包括d-松醇作为活性成分的用于预防或治疗骨代谢病症的组合物的制作方法

专利名称：包括d-松醇作为活性成分的用于预防或治疗骨代谢病症的组合物的制作方法
包括D-松醇作为活性成分的用于预防或治疗骨代谢病症
的组合物发明背景 发明领域本发明涉及包括D-松醇作为活性成分的用于预防或治疗骨代谢病症的组合物。
背景技术：
骨支持人体的肌肉或器官并通过包围内脏保护它们免受外来的冲击。骨是人体 的重要部分，其不仅储存体内的钙，而且还储存必要的无机物质诸如磷或镁。成年人的老 的骨基质被去除并替换为新的骨基质。通过重复的再吸收和破坏过程来保持骨产生的 平衡。这个过程称为骨重新塑造(Yamaguchi A.等人，Tanpakushitsu Kakusan Koso, 50(6Suppl) =664-669 (2005)) 骨基质的更新对于由应力和骨生长所产生的骨的细微损 伤的恢复以及骨功能的适当维持来说都是必不可少的(Cohen-Solal M.等人，Therapie, 58(5) :391-393(2003))。众所周知，有两种类型的细胞与骨重新塑造有关。一种是负责构建骨的成骨细胞， 另一种是负责破坏骨的破骨细胞。成骨细胞产生RANKL(核因子-k B配体的受体活化剂) 及其诱铒受体0PG (骨保护素)。其中RANKL结合于破骨细胞祖细胞上的RANK (核因子-k B 的受体活化剂)，破骨细胞祖细胞成熟，变为破骨细胞，允许发生骨吸收。然而，在0PG结合 于RANKL时，RANKL对RANK的结合被阻断，并导致阻止破骨细胞形成和抑制骨吸收(Theill LE.等人，Annu Rev Immunol, 20 795-823 (2002) ；Wagner EF.等人，Curr Op in Genet Dev, 11:527-532(2001))。老的骨的再吸收或破坏由衍生自血细胞(造血干细胞)的破骨细胞 进行，所述破骨细胞在骨上侵蚀一个孔并释放少量钙到血流中。所释放的钙可用于保持身 体功能(William J.等人，Nature，423 :337_342 (2003))。成骨细胞可以通过如下的过程产生刚性的新骨来重建骨架用胶原蛋白填充骨上 的孔并用钙和磷的羟磷灰石将其覆盖(Stains JP.等人，Birth Defects Res C Embryo Today, 75(1) =72-80 (2005)) 0为了保持恒定的骨密度，破坏骨的破坏速率必须与骨的成骨 速率相同。在骨重新塑造的平衡被破坏时，可能出现各种疾病，例如骨质疏松症(

图1)。骨质疏松症是其中由于各种原因导致骨质量减少并且由于骨组织上的显微结构 的退化使骨折的风险不断升高的病症。骨质疏松症是其中骨的矿物质(例如，钙)和基质的 含量已经降低的状态。在由于骨重新塑造的失调而使破骨作用(骨关节炎，osteoclasis) 的活性变得优于成骨作用的活性时，可能出现骨质疏松症(Iqbal匪.，South Med J, 93(1) :2-18(2000))。骨质疏松症患者的特征在于在更年期开始时发生的快速的骨损失(每年损失 2-3% )0骨质疏松症根据其起因而被分为两种类型的疾病经绝期后骨质疏松，其中脊髓 压力和腕骨的骨折风险升高；以及继发性骨质疏松症，其是由各种与年龄无关原因产生的， 所述与年龄无关原因诸如疾病(内分泌病、胃肠机能紊乱、恶性肿瘤)、药物(肾上腺皮质激素、抗癌用化疗、甲状腺激素、抗惊厥剂、抗凝血剂、甲氨蝶呤(methotexate)、环孢素、GnRH 等)、酒精、吸烟和意外(Rosep CJ.，NEnngl J Med, 353 (6) 595-603 (2005) ；Davidson M.， ClinicainReviews,12(4) :75_82(2o02))。目前以两个方向开发通过抑制破骨细胞功能起作用的骨质疏松症治疗剂。第 一个是开发抑制破骨细胞的骨吸收过程的药物。可以将可以阻止分化的破骨细胞的骨 吸收过程的物质直接用作骨质疏松症治疗剂。第二个是要研究可以抑制破骨细胞形成 (osteoclastogenesis)的信号转导途径的物质。与免疫细胞的分化一样，破骨细胞由存在于骨髓中的造血干细胞分化而来。破骨 细胞最初通过巨噬细胞分化因子、M-CSF(巨噬细胞-集落刺激因子)和TRANCE(TNF-相 关的活化诱导的细胞因子)分化为单核细胞，并最后通过TRANCE分化为破骨细胞(图2) (1-6)。由骨重新塑造平衡的破坏引起的另一个重要的疾病是由于癌细胞转移到骨而 引起的骨损伤。癌转移到骨通常发生在患有乳腺癌、前列腺癌或多发性骨髓瘤的患者中 (Kozlow ff.等人，J Mammary Gland BiolNeoplasia, 10(2) : 169-180 (2005))。已知的是， 这些癌患者的存活时间取决于癌症转移到骨的发生。在乳腺癌患者中观察到的癌转移到骨是溶骨性转移，其中大部分骨被破坏并且 已知是通过刺激破骨细胞而非通过乳腺癌细胞的直接作用发生的(Boyde A.等人，Scan Electron Microsc，4 1537-1554 (1986))。另一方面，在前列腺癌中观察到的癌转移到骨是 成骨性转移。还已知的是，成骨性转移与骨质溶解具有密切关系。已知D-松醇包含在松木和豆科植物中。发现从叶子花(Bougainvi 1 lea spectabilis)提取的未公开结构的松醇样物质以0. 01g/kg的最低剂量会降低正常小鼠和 四氧嘧啶处理的胰岛素缺乏的小鼠的血糖水平(Narayanan，C. R.，Joshi，D. D.，Mujumdar, A. M. , Dhekne, V. V. 1987.Pinitol-A new antidiabet ic compound from theleaves of Bougainvillea spectabilis. Current Science 56 :139141)。美国专利 5，827，896 提出了 D_松醇及其衍生物在治疗代谢病症糖尿病中的应用。然而，尚未知D-松醇具有治疗与骨有 关的疾病的功效。在本申请中，涉及了多种出版物和专利，并在括号中提供引证。这些出版物和专利 的公开内容被全部并入本申请作为参考，以便充分地描述本发明和本发明所述技术领域的 现有技术。发明详述本发明的发明人进行了深入研究以便开发能够用于有效地阻止或治疗骨代谢病 症并能够安全地长期用于人体的物质。结果，我们发现，D-松醇具有抑制破骨细胞形成和分 化的不平常的活性，并能够用作药物用于通过改善骨代谢失调来治疗或预防骨代谢病症。因此，本发明的目的是提供用于抑制破骨细胞形成的组合物，所述组合物包括 D-松醇作为活性成分。本发明的另一个目的是提供功能性食物组合物或药物组合物，用于改善、预防或 治疗骨代谢病症，所述功能性食物组合物或药物组合物包括D-松醇作为活性成分。本发明的另一个目的是提供预防或治疗骨代谢病症的方法。本发明的另一个目的是提供D-松醇用于制备药物的用途，所述药物用于预防或
4治疗骨代谢病症。通过以下发明详述以及权利要求和附图，本发明的其它目的和优点会变得显而易 见。在本发明的一个方面中，提供了用于抑制破骨细胞形成的组合物，所述组合物包 括D-松醇作为活性成分。本发明的发明人进行了深入研究以便开发能够用于有效地阻止或治疗骨代谢病 症并能够安全地长期用于人体的物质。结果，我们发现，D-松醇具有抑制破骨细胞形成和分 化的不平常的活性，并能够用作药物用于通过改善骨代谢失调来治疗或预防骨代谢病症。本发明的发明人证明，D-松醇具有抑制从破骨细胞祖细胞到破骨细胞的分化过程 的活性。因此，包括D-松醇作为活性成分的本发明的组合物可以有效地用作抑制破骨细胞 形成的药物。在本发明的另一个方面中，提供了用于预防或治疗骨代谢病症的药物组合物，其 包括(a)治疗有效量分D-松醇；和(b)药学可接受的载体。在本发明的另一个方面中，提供了用于预防或改善骨代谢病症的功能性食物组合 物，所述功能性食物组合物包括D-松醇作为活性成分。在本发明的另一个方面中，提供了用于预防或治疗骨代谢病症的方法，其包括对 患有骨代谢病症的受治疗者给予包括(a)治疗有效量的D-松醇；和(b)药学可接受的载体 的药物组合物。本发明的另一个目的是提供D-松醇用于制备用于预防或治疗骨代谢病症的药物 的用途。作为本发明的活性化合物的“D-松醇”具有如下的化学结构。
<formula>formula see original document page 5</formula>如本文中使用的术语“D-松醇”包括具有与D-松醇相等的对破骨细胞形成的抑制 活性的“D-松醇样化合物”。如本文中使用的，术语“D-松醇样化合物”包括D-松醇的适合的衍生物或代谢产 物、包含D-松醇的化合物或D-松醇的前体药物。如本文中使用的适合的D-松醇“衍生物”或“代谢产物”包括但不限于D-松醇糖 苷、D-松醇磷脂、酯化的D-松醇、脂质结合的D-松醇、D-松醇磷酸酯、D-松醇肌醇六磷酸 酯及其组合物。如本文中使用的，术语“包含D-松醇的化合物”是指包含D-松醇部分作为较大结 构组成的一部分的任何化合物。“包含D-松醇的化合物”包括但不限于包括D-松醇和一种 或多种另外的糖(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡糖胺、半乳糖胺、和甘露醇)的多糖以及D-松 醇与一种或多种金属离子的络合物或螯合物。如本文中使用的，术语“前体药物”表示在体内通过酶促或化学过程转化为D-松醇但是表现出增强的递送特征和/或治疗价值的D_松醇衍生物。糖的前体药物(例如，羟 基基团被甲基化或乙酰化的形式)的制备和给药是本领域中公知的(Baker等人，J.Med. Chem,27 :270_274(1984))。D-松醇可得自许多天然来源，例如松叶(pine needles)、鸡豆(chick peas)、叶子 花属叶子(Bougainvillea leaves)、紫花苜蓿(alfalfa)、大豆(soybeans)和其它豆科植 物，或者得自合成过程，优选得自大豆级分。如本文中使用的，术语“破骨细胞”是指在其中由新的骨基质代替老的骨基质的骨 重新塑造过程中负责骨质破坏的细胞。作为药物组合物的活性成分的D-松醇具有抑制从破骨细胞祖细胞分化和形成破 骨细胞的过程的活性。因此，本发明的组合物可以有效地用于预防或治疗骨代谢病症。如本文中使用的，术语“骨代谢病症”是指由破骨细胞和成骨细胞之间的活性或增 殖失衡所引起的病症或疾病，例如由破骨细胞的过度活化或过度增殖引起的疾病或病况。 术语“由破骨细胞的过度活化或过度增殖引起的疾病或病况”是指从破骨细胞过度地活化 或增殖的状态所产生的疾病。如本文中使用的，术语“预防”是指在可以发展为疾病或病症但是尚未确诊患病的 动物中预防疾病或病症发生。术语“治疗”是指(i)抑制疾病或病症的形成；(ii)减轻疾病 或病症；和(iii)消除疾病或病症。根据另一个优选实施方案，本发明的组合物可用于改善、预防或治疗由破骨细胞 产生过度的骨吸收所引起的病症。根据另一个优选实施方案，本发明的组合物可用于预防或治疗骨质疏松症和相关 的骨质减少疾病。要用本发明的组合物治疗、预防或改善的疾病包括骨质疏松症，特别是与围绝经 期或绝经期后有关的骨质疏松症，佩吉特病，与骨赘生物有关的高钙血症和其它类型的骨 质疏松疾病和相关病症，所述相关病症包括但不限于退化性骨质疏松症、I型或经绝期后 骨质疏松、II型或老年性骨质疏松、幼年型骨质疏松症、特发性骨质疏松症、内分泌异常、 甲状腺功能亢进、性腺机能减退、卵巢发育不全或特讷氏综合症、肾上腺皮质功能亢进或 Cushing氏综合征、甲状旁腺机能亢进、骨髓异常、多发性骨髓瘤和相关病症、系统性肥大细 胞增多症、散布的癌、戈谢病、结缔组织异常、成骨不全、高胱氨酸尿、埃-当综合征、马氏综 合征、门克斯综合症、制动或失重(immobilization orweightlessness)、祖德克氏萎缩、慢 性阻塞性肺病、长期肝素给药和抗惊厥药物的长期摄取。本发明的组合物还用于但不限于治疗或预防类风湿性关节炎、牙周疾病、假体周 围(periprosthetic)的骨质溶解、其它自身免疫疾病、赘生性骨质破坏、和与癌有关的骨 吸收病症。还应该理解，本发明的组合物可用于治疗本文中没有具体列举的由破骨细胞的过 度活化或过度增殖所引起其它病症和继发性病况。根据最优选的实施方案，由破骨细胞的过度活化或过度增殖所引起的其它病症包 括骨质疏松症、佩吉特病、高钙血症、类风湿性关节炎、转移性骨组织破坏、癌和免疫疾病。用于预防或治疗由破骨细胞的过度活化或过度增殖所引起的病症的本发明的药物组合物还包括除活性成分之外的药学可接受的载体。在本发明的药物组合物中，药学可接受的载体可以是通常用于制剂的那些，包括 但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、rubber arable、磷酸钾、arginate、明 胶、硅酸钾、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、 羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、和矿物油。本发明的药物组合物可以另外包括润滑剂、湿 润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、助悬剂、和防腐剂。适合的药学可接受的载体和制剂的细节 可以在 Remington' s Pharmaceutical Sciences (19th ed.，1995)中找至Ij,所述文献被并 入本文作为参考。
本发明的药物组合物的适合的剂量可以取决于药物配制方法、给药方法、患者的 年龄、体重、性别、疾病的严重程度、饮食、给药时间、给药途径、对所用药物组合物的排泄率 和敏感性而变化。优选地，本发明的药物组合物以0. 001-1000mg/kg(体重)的日剂量给药。本发明的药物组合物可以通过通常使用的途径给药，并且优选非肠道给药，即，通 过静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、或局部给药。优选药物组合物的给药途径由疾病的类型决 定。要被包含在这种组合物中作为活性成分的D-松醇的浓度可以取决于治疗的目 的、患者的状况、需要的时间段、疾病的严重程度来决定，而不局限于特定的浓度范围。根据本领域技术人员已知的常规方法，药物组合物可以用如上所述的药学可接受 的载体和/或媒介物来配制，最后提供包括单位剂量剂型和多剂量剂型的几种剂型。制剂 可以是油或水介质、再悬浮物或乳液、提取物、粉剂、颗粒剂、片剂和胶囊，并且还包括分散 剂或稳定剂。本发明的组合物可以制备用于提供食物组合物，特别是功能性食物组合物。所述 食物组合物可以包括用于制备食物组合物的常规添加剂，例如，蛋白质、碳水化合物、脂质、 营养物质和调味剂。例如，在将本发明的食物组合物作为饮料提供时，其可以另外包括调味 剂和天然的碳水化合物以及作为活性成分的D-松醇。天然的碳水化合物的非限制性实例 包括但不限于单糖(例如，葡萄糖和果糖)、二糖(例如，麦芽糖和蔗糖)、低聚糖、多糖(例 如，糊精和环糊精)和糖醇(例如，木糖醇、山梨醇和赤藓糖醇)。调味剂的非限制性实例包 括但不限于天然调味剂(例如，索马甜、和Stevia的提取物)和合成调味剂(例如，糖精和 阿斯巴甜)。考虑到食物的可利用性，本发明的食物组合物对于预防、治疗、或改善骨代谢病 症非常有用。附图简述图1示意性地表示破骨细胞和成骨细胞的体内平衡调节以及骨质疏松症的发病 机制。图2示意性地表示破骨细胞形成以及与其有关的细胞因子的功能。图3示出了 D-松醇对Raw 264. 7细胞的增殖的影响。在用0，0. 2，0. 5，1，5，10，20 和50mM浓度的D-松醇处理之后以24小时间隔测量细胞数，持续3天。图4示出了 D-松醇对骨髓衍生的造血干细胞增殖的浓度依赖性作用。图5是照片，通过TRAP染色示出了 D-松醇对Raw 264. 7细胞的破骨细胞形成的 影响。Raw 264. 7细胞用200ng/ml的RankL处理4天，然后在第四天通过TRAP染色确认破 骨细胞形成。
图6示出了根据D-松醇对Raw 264. 7细胞的处理浓度使用TRAP染色得到的破骨 细胞形成的多核破骨细胞数。
图7示出了通过TRAP溶液分析得到的D-松醇对Raw 264. 7细胞的破骨细胞形成 的浓度依赖性影响。图8是示出了 D-松醇对骨髓衍生的破骨细胞的分化的浓度依赖性影响的照片。 将骨髓的造血干细胞与200ng/ml的RankL和50ng/ml的CSF保温4天，然后在第四天通过 TRAP染色确认破骨细胞形成。图9表示通过TRAP染色得到的D-松醇对骨髓衍生的破骨细胞的多核化和破骨细 胞形成的浓度依赖性影响。图10通过TRAP溶液分析示出了 D-松醇对骨髓衍生的破骨细胞的多核化和破骨 细胞形成的浓度依赖性影响。图11是示出了在将成骨细胞和骨髓衍生的破骨细胞共同培养时D-松醇对破骨细 胞形成的浓度依赖性影响的照片。图12表示D-松醇对骨髓衍生的破骨细胞分化的每个阶段的浓度依赖性影响。图13是表示D-松醇对骨髓衍生的破骨细胞的骨质吸收的浓度依赖性影响的照 片。下面通过实施例进一步详细描述本发明。本领域技术人员应该理解，这些实施例 意在更具体地举例说明，权利要求中阐述的本发明的范围不限于实施例或受到实施例的限 制。
实施例方法Raw264. 7细胞的培养和破骨细胞的分化将妝《264.7细胞在包含10% 85(胎牛血清)的α-ΜΕΜ( α -最低必需培养基)中 培养。在检查破骨细胞形成的实验中，将细胞调解到在96孔板上的2. 0 X IO3细胞/200 μ 1 并与200ng/ml的sRANKL保温。在将细胞与分别为1、3. 5、7、12. 5、25和50mM的D-松醇浓 度处理培养3天之后在第四天进行TRAP (酒石酸盐耐酸性磷酸酶)染色和TRAP溶液分析。 将细胞固定，用于TRAP染色和TRAP溶液分析。将TARP阳性的多核(超过3个细胞核)细 胞计数为破骨细胞样细胞。使用LeicaDM IRM显微镜观察细胞。TRAP 染色对于TRAP阳性的细胞的细胞化学染色，将培养基除去。然后，向细胞添加100 μ 1 的10%福尔马林并在室温下保温10分钟。添加100 μ 1的甲醇/丙酮并在室温下保温1 分钟。将细胞用IOml的TRAP缓冲液(Tris-HCl, pH 4. 5，EDTA)、萘酚AS磷酸酯(底物， Sigma#N-4875)和5mg的固红紫色染料(Sigma，F-1625)染色。使用溶解于150ml的N，N-二 甲基甲酰胺(DMF，Sigma#_319937)中的Img的萘酚AS磷酸酯。使反应进行10-30分钟，然 后观察红色的颜色。在清楚地观察到红色的颜色时，将其用流水洗涤并干燥。在光学显微 镜下观察TRAP染色的细胞。TRAP溶液分析根据以下方法进行TRAP阳性细胞的TRAP溶液分析。除去培养基，添加100 μ 1的10%福尔马林并在室温下保温10分钟。在添加100 μ 1的甲醇/丙酮之后，在室温下保温 1分钟，然后干燥。加入TRAP底物溶液并在37°C保温20-30分钟，所述TRAP底物溶液包括 溶解于20mlTRAP缓冲液(pH 5. 2)的pNPP (对硝基苯基磷酸酯)片剂。将100 μ 1的TRAP 底物溶液转移到新的96孔板中，其中包含50 μ 1的IN NaOH0最后，在405nm测量OD (光密 度)值。D-松醇的细胞毒性分析为了验证D-松醇对Raw264. 7细胞的细胞毒性，将Raw264. 7细胞在96孔板上生 长，直到0. 5X103细胞/200μ 1。将细胞培养3天，同时用分别为1,3. 5,7,12. 5,25 ^P 50mM 的浓度的D-松醇处理。计数3天培养过程中增加细胞数，来确定所添加的化合物的细胞毒 性。为了研究D-松醇对骨髓细胞的细胞毒性，将骨髓细胞调节为在96孔板上的 1.0\105细胞/20(^1并与50叫/1111的M-CSF共同培养。然后使培养细胞生长4天，同时用 分别为1,3. 5,7,12. 5，25和50mM的浓度的D-松醇处理。使用CCK8试剂盒(Cell Counting Kit-8,Dojindo, Japan)测量细胞毒性。将10% CCK8溶液添加到每个培养时间的培养溶液 中并在37°C保温2小时。在保温之后，使用全自动定量绘图酶标仪(Microplate reader) (Bio-Rad)测量450nm的吸光度。D-松醇对骨髓衍生的破骨细胞的分化的影响为了提取小鼠骨髓细胞，将3-4周龄的雄性C57BL/6小鼠的股骨和胫骨无菌摘出 并清除它们的软组织。在所提取的骨组织中切掉长骨的两端，然后通过在一端使用26G注 射器将α -MEM/10% FBS注射到骨髓腔中收集骨髓细胞。使收集的骨髓细胞经受5ng/ml的 M-CSF并保温16小时。收获在板底部上的未连接的细胞。 为了诱导骨髓衍生的破骨细胞的分化，在200ng/ml的s RANKL和50ng/ml的 M-CSF的存在下将每孔1. OX IO5细胞的骨髓细胞与α -MEM/10% FBS培养。在培养过程中将 D-松醇以不同的浓度添加到培养基中。在每个浓度进行三个实验，并在包含sRANKL、M-CSF 和D-松醇的完全培养基中生长第三天之后更换培养基。在第四天在Leica DMIRM显微镜 下观察细胞并进行TRAP染色和TRAP溶液分析。为了考查在每个培养阶段的D-松醇对破骨细胞的影响，将D-松醇以不同的浓度 添加到破骨细胞的培养基中。在每个培养时间分离用D-松醇处理的破骨细胞，然后使用 TRAP溶液分析来分析分化的破骨细胞的量。成骨细胞制备和与破骨细胞的共培养为了制备小鼠的初级成骨细胞，将1天龄的胎小鼠的额骨和顶骨无菌摘出。在用 PBS溶液洗涤所摘出的骨组织之后，随后以20分钟间隔将其用混合酶溶液(0.2%胶原酶和 0.1%中性蛋白酶)处理6次。收获具有成骨细胞性质的细胞，然后用培养溶液洗涤。将经 过洗涤的细胞在包含10%血清的α -MEM中培养3天并用作初级成骨细胞。以在包含维生 素D3(KT6M)和前列腺素E2(PGE2，I(T8M)的96孔板上培养1.0X104细胞/200 μ 1成骨细胞 和1. OX IO5细胞的骨髓细胞的方式进行共培养，持续5天。在培养之后进行TRAP染色。测量破骨细胞在骨吸收过程中的降解能力为了考查D-松醇对破骨细胞在骨吸收过程中的降解能力的影响，将齿骨片段添加到96孔板中，然后培养骨髓细胞，直到1. 0 X IO5细胞/200 μ 1。对于破骨细胞的分化，添加50ng/ml的M-CSF和200ng/ml的s RANKL0以浓度依赖性的方式将D-松醇添加到培养 基中并保温4天。在完成培养之后观察破骨细胞的分化，将细胞从骨片段中取出并通过1 % 甲苯胺蓝染色在显微镜中观察。结果
D-松醇对Raw264. 7细胞的细胞毒性本发明的发明人考查了不同浓度的D-松醇的细胞毒性。通过用不同浓度的D-松 醇处理Raw264. 7细胞考查D-松醇对细胞增殖的影响。培养破骨细胞祖细胞系，Raw264. 7 细胞，并用0-50mM浓度的D-松醇处理。以24小时间隔计数存活的细胞数，持续3天。如 图3中所示，应该理解，即使在50mM D-松醇的最高浓度也没有观察到Raw264. 7细胞细胞毒性。D-松醇对造血干细胞的细胞毒性本发明的发明人考查了 D-松醇对造血干细胞的细胞毒性。从骨髓提取造血干细 胞，然后通过用M-SCF(50ng/ml)处理来诱导细胞增殖。然后，将诱导增殖的细胞用0_50mM 的D-松醇处理，并通过测量CCK8酶活性测定D-松醇对细胞增殖的影响。如图4中所示， 在0-50mM的范围内，D-松醇对CCK8活性没有影响。不超过50mM的D-松醇对造血干细胞 的增殖没有影响。D-松醇对Raw264. 7细胞的破骨细胞形成的抑制活性-TRAP染色在通过RankL引发细胞信号转导时，Raw264. 7细胞开始分化为破骨细胞。在分化 的早期发生细胞之间的融合。在分化完成时，破骨细胞变为具有2-50个细胞核的多核细 胞。多核细胞的形成是与破骨细胞分化有关的典型性质。破骨细胞形成可以通过TRAP染 色来确认。将Raw264. 7细胞系用200ng/ml的RankL处理4天。如图5中所示，在没有向 Raw264. 7细胞系添加RankL时(阴性对照)没有发生Raw264. 7细胞的破骨细胞形成。在 向Raw264. 7细胞系添加200ng/ml的RankL时(阳性对照)，细胞之间的融合显著增加。通 过RankL活化的细胞在TRAP染色中强烈地表现出猩红色的颜色，并观察到多核细胞，所述 融合的细胞。为了考查D-松醇对Raw264. 7细胞的分化过程的影响，向Raw264. 7细胞的培养物 添加表现出没有细胞毒性的最高50mM浓度的D-松醇，然后，观察破骨细胞形成。如图5中 所示，随着D-松醇浓度的增加，破骨细胞形成受到显著削弱。在TRAP染色中观察到的多核 细胞数目也随D-浓度的增加而减少。通过这些结果，发现D-松醇是抑制破骨细胞形成的 物质。为了量化D-松醇在Raw264. 7细胞的破骨细胞形成中的抑制活性，根据不同D-松 醇处理浓度，通过TRAP染色测量多核细胞数。如图6中所示，随着D-松醇浓度的增加，多 核细胞数显著减少。因此，应该理解，D-松醇是抑制Raw264. 7细胞的破骨细胞形成的物质。 D-松醇在50mM的浓度使破骨细胞形成抑制几乎100%。
D-松醇对Raw264. 7细胞的破骨细胞形成的抑制活性-TRAP溶液分析为了研究D-松醇在Raw264. 7细胞的破骨细胞形成中的抑制活性，进行TRAP溶液 分析。已知TRAP(酒石酸盐耐酸性磷酸酶)是破骨细胞形成中的典型的标记物蛋白。如图 7中所示，在TRAP溶液分析中得到的结果与TRAP染色的结果相似，证明了 D-松醇对于破骨细胞形成的抑制活性。然而，得自TRAP溶液分析的D-松醇抑制活性与通过计数多核细胞 数得到的抑制活性相比相对较弱。从这些结果，可以提示D-松醇对TRAP阳性细胞的转化机制的影响是相对弱的，尽管TRAP作为破骨细胞标记物有重要性。D-松醇对骨髓衍生的破骨细胞的分化的抑制活性-TRAP染色破骨细胞由骨髓中的单核细胞分化得到。骨髓衍生的破骨细胞是最接近存在于生 物体中的破骨细胞的初生细胞，其与Raw264. 7细胞形成对比。从骨髓分离破骨细胞的祖细胞，然后用于分化为破骨细胞的实验。可以如 Raw264. 7细胞那样通过TRAP染色在骨髓衍生的破骨细胞中观察多核细胞的分化形式。如图8中所示，可以确认，在RankL(200ng/ml)和M-CSF(50ng/ml)(阳性对照)的 存在下从骨髓培养祖细胞时，在培养4天时形成破骨细胞。然而，在未用细胞因子处理的细 胞(阴性对照)中没有观察到破骨细胞。为了研究D-松醇对从骨髓衍生的单核细胞分化破骨细胞的影响，从骨髓提取造 血干细胞并用M-CSF (5ng/ml)活化1天，导致诱导分化为单核细胞。将单核细胞在200ng/ ml的RankL和50ng/ml的M-CSF的存在下培养4天。在培养过程中添加0_50mM的D-松醇 并使用TRAP染色观察破骨细胞的分化模式。如图8中所示，TRAP染色的破骨细胞的数目与 D-松醇的浓度成比例地减少，表明D-松醇抑制骨髓衍生的破骨细胞的分化，这与Raw264. 7 细胞相似。为了量化D-松醇对骨髓衍生的单核细胞的破骨细胞形成的影响，使用TRAP染色 测量样品内的破骨细胞细胞数。如图9中所示，多核细胞数目随着D-松醇浓度的增加而减 少并且从25mM观察到显著减少。50mM浓度的D-松醇使破骨细胞形成抑制几乎达100%。D-松醇对骨髓衍生的破骨细胞的分化的抑制活性-TRAP溶液分析为了确定D-松醇对破骨细胞形成的抑制作用，使用TRAP溶液分析来分析由骨髓 初级细胞衍生的破骨细胞。如图10中所示，在TRAP溶液分析中也观察到对骨髓衍生的破 骨细胞分化的抑制作用，这表明D-松醇对于骨髓衍生的初级细胞分化为TRAP阳性细胞有 抑制作用。D-松醇对成骨细胞和破骨细胞共培养中的破骨细胞形成的抑制活性成骨细胞和破骨细胞的共培养系统是可以提供与人体最相似环境的并且允许研 究破骨细胞形成过程的共培养系统。从小鼠颅骨提取成骨细胞，然后与骨髓的造血干细胞共培养，以便诱导破骨细胞 的分化。通过在分化诱导过程中用0-50mM范围内的D-松醇处理细胞来研究D-松醇对破 骨细胞形成的影响如图11中所示，多核破骨细胞的细胞数随着D-松醇浓度的增加而显著 减少。在50mM D-松醇的浓度时破骨细胞形成明显地受到抑制。从这个结果，可以理解， D-松醇对于与人体非常相似的共培养系统中的破骨细胞分化也有抑制作用。D-松醇对破骨细胞形成的各个阶段中的破骨细胞分化的抑制活性为了分析D-松醇对骨髓衍生的破骨细胞分化的各个阶段的影响，以时间依赖性 的进程估计在不同浓度D-松醇的存在下培养的破骨细胞的分化状态。如图12中所示，随 着D-松醇浓度的增加，破骨细胞的多核细胞数目显著减少。在不低于25mM的D-松醇时， 从培养之后的2天开始，骨髓衍生的破骨细胞的分化显著受到抑制。以50mM浓度的D-松醇处理时，明显地显示出D-松醇对破骨细胞形成的抑制活性，这证明D-松醇是在破骨细胞 形成的早期阶段产生抑制作用的化合物。还应该理解，D-松醇影响破骨细胞形成的细胞融合阶段。
D-松醇对破骨细胞的骨吸收和降解的抑制活性在身体内，骨碎片被破骨细胞降解和吸收。使用骨碎片测定破骨细胞的骨吸 收_降解能力是体内估计破骨细胞功能的适合的分析方法。为了研究D-松醇对破骨细胞的骨吸收-降解能力的影响，在得自人牙齿的骨碎片 上在分化为破骨细胞的过程中将细胞用0-50mM范围内的D-松醇处理。如图13中所示，使 用骨染色试验法证实，破骨细胞的骨吸收_降解能力随着D-松醇浓度的增加显著地降低。 特别地，在不低于25mM的浓度时，破骨细胞的骨吸收-降解能力显著地降低。这个结果证 明，对破骨细胞形成的抑制作用与对破骨细胞的骨吸收_降解能力的抑制有关。已经描述了本发明的优选实施方案，应该理解，落入本发明范围内的变体和改进 对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且本发明的范围由权利要求及其等价物来决 定。参考文献1. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factorreceptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in Tcells. J Biol Chem. 1997 Oct 3 ； 272(40) :25190-4.2.Diverse roles of the tumornecrosis factor family memberTRANCE in skeletal physiology revealed by TRANCE deficiency andpartial rescue by al ymphocyte-expressed TRANCE trans gene. ProcNatl Acad Sci USA. 2000Sep 26 ； 97(20) 10905-10.3.TRANCE, a TNF family member, act ivates Akt/PKB througha signaling complex inyolving TRAF6and c-Src. Mol Cell.1999Dec ；4(6) 1041-9.4. Bisphosphona tes :Mechanisms of Action. Endocr. Rev. , Febl998 ； 19 80-100.5. The pathobiology of the osteoclast. J. Clin. Pathol. , Mar 1985 ；38 241-252.6. Cancer and Bone. Endocr. Rev.，Feb 1998 ；19 18-54.
权利要求
用于抑制破骨细胞形成(osteoclastogenesis)的组合物，其包括D-松醇作为活性成分。
2.用于预防或治疗骨代谢病症的药物组合物，其包括(a)治疗有效量的D-松醇；和 (b)药学可接受的载体。
3.权利要求2的组合物，其中所述骨代谢病症为骨质疏松症、佩吉特病、高钙血症、赘 生性破坏(neoplastic destruction)、与癌有关的骨吸收疾病、骨质溶解、类风湿性关节炎 或免疫性疾病。
4.用于预防或改善骨代谢病症的功能性食物组合物，其包括D-松醇作为活性成分。
5.权利要求4的组合物，其中所述骨代谢病症为骨质疏松症、佩吉特病、高钙血症、赘 生性破坏、与癌有关的骨吸收疾病、骨质溶解、类风湿性关节炎或免疫性疾病。
6.用于预防或治疗骨代谢病症的方法，包括对患有骨代谢病症的受治疗者给予药物组 合物，所述药物组合物包括(a)治疗有效量的D-松醇；和(b)药学可接受的载体。
7.权利要求6的方法，其中所述骨代谢病症为骨质疏松症、佩吉特病、高钙血症、赘生 性破坏、与癌有关的骨吸收疾病、骨质溶解、类风湿性关节炎或免疫性疾病。
8.D-松醇用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗骨代谢病症。
9.权利要求8的组合物，其中所述骨代谢病症为骨质疏松症、佩吉特病、高钙血症、赘 生性破坏、与癌有关的骨吸收疾病、骨质溶解、类风湿性关节炎、或免疫性疾病。
全文摘要
本发明提供了包括D-松醇作为活性成分的用于抑制破骨细胞形成的组合物和用于预防或治疗骨代谢病症的药物组合物。本发明的组合物对破骨细胞的分化有抑制活性并且可用于预防或治疗由破骨细胞过度活化或过度增殖所引起的骨代谢病症。
文档编号A61K47/00GK101808628SQ200880108501
公开日2010年8月18日 申请日期2008年9月3日 优先权日2007年9月5日
发明者卢载郎, 明贤君 申请人:索建特股份有限公司