽抗菌活性的影响。在图8中，⑴是指乳链菌肽+DMSO中的SATA(30分钟反应)；(II)是指乳链菌肽+DMSO(30分钟对照)；(III)是指乳链菌肽+SATA，通过SEPHADEX柱以去除SATA；(IV)是指乳链菌肽+DMS0，通过SEPHADEX柱；(V)是指乳链菌肽-SATA+羟胺-HCl(2小时反应)；(VI)是指乳链菌肽+缓冲液(2小时反应，对照)；(VII)是指乳链菌肽-SH，通过SEPHADEX柱，以去除羟胺-HCl；和(VIII)是指乳链菌肽+DMSO，通过SEPHADEX柱。从图8可以看出在用SATA处理后保留一些乳链菌肽活性是可能的。在脱乙酰步骤后观察到最大的活性损失，然而，发现这在去除羟胺-HCl时是部分可逆的。实施例7#用SAT(PEO1)制各硫醇化的链菌flt和活件测丨量使用N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基(硫代四甘醇)酯(SAT(PEO4))(皮尔斯生物技术(PierceBiotechnology)，Rockford，Illinois)来在乳链菌肽的η端结合保护的硫醇。制备在三氟乙酸(TFA)中包含lOmg/mL的乳链菌肽溶液。通过加入含有乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾缓冲液升高乳链菌肽溶液的PH，以获得在pH7.OUmMEDTA的20mM磷酸钾缓冲液中2.0mg/mL乳链菌肽的最终组合物。在反应前立即将SAT-PEO溶解在二甲亚砜(DMSO)中，以获得250Mm的储液。将SAT-PEO溶液的等分试样与乳链菌肽溶液混合，以获得所需要的SAT-PEO对于乳链菌肽的摩尔过量。在该实施例中，SAT-PEO对于乳链菌肽的摩尔过量在1.085-4.34之间变化。将反应混合物包装在铝箔中，以避光，并且允许反应在室温下在旋转摇动器上进行30分钟。在反应结束后，通过将反应混合物通过填装了SEPHADEXG-10(MWC0800Da)的凝胶过滤柱并用20mM磷酸钾缓冲液洗脱而去除过量的SAT-PE0。收集并合并包含乳链菌肽的级分。然后，通过加入羟胺-HCl(0.5M羟胺-HCL(皮尔斯生物技术(PierceBiotechnology)),25mMEDTA，在磷酸缓冲液中，pH7.8)溶液而将修饰的乳链菌肽脱乙酰基。允许脱乙酰反应在室温下进行2小时。然后，通过将反应混合物通过填充了SEPHADEXG-10的柱并用20mM磷酸钾缓冲液洗脱硫醇化的乳链菌肽，而回收硫醇化的乳链菌肽。使用Ellman’s测定法[16]确定使用SAT-PEO的乳链菌肽衍生程度。测量硫醇化乳链菌肽的活性使用按上述实施例7中所述的琼脂孔扩散测定法，测量用SAT-PEO硫醇化的乳链菌肽活性。在下述表1中显示用1.085倍摩尔过量的SAT-PEO制备的乳链菌肽嵌段共聚物的三次试验结果的总结，并且举例说明可以衍生肽以结合巯基基团，同时保持合理的抗菌活性水平。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>实施例8m车菌flt与末端某闭活化的ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0三嵌段物(共勿)的偶联和活t牛测丨量m车菌flt与末端某闭活化的ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0三嵌段物(共勿)的偶联按照Li等[15]的方法，衍生PLURONICF108(BASF)以结合末端吡啶基二硫化物基团。通常产生每F108分子具有1-1.2吡啶基二硫化物(“PDS”)基团的取代程度的末端基团活化的共聚物(EGAP-PDS)。F108是合适的起始材料，因为其(完全延伸的)ΡΕ0链约为60nm长。为了与膜相互作用，乳链菌肽必须通过敏感革兰氏阳性细菌的细胞壁。细胞壁厚度随细菌物种不同，但是平均来说，敏感葡萄球菌细胞壁为20-30nm厚。将300μL硫醇化的乳链菌肽溶液添加到包含100μ1溶解在ρΗ7.0的磷酸钾缓冲液中的EGAP-PDS或F108的微量离心管中。在每种情形中的终浓度在三嵌段共聚物比所修饰的肽0.2倍至5倍摩尔过量的范围内。将该管用铝箔包装，并且在室温下连续混合温育过夜。通过按照供应商的使用说明，使用具有10，000道尔顿的MWCO的Slide-A-Lyzer盒(皮尔斯生物技术(PierceBiotechnology))针对ρΗ7的磷酸缓冲液透析而去除未反应的乳链菌肽。通过测量在反应过程中释放的PDS基团的浓度，而确定乳链菌肽和EGAP-PDS之间的偶联程度。这通过在时间0(、)和在透析前反应结束时(tf)，测量反应混合物在343nm处的吸光度而实现。然后，利用在、和tf时的吸光度之间的差别来用8060M—1的消光系数计算PDS基团的浓度。针对上述这些的其余的对照，包括100μ1每种类型的三嵌段物(末端活化的和其它)溶液，其中加入300μ1磷酸缓冲液替代硫醇化的乳链菌肽溶液。制备这些来观察三嵌段物自身对细菌生长的影响。图9显示乳链菌肽与嵌段共聚物的连接，如本文所教导那样。测量共聚物_乳链菌肽构津体的活件在细菌中鉴定脂质II为乳链菌肽的特异性靶标，如上文所解释，已经能够呈现出乳链菌肽中结构和功能关系的更清楚的描绘。已经表明乳链菌肽通过三种不同的机制杀死细菌。在功效次序上，它们是(i)结合脂质II，并且随后形成孔；(ii)在不存在孔形成的条件下，结合脂质II，和(iii)在不存在脂质II的条件下，不依赖于靶标的孔形成。对于每种机制，已经鉴定了肽的特异性结构和功能特征。一种分子中的杀死机制(i)和(ii)的组合强化了抗微生物活性，并且导致纳摩尔范围内的最小抑制浓度。尽管不受该理论的限制，据信所述化合物和方法包括通过与N端异亮氨酸的伯胺的连接，确保乳链菌肽以“端点”方向固定至柔软的PEO链。(关于乳链菌肽的结构参见图1)以这种方式，N端结构域与脂质II的结合应该不受影响，铰链区的柔性也应该不受影响。图10提议以这种方式索链化的乳链菌肽形成的脂质II-介导的孔的示意图。具体地，在图10中，对于脂质II结合(左)和孔形成(右)，乳链菌肽相对于膜和相对于脂质II的取向，如Wiedemann等[17]^PvanHeusdan[18]所述。在图10中，乳链菌肽首先通过其N端结构域结合脂质II的碳水化合物结构部分。然后，假定乳链菌肽的C端部分在某种程度上穿过膜易位。对于这一步骤，环簇之间的柔性的铰链区是重要的。在图10中，N-乙酰化的糖GIcNAc和MurNAc分别显示为六元环标记的G和M。附着到MurNAc上的五肽的氨基酸显示为5个圆圈。圆圈标记的Pi表示为脂质II中连接糖-肽基团和疏水尾部的磷酸结构部分。在图10中，乳链菌肽由其官能重要结构域表示大椭圆表示N端结构域和小椭圆表示C端结构域。结构域通过短的铰链区连接。在图10中还显示在环A之前(N端，标记为N)和在环E之后(C端，标记为C)的短线性肽序列。假定装配一些乳链菌肽_脂质II复合物用于功能性的孔，由此解释羧基荧光素、氨基酸、ATP尺寸的分子从脂质体和活细胞的快速流出，但是准确的数目目前是未知的。在任何事件中，在界面环境中索链化的乳链菌肽的浓度是高的。因此，据信膜将表现出高水平的活性，并且同时克服与通过直接吸附进行的膜形成/负载相关的局限性。使用细菌培养物悬浮测定法，而不是琼脂孔扩散测定法，检测共聚物_乳链菌肽构建体的活性，因为相对于乳链菌肽，所述构建体的尺寸和结构将妨碍它们在固体琼脂培养基中的扩散率。预计二硫化物交换反应随着时间在体内缓慢发生。这可能导致一些延长的乳链菌肽从EGAP的释放。考虑到这种潜在的释放机制，在通过DTT还原后，还检测共聚物乳链菌肽构建体的活性。按实施例6所述制备片球菌的过夜培养物，并且在无菌MRS肉汤中稀释100-倍，以提供约9X105CFU/ml的细胞计数。将900μL这种稀释的培养物转移到15ml聚丙烯管中。然后，向该管中加入IOOyL共聚物(末端活化的或其它)溶液，其已经与硫醇化的乳链菌肽反应或与磷酸缓冲液组合，并且将所有这些管在恒定的搅动下在37°C温育4小时。还以这种方式检测硫醇化的乳链菌肽溶液，和不含共聚物、不含乳链菌肽的磷酸缓冲液。在温育时间结束时，在600nm处确定每份培养物的细胞密度。在图11中显示关于用SAT(PEO4)硫醇化的乳链菌肽制备的EGAP-乳链菌肽构建体的结果。具体地，图11显示EGAP-乳链菌肽共聚物和对照的抗菌活性的结果。特别地，图12显示在DTT处理后包含嵌段共聚物的乳链菌肽和对照的抗菌活性结果。对于图11和12，将1.085摩尔过量的SAT(PEO4)用于乳链菌肽硫醇化反应，且将对于乳链菌肽-SH5摩尔过量的EGAP用于制备所述构建体。备选的连接策略，可能包括蛋白工程技术，可以用来制备索链化的羊毛硫抗生素。例如，在分子中彻底结合半胱氨酸残基将排除在使用本文所述的EGAP-PDS连接PEO之前对化学修饰的需要。这可能是有问题的，因为羊毛硫抗生素前体肽中的半胱氨酸残基提供在翻译后修饰过程中参与形成硫醚连接的巯基基团，但是这仅是蛋白工程引起的许多解决方案中的一种。使用羊毛硫抗生素的蛋白工程比用于酶和结构蛋白的蛋白工程仍然复杂一些，因为表达系统必须不仅包括结构基因，还包括编码生物合成酶、免疫性蛋白和调控蛋白的基因[80]。另外，在多种情形中，对于生产和分泌有任何活性的羊毛硫抗生素需要特定残基的正确的翻译后修饰。然而，已经制备了相对于野生型具有相似的、减少的和甚至增加活性的多种定向位点乳链菌肽突变体，并且这样的方法可能最终归因于最佳适于在界面应用的羊毛硫抗生素的合理设计。本发明可以以其它具体形式实施，而不背离其结构、方法、或在本文广泛所述和下文要求的其它基本特征。所述的实施方案仅被视为是示例性的，并不是限制性的。因此，本发明的范围由后附的权利要求而不是前述描述指明。在它们的范围内包括在权利要求的含义和等价范围之内的所有改变。实施例9祥酉旨卜.白句·车麵禾口城劇_&_丨纖_應牛测量将医学装置级PU管，80ShoreΑ,(科学日用品公司(ScientificCommoditiesInc.)，LakeHavasuCity,AZ)切割成Icm长，用99%异丙醇洗涤30分钟，然后用无菌DI水漂洗一次5分钟。样品用已经进行无菌过滤的水、1%F108或1%EGAP-NTA温育过夜。然后，将进一步要用乳链菌肽处理的样品用PH6.O的磷酸缓冲液漂洗3次。其余样品用PBS(20mMPB,150mMNaCl，pH7.4)漂洗3次。将乳链菌肽溶液(在0.OlMPB，pH6.O中0.5mg/mL)添加到适当的样品中，并且温育过夜。然后，将这些样品用PBS漂洗3次。制备如实施例1所示的标准细菌溶液，并且加入到在1.5mL聚苯乙烯管中的样品。将细菌培养物与样品在37°C温育24小时。样品用PBS洗涤三次，然后置于新的无菌1.5mL聚苯乙烯管中。加入MRS肉汤，并且将样品超声处理5分钟。超声处理后，将110和1100稀释的每份样品的100μ1等分试样划线到各自的琼脂平板上。48小时的生长期间后，计数在每个琼脂平板上形成的菌落数目。结果图13Α显示在所有涂覆了乳链菌肽的表面上对细菌的明显抑制，和在乳链菌肽用F108且进一步用EGAP-NTA涂覆时增加效力的倾向，如图13Β所示。具体地，图13a举例说明在存在MRS肉汤的条件下24小时，在涂覆和未涂覆的PU管上细菌黏附的结果。图13B举例说明在涂覆了乳链菌肽和乳链菌肽与共聚物组合的聚氨基甲酸酯表面上的细菌黏附之间的比较。在存在MRS肉汤的条件下3天后，使用PU管获得关于细菌黏附的类似的鼓舞性结果(图14)。实施例10在存在血液g白的K牛下，在聚氨,基甲！!酉旨导If表gilg丨肩车Iffl太的稳定j牛禾卯舌个牛通过在一次性测试管中，用在IOmM磷酸缓冲液中的F108(5mg/mL)温育24小时，涂覆聚氨基甲酸酯导管片段(22GA，1.0在I.V.导管中，REF381423，BectonDickinson)。然后，将它们用多个测试管体积的磷酸缓冲液漂洗，以去除未结合的F108。将F108-涂覆的和裸露的片段在室温下在0.5mg/mL乳链菌肽中温育1小时。1小时后，用多个测试管体积的过滤的IOmM磷酸钠缓冲液漂洗导管片段，以去除未结合的乳链菌肽。然后，将乳链菌肽处理的导管片段在25%马血清或IOmM磷酸缓冲液中温育需要的时间阶段。然后，用大量磷酸缓冲液漂洗乳链菌肽-处理的片段，在每种情形中通过注射器施用至内腔。乳链菌肽敏感的戊糖片球菌(如实施例3所述培育)用来接种MRS琼脂培养皿。将漂洗的导管片段插入到接种戊糖片球菌的平板上，用于抗菌活性的琼脂扩散测定。将平板在37°C温育48小时，并且测量杀伤区的面积，以提供乳链菌肽活性的指示。结果显示在图15中。当用血液蛋白(25%马血清)刺激导管片段时，在F108-涂覆的和裸露的表面组之间，尤其是随着温育时间的增加，观察到更大的差异。这些结果支持这样的观点，即，F108涂层的悬垂PEO链抑制血液蛋白对乳链菌肽的交换。实施例11利用辐射稳定聚氨某甲酸酯表面h^PLURONICElM评估了两种类型的辐射，e-束和UV。通过用SDS溶液彻底洗涤然后进行蛋白吸附测定而评估持久性，其中共聚物的保留由减少的蛋白吸附证实。图16包含显示辐射对PLURONICF108涂层稳定性的影响的结果。图16所示的结果表明，在某些条件下，通过应用辐射在PU上稳定未修饰的共聚物或EGAP是可行的。实施例12PEO链在乳链菌肽的吸附和洗脱中的作用可以通过参考“历史依赖性”吸附机制[21，22]分析乳链菌肽吸附-洗脱数据而进一步揭示PEO链在吸附和洗脱中的作用。由于在界面上不平衡结构的缓慢松弛，许多大分子部分，包括蛋白，表现出历史依赖性吸附行为。即，对于在给定表面负载的给定的蛋白，吸附速率依赖于吸附层的形成历史。当蛋白-蛋白相互作用可能影响适于吸附的表面积的可用性时，在单层表面覆层附近，这是特别相关的。Tie等[22]使用光波导发光模式光谱法以多步骤模式研究了纤连蛋白、细胞色素c和溶菌酶的吸附，其中吸附表面备选地暴露于蛋白溶液和不含蛋白的溶液。通常，他们观察到，在第二步中的初始吸附速率超过在第一步骤在相同表面覆层观察到的初始吸附速率。他们假定，对于界面上给定的质量密度，如果蛋白以“簇”或聚集体排列，相对于随机分布的蛋白，更“清空的(cleared)”表面积将可用于进一步的吸附。在另一方面，如果吸附的蛋白膜处于平衡，由于蛋白将具有相同的结构特征，我们将在每个周期中预测到相同的吸附速率。因此，吸附速率数据可以提供与吸附层结构相关的重要信息[21，22]，并且出于该目的，我们利用图17所示的顺序吸附动力学数据种类。图17显示在裸露的疏水表面和F108-涂覆的表面顺序进行的两个乳链菌肽吸附-洗脱步骤的结果。对于每种表面，将第二吸附步骤的初始斜率与具有相同初始质量密度的第一吸附周期这一点的斜率进行比较。在涂覆和未涂覆的表面，在第二步中的初始吸附速率超过在第一步中在相同表面覆层观察到的初始吸附速率。但是，当与F108-涂覆的硅石比较时，在未涂覆的硅石的情形中，斜率的增加是明显的。即，对于F108-涂覆的表面，第一和第二步吸附速率没有不同，这表明在该情形中发生较少的乳链菌肽吸附后重排(或较少的“簇集”)。我们认为PEO链抑制了形成簇和未占据的表面积的产生所需要的横向移动性。在未涂覆的和F108-涂覆的表面的乳链菌肽吸附和洗脱动力学的比较(图6，7，和17)表明，乳链菌肽吸附和洗脱速率，以及其在界面的横向移动性，通常在未涂覆的表面上更大。这将与PEO刷层内的乳链菌肽吸附或“包埋”一致，与以非穿透模式与PEO链吸附相反。实施例13PEO链对乳链菌肽结构特征的影响将通过用六甲基二硅氮烷硅(产品R816，190m7g，10-12nm直径)烷化而变得疏水的硅石纳米颗粒通过悬浮在旋转器上的磷酸缓冲液中过夜而涂覆F108。基于估计为3.3mg/m2的特定F108涂层密度[5]，选择用于该目的的F108的量(1.35mg/mL)，以足以覆盖所述纳米颗粒在混悬液中展现的表面积。然后，将F108-涂覆的和裸露的疏水硅石纳米颗粒用乳链菌肽(0.5mg/mL)在室温下温育需要的时间阶段(4小时-1周)。选择用于与乳链菌肽(2.19mg/mL纳米颗粒)组合的纳米颗粒的量比支持0.15μg/cm2的乳链菌肽涂层所需要的大1.25倍的表面积。允许乳链菌肽吸附发生2小时。0.15μg/cm2的乳链菌肽负载与单层吸附一致(基于乳链菌肽在溶液中的尺寸，在端点吸附的单层分子将导致约0.145μg/cm2的吸附质量)，并且利用原位椭圆对称法进行的早期工作表明，2小时将为该水平的吸附提供充足的时间。在JascoJ-720分光偏振计上，在25°C用0.2mm径长和圆柱体小杯，在300_180nm之间记录乳链菌肽_纳米颗粒混悬液和对照样品的CD光谱。在每种情形中，记录六次扫描，并且平均，以增加信号-比-噪声的比率。在每种情形中，与参照样品一起记录乳链菌肽_负载的纳米颗粒混悬液和对照的CD光谱(纳米颗粒+缓冲液，纳米颗粒+F108+缓冲液，F108+缓冲液，和仅有缓冲液)，以减去背景信号，并且确保仅测量乳链菌肽的结构特征。图18显示在包含选定浓度的F108或聚乙二醇(PEG)的(不含纳米颗粒)的溶液中温育2小时和1周的乳链菌肽⑶光谱。选择PEG(MW6000)的分子量，来近似F108三嵌段物中的单个PEO链的分子量(MW约5700)。如图6中所示，在所有组中乳链菌肽的光谱非常相似，这暗示F108和PEG都对乳链菌肽构象没有任何影响。另外，这些光谱没有提供关于乳链菌肽在溶液中温育2小时或1周的结构变化的证据。图19显示与疏水硅石颗粒悬浮在磷酸钠缓冲液(pH7)中的乳链菌肽在25°C温育4小时(图19a)和1周(图19b)后的⑶光谱。在4小时后与纳米颗粒接触时，在190-215nm之间椭圆率的上移是明显的。然而，与未涂覆的颗粒样品相比较，在具有F108-涂覆的纳米颗粒的混悬液中记录的乳链菌肽光谱保持与在不存在颗粒的条件下关于乳链菌肽记录的光谱更相似。在与纳米颗粒接触1周后，在190-215nm之间的椭圆率的更多的上移是明显的。然而，此外，在具有F108-涂覆的纳米颗粒的混悬液中记录的乳链菌肽光谱比在具有未涂覆的纳米颗粒的混悬液中关于乳链菌肽记录的那些改变得少得多。图19b还显示在220nm以外，对于F108-涂覆的纳米颗粒混悬液和不含颗粒的溶液，乳链菌肽光谱保持充分地相似，而对于未涂覆的纳米颗粒记录的光光谱与该区域中的另外两种样品不同。这些结果表明，与在具有F108-涂覆的表面的混悬液中相比，在具有未涂覆的、疏水硅石的混悬液中，乳链菌肽经历更多的结构改变。图20显示增加的表面积对与未涂敷的(图20a)和F108-涂敷的硅石纳米颗粒(图20b)悬浮的乳链菌肽在温育4小时后的CD光谱的影响。颗粒表面积的增加将为乳链菌肽结构改变提供更多的机会，如果在上述使用的颗粒浓度下，一些乳链菌肽保持未结合或另外没有紧密与界面缔合(例如，停留在弥散的外层)。图20显示在每种情形中，当与5_倍增加的颗粒表面积接触时，在190-215nm之间椭圆率的上移是明显的。图20还显示，当未涂覆的颗粒表面积5-倍增加时，215nm之外的乳链菌肽光谱继续偏离在较小的表面积记录的乳链菌肽光谱，而具有大量和少量F108-涂覆的颗粒的乳链菌肽混悬液在215nm之外表现出充分相似的光谱。与图19所示的温育时间影响相似，这些结果表明，相对于在(不含颗粒的)溶液中记录的乳链菌肽光谱，在具有F108-涂覆的纳米颗粒的混悬液中记录的乳链菌肽光谱比在具有未涂覆的纳米颗粒的混悬液中关于乳链菌肽记录的那些保持少得多的改变。这些结果表明，与吸附至先前涂覆了F108的相同颗粒时相比，当吸附至裸露的疏水颗粒时，乳链菌肽经历更多的结构改变。参考文献[1]J.N.Hansen,Nisinasamodelfoodpreservative(乳链菌肽作为食品防腐模型).CritRevFoodSciNutr(食品科学和营养学的评论)34(1994)69-93.[2]J.Andersson,R.Larsson,R.Richter,K.N.Ekdahl,禾口B.Nilsson,Bindingofamodelregulatorofcomplementactivation(RCA)toabiomaterialsurfacesurface-boundfactorHinhibitscomplementactivation(补体活化的模式调控齐[J(RCA)与生物材料表面的结合表面结合的因子H抑制补体活化).Biomaterials(生物材料)22(2001)2435-43.[3]J.H.Lee,J.Kopecek,禾口J.D.Andrade,Protein-resistantsurfacespreparedbyPEO-containingblockcopolymersurfactants(由含有PEO的嵌段共聚物表面活性齐[J制备蛋白抗性表面).JBiomedMaterRes(生物医学材料研究杂志)23(1989)351-68.[4]J.T.Li,J.Carlsson,S.-C.Huang,禾口K.D.Caldwel1，Adsorptionofpoly(ethyleneoxide)-containingblockcopolymersaroutetoproteinresistencd包含聚(环氧乙烷)的嵌段共聚物的吸附一种蛋白抗性途^:J.Ε.Glass,(IS)jHydrophillicPolymers()Φ.Performancewithenvironmentalacceptability(环境可接受性的成绩)，AmericanChemicalSociety(美国化学学会)，Washington,D.C.，1996，第61-78页.[5]J.T.Li,禾口K.D.Caldwell,PlasmaproteininteractionswithPLURONIC-treatedcolloids(血浆蛋白与PLURONIC-处理的胶体的相互作用).ColloidsandSurfacesB:Biointerfaces(胶体和表面B生物界面)7(1996)9-22.[6]T.McPherson,K.Park,禾口S.Jo，Graftingofbiocompatiblehydrophilicpolymersontoinorganicandmetalsurfaces(向无机禾口金属表面植入生物才目容的亲水聚合物)，USPT0，UnitedStatesSurgical(Norwalk，CT)，美国，2000.[7]C.Maechling-Strasser，P.Dejardin,J.C.Galin,A.Schmitt，V.Housse-Ferrari，B.Sebi1Ie，J.N.Mulvihi11,禾口J.P.Cazenave，Synthesisandadsorptionofapoly(N-acetylethyleneimine)-polyethyleneoxide-poly(N-acetylethyleneimine)triblock-copolymeratasilica/solutioninterface.Influenceofitspreadsorptiononplateletadhesionandfibrinogenadsorption.(聚(N—乙酉先乙烯亚胺)-聚环氧乙烷-聚(N-乙酰乙烯亚胺)三嵌段_共聚物在硅石/溶液界面的合成和吸附。其预吸附对血小板黏附和血纤蛋白原吸附的影响)JBiomedMaterRes(生物医学材料研究杂志)23(1989)1395-410.[8]N.D.ffinblade,I.D.Nikolic,A.S.Hoffman,禾口J.A.Hubbe11，BlockingadhesiontocellandtissuesurfacesbythechemisorptionofapoIy-L-lysine-graft-(poly(ethyleneglycol)；phenylboronicacid)copolymer.(聚_L_赖氛酸-植入物-(聚(乙二醇)；苯基硼酸)共聚物的化学吸附阻断对细胞和组织表面的黏附)Biomacromolecules(生物大分子)1(2000)523-33.[9]D.K.Han,K.B.Lee,K.D.Park,C.S.Kim,S.Y.Jeong,Y.H.Kim,H.M.Kim,禾口B.G.Min,Invivocani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