治疗肺癌、特别是非小肺癌(nsclc)的组合物的制作方法

专利名称：治疗肺癌、特别是非小肺癌(nsclc)的组合物的制作方法
治疗肺癌、特别是非小肺癌(NSCLC)的组合物 本发明涉及活性(免疫刺激性)组合物，其包括至少一种RNA，优选mRNA，其编码 至少两种(优选不同的)能够在哺乳动物中引发(适应性)免疫反应的抗原。本发明还涉 及包括所述活性(免疫刺激性)组合物的疫苗，涉及所述活性(免疫刺激性)组合物(用 于制备疫苗)的应用和/或所述疫苗用于引发(适应性)免疫反应以用于治疗肺癌、特别 是非小细胞肺癌(NSCLC)、或与其相关的病症的应用，所述肺癌优选选自三种主要亚型的鳞 状细胞肺癌、腺癌和大细胞肺癌。最后，本发明涉及包含所述活性(免疫刺激性)组合物和 /或所述疫苗的试剂盒，特别是多部件的试剂盒。在所有的恶性肿瘤中，有25%为支气管癌(肺癌)。在全世界范围内，这是男性中 最常见的癌症相关的死亡原因，女性中第二常见的癌症相关的死亡原因。在德国，它是排在 前列腺癌(carcinoma of the prostata)和结肠直肠癌之后的第三大类最多的癌症。它每 年在世界范围内引起130万例死亡。在中欧，发病率为约60人/100. 000名居民，并且最近 诊断患有肺癌的人数稳步上升(在德国，目前为约50. 000/年)，当诊断患有肺癌时，平均 总共5年的存活率仅为5%。此外，每名个别患者的生命预期完全取决于疾病阶段(TMN分 类)和患有的癌症(肺癌)的亚型(见下文)。由在显微镜下鉴定的恶性细胞的尺寸和外观分类的肺癌的主要亚型为小细胞肺 癌(20% )和非小细胞肺癌(NSCLC) (80% )0尽管是基于单纯的组织学标准，但是这种分 类对于疾病的临床管理和预后具有非常重要的意义，其中小细胞肺癌通常通过化疗进行治 疗，而非小细胞肺癌主要进行手术作为一线治疗。非小细胞肺癌(NSCLC)分组在一起，是因为它们的预后和管理大致相同。存在三 种主要的亚型鳞状细胞肺癌，腺癌和大细胞肺癌。手术是主要的治疗，然而，仅有四分之 一的患者进行了成功的切除，具有50%的复发率。晚期疾病的治疗方法包括一一在手术 后一一辅助的化疗和/或辅助的放疗，而化疗作为单一治疗(一线治疗)似乎是与相对较 差的结果相关的方法。在四种常用的组合化疗方案的比较中，没有一种是优越的。响应率 从15%到22%变化，1年的存活率为31% -36% (参见，例如，0' Mahony, D.，S. Kummar, 等· (2005). “ Non-small-cell lung cancer vaccine therapy :aconcise review.(非小 细胞肺癌疫苗治疗简短综述)"J Clin Oncol (临床肿瘤学杂志)23 (35) :9022_8)。因 此，即使手术前的化疗似乎尚未导致生命预期的延长，但是辅助的化疗一一还包括如果与 放疗组合一一没有显示出生命预期的显著增加。当前所用的一种化疗方法是组合基于钼的物质与例如吉西他滨(Gemcitabin)甚 至作为一线治疗，而例如培美曲塞用作二线治疗。用于NSCLC治疗的另一选择是所谓的“靶向治疗”，其试图通过在分子水平上影响 肿瘤特异性靶标结构而提高经典细胞毒性化疗的成功性。所用的物质包括贝伐单抗(血管 生成抑制剂)或厄洛替尼，其目的在于表皮生长因子受体(EGFR)的酪氨酸激酶。即使无疑在当前的肺癌、特别是NSCLC的治疗方法处理中存在一些提高，但是由 于高死亡率，对于其它、备选的或改进的治疗方法的强烈需求仍然是一场艰难的战斗。因此，本文建议在NSCLC治疗方法中应用免疫系统。免疫系统在多种疾病的治疗和预防中起着重要的作用。按照目前的知识水平，哺乳动物提供了多种机制通过识别和杀 死例如肿瘤细胞来保护生物体。这些肿瘤细胞必须检测到并且与生物体的正常细胞和组织 区别开来。脊椎动物如人的免疫系统由多种类型的蛋白、细胞、器官、和组织组成，其以精细 的和动态的网络相互作用。作为该种更复杂的免疫反应的部分，脊椎动物系统随时间适应 更有效地识别特定病原体或肿瘤细胞。适应过程产生免疫学记忆，并且允许在将来相遇过 程中甚至更有效的保护。该适应性或获得性免疫性过程形成接种策略的基础。适应性免疫系统是抗原特异性的，并且需要在称为抗原呈递的过程中识别特定的 “自体”或“非自体”抗原。抗原特异性允许产生专门针对特定病原体或病原体-感染细胞 或肿瘤细胞的反应。固定这些专门反应的能力在体内通过所谓的“记忆细胞”保持。如果 病原体不止一次感染机体，则这些特异性记忆细胞用来快速清除其。因此，适应性免疫系统 允许更强的免疫反应以及允许免疫学记忆，其中每种病原体或肿瘤细胞被一种或多种特征 抗原“记住”。脊椎动物中适应性免疫系统的主要成分在细胞水平主要包括淋巴细胞，在分子水 平主要包括抗体。淋巴细胞作为适应性免疫系统的细胞成分包括B细胞和T细胞，其来源 于骨髓中的造血干细胞。B细胞参与体液反应，而T细胞参与细胞介导的免疫反应。B细胞 和T细胞携带识别特定靶标的受体分子。仅在抗原(例如，病原体的小片段)已经被处理 且与称为主要组织相容性复合体(MHC)分子的“自我”受体组合呈递后，T细胞识别“非自 我”靶标，如致病性靶标结构。相反，B细胞抗原特异性受体是在B细胞表面上的抗体分子， 并且当其表面上的抗体与特异性外源抗原结合时，识别这样的病原体。该抗原/抗体复合 体被B细胞吸收，并且通过蛋白质水解作用处理成肽。然后，B细胞在其表面II类MHC分 子上展示这些抗原肽。MHC和抗原的这种组合吸引匹配的辅助T细胞，其释放淋巴因子并且 激活B细胞。因为活化的B细胞然后开始分化，其后代分泌数百万拷贝的识别该抗原的抗 体。这些抗体在血浆和淋巴中循环，结合病原体或表达所述抗原的肿瘤细胞，并且将它们标 记，用以通过补体激活进行分解或用以通过吞噬细胞吸收和分解。作为适应性免疫系统的细胞成分，细胞毒性T细胞(CD8+)可以形成CTL-反应。细 胞毒性T细胞(CD8+)可以识别来自内源性病原体的肽和由I型MHC分子结合的自体抗原。 CD8+-T细胞通过在细胞中释放细胞毒性蛋白而行使它们的杀伤功能。免疫系统机制形成有疗效的治疗的靶标。适当的方法典型地基于施用佐剂，以引 发先天性免疫反应，或者基于施用抗原或免疫原，以激发适应性免疫反应。由于抗原典型地 是基于病原体(例如，表面蛋白)或其片段的特定成分，所以还考虑向患者施用核酸然后其 表达需要的多肽、蛋白或抗原。迄今为止引发免疫反应，免疫或接种的常规方法是基于DNA分子的应用，以将需 要的遗传信息结合到细胞中。已经开发了多种方法，用以将DNA引入到细胞中，如磷酸钙转 染，聚戊二烯转染、原生质体融合，电穿孔，显微注射和脂质转染法，已经特别证明脂质转染 法是合适的方法。DNA病毒可以同样用作DNA赋形剂。由于它们的感染特性，所述病毒实 现非常高的转染率。所用的病毒以这样的方式进行遗传修饰，以致在转染细胞中不形成功 能性感染颗粒。然而，尽管有这些防范，不可能排除所引入的基因和病毒基因的不可控的繁 殖的风险，这是例如由于潜在的重组事件引起。这还伴随着例如通过重组DNA被插入到宿主细胞基因组的完整基因中的危险，产生这样的后果，即，该基因可能突变，并且因此完全 或部分失活，或者可能产生错误信息。换言之，对细胞至关重要的基因产物的合成完全被抑 制，或者备选地表达修饰的或错误的基因产物。如果DNA整合到参与细胞生长调控的基因 中，则发生一种特别的危险。在该情形中，宿主细胞可能变成退化的，并且导致癌症或肿瘤 形成。此外，如果引入到细胞中的DNA将被表达，则相对应的DNA赋形剂需要包含强启动子， 如病毒CMV启动子。所述启动子整合到治疗的细胞的基因组中可以在细胞中导致基因表达 调控的不需要的改变。使用DNA作为诱导免疫反应的试剂(例如，作为疫苗)的另一种危 险是在已经引入了外源DNA的患者中诱导致病性抗-DNA抗体，因此导致(可能致死性)的 免疫反应。因此，综上所述，对于有效的系统存在空间和需求，所述有效的系统可以用来有效 地刺激免疫系统，以允许治疗肺癌，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)，同时避免由于基于DNA 的组合物引起的所引入的基因的不可控增殖的问题。因此，本发明的目的是提供一种组合物，其a)允许通过刺激免疫系统治疗肺癌， 同时b)避免上述提及的缺点。这一目的由本发明的主题解决，特别是由活性(免疫刺激性)组合物解决，所述活 性(免疫刺激性)组合物包括至少一种RNA，其编码选自包括下列抗原的组的至少两种(优 选不同的)抗原· hTERT，‘ WTl,· MAGE-A2,· 5T4,· MAGE-A3,‘ MUCl,· Her-2/neu,· NY-ESO-1，· CEA， 存活蛋白，· MAGE-Cl，和/ 或·ΜΑ6Ε-C2。令人吃惊地，已经发现前文提及的组的至少两种抗原、抗原性蛋白或抗原性肽的 特定组合，被包含在本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物中，能够有效地刺激(适应 性)免疫系统，以允许治疗肺癌，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)。在本文中，术语抗原、抗原 性蛋白或抗原性肽可以同义使用。在本发明的上下文中，本发明所述的活性(免疫刺激性) 组合物还应该理解为一种组合物，其能够引发免疫反应，优选是本文定义的适应性免疫反 应，这是由于所述活性(免疫刺激性)组合物的成分所包含或所编码的成分之一引起，优选 是由编码至少两种(优选不同的)抗原的至少一种RNA，优选是(m)RNA引起。所述活性(免疫刺激性)组合物的至少一种RNA可以编码hTERT。在本发明的 上下文中，“hTERT”是人端粒末端转移酶反转录酶，并且编码“hTERT”的RNA、优选mRNA 的优选序列一一如果用于本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物中一一显示在图7中(SEQ ID N0:7)，并且——甚至更优选地，显示在图8中(SEQ ID NO :8)。Minev, Hipp 等.(2000)描述了端粒末端转移酶是一种核糖核蛋白酶，其已经与人细胞中的恶性转化相 联系(Minev, B. , J. Hipp,等，(2000). “ Cytotoxic T cell immunity againsttelomerase reverse transcriptase in humans.(针对人中端粒末端转移酶反转录酶的细胞毒性T细 胞免疫性)〃 Proc Natl Acad Sci USA (美国国家科学院学报)97 (9) :4796_801)。在非 常大部分的人肿瘤中，端粒末端转移酶活性升高，使得其基因产物成为所有人肿瘤最常见 的分子。因此，内源性加工的与I类MHC分子结合的端粒末端转移酶肽的产生可能使细胞 毒性T淋巴细胞(CTL)靶向不同来源的肿瘤。因此，根据它们，这可能促进针对癌症的疫苗 治疗，条件是在正常成人和癌症患者中识别端粒末端转移酶肽的前体CTL可以通过免疫扩 充。他们还证明，在体外针对来自端粒末端转移酶反转录酶(hTRT)的两种HLA-A2. 1限制 性肽免疫的大部分正常个体和患有前列腺癌的患者发展了 hTRT-特异性的CTL。Carpenter 禾口Vonderheide (2006) (Carpenter,Ε· L.禾口R. H. Vonderheide(2006) ； “ Telomerase-based immunotherapy of cancer (基于端粒末端转移酶的癌症免疫治疗).“Expert Opin Biol Ther (生物学治疗的专家观点)6 (10) :1031_9)报道了从1997年克隆人端粒末端转移酶反 转录酶(hTERT)到hTERT作为抗肿瘤免疫治疗靶标的第一次临床试验的进展已经是迅速 的。hTERT在大部分人癌症中是过量表达的，而其在正常的成人组织中具有有限的表达。其 在肿瘤形成中起着重要作用，并且可以由癌症干细胞表达。然而，尽管是自体抗原，hTERT在 体外和体内均是免疫原性的。已经在患有乳腺癌、前列腺癌、肺癌和其它癌症的患者中完成 了一些I期hTERT免疫治疗研究，并且临床和免疫学结果是令人鼓舞的。在不存在临床毒 性的条件下，免疫治疗诱导患者中的功能性抗肿瘤T细胞。对于基于hTERT的治疗，还可以 考虑作为免疫预防策略而接种个体的时机。Nair，S. K.和Heiser等，(2000)描述了在用 转导了鼠TERT RNA的树突细胞接种的小鼠中诱导了抗鼠TERT免疫性(参见Nair，S. K.， A. Heiser,等，(2000). “ Induction of cytotoxic T cell responses and tumor immunity against unrelatedtumors using telomerase reverse transcriptase RNA transfected dendritic cells.(使用端粒末端转移酶反转录酶RNA转染的树突细胞诱导细胞毒性T细 胞反应和针对不相关的肿瘤的肿瘤免疫性)"Nat Med(自然医学)6(9) :1011-7·)。按照 优选实施方案，因此，所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA可以编码选自如 图7所示(SEQ ID N0:7)，且——更优选地图8所示(SEQ ID NO 8)的序列的hTERT抗原。 按照更优选的实施方案，所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA可以备选地 或另外编码选自下列各项的hTERT抗原如图7所示(SEQ ID NO 7)，且一一更优选地图 8所示(SEQ ID NO 8)的hTERT序列的片段、变体或表位。 所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA还可以编码WT1。在本发明的 上下文中，“WT1 ”是维尔姆斯瘤1，并且优选的编码“WT1 ”的RNA序列、优选mRNA序列一一如 果用在本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物中显示在图9中(SEQ ID N0:9)，更 优选显示在

图10中(SEQ ID NO 10)，并且-甚至更优选地-显示在图11中(SEQ ID NO 11)。Oka, Y. Α.和Tsuboi等，(2004)发现维尔姆斯瘤蛋白在肺癌中过量表达(参见Oka， Y.,A. Tsuboi,等，(2004) · “ Induction of WTl(Wilms‘ tumorgene)-specific cytotoxic T lymphocytes by WTl peptide vaccine and theresultant cancer regression. (iM 过WTl肽疫苗诱导WTl (维尔姆斯瘤基因)-特异性细胞毒性T淋巴细胞和所获得的癌症衰退)〃 Proc Natl Acad Sci USA(美国国家科学院学报)101 (38) 13885-90)。Oka 等，(2004，同前所述)用来源于WTl的肽接种了 10名肺癌患者。他们可表明，临床反应与抗肿 瘤CD8+T细胞活性相关。维尔姆斯瘤基因WTl在白血病和多种类型的实体瘤中过量表达，并 且证明WTl蛋白是针对这些恶性肿瘤的免疫治疗的令人感兴趣的靶标抗原。Oka等，(2004， 同前所述)报道了基于WTl肽的免疫治疗用于患有乳腺癌或肺癌、脊髓发育不良综合征、或 急性骨髓性白血病的患者的I期临床研究的结果。对于可以评估WTl接种功效的20名患 者中有12名表现出临床响应，如白血病母细胞或肿瘤尺寸和/或肿瘤标记的减少。在WTl 接种后的WTl-特异性细胞毒性T淋巴细胞的频率和临床响应的增加之间观察到明显的相 关性。因此，证明WTl接种可能诱导WTl-特异性细胞毒性T淋巴细胞，并且导致癌症衰退， 而不损伤正常组织。按照优选实施方案，所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种 RNA可以因此编码选自如图9 (SEQ ID NO 9)所示，且-更优选地，如图10 (SEQ ID NO 10) 所示且甚至更优选地如图11 (SEQ ID NO :11)所示的序列的WTl抗原。按照更优选的实施 方案，所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA可以备选地或另外地编码选自 下列各项的WTl抗原如图9 (SEQ ID NO 9)所示，且-更优选地，如图10 (SEQ ID NO 10) 所示，且甚至更优选地如图11(SEQ ID N0:11)所示的WTl序列的片段、变体或表位。所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA还可以编码MAGE-A2。在本 发明上下文中，“MAGE-A2”是黑素瘤抗原家族A，2B,并且优选的编码“MAGE-A2”的RNA序 列、优选是mRNA序列一一如果用在本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物中一一显 示在图14(SEQ ID N0:14)中，且-甚至更优选地-显示在图15(SEQ ID N0:15)中。 Gillespie和 Coleman(1999) (Gillespie，A.M.和 R. Ε· Coleman(1999). “ The potentialof melanoma antigen expression in cancer therapy.(黑素瘤抗原表达在癌症治疗中的潜 力)"Cancer Treat Rev (癌症治疗综述)25 (4) :219_27)报道了在膀胱癌、乳腺癌、结肠 直肠癌、胃癌、头颈癌、肺癌、上颂骨癌、黑素瘤、食管癌、骨肉瘤、和卵巢癌中的表达。按照优 选实施方案，所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA可以因此编码选自如图 14 (SEQ ID NO 14)所示，且-更优选地，如图15 (SEQ ID NO 15)所示的序列的MAGE-A2抗 原。按照更优选的实施方案，所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA可以另 外或者备选地编码选自下列各项的MAGE-A2抗原如图14(SEQ ID NO 14)所示，且-更优 选地，如图15(SEQ ID NO 15)所示的MAGE-A2序列的片段、变体或表位。所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA还可以编码5T4。在本发明 的上下文中，“5T4”是滋养层糖蛋白，并且优选的编码“5T4”的RNA序列，优选是mRNA序
列--------如果用在本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物中一一显示在图3 (SEQ ID
NO 3)中，且-甚至更优选地-显示在图 4(SEQ ID NO 4)中。Harrop，Connolly 等，(2006) 报道了人癌胚抗原5T4是一种72-kDa的富含亮氨酸的膜糖蛋白，其以高水平表达在胎盘 上，并且还表达在宽范围的人癌症上，包括结肠直肠癌、胃癌、肾癌、和卵巢癌，但是在正常 组织中很少表达(参见Harrop，R.，N. Connolly，等，(2006). “ Vaccination of colorectal cancer patients with modified VacciniaAnkara delivering the tumor antigen 5T4 (TroVax) induces immune responseswhich correlate with disease control -.a phase I/II trial.(用递送肿瘤抗原5T4 (TroVax)的改良安卡拉疫苗(Vaccinia Ankara) 接种结肠直肠癌患者诱导与疾病控制相关的免疫反应I/II期试验)"Clin CancerRes (临床癌症研究)12 (11 Ptl) :3416-24)。5T4的过量表达与患有结肠直肠癌、胃癌和卵巢癌的患者的较差的预后相关。尽管所述组合因素，在TroVax免疫后，在大部分患者(17 名中有16名；94%)中诱导了 5T4-特异性细胞和/或体液免疫反应，与多种其它癌症免疫 治疗实验相比较，认为其是令人鼓舞的。总之，他们证明了通过i.m.和i.d.施用途径递送 的 TroVax 的安全性和免疫原性。Zhao 和 Wang (2007) (Zhao，Y.和 Y. Wang (2007). 〃 5T4on cotrophoblast glycoprotein janus molecule in life and a novel potentialtarget against tumors. (5T4癌滋养层糖蛋白在生命和新型潜在的抗肿瘤靶标中的两面分 子)"Cell Mol Immunol (细胞分子免疫学)4 (2) :99_104)报道了 5T4癌滋养层糖蛋白是 一种表达在胚胎组织和多种恶性肿瘤细胞表面上的跨膜蛋白。它在多种生物学和病理学过 程中起着至关重要的作用，包括在胚胎形成过程中的大量细胞迁移，与植入相关的细胞侵 入，和肿瘤发生进展中的肿瘤转移。按照Kopreski，Benko等，(2001)，5T4是通常在上皮 恶性肿瘤中过量表达的滋养层糖蛋白，其为癌症治疗提供了潜在的靶标(参见Kopreski， Μ. S. , F.A.Benko,等，(2001). " Circulating RNA asa tumor marker !detection of 5T4 mRNA in breast and lung cancer patientserum.(循环的RNA作为肿瘤标记在乳腺癌禾口 肺癌患者血清中检测5T4mRNA) 〃 Ann NY Acad Sci (纽约科学学会年刊)945 172-8)。血清 收集自19名患有晚期乳腺癌(5名患者)或非小细胞肺癌(14名患者)患者，和25名具有 扩增RNA的正常对照志愿者。将由所述血清提取的RNA用半巢式、两阶段反应进行RT-PCR 扩增，产物通过凝胶电泳检测。5T4mRNA在8/19(42%)癌症患者血清中可重复检测到，其 中包括2/5乳腺癌患者血清和6/14肺癌患者血清，但是仅在3/25(12% )正常对照血清中 可重复检测到(P = 0. 035)。按照优选实施方案，所述活性(免疫刺激性)组合物的所述 至少一种RNA可以因此编码选自如图3 (SEQ ID NO 3)所示，且-更优选地，如图4 (SEQ ID NO 4)所示的序列的5T4抗原。按照更优选的实施方案，所述活性(免疫刺激性)组合物的 所述至少一种RNA可以备选地或另外地编码选自下列各项的5T4抗原如图3 (SEQ ID NO 3)所示，且-更优选地，如图4(SEQ ID NO 4)所示的5T4序列的片段、变体或表位。
所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA还可以编码MAGE-A3。在 本发明的上下文中，‘‘MAGE-A3”是黑素瘤抗原家族A，3，并且优选的编码‘‘MAGE-A3”的 RNA序列，优选是mRNA序列，一一如果用在本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物 中——显示在图16 (SEQ ID NO :16)中，且-甚至更优选地-显示在图17 (SEQ ID N0: 17)中。Gillespie 和 Coleman (1999) (Gillespie，A.M.和 R. Ε· Coleman (1999) · “ The potentialof melanoma antigen expression in cancer therapy. (MM'^iliW^^iik^ 癌症治疗中的潜力)"Cancer Treat Rev (癌症治疗综述)25 (4) :219_27)报道了在膀 胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、神经胶质瘤、头颈癌、肺癌、上颂骨癌、黑素瘤、成神经细 胞瘤、食管癌和卵巢癌中的表达。Sienel，Varwark等，(2004)描述了为确定在早期非小 细胞肺癌(NSCLC)中的MAGE-A3表达率进行的研究(参见Sienel，W.，C. Varwerk,等， (2004). “ Melanomaassociated antigen(MAGE)-A3 expression in Stages I and II non-small celllung cancer :results of a multi-center study.(在 I 禾口 II 期非小细胞 肺癌中的黑素瘤相关的抗原(MAGE)-A3的表达多中心研究的结果)“Eur .TCardiothorac Surg (欧洲心肺手术杂志)25 (1) 131-4)。收集来自204名具有手术临床I和II期NSCLC 的患者的原发性肿瘤样品，并且确定病理学阶段。通过使用反转录酶聚合酶链式反应检测MAGE-A3转录物而分析来自组织样品的MAGE-A3表达。在204份检验的I-II期原发性肿 瘤中的 80 份(39. 2% )中观察至Ij MAGE-A3 表达。Atanackovic, Altorki 等，(2004)描述 了 MAGE-A3，最初在黑素瘤中鉴定的一种肿瘤相关抗原，还在非小细胞肺肿瘤中发现(参见 Atanackovic, D. , N. K. Altorki,等，(2004). “ Vaccine-induced CD4+T cell responses to MAGE-3 protein in lung cancerpatients.(在肺癌患者中疫苗诱导的针对 MAGE-3 蛋 白的CD4+T细胞反应)“J Immunol (免疫学杂志)172 (5) :3289_96)。在临床试验中，9名 NSCLC患者接种该蛋白；3名发展了抗体反应。接受与佐剂AS02B组合的MAGE-A3的8名患 者中有7名产生了针对MAGE-A3的抗体。这些患者中的一些还发展了针对该蛋白的T细胞 反应。按照优选实施方案，所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA可以因此 编码选自如图16(SEQ ID NO 16)所示，且-更优选地，如图17 (SEQ ID N0:17)所示的序列 的MAGE-A3抗原。按照更优选的实施方案，所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一 种RNA可以备选地或另外地编码选自下列各项的MAGE-A3抗原如图16 (SEQ ID NO 16)， 所示，且_更优选地，如图17 (SEQ ID NO 17)所示的MAGE-A3序列的片段、变体或表位。
所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA还可以编码MUCl。在本发 明的上下文中，“MUC1”是黏蛋白1，并且优选的编码“MUC1”的RNA序列、优选是mRNA序 列如果用在本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物中显示在图1 (SEQ ID N0 1)中，且-甚至更优选地-显示在图2 (SEQ ID NO 2)中。癌症相关的黏蛋白是用于免疫 治疗的潜在的靶标。认为这些分子通过促进恶性细胞黏附到内皮细胞表面而促进转移。 按照 Denda-Nagai 禾Π Irimura (2000) (Denda-Nagai, K.和 Τ. Irimura (2000). “ MUCl in carcinoma-host interactions.(癌症-宿主相互作用中的MUC1) 〃 Glycoconj J17(7_9) 649-58)，MUC-I在90%的所有腺癌中过量表达， 包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃 癌、结肠癌和卵巢癌。Kontani，Taguchi等，(2001)发现，已经发现MUC-1在60 %的肺癌 Kontani, K. , 0. Taguchi,^, (2001). “ Modulation of MUClmucin as an escape mechanism of breast cancer cells from autologouscytotoxic T-lymphocytes. (MUC1黏蛋白的调控作为乳腺癌细胞逃离自体细胞毒性T淋巴细胞的逃逸机制)"Br J Cancer (英国癌症杂志)84 (9) 1258-64)，而 Kontani，Taguchi 等，(2003)在分析使用 MUCl 抗原脉冲的DCs来在MUCl阳性癌症中引发细胞免疫性的研究中发现，临床上9名MUC-I 阳性患者中有7名响应该治疗，具有肿瘤标记水平的下降或恶性胸膜渗出的消失(参见 Kontani,K. ,0. Taguchi,等，(2003) · “ Dendritic cellvaccine immunotherapy of cancer targeting MUCl mucin.(靶向MUCl黏蛋白的树突细胞疫苗癌症免疫治疗)〃 Int J Mol Med (国际分子医学杂志)12 (4) :493-502)。这些响应的患者中有三名患有NSCLC。Palmer, Parker等，(2001)报道了在III/IV期NSCLC中使用MUCl肽的I期临床试验中，确定了该 试剂的安全性和耐受性(参见 Palmer，M.，J. Parker，等，(2001). “ Phase I study of the BLP25(MUC1 peptide)liposomal vaccine for activespecific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer (在IIIB/IV期非小细胞肺癌中用于活性特异性免 疫治疗的BLP25(MUC1肽)脂质体疫苗的I期研究).“Clin Lung Cancer (临床肺癌)3 (1) 49-57;讨论58)。12名患者中有5名(42具有免疫学响应，并且12名患者中有4名 (33% )达到了稳定疾病。Wierecky，Mueller 等，(2006)还鉴定了 TAAMUC1 的两种 HLA-A2 结合的新型9-mer肽，其在多种血液学和上皮恶性肿瘤上过量表达(参见Wierecky，J.，Μ. Mueller,等，(2006). “ Dendriticcel1-based cancer immunotherapy targeting MUC-1.(靶向MUC-I的基于树突细胞的癌症免疫治疗)〃 Cancer Immunol Immunother (癌 症免疫学免疫治疗)55(1) :63-7)。在用这些肽脉冲DC后产生的细胞毒性T细胞能够以抗 原-特异性和HLA-限制性方式诱导表达MUCl的肿瘤细胞裂解。在两个临床研究中，表明 用MUCl衍生的肽脉冲的DCs接种患有晚期癌症的患者是很好耐受的，没有严重的副作用， 并且能够诱导免疫学反应。在20名患有转移性肾细胞癌的患者中，6名患者表现出转移的 衰退，3名具有客观的响应(1CR，2PR)。按照优选实施方案，所述活性(免疫刺激性)组合 物的所述至少一种RNA可以因此编码选自如图1 (SEQ ID NO :1)所示，且-更优选地，如图 2 (SEQ ID NO 2)所示的序列的MUCl抗原。按照其它优选的实施方案，所述活性(免疫刺激 性)组合物的所述至少一种RNA可以备选地或另外地编码选自下列各项的MUCl抗原如图 1(SEQID NO 1)中所示，且-更优选地，如图2 (SEQ ID NO 2)中所示的MUCl序列的片段、 变体或表位。 所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA还可以编码Her-2/neu。在 本发明的上下文中，“Her-2/neu”是V-erb_b2成红血细胞白血病病毒癌基因同源物2，并 且优选的编码“Her-2/neu”的RNA序列、优选是mRNA序列一一如果用在本发明所述的活 性(免疫刺激性)组合物中显示在图5(SEQ ID NO 5)中，且-甚至更优选地-显 示在图 6(SEQ IDNO :6)中。按照 Baxevanis，Sotiropolou 等，(2004)，HER-2/neu(还已 知为HER2或C-erb-B2)是一种具有酪氨酸激酶活性和广泛的针对表皮生长因子(EGF) 受体的同源性的185-kDa蛋白受体(参见Baxevanis, C. N.，P. A. Sotiropoulou,等， (2004). “ Immunobiology of HER-2/neu oncoprotein and itspotential application in cancer immunotherapy. (HER-2/neu癌蛋白的免疫生物学及其在癌症免疫治疗中潜在 的应用)〃 Cancer Immunol Immunother (癌症免疫学和免疫治疗)53 (3) 166-75)。HER_2/ neu在多种上皮肿瘤中表达，并且已知在约20-25%的所有的卵巢癌和乳腺癌、35-45%的 所有的胰腺癌、和多至90%的结肠直肠癌中过量表达。HER-2/neu过量表达代表较差的预 后的标记。已经在乳腺、卵巢、胰腺、结肠、肺和其它组织的恶性肿瘤中观察到Her-2的过 量表达。正常情况下，Her-2以低水平在多种人组织(皮肤，消化道上皮，乳腺，卵巢，肝细 胞)中表达。Bernhard，Salazar (2002)在他们的结论中报道，针对HER-2/neu主动免疫 癌症患者的临床试验的早期结果表明可能产生免疫性，并且免疫反应持续一段时间(参见 Bernhard, H. , Salazar L.,等，(2002). “ Vaccination against the HER-2/neuoncogenic protein.(针对HER-2/neu致瘤蛋白的接种)〃 Endocr Relat Cancer (内分泌相关癌 症)9(1) 33-44) 0当前的疫苗试验完全集中于基于表位或基于肽的疫苗的使用，主要是 由于这样的观察，即，在啮齿动物模型中肽疫苗策略可能回避neu-特异性耐受性。按照 Bernhard等，(2002，同前所述)的下一代疫苗方法将可能包括基于蛋白的疫苗，负载在DC 上的HER-2/neu抗原制备物，和基于核酸的制剂。在啮齿动物模型中在临床前水平研究这 些策略的研究是有希望的。因此，在主动免疫后离体扩增HER-2/neu-特异性T-细胞或用表达HER-2/neu的DC在体外培养被认为是治疗晚期过度表达HER-2/neu的肿瘤的治疗 选择。Baxevanis，Sotiridou等，(2006)发现，在人类中，尽管已经检测到针对用于接种 的肽的免疫学反应，但是尚没有记述临床响应(参见Baxevanis，C. N.，N. N. Sotiriadou, 等，(2006). ‘‘ Immunogenic HER-2/neu peptides as tumor vaccines.(作为月中瘤疫苗的免疫原性HER-2/neu肽)“Cancer Immunol Immunother (癌症免疫学免疫治疗)55 (1)85-95)。按照 Disis，Gooley 等，(2002)，Her-2/neu 是 EGFR家族的一员(参见 Disis，M. L.， T. A. Gooley,等，(2002). “ Generation ofT-cell immunity to the HER-2/neu protein after active immunization withHER-2/neu peptide-based vaccines.(用基于 HER-2/ neu肽的疫苗主动免疫后产生针对HER-2/neu蛋白的T细胞免疫性)"J Clin Oncol (临 床肿瘤学杂志)20 (11) :2624-32)。它通常在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌和肺癌中过 量表达。在I期临床试验中，38名患者(2名患有NSCLC)用Her-2/neu肽接种。92%的患 者发展了针对Her-2/neu的T-细胞免疫性。按照优选实施方案，所述活性(免疫刺激性) 组合物的所述至少一种RNA可以因此编码选自如图5 (SEQ ID NO 5)所示，且-更优选地， 如图6(SEQ ID NO 6)所示的序列Her-2/neu抗原。按照更优选的实施方案，所述活性(免 疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA可以备选地或另外地编码选自下列各项的Her-2/ neu抗原如图5 (SEQ ID NO 5)所示，且-更优选地，如图6 (SEQ ID NO 6)所示的Her_2/ neu序列的片段、变体或表位。 所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA还可以编码NY-ES0-1。在 本发明的上下文中，“NY-ES0-1”是癌症/睾丸抗原1B，并且优选的编码“NY-ES0-1”的RNA 序列、优选是mRNA序列一一如果用在本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物中一一显 示在图20 (SEQ ID NO 20)中，且-甚至更优选地-显示在图21 (SEQ ID NO 21)中。Chen， Scanlan等，(1997)报道了通过RT-PCR发现NY-ES0-1在多种人肿瘤中的mRNA表达，黑素瘤 23/67，卵巢癌2/8，乳腺癌10/33，甲状腺癌2/5，前列腺癌4/16，膀胱癌4/5，结肠癌0/16， 伯基特淋巴瘤1/2，神经胶质瘤0/15，基底细胞癌0/2，胃癌0/12，平滑肌肉瘤0/2，肺癌 2/12，其它肉瘤0/2，肾癌0/10，胰腺癌0/2，淋巴瘤0/10，精原细胞瘤0/1，肝细胞瘤2/7，脊 髓瘤0/1(参见0^11，￥.1\，]\1工50&111&11，等，(1997).〃 A testicular antigenaberrantly expressed in human cancers detected by autologous antibody screening.(通过自体 抗体筛查检测到在人癌症中异常表达的睾丸抗原)〃 Proc Natl Acad Sci USA(美国国家 科学院学报)94(5) 1914-8) ο Jager，Karbach 等，(2006)报道了 NY-ESO-1 是在宽范围人 恶性肿瘤中表达的癌症/睾丸抗原，并且正在开发多种靶向NY-ES0-1的疫苗策略(参见 Jager, E. , J. Karbach,等，(2006). “ Recombinant vaccinia/fowlpox NY-ESO-Ivaccines induce both humoral and cellular NY-ES0-l-specific immuneresponses in cancer patients.(重组痘苗/禽痘NY_ES0_1疫苗在癌症患者中诱导体液和细胞NY-ES0-1-特异 性免疫反应)〃 Proc Natl Acad Sci USA (美国国家科学院学报)103 (39) :14453_8)。在本 研究中，在一系列具有一定范围的不同肿瘤类型的36名患者中分析重组痘苗-NY-ES0-1和 重组禽痘-NY-ES0-1的安全性和免疫原性。每种构建体首先以两种不同的剂量水平检测， 然后用重组痘苗-NY-ES0-1之后是重组禽痘-NY-ES0-1的引发-加强设定。所述疫苗不论 是单独的还是一起的很好耐受。通过以每月一次的时间间隔至少4次接种的过程，在高比 例的患者中诱导了针对宽范围的NY-ES0-1表位的NY-ES0-1-特异性抗体反应和/或特异 性⑶8和⑶4T细胞反应。源自5名接种的患者的⑶8T细胞克隆表现出裂解表达NY-ES0-1 的黑素瘤靶细胞。在数名患有黑素瘤的患者中，存在强烈的印象，即，疾病的自然过程有利 地被接种影响。Davis，Chen等，(2004)报道了皮内注射的HLA-A2-限制性NY-ES0-1肽 表现出是安全和免疫原性的(Davis，I.D.，W. Chen，等，(2004). “ Recombinant NY-ES0-1protein withlSCOMATRIX adjuvant induces broad integrated antibody and CD4(+) andCD8 (+)T cell responses in humans.(重组NY-ESO-l 蛋白与 ISCOMATRIX佐剂在人中诱 导广泛整合的抗体和CD4(+)与CD8(+)T细胞反应)"ProcNatl Acad Sci USA(美国国家科 学院学报)101(29) 10697-702) 0尽管设计这些试验仅是为了确定安全性和免疫原性，但 是一些患者表现出肿瘤衰退或疾病的稳定。JagenGnjatic等，(2000)进一步表示，在具有 切除的表达NY-ES0-1的黑素瘤的患者中用重组NY-ES0-1蛋白组合ISCOMATRIX佐剂(CSL Ltd.，Parkville，Victoria，澳大利亚)免疫后，观察到广泛的NY-ES0-1-特异性免疫反应， 包括抗体和 CD4 与 CD8T 细胞反应(参见 Jager, E.，S. Gnjatic,等，(2000) · “ Induction of primary NY-ESO-limmunity :CD8+T lymphocyte and antibody responses in peptide-vaccinatedpatients with NY-ESO-l+cancers.(诱导一级 NY-ESO-1 免疫个生在 肽-接种的NY-ES0-1+癌患者中的CD8+T淋巴细胞和抗体反应)〃 Proc NatlAcad Sci USA(美国国家科学院学报)97(22) =12198-203) 0这种针对疫苗的免疫反应似乎与长久的 无疾病存活相关。此外，Odunsi，Qian等，(2007)报道用NY-ES0-1肽接种在卵巢癌中诱 导整合的体液禾口 T 细胞反应(参见 Odunsi，K.，F. Qian，等，(2007). “ Vaccination with an NY-ESO-Ipeptide of HLA class I/II specificities induces integrated humoral and T cellresponses in ovarian cancer.(用 HLA I/II 类特异性 NY-ESO-l 肽接种诱导 整合的体液和T细胞反应)"Proc Natl Acad Sci USA(美国国家科学院学报)104 (31) 12837-42)。按照优选实施方案，所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA可以 因此编码选自如图20 (SEQ ID NO :20)所示序列，且-更优选地，如图21 (SEQ ID NO :21)所 示的序列的NY-ES0-1抗原。按照更优选的实施方案，所述活性(免疫刺激性)组合物的所 述至少一种RNA可以备选地或另外地编码选自下列各项的NY-ES0-1抗原如图20 (SEQ ID NO 20)所示，且-更优选地，如图21 (SEQ ID NO 21)所示的NY-ES0-1序列的片段、变体或 表位。 所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA还可以编码CEA。在本发明 的上下文中，‘‘CEA”是癌胚抗原(CECAM5 =癌胚抗原-相关细胞黏附分子5)，并且优选的编 码“CEA”的RNA序列、优选是mRNA序列一一如果用在本发明所述的活性(免疫刺激性) 组合物中——显示在图12(SEQ ID NO :12)中，且-甚至更优选地-显示在图13(SEQID NO 13)中。按照Hammarstrom(1999)，CEA是一种180kDa的作用为黏附分子的胎性癌糖蛋 白，并且在 70% 的 NSCLC 中过量表达(Hammarstrom，S. (1999). “ The carcinoembryonic antigen(CEA)family structures, suggested functions and expression in normal and malignant tissues.(癌胚抗原(CEA)家族结构、提议的功能和在正常和恶性组织 中的表达)"Semin Cancer Biol (癌症生物学研讨会)9 (2) :67_81)。Berinstein (2002) 报道了 CEA具有作为抗癌主动接种方法的靶标的多种令人感兴趣的特征(Berinstein， N. L. (2002). “ Carcinoembryonic antigen as a target fortherapeutic anticancer vaccines :a review.(癌胚抗原作为治疗性抗癌疫苗的靶标综述)〃 J Clin Oncol (临 床肿瘤学杂志)20(8) :2197-207)。它具有有利的表达模式，并且在多于50 %的所有人类 癌症中表达。它自身可能在肿瘤发生过程中起作用，并且因此在整个癌症进展过程中其表 达可以被选择和保守的。已经充分证明，CEA在多种1类MHC分子上加工和呈递。此外， 针对CEA的免疫学耐受性不是绝对的。存在大量的数据证明人T细胞可以识别、变成激活的、并且裂解表达CEA的癌细胞。已经评估了一些使用CEA作为靶抗原的不同的治疗性 接种方法。已经确定了这些方法的安全性。另外，已经证明了针对CEA的体液和/或细胞 反应。尽管Berinstein (2002，同前所述)描述的为这些研究所选的大部分患者患有非常 晚期和难以治愈的转移性结肠癌，但是已经记录了一些临床活性证据，在一些患者中发生 的疾病稳定性和甚至是客观的响应。用激动剂CEAI类MHC结合肽(CAP1-6D)和有或无共 刺激分子的结合CEA的基于痘病毒的载体脉冲的树突细胞似乎在激活CD8 T-细胞反应中 最活跃。不幸的是，树突细胞方法可能受到获得患者-特异性的树突细胞制备物的后勤 (logistic)困难的限制。报道了使用金丝雀痘载体系统靶向CEA的四次I期研究。这些 试验表明所述方法是安全的，具有主要局限在注射部位的轻微的1级和2级毒性。此外，所 述试验表明在大部分患者中可以激活针对CEA的特异性细胞T细胞反应。这些反应可以通 过在所述载体中包含B7. 1共刺激分子或通过在注射部位加入重组GM-CSF而增强。尽管 没有报道客观的临床响应，但是在这些I期研究中的显著比例的患者已经经历了疾病稳定 性。进一步增强识别CEA的T细胞频率的接种策略认为是对这些疫苗的临床活性的进一步 加强。存在数据表明至少一些疫苗可能在最小的疾病状态更有效。Ueda，Itoh等(2004)描 述了一次研究，其中用CEA-衍生的肽脉冲的自体树突细胞治疗18名患有转移胃肠癌或肺 癌的患者(参见 Ueda, Y.，T. Itoh,等，(2004). “ Dendritic cell-based immunotherapy ofcancer with carcinoembryonic antigen-derived, HLA-A24_restricted CTLepitope Clinical outcomes of 18 patients with metastatic gastrointestinal orlung adenocarcinomas.(使用癌胚抗原-衍生的、HLA-A24-限制性CTL表位的基于树突细胞的 癌症免疫治疗18名转移胃肠癌或肺腺癌患者的临床结果)"Int J OncoK国际肿瘤学杂 志)24(4) 909-17)。在大部分患者中观察到通过皮肤测试和体外T细胞测定法测量的免疫 反应。尽管没有报道客观临床响应，但是一些患者在接受该种免疫治疗时具有稳定的疾病。 按照优选实施方案，所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA可以因此编码选 自如图12 (SEQ ID NO 12)所示，且-更优选地，如图13 (SEQ ID NO 13)所示的序列的CEA 抗原。按照更优选的实施方案，所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA可以 备选地或另外地编码选自下列各项的CEA抗原如图12 (SEQ ID NO 12)所示，且-更优选 地，如图13(SEQ ID NO 13)中所示的CEA序列的片段、变体或表位。
所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA还可以编码存活蛋白。在 本发明的上下文中，“存活蛋白，，是杆状病毒IAP重复-包含5 (存活蛋白)，并且优选的编 码“存活蛋白”的RNA序列、优选是mRNA序列如果用在本发明所述的活性(免疫刺激 性)组合物中一一显示在图18 (SEQ ID N0:18)中，且-甚至更优选地-显示在图19 (SEQ ID NO 19)中。Grube，Moritz 等，(2007)描述了存活蛋白(参见 Grube，M.，S. Moritz, 等，(2007). “ CD8+T cells reactive to survivin antigen in patients withmultiple myeloma.(在患有多发性骨髓瘤的患者中与存活蛋白抗原反应的⑶8+T细胞)"Clin Cancer Res (临床癌症研究)13 (3) 1053-60).存活蛋白是程序性细胞死亡家族抑制剂中 的一员，并且在不同类型的恶性肿瘤中过量表达。可以在体外和通过对患有白血病、乳腺 癌、和黑素瘤的患者接种而引发识别存活蛋白表位的细胞毒性T细胞。研究了存活蛋白-特 异性CD8+T细胞是否在多发性骨髓瘤患者中存在，并且在23名患者中的9名中和21名健康 志愿者中的1名中检测到识别HLA-A2. 1-结合存活蛋白肽的T细胞。存活蛋白-反应性T细胞鉴定为终末分化的效应器T细胞(⑶8+，⑶45RA+，和CCR7-)。在11名患者中的7名中表现出在骨髓样品中骨髓瘤细胞的阳性存活蛋白表达。存活蛋白在大部分上皮和造血来源的 人癌细胞中高度表达，并且过量表达与癌症进展、极差的预后、抗性、和短的患者存活相关。 Duffy, O’ Donovan(2007)描述了存活蛋白是一种在几乎所有的恶性肿瘤中过量表达但是 很少在正常分化的成人组织中检测到的16. 5kDa蛋白(参见Duffy，Μ. J.，N. O' Donovan, 等，(2007). “ Survivin :a promising tumor biomarker.(存活蛋白有希望的肿瘤生物 标记)〃 CancerLett (癌症通信)249 (1) :49_60)。功能上，存活蛋白已经表现出抑制程序 性细胞死亡，促进细胞增殖和增强血管形成。与其在这些过程中的作用一致，描述存活蛋白 在癌症进展中起着重要的作用。由于在正常和恶性组织之间表达的巨大差异及其在癌症 进展中的因果作用，目前正对存活蛋白进行作为潜在的肿瘤标记的强化研究。出现的数据 表明存活蛋白的测量可以辅助膀胱癌的早期诊断，确定多种癌症类型的预后，和预测对各 种抗癌治疗的响应。Zeis，Siegel等，(2003)证明通过用转染了存活蛋白-RNA的自体树 突细胞刺激由PBMC产生的人存活蛋白-特异性CTLs对于一系列的造血恶性细胞系和由 急性骨髓性白血病患者分离的原代肿瘤细胞是细胞毒性的(参见Zeis，Μ.，S.Siegel，等， (2003). “ Generation of cytotoxicresponses in mice and human individuals against hematological malignanciesusing survivin-RNA-transfected dendritic cells.(使 用存活蛋白-RNA-转染的树突细胞在小鼠和人个体中产生针对造血恶性肿瘤的细胞毒性 反应)"JImmimol (免疫学杂志)170(11) :5391_7)。还表明用存活蛋白-RNA-转染的树 突细胞接种小鼠导致对表达存活蛋白的淋巴瘤刺激的长期抗性，这证明存活蛋白作为肿瘤 排斥性Ag的潜力。提供了存活蛋白用作抗造血性肿瘤的免疫治疗策略的靶标结构的证据。 按照优选实施方案，所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA可以因此编码选 自如图18(SEQID NO 18)所示，且-更优选地，如图19 (SEQ ID NO 19)所示的序列的存活 蛋白抗原。按照更优选的实施方案，所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA 可以备选地或另外地编码选自下列各项的存活蛋白抗原如图18(SEQ ID NO 18)中所示， 且-更优选地，如图19(SEQID NO 19)中所示的存活蛋白序列的片段、变体或表位。
所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA还可以编码MAGE-Cl。在本 发明的上下文中，“MAGE-Cl ”是黑素瘤抗原家族C，1，并且优选的编码“MAGE-C1 ”的RNA序 列、优选是mRNA序列一一如果用在本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物中一一显 示在图22 (SEQ IDNO 22)中，更优选地显示在图23 (SEQ ID NO 23)中，且-甚至更优选 地-显示在图24(SEQ ID NO 24)中。Lucas，De Smet等，(1998)最近通过进行RDA鉴定 了 MAGE-Cl (参见 Lucas，S.，C. De Smet，等，(1998). “ Identification of a new MAGE gene with tumor-specific expression byrepresentational difference analysis. (通过代表性差异分析鉴定具有肿瘤-特异性表达的新MAGE基因)"Cancer Res (癌症 研究)58(4) :743-52)。除了睾丸之外，MAGE-Cl不在所检测的一组正常组织中表达。在 肿瘤样品中，MAGE-Cl通常在精原细胞瘤、黑素瘤、和膀胱癌中表达。它还在显著部分的 头颈癌、乳腺癌、非小肺癌、前列腺腺癌和肉瘤中表达。Jungbluth，Chen等，(2002)描 述了在乳腺癌、卵巢癌、肝癌、睾丸癌、膀胱癌、黑素瘤和非小细胞肺癌(39%)中的表达 (参见 Jungbluth，A. A.，Y. T. Chen，等，(2002). “ CT7 (MAGE-Cl) antigen expression in normal andneoplastic tissues. (CT7 (MAGE-C1)抗原在正常和肿瘤组织中的表达)“IntJ Cancer (国际癌症杂志)99 (6) 839-45)。Gure，Chua 等，(2005)分析了来自523名非小细胞肺癌(NSCLC)患者的肿瘤，分析其癌性睾丸抗原的表达(参见Gure， A. 0. ,R. Chua,等，(2005) · “ Cancer-testis genes are coordinatelyexpressed and are markers of poor outcome in non-small cell lung cancer (在非小细胞月市癌中，癌性 睾丸基因协同表达并且是极差结果的标记).“ClinCancer Res (临床癌症研究)11 (22) 8055-62)。MAGE-Cl 在 18 名中存在，为 8 %。Scanlan，Altorki 等，(2000)还报道了 CT 抗原在33例非小细胞肺癌中的表达MAGE-Cl 30% (参见Scanlan，M.J.，N. K.Altorki, 等，(2000). “ Expression of cancer-testis antigens in lung cancer :definition ofbromodomain testis-specif ic gene (BRDT) as a new CT gene, CT9.(癌性辜丸抗原在月市 癌中的表达溴结构域(bromodomain)睾丸-特异性基因(BRDT)作为新CT基因CT9的定 义)"Cancer Lett (癌症通信)150 (2) 155-64).按照优选实施方案，所述活性(免疫刺 激性)组合物的所述至少一种RNA可以因此编码选自如图22 (SEQ ID NO 22)所示，且-更 优选地，如图23(SEQ ID NO 23)中所示，且甚至更优选地如图24 (SEQ ID NO 24)中所示的 序列的MAGE-Cl抗原。按照更优选的实施方案，所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至 少一种RNA可以备选地或另外地编码选自下列各项的MAGE-Cl抗原如图22 (SEQ ID NO 22)中所示，且-更优选地，如图23 (SEQ ID NO 23)中所示，且甚至更优选地如图24 (SEQ ID NO 24)中所示的MAGE-Cl序列的片段、变体或表位。所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA还可以编码MAGE-C2。在本 发明的上下文中，“MAGE-C2”是黑素瘤抗原家族C2，并且优选的编码“MAGE-C2”的RNA序 列、优选是mRNA序列一一如果用在本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物中一一显示 在图25 (SEQ IDNO 25)中，且-甚至更优选地-显示在图26 (SEQ ID NO 26)中。Lucas， De Plaen等，(2000)最近通过进行RDA在黑素瘤细胞系上鉴定了 MAGE-C2 (参见Lucas， S. , Ε. De Plaen,等，(2000). “ MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C2, and MAGE-C3 :four new members of the MAGE family withtumor-specific expression. (MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C2，和MAGE-C3 四种具有肿瘤特异性表达的MAGE家族新成员)‘‘Iht J Cancer (国 际癌症杂志)87(1) :55-60)。除了睾丸之外，MAGE-C2不在所检测的一组正常组织中表 达。在肿瘤样品中，MAGE-C2通常在精原细胞瘤、黑素瘤、和膀胱癌中表达。它还在显著部 分的头颈癌、乳腺癌、非小肺癌和肉瘤中表达。Scanlan，Altorki等，(2000)报道了 CT抗 原在33例非小细胞肺癌中的表达:MAGE-C2 30% (参见Scanlan，Μ. J.，N. K.Altorki, 等，(2000). “ Expression of cancer-testis antigens in lung cancer :definition ofbromodomain testis-specif ic gene (BRDT) as a new CT gene, CT9.(癌性辜丸抗原在月市 癌中的表达溴结构域(bromodomain)睾丸-特异性基因(BRDT)作为新CT基因CT9的定 义)"Cancer Lett (癌症通信)150 (2) 155-64).按照优选实施方案，所述活性(免疫刺 激性)组合物的所述至少一种RNA可以因此编码选自如图25 (SEQ ID NO 25)所示，且-更 优选地，如图26(SEQ ID N0:26)所示的序列的MAGE-C2抗原。按照更优选的实施方案，所 述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA可以备选地或另外地编码选自下列各项 的MAGE-C2抗原如图25(SEQ ID NO 25)中所示，且-更优选地，如图26 (SEQ ID NO 26) 中所示的MAGE-C2序列的片段、变体或表位。上述定义的可以由本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA编码的抗原、抗原蛋白或抗原肽，可以包括那些序列的片段或变体。所述片段或变体可以典 型地包括与上文提及的抗原、抗原蛋白或抗原肽或序列或它们的编码核酸序列之一具有至 少5 %，10 %，20 %，30 %，40 %，50 %，60 %，优选地至少70 %，更优选地至少80 %，等价地更 优选地至少85 %，甚至更优选地至少90 %且最优选地至少95 %或甚至97 %，至完整的野生 型序列的序列同源性的序列，不管是在核酸水平还是在氨基酸水平上。在本发明的上下文中，抗原、抗原蛋白或抗原肽的“片段”可以包括如上文定义的 抗原、抗原蛋白或抗原肽的序列，关于其氨基酸序列(或编码其的核酸序列)，与原始(天 然)蛋白的氨基酸序列(或编码其的核酸序列)相比较，其是N端、C端和/或序列内部截 短的。所述截短可以因此发生在氨基酸水平或者相对应的发生在核酸水平上。因此，关于 如上文定义的所述片段的序列同源性可以优选地是指如上文定义的完整的抗原、抗原蛋白 或抗原肽或所述抗原、抗原蛋白或抗原肽的完整(编码)核酸序列。在本发明的上下文中，抗原、抗原蛋白或抗原肽的片段还可以包括如上述定义的 抗原、抗原蛋白或抗原肽的序列，其具有约6-约20个或甚至更多个氨基酸的长度，例如，由 I类MHC分子处理和呈递的片段，优选地具有约8-约10个氨基酸的长度，例如，8，9，或10 个，(或者甚至6，7，11，或12个氨基酸)，或由II类MHC分子处理和呈递的片段，优选地具有 约13个以上的氨基酸的长度，例如，13，14，15，16，17，18，19，20个或甚至更多个氨基酸，其 中这些片段可以选自所述氨基酸序列的任一部分。这些片段典型地以由所述肽片段和MHC 分子组成的复合体形式被T细胞识别，即，所述片段典型地不以它们的天然形式被识别。如本文定义的抗原、抗原蛋白或抗原肽的片段还可以包括那些抗原、抗原蛋白或 抗原肽的表位。在本发明的上下文中，表位(还称为“抗原决定簇”)典型地是位于本文定 义的(天然)抗原、抗原蛋白或抗原肽的外表面的片段，优选地具有5-15个氨基酸，更优选 地具有5-12个氨基酸，甚至更优选地具有6-9个氨基酸，其可以被抗体或B细胞受体识别， 艮口，以它们的天然形式被识别。抗原、抗原蛋白或抗原肽的所述表位还可以选自本文提及的 所述抗原、抗原蛋白或抗原肽的变体的任一种。在该情形中，抗原决定簇可以是构象或不连 续的表位，其由本文定义的抗原、抗原蛋白或抗原肽的片段组成，所述片段在本文定义的抗 原、抗原蛋白或抗原肽的氨基酸序列中是不连续的，但是在三维结构中是在一起的或是由 单一多肽链组成的连续的或线性表位。如上文定义的抗原、抗原蛋白或抗原肽的“变体”可以由本发明所述的活性(免疫 刺激性)组合物的所述至少一种RNA编码，其中编码如上文定义的抗原、抗原蛋白或抗原肽 的所述至少一种(m)RNA的核酸是交换的。由此，可以产生具有在一个或多个突变，如一个 或多个取代的、插入的和/或删除的氨基酸而与原始序列不同的氨基酸序列的抗原、抗原 蛋白或抗原肽。优选地，与全长天然抗原或抗原蛋白相比较，这些片段和/或变体具有相同 的生物学功能或特异性活性，例如，其特异性抗原特性。本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA还可以编码上文定义的抗原或抗原蛋白，其中与其生理学序列相比较，所编码的氨基酸序列包括保守氨基酸 取代。那些编码的氨基酸序列以及它们的编码核苷酸序列特别落入如上文定义的术语变体 中。来源于相同种类的氨基酸与另一种交换的取代称为保守取代。特别地，这些是具有脂肪 族侧链、带正电荷或负电荷的侧链、在侧链中具有芳香族基团的氨基酸，或其侧链可以进入 氢桥的氨基酸，例如，具有羟基官能的侧链。这意味着，例如，具有极性侧链的氨基酸被具有同样极性侧链的另一种氨基酸替换，或者例如，以疏水侧链为特征的氨基酸被具有同样的疏水侧链的另一种氨基酸取代(例如，丝氨酸(苏氨酸)被苏氨酸(丝氨酸)置换或亮氨酸 (异亮氨酸)被异亮氨酸(亮氨酸)置换)。插入和取代是可能的，特别是在对三维结构没 有引起修饰或不影响结合区的那些序列位置上。插入或删除对三维结构的修饰可以容易地 确定，例如，使用 CD 光谱确定(圆二色谱)(Urry，1985，Absorption, Circular Dichroism and ORD of Polyp印tides (多肽的吸附、圆二色性和 ORD)，在Modern Physical Methods in Biochemistry (生物化学的现代物理方法)中，Neuberger等，(ed.)，Elsevier，阿姆斯 特丹)。此外，如上文定义的抗原、抗原蛋白或抗原肽的变体，其可以由本发明所述的活性 (免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA编码，还可以包括那些序列，其中所述至少一种 (m)RNA的核酸按照遗传密码的简并性进行交换，不导致所述抗原、抗原蛋白或抗原肽的各 自氨基酸序列的改变，即，所述氨基酸序列或至少其部分可以以在上述意义内的一个或多 个突变而并不在原始序列上不同。为了确定两个序列(核酸序列，例如，如本文定义的RNA或mRNA序列，或氨基酸序 列，优选地它们编码的氨基酸序列，例如，如上文定义的抗原、抗原蛋白或抗原肽的氨基酸 序列)相同的百分比，可以比对序列，以随后与另一种进行比较。因此，例如，可以在第一序 列的序列中插入缺口，并且可以比较在第二序列的相对应位置处的成分。如果在第一序列 中的位置由与在第二序列中位置处的情形相同的成分占据，则这两个序列在该位置处是相 同的。两个序列相同的百分比是相同的位置数目除以位置总数的函数。两个序列相同的 百分比可以使用数学算法确定。可以应用的数学算法的一个优选的但非限制性的实例是 Karlin 等，(1993)，PNAS USA，90 :5873_5877或Altschul 等，(1997)，Nucleic Acids Res. (核酸研究)，25:3389-3402的算法。这样的算法结合在BLAST程序中。可以通过该程序 鉴定与本发明的序列在某种程度上相同的序列。本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物包括，如上文定义，至少一种RNA，其编码 选自上述组的任意抗原的至少两种(优选不同的)抗原，原因在于按照本发明，前文提及的 组的至少两种(优选不同的)抗原的特定组合能够有效刺激(适应性)免疫系统，以允许 治疗肺癌，尤其是非小细胞肺癌(NSCLC)。然而，本发明还可以提供这样的活性(免疫刺激 性)组合物，其包括编码选自上述组任意抗原的三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、 十种、十一种或甚至十二种(优选不同的)抗原的至少一种RNA，其中这些抗原的任意组合 是可能的和被考虑的。按照特别优选的实施方案，本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少 一种RNA可以编码至少两种(优选不同的)抗原，所述抗原选自包括下述抗原的亚组的任 意抗原· hTERT,‘ WTl,· 5T4,· NY-ESO-1， 存活蛋白，和/或· MAGE-C2.
更优选地，本发明还可以提供包括至少一种RNA的活性(免疫刺激性)组合物，所述至少一种RNA编码选自上述组或亚组的任意抗原的至少三种、四种、五种或六种(优选不 同的)抗原，其中这些抗原的任意组合是可能的。因此，由于另一个特别优选的实施方案，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所 述至少一种RNA可以编码至少两种(优选不同的)抗原，所述抗原选自上文提及的包括(至 少)任一种下述抗原组合的组或亚组的任意抗原· hTERT 禾口 WT1，或.hTERT 和 5T4，或· hTERT 和 NY-ES0-1，或· hTERT和存活蛋白，或· hTERT 和 MAGE-C2，或·Π1 禾口 5T4，或· WTl 禾口 NY-ES0-1，或· WTl和存活蛋白，或· WTl 禾口 MAGE-C2，或· 5Τ4 和 NY-ES0-1，或·5Τ4和存活蛋白，或· 5Τ4 和 MAGE-C2，或· NY-ES0-1和存活蛋白，或· NY-ES0-1 和 MAGE-C2，或·存活蛋白和MAGE-C2，或· hTERT, WTl 和 5T4，或· hTERT, WTl 和 NY-ESO-l，或· hTERT，WTl和存活蛋白，或· hTERT，WT1 禾口 MAGE-C2，或
· hTERT, 5T4,和 NY-ESO-l，或· hTERT，5T4，和存活蛋白，或· hTERT，5T4，和 MAGE-C2，或· hTERT, NY-ES0-1 和存活蛋白，或· hTERT, NY-ES0-1 和 MAGE-C2，或· hTERT，存活蛋白和 MAGE-C2，或· WTl，5T4 和 NY-ESO-l，或· WT1，5T4和存活蛋白，或· WT1，5T4 禾口 MAGE—C2，或· WT1，NY-ES0-1 和存活蛋白，或· WT1，NY-ES0-1 和 MAGE-C2，或· WT1，存活蛋白和 MAGE-C2，或· 5T4，NY-ES0-1 和存活蛋白，或
· 5T4, NY-ES0-1 和 MAGE-C2，或· 5T4，存活蛋白和 MAGE-C2，或· NY-ES0-1，存活蛋白，和 MAGE-C2，或· hTERT, WTl，5T4 和 NY-ESO-l，或· hTERT，WT1，5T4 和存活蛋白，或· hTERT，WT1，5T4 禾口 MAGE-C2，或· hTERT, 5T4, NY-ESO-I 和存活蛋白，或· hTERT, 5T4, NY-ESO-I 和 MAGE-C2，或· hTERT, NY-ESO-I，存活蛋白和 MAGE-C2，或· WTl, 5T4, NY-ES0-1，和存活蛋白，或· WT1，5T4，NY-ES0-1，和 MAGE-C2，或· WT1，5T4，存活蛋白，和 MAGE-C2，或· 5T4, NY-ES0-1，存活蛋白，和 MAGE-C2，或· hTERT, WTl, 5T4, NY-ES0-1 和存活蛋白，或· hTERT, WTl, 5T4, NY-ES0-1 和 MAGE-C2，或· WTl, 5T4, NY-ES0-1，存活蛋白和 MAGE-C2，或· hTERT, WTl, 5T4, NY-ESO-l，存活蛋白，和 MAGE-C2。更优选地，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA可以编码专 门选自上文提及的组或亚组的任意抗原的至少两种(优选不同的)抗原，所述组或亚组包 括(至少)任一种下述抗原组合· hTERT 禾口 WTl，或.hTERT 和 5T4，或· hTERT 和 NY-ES0-1，或· hTERT和存活蛋白，或· hTERT 和 MAGE-C2，或·Π1 禾口 5T4，或.WTlfPNY-ESO-Ij· WTl和存活蛋白，或· WTl 禾口 MAGE-C2，或· 5Τ4 和 NY-ES0-1，或·5Τ4和存活蛋白，或· 5Τ4 和 MAGE-C2，或· NY-ES0-1和存活蛋白，或· NY-ES0-1 和 MAGE-C2，或·存活蛋白和MAGE-C2，或
hTERT，WT1 和 5T4，或 hTERT, WT1 和 NY-ESO-l，或 hTERT，WT1和存活蛋白，或 hTERT，WT1 禾P MAGE-C2，或 hTERT, 5T4,和 NY-ESO-l，或 hTERT，5T4，和存活蛋白，或 hTERT，5T4，和 MAGE-C2，或 hTERT，NY-ES0-1 和存活蛋白，或 hTERT, NY-ESO-l 和 MAGE-C2，或 hTERT，存活蛋白和 MAGE-C2，或 WT1，5T4 和 NY-ES0-1，或 WT1，5T4和存活蛋白，或 WT1，5T4 和 MAGE-C2，或 WT1，NY-ES0-1 和存活蛋白，或 WT1，NY-ES0-1 和 MAGE-C2，或 WT1，存活蛋白和 MAGE-C2，或 5T4，NY-ES0-1 和存活蛋白，或 5T4, NY-ES0-1 和 MAGE-C2，或 5T4，存活蛋白和 MAGE-C2，或 NY-ES0-1，存活蛋白，和 MAGE-C2，或 hTERT, WT1, 5T4 和 NY-ESO-l，或 hTERT，WT1，5T4 和存活蛋白，或 hTERT，WT1，5T4 和 MAGE-C2，或 hTERT, 5T4, NY-ESO-l 和存活蛋白，或 hTERT, 5T4, NY-ESO-l 和 MAGE-C2，或 hTERT, NY-ESO-l，存活蛋白和 MAGE-C2，或 ffTl,5T4, NY-ESO-l，和存活蛋白，或 WT1，5T4，NY-ESO-l，和 MAGE-C2，或 WT1，5T4，存活蛋白，和 MAGE-C2，或 5T4, NY-ES0-1，存活蛋白，和 MAGE-C2，或 hTERT, WT1,5T4, NY-ESO-l 和存活蛋白，或 hTERT, WT1,5T4, NY-ESO-l 和 MAGE-C2，或 WT1,5T4, NY-ESO-l，存活蛋白和 MAGE-C2，或 hTERT，WT1，5T4，NY-ES0-1，存活蛋白，和 MAGE-C2.按照更优选的实施方案，本发明提供包括编码至少两种(优选不同的)抗原的至 少一种RNA的活性(免疫刺激性)组合物，
a)其中这些至少两种抗原的至少一种、优选地至少两种、三种、四种、五种、或甚至 六种选自 5T4‘ NY-ES0-1, MAGE-A2，‘ MAGE-A3, MAGE-C1，禾口 / 或.MAGE-C2，禾口b)其中其它抗原选自本文定义的至少一种抗原，优选地在任意本文提及的抗原组 合、组或亚组中，例如，所述其它抗原选自，例如 hTERT，‘ WT1, MAGE-A2， 5T4,‘ MAGE-A3,‘ MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1， CEA， 存活蛋白， MAGE-C1，禾口 / 或 MAGE-C2。按照更优选的实施方案，按照a)的所述至少一种抗原选自 NY-ES0-1, MAGE-C1，禾口 / 或 MAGE_C20按照另一个优选实施方案，按照a)的所述至少一种抗原选自 MAGE-C1，禾口 / 或 MAGE-C2。按照另一个优选实施方案，按照b)的所述至少一种抗原选自在下述组合之一中 定义的一种抗原(多种抗原).hTERT 和 WT1;或 hTERT 和 MAGE-A2 ；或.hTERT 和 5T4;或 hTERT 和 MAGE-A3 ；或 hTERT 和 MUC1 ；或 hTERT 和 Her-2/neu ；或 hTERT 和 NY-ESO-l ；或 hTERT 禾口 CEA ；或
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hTERT和存活蛋白；或 hTERT 和 MAGE-C1 ；或 hTERT 和 MAGE-C2 ；或 WT1 禾口 MAGE-A2 ；或 WT1 禾口 5T4 ；或 WT1 禾口 MAGE-A3 ；或.WT1 禾口 MUC1;或 WT1 禾口 Her-2/neu ；或 WT1 禾口 NY-ES0-1 ；或 町1禾口〇￡八；或和存活蛋白；或.m 和 MAGE-C1;或 WT1 禾口 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2 和 5T4 ；或 MAGE-A2 和 MAGE-A3 ；或 MAGE-A2 禾口 MUC1 ；或 MAGE-A2 禾口 Her-2/neu ；或 MAGE-A2 和 NY-ESO-l ；或 MAGE-A2 和 CEA ；或 MAGE-A2和存活蛋白；或 MAGE-A2 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A2 和 MAGE-C2 ；或 5T4 禾口 MAGE-A3 ；或.5T4 和 MUC1;或 5T4 禾口 Her-2/neu ；或 5T4 和 NY-ES0-1 ；或 5丁4和〇￡六；或*5T4和存活蛋白；或 5T4 和 MAGE-C1 ；或 5T4 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3 禾口 MUC1 ；或 MAGE-A3 禾口 Her-2/neu ；或 MAGE-A3 和 NY-ESO-l ；或 MAGE-A3 和 CEA ；或 MAGE-A3和存活蛋白；或 MAGE-A3 禾口 MAGE-C1
MAGE-A3 和 MAGE-C2 MUC1 禾口 Her-2/neu ；或 MUC1 禾口 NY-ESO-l ；或
MUC1和 CEA ；或*MUC1和存活蛋白；或 MUC1 和 MAGE-C1 ；或 MUC1 和 MAGE-C2 ；或 HER-2/NEU 和 NY-ESO-l ；或 HER-2/NEU 和 CEA ；或 HER-2/NEU和存活蛋白；或
HER-2/NEU 和 MAGE-C1 ；或 HER-2/NEU 和 MAGE-C2 ；或 NY-ES0-1 和 CEA ；或 NY-ES0-1和存活蛋白；或 NY-ES0-1 和 MAGE-C1 ；或 NY-ES0-1 和 MAGE-C2 ；或*CEA和存活蛋白；或 CEA 和 MAGE-C1 ；或 CEA 和 MAGE-C2 ；或 存活蛋白和MAGE-C1 ；或 存活蛋白和MAGE-C2 ；或 MAGE-C 1 和 MAGE-C2 ；或 hTERT，WT1 和 MAGE-A2 ；或 hTERT, WT1 和 5T4 ；或 hTERT，WT1 和 MAGE-A3 ；或 hTERT, WT1 和 MUC1 ；或 hTERT, WT1 和 Her-2/neu ；或 hTERT, WT1 和 NY-ESO-l ；或 hTERT, WT1 和 CEA ；或 hTERT, WT1和存活蛋白；或 hTERT, WT1 和 MAGE—C1 ；或 hTERT，WT1 和 MAGE-C2 ；或 WT1，MAGE-A2 和 5T4 ；或 WT1，MAGE-A2 和 MAGE-A3 ；或 WT1，MAGE-A2 和 MUC1 ；或 WT1，MAGE-A2 和 Her-2/neu ；或 WT1，MAGE-A2 和 NY-ESO-l ；或 WT1，MAGE-A2 和 CEA ；或 WT1, MAGE-A2 和存活蛋白；或 WT1, MAGE-A2 和 MAGE-C1 ；或 WT1，MAGE-A2 和 MAGE-C2 ；或
MAGE-A2，5T4 和 MAGE-A3 ；或 MAGE-A2,5T4 和 MUC1 ；或 MAGE-A2，5T4 和 Her-2/neu ；或 MAGE-A2, 5T4 和 NY-ESO-l ；或 MAGE-A2，5T4 和 CEA ；或 MAGE-A2，5T4 和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A2，5T4 和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3 和 MUC1 ；或 5T4, MAGE-A3 禾口 Her-2/neu ；或 5T4, MAGE-A3 和 NY-ESO-l ；或 5T4, MAGE-A3 和 CEA ；或 5T4，MAGE-A3 和存活蛋白；或 5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C1 ；或 5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3, MUC1 禾口 Her-2/neu ；或 MAGE-A3, MUC1 和 NY-ESO-l ；或 MAGE-A3，MUC1 和 CEA ；或 MAGE-A3, MUC1 和存活蛋白；或 MAGE-A3, MUC1 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A3, MUC1 和 MAGE-C2 ；或 MUC1, Her-2/neu 禾口 NY-ESO-l ；或 MUC1，Her-2/neu 和 CEA ；或 MUC1，Her-2/neu 和存活蛋白；或 MUC1, Her-2/neu 禾口 MAGE-C1 ；或 MUC1, Her-2/neu 禾口 MAGE-C2 ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1 和 CEA ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1 和存活蛋白；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1 和 MAGE-C1 ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1 和 MAGE-C2 ；或 NY-ES0-1，CEA 和存活蛋白；或 NY-ESO-l, CEA 和 MAGE-C1 ；或 NY-ES0-1，CEA 和 MAGE-C2 ；或 CEA，存活蛋白和 MAGE-C1 ；或 CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2 和 5T4 ；或
hTERT, WT1, MAGE-A2 和 MAGE-A3 ；或
hTERT，WT1，MAGE-A2 和 MUC1 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2 和 Her-2/neu ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2 和 NY-ESO-l ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2 和 CEA ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2 和存活蛋白；或 hTERT, WT1, MAGE-A2 和 MAGE-C1 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2 和 MAGE-C2 ；或 WT1，MAGE-A2，5T4 禾口 MAGE—A3 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4 和 MUC1 ；或 WT1，MAGE-A2,5T4 和 Her-2/neu ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4 和 NY-ESO-l ；或 WT1，MAGE-A2，5T4 禾口 CEA ；或 WT1, MAGE-A2,5T4 和存活蛋白；或 WT1，MAGE-A2, 5T4 和 MAGE-C1 ；或 WT1，MAGE-A2，5T4 禾口 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 MUC1 ；或 MAGE-A2，5T4，MAGE-A3 和 Her-2/neu ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 NY-ESO-l ；或 MAGE-A2，5T4，MAGE-A3 和 CEA ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A2，5T4，MAGE-A3 和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1，和 Her-2/neu ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1 和 NY-ESO-l ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1 和 CEA ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1 和存活蛋白；或 5T4, MAGE-A3, MUC1 和 MAGE-C1 ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu 和 NY-ESO-l ；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu 和 CEA ；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu 和存活蛋白；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu 和 MAGE-C2 ；或 MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 CEA ；或 MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和存活蛋白；或 MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 MAGE-C1 ；或 MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 MAGE-C2 ；或 HER-2/NEU, NY-ESO-l, CEA 和存活蛋白；或 HER-2/NEU, NY-ESO-l, CEA 和 MAGE-C1 ；或
HER-2/NEU, NY-ESO-l，CEA 和 MAGE-C2 ；或 NY-ESO-l, CEA，存活蛋白和 MAGE-C1 ；或 NY-ESO-l, CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 CEA,存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ；或 hTERT, WT1, MAGE—A2，5T4 禾口 MAGE—A3 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4 和 MUC1 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4 禾口 Her-2/neu ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4 和 NY-ESO-l ；或 hTERT, WT1, MAGE—A2，5T4 禾口 CEA ；或 hTERT，WT1，MAGE-A2，5T4 和存活蛋白；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4 和 MAGE-C1 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4 和 MAGE-C2 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 MUC1 ；或 WT1，MAGE-A2，5T4，MAGE-A3 和 Her-2/neu ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 NY-ESO-l ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 CEA ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和存活蛋白；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C1 ；或 WT1，MAGE-A2，5T4，MAGE-A3 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1 和 Her-2/neu ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1 和 NY-ESO-l ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1 和 CEA ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1 和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1 和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu 和 NY-ESO-l ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu 和 CEA ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu 和存活蛋白；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu 和 MAGE-C1 ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 CEA ；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和存活蛋白；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 MAGE-C2 ；或 MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和存活蛋白；或 MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和 MAGE-C1 ；或 MUC1，Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和 MAGE-C2 ；或 HER-2/NEU, NY-ESO-l, CEA,存活蛋白和 MAGE-C1 ；或
HER-2/NEU, NY-ESO-l，CEA,存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 NY-ESO-l，CEA,存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3 和 MUC1 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4，MAGE-A3 和 Her-2/neu ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3 和 NY-ES0-1 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4，MAGE-A3 和 CEA ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3 和存活蛋白；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C1 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4，MAGE-A3 和 MAGE-C2 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC 1 和 Her-2/neu ；或 WT1, MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUC1 和 NY-ES0-1 ；或 WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1 和 CEA ；或 WT1, MAGE-A2,5T4, MAGE-A3，MUC1 和存活蛋白；或 WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1 和 MAGE-C1 ；或 WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 NY-ES0-1 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 CEA ；或 MAGE-A2,5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 CEA ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和存活蛋白；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 MAGE-C1 ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和存活蛋白；或 MAGE-A3, MUC1，Her-2/neu, NY-ES0-1，CEA 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A3, MUC1，Her-2/neu, NY-ES0-1，CEA 和 MAGE-C2 ；或 MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA，存活蛋白和 MAGE-C1 ；或 MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1，CEA,存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ；
38
或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1 和 Her-2/neu ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1 和 NY-ESO-l ；或
hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1 和 CEA ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC 1 和存活蛋白；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1 和 MAGE-C1 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1 和 MAGE-C2 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 NY-ESO-l ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 CEA ；或 WT1, MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu 和存活蛋白；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 MAGE-C1 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l 和 CEA ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l 和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l 和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和存活蛋白；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和 MAGE-C1 ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA，存活蛋白和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu，NY-ESO-l, CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 MUC1，Her-2/neu, NY-ESO-l，CEA,存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 NY-ES0-1 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 CEA ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和存活蛋白；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 MAGE-C1 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 MAGE-C2 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 CEA ；或 WT1, MAGE-A2,5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l 和存活蛋白；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 MAGE-C1 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA，存活蛋白和 MAGE-C1 ；或
5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l，CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l，CEA,存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l 和 CEA ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l 和存活蛋白；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l 和 MAGE-C1 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l 和 MAGE-C2 ；或 WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和存活蛋白；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和 MAGE-C1 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2,5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA，存活蛋白和 MAGE-C1 ； 或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA,存活蛋白和 MAGE-C2 ； 或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA,存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和存活蛋 白；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1，Her-2/neu, NY-ESO-l，CEA 和 MAGE-C1 ； 或'hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1，Her-2/neu, NY-ESO-l，CEA 和 MAGE-C2 ； 或 WT1, MAGE-A2,5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA,存活蛋白和 MAGE-C1 ；或 WT1, MAGE-A2,5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA,存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2,5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA，存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ；或 hTERT, WT1, MAGE_A2，5T4，MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA，存活蛋白 和 MAGE-C1 ；或 hTERT, WT1, MAGE_A2，5T4，MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA，存活蛋白 和 MAGE-C2 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4，MAGE-A3，MUC1，Her-2/neu, NY-ESO-l，CEA，存活蛋白，MAGE-C1 禾口 MAGE-C2 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA，存活蛋白， MAGE-C1和 MAGE-C2.按照另一个特别优选的实施方案，按照b)的所述至少一个抗原选自下述如上文定义的特定的抗原组合 存活蛋白和5T4本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA典型地是任意RNA， 优选地，但不限于此，编码RNA，环形或线性RNA，单链或双链RNA (其还可以视为是由于两个 单链RNA的非共价缔合形成的RNA)或部分双链或部分单链的RNA，其至少部分是自身互补 性的(这些部分双链或部分单链的RNA分子二者典型地由更长和更短的单链RNA分子形 成，或者由两个单链RNA分子形成，其在长度上大约相等，其中一个单链RNA分子部分与另 一而单链RNA分子互补，并且因此二者在该区域形成双链RNA，S卩，相对于完整的RNA序列部 分是双链或部分是单链的RNA)。更优选地，本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物的所 述至少一种RNA是单链RNA，甚至更优选地是线性RNA。最优选地，本发明所述的活性(免 疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA是信使RNA (mRNA)。在该情形中，信使RNA (mRNA)典 型地是这样的RNA，其由(至少)一些结构元件组成，例如，任选的5’ -UTR区，位于上游的 核糖体结合位点，之后是编码区，任选的3’-UTR区，其可以后接聚腺苷酸尾(和/或聚胞苷 酸尾)。由于一个特别优选的实施方案，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少 两种(优选不同的)抗原的每一种，可以由一种(单顺反子)RNA编码，优选地一种(单顺 反子)mRNA编码。换言之，本发明的活性(免疫刺激性)组合物可以包含至少两种(单顺 反子)RNAs，优选mRNAs，其中这些至少两种(单顺反子)RNAs、优选mRNAs的每一种可以仅 编码一种(优选不同的)抗原，所述抗原选自上文提及的组或亚组之一，优选地以上文提及 的组合之一。按照另一个特别优选的实施方案，本发明的活性(免疫刺激性)组合物可以包括 (至少)一种双顺反子或者甚至多顺反子RNA，优选mRNA，S卩，携带至少两种(优选不同的) 抗原的两种或甚至多种编码序列的(至少)一种RNA，所述抗原选自上文提及的组或亚组 之一，优选地在上文提及的组合之一中。所述(至少)一种双顺反子或甚至多顺反子RNA 的至少两种(优选不同的)抗原的所述编码序列可以由至少一个下文定义的IRES(内部核 糖体进入位点)序列分开。因此，术语“编码至少两种(优选不同的)抗原”可以意指，但 不限于，所述(至少)一种(双顺反子或甚至多顺反子)RNA，优选mRNA，可以编码上文提及 的抗原组的至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种或十二种(优 选不同的)抗原或在它们上述定义内的片段或变体。更优选地，但不限于此，所述(至少) 一种(双顺反子或甚至多顺反子)RNA,优选mRNA，可以编码，例如，上文提及的抗原亚组的 至少两种、三种、四种、五种或六种(优选不同的)抗原或它们在上述定义内的片段或变体。 在该情形中，如上文定义的所谓的IRES(内部核糖体进入位点)序列可以作为唯一的核糖 体结合位点行使功能，但是它还可以作用为提供如上文定义的编码几种蛋白的双顺反子或 甚至多顺反子RNA，所述蛋白将由彼此独立的核糖体翻译。按照本发明可以使用的IRES序 列的实例是选自小RNA病毒(例如FMDV)，鼠疫病毒(CFFV)，脊髓灰质炎病毒(PV)，脑心肌 炎病毒(ECMV)，口蹄疫病毒(FMDV)，丙型肝炎病毒(HCV)，猪霍乱病毒(CSFV)，小鼠淋巴瘤 病毒(MLV)，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痹病毒(CrPV)的那些。按照另一个特别优选的实施方案，本发明的活性(免疫刺激性)组合物可以包括 如上文定义的至少一种单顺反子RNA、优选mRNA和如上述定义的至少一种双顺反子或甚至
41多顺反子RNA、优选mRNA的混合物。所述至少一种单顺反子RNA和/或所述至少一种双顺 反子或甚至多顺反子RNA优选地编码不同的抗原或它们在上述定义内的片段或变体，所述 抗原优选地选自上文提及的抗原组或亚组之一，更优选地在上文提及的组合之一中。然而， 所述至少一种单顺反子RNA和所述至少一种双顺反子或甚至多顺反子RNA可以优选地还编 码选自上文提及的抗原组或亚组之一的(部分)相同的抗原，优选地在上文提及的组合之 一中，条件是本发明的活性(免疫刺激性)组合物完全提供如上文定义的至少两种(优选 不同的)抗原。这样的实施方案可以有利的用于，例如交错的，例如时间依赖性的向需要其 的患者施用本发明的活性(免疫刺激性)组合物。本发明的所述活性(免疫刺激性)组合 物的成分，特别是编码所述至少两种(优选不同的)抗原的不同RNAs，可以，例如，包含在部 分组合物试剂盒(的不同部分)中，或者可以，例如，作为本发明所述的不同活性(免疫刺 激性)组合物的成分分开施用。优选地，所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA，其编码选自上文定 义的抗原组或亚组、更优选地在上述组合中的至少两种(优选不同的)抗原，典型地包括约 50-约20000个，或100-约20000个核苷酸的长度，优选地约250-约20000个核苷酸，更优 选地约500-约10000个，甚至更优选地约500-约5000个核苷酸长度。按照一个实施方案，所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA，其编码 选自上文定义的抗原组或亚组、更优选地在上述组合中的至少两种(优选不同的)抗原， 可以采用修饰的RNA的形式，其中如本文定义的任何修饰可以引入到所述活性(免疫刺激 性)组合物的所述至少一种RNA中。如本文定义的修饰优选地导致本发明的活性(免疫刺 激性)组合物的稳定的至少一种RNA。按照第一实施方案，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA可 以因此提供为“稳定的RNA”，优选稳定的mRNA，也就是说，作为基本上抗体内降解(例如， 由外切-或内切-核酸酶进行)的(m)RNA。所述稳定可以，例如，通过本发明的活性(免 疫刺激性)组合物的所述至少一个(m)RNA的修饰的磷酸酯骨架实现。关于本发明的骨架 修饰是其中化学修饰RNA中包含的核苷酸骨架的磷酸酯的修饰。可以优选地用在该情形 中的核苷酸包含，例如，硫代磷酸酯_修饰的磷酸酯骨架，优选地磷酸酯骨架中所包含的至 少一个磷酸氧被硫原子取代。稳定的(m)RNAs还可以包括，例如非离子磷酸酯类似物，诸 如例如，烷基和芳基磷酸酯，其中带电荷的磷酸酯氧被烷基或芳基替换，或磷酸二酯和烷基 磷酸三酯，其中带电荷的氧残基以烷基化形式存在。所述骨架修饰典型地包括，但不暗示 任何限制，来自由下列各项组成的组的修饰甲基膦酸酯，磷酰胺和硫代硫酸酯(例如，胞 苷-5' -0-(l-硫代磷酸))。本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA可以另外或备选地还包 含糖修饰。与本发明有关的糖修饰是对所述至少一种RNA的核苷酸的糖的化学修饰，并且 典型地包括，不暗示任何限制，选自由下列各项组成的组的糖修饰2'-脱氧-2'-氟-寡 核糖核苷酸(2'-氟-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸，2'-氟-2'-脱氧尿苷-5'-三磷 酸)，2'-脱氧-2'-脱氨寡核糖核苷酸(2'-氨基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸，2'-氨 基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸)，'-0-烷基寡核糖核苷酸，2'-脱氧-2' -C-烷基寡 核糖核苷酸(2 ‘ -0-甲基胞苷-5'-三磷酸，2'-甲基尿苷-5'-三磷酸)，‘-C-烷 基寡核糖核苷酸，和它们的异构体(2'-阿糖胞苷(araCytidine)-5'-三磷酸，2'-阿
42糖尿苷(araUridine)-5' _三磷酸)，或叠氮三磷酸(2'-叠氮-2'-脱氧胞苷-5'-三 磷酸，2'-叠氮-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸)。本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA可以另外或备选地还包 含至少一种碱基修饰，与未改变的、即天然(natural)(=天然(native)) RNA序列相比较， 其优选地适于显著增加由所述至少一种RNA序列编码的蛋白的表达。在这种情形中，显著 性意指与天然RNA序列的表达相比，蛋白表达增加至少20%，优选地至少30%，40%，50% 或60 %，更优选地至少70 %，80 %，90 %或甚至100 %，并且最优选地至少150 %，200 %或者 甚至300%以上。关于本发明，具有这样的碱基修饰的核苷酸优选地选自由下列各项组成的 碱基-修饰的核苷酸组2_氨基-6-氯嘌呤核苷-5'-三磷酸，2-氨基腺苷-5'-三磷酸， 2_硫胞苷-5'-三磷酸，2-硫尿苷-5'-三磷酸，4-硫尿苷-5'-三磷酸，5-氨基烯丙 基胞苷-5'-三磷酸，5-氨基烯丙基尿苷-5'-三磷酸，5-溴胞苷-5'-三磷酸，5-溴尿 苷-5'-三磷酸，5-碘胞苷-5'-三磷酸，5-碘尿苷-5'-三磷酸，5-甲基胞苷-5'-三 磷酸，5-甲基尿苷-5'-三磷酸，6-氮胞苷-5'-三磷酸，6-氮尿苷-5'-三磷酸，6-氯 嘌呤核苷-5'-三磷酸，7-脱氮腺苷-5'-三磷酸，7-脱氮鸟苷-5'-三磷酸，8-氮杂 腺苷-5'-三磷酸，8-叠氮腺苷-5'-三磷酸，苯并咪唑-核苷-5'-三磷酸，N1-甲基 腺苷-5'-三磷酸，N1-甲基鸟苷-5'-三磷酸，N6-甲基腺苷-5'-三磷酸，06-甲基鸟 苷-5'-三磷酸，假尿苷-5'-三磷酸，或嘌呤霉素-5'-三磷酸，黄苷-5'-三磷酸。 对于碱基修饰特别优选的核苷酸选自由下列各项组成的碱基_修饰的核苷酸组5_甲基胞 苷-5'-三磷酸，7-脱氮鸟苷-5'-三磷酸，5-溴胞苷-5'-三磷酸，和假尿苷-5'-三 磷酸。按照另一个实施方案，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA 同样可以通过引入进一步修饰的核苷酸进行修饰(且优选地进行稳定)，所述进一步修饰 的核苷酸包含它们的核糖或碱基结构部分的修饰。通常，本发明的活性(免疫刺激性)组 合物的所述至少一种(m)RNA可以包含任何天然的(=天然存在的)核苷酸，例如，鸟苷， 尿嘧啶，腺苷，和/或胞嘧啶或它们的类似物。在该情形中，核苷酸类似物定义为天然存 在的核苷酸的非天然存在的变体。因此，类似物是化学衍生的具有非天然存在的官能团 的核苷酸，所述非天然存在的官能团优选地添加或由天然存在的核苷酸删除，或其取代核 苷酸的天然存在的官能团。因此，天然存在的核苷酸的每个成分可以进行修饰，即，形成 RNA序列的骨架(见上文)的碱基成分、糖(核糖)成分和/或磷酸酯成分。鸟苷、尿嘧 啶、腺苷和胞嘧啶的类似物包括，不暗示任何限制，已经化学改变的任何天然存在的或非天 然存在的鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷或胞嘧啶，例如，通过乙酰化、甲基化、羟基化等化学改 变，其包括1-甲基-腺苷，1-甲基-鸟苷，1-甲基-肌苷，2，2_ 二甲基-鸟苷，2，6_ 二氨 基嘌呤，2'-氨基-2'-脱氧腺苷，2'-氨基-2'-脱氧胞苷，2'-氨基-2'-脱氧 鸟苷，2'-氨基-2'-脱氧尿苷，2-氨基-6-氯嘌呤核苷，2-氨基嘌呤-核苷，2'-阿 糖腺苷(Araadenosine),2'-阿糖胞苷(Aracytidine), 2 ‘-阿糖尿苷(Arauridine)， 2'-叠氮-2'-脱氧腺苷，2'-叠氮-2'-脱氧胞苷，2'-叠氮-2'-脱氧鸟苷， 2'-叠氮-2'-脱氧尿苷，2-氯腺苷，2'-氟-2'-脱氧腺苷，2'-氟-2'-脱氧胞 苷，2'-氟-2'-脱氧鸟苷，2'-氟-2'-脱氧尿苷，2'-氟胸苷，2-甲基-腺苷，2-甲 基-鸟苷，2-甲基-硫-N6-异戊烯基(isopenenyl)-腺苷，2' -0-甲基_2_氨基腺苷，2' -0-甲基-2'-脱氧腺苷，2' -0-甲基-2'-脱氧胞苷，2' -0-甲基-2'-脱氧鸟 苷，2' -0-甲基-2'-脱氧尿苷，2' -0-甲基-5-甲基尿苷，2' -0-甲基肌苷，2' -0-甲 基假尿苷，2-硫代胞苷，2-硫代-胞嘧啶，3-甲基-胞嘧啶，4-乙酰基-胞嘧啶，4-硫尿苷， 5-(羧基羟甲基)-尿嘧啶，5，6- 二氢尿苷，5-氨基烯丙基胞苷，5-氨基烯丙基-脱氧-尿 苷，5-溴尿苷，5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶，5-氯-阿 糖胞苷，5-氟-尿苷，5-碘尿苷，5-甲氧基羰基甲基-尿苷，5-甲氧基-尿苷，5-甲基-2-硫 代_尿苷，6-氮胞苷，6-氮尿苷，6-氯-7-脱氮-鸟苷，6-氯嘌呤核苷，6-巯基-鸟苷，6-甲 基_巯基嘌呤_核苷，7-脱氮-2 ‘-脱氧-鸟苷，7-脱氮腺苷，7-甲基-鸟苷，8-氮腺苷， 8_溴-腺苷，8-溴-鸟苷，8-巯基-鸟苷，8-氧代鸟苷，苯并咪唑-核苷，3-D-甘露糖基-辫 苷((0-D-marmosyl-queosine)，二氢-尿嘧啶，肌苷，N1-甲基腺苷，N6_([6_氨基己基] 氨基甲酰基甲基)“腺苷，N6-异戊烯基-腺苷，N6-甲基-腺苷，N7-甲基-黄苷，N-尿嘧 啶-5-羟基乙酸甲酯，嘌呤霉素，辫苷(Queosine)，尿嘧啶-5-羟基乙酸，尿嘧啶-5-羟基乙 酸甲酯，Wybutoxosine，黄苷，和木-腺苷。所述类似物的制备是本领域的技术人员已知的， 例如，由美国专利 4，373，071，US 4, 401, 796,US 4, 415, 732,US 4, 458, 066,US 4，500，707， US4, 668, 777,US 4，973，679，US 5，047，524，US 5，132，418，US 5，153，319，US5, 262，530 和 5，700，642可知。在上述类似物的情形中，按照本发明可以特别优选增加本发明活性(免 疫刺激性)组合物的RNA的免疫原性和/或不干扰已经引入的RNA进一步修饰的那些类似 物。按照特别的实施方案，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA 可以包含脂质修饰。所述脂质_修饰的RNA典型地包括如本文定义的RNA，其编码选自上述 定义的抗原组或亚组的、优选在上述组合中的至少两种抗原。所述脂质_修饰的RNA典型 地进一步包含与所述RNA共价连接的至少一个连接体，和与各自的连接体共价连接的至少 一个脂质。备选地，所述脂质_修饰的RNA包括如本文定义的至少一个RNA和与所述RNA 共价连接(无连接体)的至少一个(双官能性)脂质。按照第三备选方案，所述脂质-修 饰的RNA包括如本文定义的RNA，与所述RNA共价连接的至少一个连接体，和与各自的连接 体共价连接的至少一个脂质，和与所述RNA共价连接(无连接体)的至少一个(双官能性) 脂质。在本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA中包含的脂质(与 其复合或共价结合)典型地是脂质或优选自身是生物活性的亲脂残基。所述脂质优选地 包括天然物质或化合物，诸如例如，维生素，例如，a “生育酚(维生素E)，包括RRR- a -生 育酚(以前为D-a-生育酚)，L-a-生育酚，外消旋D，L_ a -生育酚，维生素E琥珀酸 酯(VES)，或维生素A及其衍生物，例如视黄酸，视黄醇，维生素D及其衍生物，例如维生素 D以及其麦角固醇前体，维生素E及其衍生物，维生素K及其衍生物，例如维生素K和相关 的醌或植醇化合物，或类固醇，如胆汁酸，例如胆酸，脱氧胆酸，脱氢胆酸，可的松，洋地黄毒 苷(digoxygenin)，睾酮，胆固醇或硫代胆固醇。在本发明范围内的其它脂质或亲脂残基包 括，不暗示任何限制，聚二醇(Oberhauser等，，Nucl. Acids Res.(核酸研究)，1992，20， 533)，脂肪族基团，诸如例如，C1-C20-链烷，C1-C20-链烯或C1-C20-链烷醇化合物，等等， 诸如例如，十二烷二醇，十六醇或i^一烷基残基(Saison-Behmoaras等，，EMB0 J，1991，10， 111 ；Kabanov 等，，FEBS Lett. (FEBS 通信)，1990，259，327 ；Svinarchuk 等，，Biochimie,1993，75，49)，磷脂，诸如例如，磷脂酰甘油，二酰基磷脂酰甘油，磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂 酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺，双十六烷基_外消旋_甘油 (di-hexadecyl-rac-glycerol)，鞘脂，脑苷脂，神经节苷脂，或三乙基铵1，2_ 二 _0_十六 烷基_外消旋_甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等，，Tetrahedron Lett.(四面体通信)， 1995，36，3651 ；Shea 等，，Nucl. Acids Res.(核酸研究)，1990，18，3777)，聚胺或聚二醇， 诸如例如，聚乙二醇(PEG) (Manoharan 等，，Nucleosides&Nucleotides (核苷和核苷酸)， 1995，14，969)，六甘醇(HEG)，棕榈酸甘油酯或棕榈基残基(Mishra等，，Biochim. Biophys. Acta (生物化学生物物理学报)，1995，1264，229)，十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇残 基(Crooke 等，，J. Pharmacol. Exp. Ther.(药理学实验治疗杂志)，1996，277，923)，以及 蜡，萜烯，脂环烃，饱和的和单_或多-不饱和脂肪酸残基，等等。本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA可以同样进行稳定，以 防止RNA在体内被各种途径降解。在本领域已知mRNA或RNA的体内不稳定性和(快速) 降解通常可以在基于RNA的组合物应用中代表这严重的问题。这种RNA不稳定性典型地是 由于RNA-降解酶“RNA酶”(核糖核酸酶)引起，其中所述核糖核酸酶的污染有时可以完全 降解溶液中的RNA。因此，在细胞的细胞质中的天然mRNA降解非常精细地调控，并且RNA酶 污染通常可以通过在使用所述组合物之前进行专门的处理而去除，特别是用焦碳酸二乙酯 (DEPC)处理。在现有技术中，在该情形中，可以使用的多种天然降解机制是已知的。例如， 在体内，末端结构典型地对于mRNA是至关重要的。例如，在天然存在的mRNAs的5'末端通 常存在所谓的“帽结构”(修饰的鸟苷核苷酸)，且在3'末端典型地是多至200个腺苷的核 苷酸的序列(所谓的聚腺苷酸尾)。本发明活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA，特别是如果作为mRNA提 供，因此可以通过添加所谓的“5'帽”结构而抗RNA酶降解被稳定。在这种情形中，特别优 选 m7G(5' )ppp(5' (A，G(5' )ppp(5' )A 或 G(5' )ppp(5' )G 作为 “5'帽”结构。然 而，仅在如果还没有在本发明的免疫刺激性组合物的(m)RNA 5'末端引入修饰如脂质修饰 时或者如果所述修饰不干扰所述(未修饰的或化学修饰的)(m)RNA的免疫原性特性时引入 这样的修饰。按照更优选的实施方案，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种 RNA，特别是如果所述RNA采用mRNA形式时，可以在3'末端包含典型地约10-200个腺苷 核苷酸、优选约10-100个腺苷核苷酸、更优选约20-100个腺苷核苷酸或甚至更优选地约 40-80个腺苷核苷酸的聚腺苷酸尾。按照更优选的实施方案，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种 RNA，特别是如果所述RNA采用mRNA形式时，可以在3'末端包含典型地约10-200个胞嘧啶 核苷酸、优选地约10-100个胞嘧啶核苷酸、更优选地约20-70个胞嘧啶核苷酸或甚至更优 选地约20-60个或甚至10-40个胞嘧啶核苷酸的聚胞苷酸尾。按照另一个实施方案，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA 可以进行修饰，并且因此被稳定，特别是如果所述RNA采用mRNA形式时，通过修饰所述RNA 的G/C含量，优选是至少一种RNA的编码区的G/C含量进行。在本发明的特别优选的实施方案中，与其具体的野生型(m)RNA，即未修饰的(m) RNA编码区的G/C含量相比较，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种(m)RNA的编码区的G/C含量被修饰，特别是增加。与具体的野生型(m) RNA所编码的氨基酸序列相 比较，所述至少一种(m) RNA所编码的氨基酸序列优选不被修饰。 本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种(m)RNA的这种修饰是基于 要翻译的任意(m) RNA区序列对于所述(m) RNA的有效翻译是重要的事实。因此，多种核苷酸 的组成和序列是重要的。特别地，具有增加的G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量的序列比具有增 加的A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量的序列更稳定。按照本发明，因此与其野生型(m)RNA相比 较，所述(m)RNA的密码子不同，同时保留所翻译的氨基酸序列，以致它们包括增加量的G/C 核苷酸。关于一些密码子编码一种和相同的氨基酸的事实(所谓的遗传密码简并性)，可以 确定对稳定性最有利的密码子(所谓的备选密码子应用)。取决于由所述至少一种(m) RNA编码的氨基酸，与其野生型序列相比较，对于所述 至少一种(m)RNA序列的修饰存在多种可能性。在由专门包含G或C核苷酸的密码子编码 的氨基酸的情形中，不需要密码子的修饰。因此，对于Pro (CCC或CCG)，Arg (CGC或CGG)， Ala (GCC或GCG)和Gly (GGC或GGG)的密码子不需要修饰，因为不存在A或U。相反，包含A和/或U核苷酸的密码子可以通过编码相同的氨基酸但是不含有A 和/或U的其它密码子的取代而进行修饰。这些的实例如下Pro的密码子可以由CXU或CCA修饰为CCC或CCG ；Arg的密码子可以由CGU或CGA或AGA或AGG修饰为CGC或CGG ；Ala的密码子可以由G⑶或GCA修饰为GCC或GCG ；Gly的密码子可以由GGU或GGA修饰为GGC或GGG。在其它情形中，尽管不从所述密码子中去除A或U核苷酸，然而，可以通过使用含 有较低的A和/或U核苷酸含量的密码子而降低A和U含量。这些的实例如下Phe的密码子可以由UUU修饰为UUC ；Leu的密码子可以由UUA，UUG, CUU或CUA修饰为CUC或CUG ；Ser的密码子可以由UCU或UCA或AGU修饰为UCC，UCG或AGC ；Tyr的密码子可以由UAU修饰为UAC ；Cys的密码子可以由UGU修饰为UGC ；His的密码子可以由CAU修饰为CAC ；Gln的密码子可以由CAA修饰为CAG ；Ile的密码子可以由AUU或AUA修饰为AUC ；Thr的密码子可以由A⑶或ACA修饰为ACC或ACG ；
Asn的密码子可以由AAU修饰为AAC ；Lys的密码子可以由AAA修饰为AAG ；Val的密码子可以由GUU或GUA修饰为GUC或⑶G ；Asp的密码子可以由GAU修饰为GAC ；Glu的密码子可以由GAA修饰为GAG ；终止密码子UAA可以修饰为UAG或UGA。另一方面，在Met (AUG)和Trp (UGG)的密码子的情形中，不存在序列修饰的可能性。上文列出的取代可以单独的或以所有可能的组合使用，以在与其具体的野生型(m) RNA (S卩，原始序列)相比较时，提高本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少 一种(m)RNA的G/C含量。因此，例如，在野生型序列中存在的所有Thr密码子可以修饰为 ACC (或ACG)。然而，优选地，例如，使用上述取代可能性的组合将原始序列(野生型(m) RNA)中编码Thr的所有密码子取代为ACC (或ACG)和将原始编码Ser的所有密码子取代为UCC (或UCG或AGC)；将原始序列中编码Ile的所有密码子取代为AUC和将原始编码Lys的所有密码子取代为AAG和将原始编码Tyr的所有密码子取代为UAC ；将原始序列中编码Val的所有密码子取代为GUC (或GUG)和将原始编码Glu的所有密码子取代为GAG和将原始编码Ala的所有密码子取代为GCC (或GCG)和将原始编码Arg的所有密码子取代为CGC (或CGG)；将原始序列中编码Val的所有密码子取代为GUC (或GUG)和将原始编码Glu的所有密码子取代为GAG和将原始编码Ala的所有密码子取代为GCC (或GCG)和
将原始编码Gly的所有密码子取代为GGC (或GGG)和将原始编码Asn的所有密码子取代为AAC ；将原始序列中编码Val的所有密码子取代为GUC (或GUG)和将原始编码Phe的所有密码子取代为UUC和将原始编码Cys的所有密码子取代为UGC和将原始编码Leu的所有密码子取代为CUG (或CUC)和将原始编码Gln的所有密码子取代为CAG和将原始编码Pro的所有密码子取代为CCC(或CCG)；等等。优选地，与编码本文定义的抗原、抗原蛋白或抗原肽或其片段或变体的野生型(m) RNA的G/C含量相比较，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种(m) RNA的编 码区的G/C含量增加至少7%，更优选地至少15%，特别优选地至少20%。按照具体实施方 案，在编码本文定义的抗原、抗原蛋白或抗原肽或其片段或变体的区域中或野生型(m)RNA 序列的完整序列中至少5%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，更优选地至少70%，甚至 更优选地至少80%和最优选地至少90%，95%或者甚至100%的可取代的密码子被取代， 由此增加所述序列的GC/含量。在该情形中，与野生型序列相比较，特别优选将本发明的活性(免疫刺激性)组合 物的所述至少一种(m) RNA的G/C含量增加至最大值(S卩，可取代的密码子100%被取代)， 特别是在编码蛋白的区域中。按照本发明，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种(m)RNA的另一种优选修饰基于这样的发现，即翻译效率也通过细胞中tRNA出现的不同频率确定。因此， 如果在本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种(m) RNA中存在所谓的“罕用密 码子”达到增多的程度，则相应修饰的至少一种(m) RNA序列被翻译至比其中存在编码相对 “频繁” tRNA的密码子的情形显著更差的程度。按照本发明，在本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述修饰的至少一种(m)RNA中，编码辅助蛋白的区域与野生型(m)RNA的相应区域相比被修饰，以致编码细胞中相对稀有的tRNA的野生型序列的至少一个密码子交换成编码细胞中相对频繁的tRNA的密码 子并携带与相对稀有tRNA相同的氨基酸。通过该变化，改变本发明的活性(免疫刺激性) 组合物的所述至少一种(m)RNA的序列，从而插入可以获得频繁出现的tRNA的密码子。换 言之，按照本发明，在各种情形中，通过该变化，野生型序列的编码细胞中相对稀有的tRNA 的所有密码子可以交换成编码细胞中相对频繁的tRNA的密码子，并且其，在各种情形中， 携带与相对稀有tRNA相同的氨基酸。哪些tRNA在细胞中相对频繁出现和相反地哪些相对罕见出现是本领域中技术 人员已知的，cf.例如Akashi，Curr. Opin. Genet. Dev.(当前遗传发育观点)2001，11 (6) 660-666。特别优选对于特定氨基酸，使用最频繁出现的tRNA的密码子，例如Gly密码子， 其使用在(人)细胞中最频繁出现的tRNA。按照本发明，特别优选的是将本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述修饰的 至少一种(m) RNA中增加的特别是最大化的序列G/C含量与不改变由所述(m) RNA编码区编 码的蛋白的氨基酸序列的“频繁”密码子相连。这个优选的实施方案容许提供本发明的活 性(免疫刺激性)组合物的特别有效翻译和稳定(修饰)的至少一种(m)RNA。如上述的本发明的活性(免疫刺激性)组合物的修饰的至少一种(m)RNA的确定 (增加的G/C含量；tRNA的交换)可以利用WO 02/098443中解释的计算机程序进行——其 公开内容全文包括在本发明中。利用该计算机程序，任何所需的(m)RNA的核苷酸序列可以 借助于遗传密码或其简并性质来修饰，由此最大G/C含量结果，与使用编码细胞中尽可能 频繁出现的tRNA的密码子相结合，导致由所述修饰的至少一种(m) RNA编码的氨基酸序列 与未修饰的序列相比，优选不被改变。备选地，与原始序列相比，还可能仅改变G/C含量或 仅改变密码子的使用。Visual Basic (视觉基础)6. 0(使用的开发环境具有Servic印ack3 的 Microsoft Visual StudioEnterprise6. 0)中的源码也记述在 WO 02/098443 中。在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的至少 一种(m) RNA的核糖体结合位点环境中的A/U含量与其特定野生型(m) RNA的核糖体结合 位点环境中A/U含量相比是增加的。该修饰(在核糖体结合位点周围增加的A/U含量) 增加核糖体结合所述至少一种(m)RNA的效率。核糖体与核糖体结合位点(Kozak序列 GCCGCCACCAUGG(SEQ ID NO 27)，AUG形成起始密码子)的有效结合又具有有效翻译所述至 少一种(m)RNA的作用。按照本发明的另一个实施方案，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的至少一种 (m) RNA可以关于潜在地促降解序列元件(destabilizingsequence elements)而被修饰。 具体地，所述至少一种(m)RNA的编码区和/或5’和/或3’非翻译区与特定野生型(m)RNA 相比可以被修饰，从而不包含促降解序列元件，所修饰的至少一种(m)RNA的编码氨基酸序 列与其特定野生型(m) RNA相比优选不被修饰。已知，例如，在真核生物的RNA序列中存在 促降解序列元件(DSE)，信号蛋白与其结合并在体内调节RNA的酶降解。为了进一步稳定所 修饰的至少一种(m)RNA，任选地在编码本文定义的抗原、抗原蛋白或抗原肽的区域内，可以 因此进行与野生型(m)RNA的相应区域相比的一种或多种这样的修饰，从而使其中不含有 或基本上不含有促降解序列元件。按照本发明，也可以通过所述修饰，从本发明的活性(免 疫刺激性)组合物的至少一种(m)RNA中除去非翻译区(3‘-和/或5' -UTR)中存在的DSE。所述促降解序列是例如富含AU的序列(AURES)，其存在于许多不稳定RNA的 3 ‘ -UTR 部分(Caput 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美国国家科学院学报)1986，83 1670-1674)。因此按照本发明的活性(免疫刺激性)组合物的至少一种(m)RNA与野生型 (m)RNA相比，优选被修饰使得该所述至少一种(m)RNA不含有所述促降解序列。这还应用于 那些由可能的核酸内切酶识别的序列基序，例如序列GAACAAG，其包含在编码转铁蛋白受体 的基因的 3' -UTR 片段中(Binder 等，EMBO J. (ΕΜΒ0 杂志)1994，13 1969-1980)。在本发 明的活性(免疫刺激性)组合物的至少一种(m)RNA中，这些序列基序优选地被去除。按照本发明还优选地，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的至少一种(m)RNA，以 修饰的形式，具有如上文定义的以修饰形式存在的至少一个IRES和/或至少一个5'和/ 或3'稳定序列，例如，以增强核糖体结合或允许位于本发明的活性(免疫刺激性)组合物 的至少一种(双_或甚至是多顺反子)RNA上的不同编码的抗原的表达。按照本发明，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种(m)RNA还更 优选地具有至少一个5'和/或3'稳定序列。这些位于5’和/或3’非翻译区的稳定序 列具有增长所述至少一种(m)RNA在细胞溶胶中半衰期的作用。这些稳定序列可以与在病 毒、细菌和真核生物中存在的天然存在序列具有100%序列同源性，但也可以是部分或完全 合成的。例如来自智人(Homo sapiens)或非洲爪蟾(Xenopus laevis)的珠蛋白基因的 不翻译序列(UTR)可以作为可以在本发明中关于稳定的RNA使用的稳定序列的实例提及。 稳定序列的另一个实例具有通式(C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC(SEQ ID NO :28)，其包 含在编码珠蛋白，α (I)-胶原蛋白，15-脂加氧酶或编码酪氨酸羟化酶的非常稳定的RNA 的 3，UTR 中(参见 Holcik 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美国国家科学院学报)1997，94 2410-2414)。所述稳定序列当然可以单独或彼此组合使用，并且还与本领域中技术人员已 知的其他稳定序列组合使用。本发明的活性(免疫刺激性)组合物的至少一种(m)RNA因 此优选表示为珠蛋白UTR(非翻译区)-稳定的RNA，特别地表示为珠蛋白UTR-稳定的RNA。然而，关于本发明的活性(免疫刺激性)组合物的至少一种RNA优选地进行碱基 的置换、添加或去除，其利用用来制备本发明的活性(免疫刺激性)组合物的至少一种RNA 的DNA基质使用公知的基因定点诱变或寡核苷酸连接策略技术进行(参见例如Maniatis 等，Molecular Cloning =ALaboratory Manual (分子克隆实验室手册)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(冷泉港实验室出版社)，第三版，Cold Spring Harbor(冷泉港)， 纽约，2001)。在该过程中，为了制备所述至少一种(m)RNA，可以在体外转录相应的DNA分 子。该DNA基质优选地包括合适的启动子，例如T7或SP6启动子，以用于体外转录，其后是 待制备的所述至少一种RNA的理想核苷酸序列和体外转录的终止信号。形成至少一种目 的RNA基质的DNA分子可以通过发酵增殖和随后分离为可以在细菌内复制的质粒的一部分 来制备。可以作为适合于本发明提及的质粒是例如质粒pT7Ts (GenBank编号U26404 ；Lai 等，Development (发育)1995，121 :2349_2360)，pGEM 系列，例如pGEM -l (GenBank 编号 X65300 ；来自 Promega)和 pSP64(GenBank 编号 X65327)；还参考Mezei 和 Storts， Purification of PCRProducts (PCR 产物的纯化)，在Griffin 和 Griffin (编)，PCR Technology =Current Innovation (PCR 技术当前改革)中，CRC Press (CRC 出版社)，Boca Raton, FL,2001 ο
本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA的稳定可以同样通过 将所述至少一种RNA与阳离子化合物缔合或复合、或与其结合而进行，所述阳离子化合物 特别是聚阳离子化合物，例如，(聚)阳离子肽或蛋白。特别地，使用鱼精蛋白、核仁蛋白 (nucleoline)、精胺(spermin)或亚精胺作为聚阳离子，针对RNA的核苷酸结合蛋白是特别 有效的。此外，同样可以使用其它阳离子肽或蛋白，诸如聚-L-赖氨酸或组蛋白。用于稳定 RNA的这一方法记述在EP-A-1083232中，其公开内容通过弓I用完全结合在本发明中。可以 用于稳定本发明的活性(免疫刺激性)组合物的RNA的其它优选的阳离子物质包括阳离子 多糖，例如，脱乙酰壳多糖、polybrene、聚氮丙啶(PEI)或聚-L-赖氨酸(PLL)等。本发明 活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA与阳离子化合物(例如，作为基于脂质的 复合剂的阳离子蛋白或阳离子脂质，例如，oligofectamine)的缔合或复合优选地增加作为 药物活性成分存在的所述至少一种RNA向待治疗的细胞或待治疗的生物体内的转运。关于 通过复合稳定本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA的稳定作用，还参 考本文的公开内容，其也支持RNA的稳定。按照另一个特别优选的实施方案，所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一 种RNA可以另外或备选地编码分泌信号肽。所述信号肽是这样的序列，其典型地表现出约 15-30个氨基酸的长度，且优选地位于所编码的肽的N端，并不限于此。如本文定义的信号 肽优选地允许由所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA编码的抗原、抗原蛋 白或抗原肽转运到限定的细胞区室中，优选地转运到细胞表面、内质网(ER)或内体-溶酶 体区室中。如本文定义的分泌信号肽序列的实例包括，但不限于此，经典或非经典MHC-分 子的信号序列(例如，MHC I和II分子的信号序列，例如，I类MHC分子HLA-A*0201的信号 序列)，如本文定义的细胞因子或免疫球蛋白的信号序列，如本文定义的免疫球蛋白或抗体 的不变链的信号序列，Lampl、Tapasin、Erp57、Calretikulin、钙联蛋白(Calnexin)、和其它 膜缔合蛋白或与内质网(ER)或内体-溶酶体区室缔合的蛋白的信号序列。特别优选地，按 照本发明可以使用I类MHC分子HLA-A*0201的信号序列。任何上述修饰可以应用于本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种 RNA上，并且还应用于在本发明的情形中所使用的任意(m) RNA上，并且可以，如果合适或需 要，以任意组合彼此组合，条件是这些修饰组合在各自的至少一种RNA中彼此互不干扰。本 领域技术人员能够因此进行他的选择。按照另一个实施方案，本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物可以包括佐剂。 在该情形中，佐剂可以理解为适于支持本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物的施用和 递送的任何化合物。此外，所述佐剂可以，不限于此，起始或增加先天免疫系统的免疫反应， 即，非特异性免疫反应。换言之，当施用时，本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物典型 地由于由包含在本发明的活性(免疫刺激性)组合物中的至少一种RNA编码的至少两种 抗原而起始适应性免疫反应。另外，本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物可以由于加 入如本文为本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物限定的佐剂而产生(支持性)先天 性免疫反应。所述佐剂可以选自本领域技术人员已知的和适用于本情形的任何佐剂，即， 支持在哺乳动物中诱导免疫反应的任何佐剂。优选地，所述佐剂可以选自由下列各项组 成的组，但不限于此TDM，MDP,胞壁酰二肽，泊洛沙姆(pluronics)，明矾溶液，氢氧化铝， ADJUMER (聚磷腈)；磷酸铝凝胶；源自藻类的葡聚糖；algammulin ；氢氧化铝凝胶(明矾)；高蛋白吸附性氢氧化铝凝胶；低粘性氢氧化铝凝胶；AF或SPT(角鲨烷乳状液(5% )，吐温 80(0.2% )，泊洛沙姆 L121(1.25% )，磷酸盐缓冲液，pH 7.4) ；AVRIDINE (丙烷二胺)； BAYR1005 ((N- (2-脱氧-2-L-亮氨酰氨基_b_D_吡喃葡糖基)-N-十八烷基-十二烷酰_酰 胺氢化乙酸(hydroacetate)) ；CALCITRI0L (1-α，25-二羟基-维生素D3)；磷酸钙凝胶； CAPTM (磷酸钙纳米颗粒)；霍乱全毒素，霍乱-毒素-Al-蛋白-A-D-片段融合蛋白，霍乱毒 素的B亚基；CRL 1005(嵌段共聚物Ρ1205)；包含细胞因子的脂质体；DDA (二甲基二-十八 烷基溴化铵)；DHEA (脱氢表雄酮)；DMPC (二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)；DMPG ( 二肉豆蔻酰磷 脂酰甘油)；DOC/明矾复合物(脱氧胆酸钠盐)；弗氏完全佐剂；弗氏不完全佐剂；Y菊粉； Gerbu佐剂(下列各项的混合物i)N-乙酰葡糖胺基-(P 1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰 基-D-谷氨酰胺(GMDP)，ii) 二甲基双十八烷基氯化铵(DDA)，iii)锌_L_脯氨酸盐复合物 (ZnPro-8) ；GM-CSF) ；GMDP (N-乙酰葡糖胺基_(bl_4)-N-乙酰胞壁酰_L_丙氨酰基-D-异谷 氨酰胺)；咪喹莫特(1-(2_甲基丙基)-1Η-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺)；ImmTherTM(N-乙 酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-异Glu-L-Ala- 二棕榈酸甘油酯)；DRVs (由脱 水-再水合小泡制备的免疫脂质体)；干扰素-Y ；白介素；白介素-2;白介素-7;白介 素-12 ； ISC0MS ； ISC0PREP 7. 0. 3. ；脂质体；L0X0RIBINE (7-烯丙基 _8_ 氧代鸟苷)；LT 口服佐剂(大肠杆菌(E. coli)易变肠毒素-前毒素)；任意组成的微球体和微粒；MF59 ； (角鲨烯-水乳状液)；M0NTANIDE ISA 51 (纯化的不完全弗氏佐剂)；M0NTANIDEISA 720 (可代谢的油佐剂)；MPL (3-Q-去酰基-4 ‘-单磷酰基脂质A) ；MTP-PE和MTP-PE脂 质体((N-乙酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2- (1，2- 二棕榈酰基-sn-甘 油 _3-(羟基磷酰氧基))-乙基酰胺，一钠盐)；MURAMETIDE (Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH 3) ；MURAPALMITINE 和 D-MURAPALMITINE (Nac-Mur-L-Thr-D-异 Gln-sn-甘油二棕榈酰)； NAGO(唾液酸苷酶-半乳糖氧化酶)；任意组成的纳米球体或纳米颗粒；NISVs (非离子表 面活性剂小泡)；PLEURAN ( β -葡聚糖)；PLGA，PGA和PLA (乳酸和乙醇酸的同聚物-和共 聚物；微球体/纳米球体)；PLUR0NICL121 ;PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)；P0DDS (类蛋白 微球体)；聚乙烯氨基甲酸酯衍生物；聚_rA:聚-rU(聚腺苷酸-聚尿苷酸复合物)；聚山 梨酸酯80 (吐温80)；螺旋状蛋白(Avanti极性脂质公司(Avanti Polar Lipids, Inc.), Alabaster, AL) ；STIMUL0N (QS-21) ；Quil-A (Quil-A 皂角苷)；S-28463 (4-氨基-otec-二 甲基-2-乙氧基甲基-IH-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇)；SAF-ItmC Syntex佐剂制剂〃)； Sendai脂蛋白体(proteoliposomes)和包含Sendai的脂质基质；Span-85 (失水山梨糖醇 三油酸酯)；Specol (Marcol 52，司盘85和吐温85的乳液)；角鲨烯或Robane (2,6,10, 15，19，23-六甲基二十四烧和 2，6，10，15，19，23—六甲基-2，6，10，14，18，22- 二十四烧 己烷)；硬脂酰酪氨酸(十八烷基酪氨酸盐酸盐)；Theramid (N-乙酰葡糖胺基-N-乙酰基胞壁酰-L-Ala-D-异 Glu-L-Ala- 二棕榈氧基丙酰胺)；Theronyl-MDP (Termurtide 或[thr U-MDP ；N-乙酰基胞壁酰-L-threonyl-D-异谷氨酰胺)；Ty颗粒(Ty-VLPs或病 毒样颗粒)；Walter-Reed脂质体(包含吸附在氢氧化铝上的脂质A的脂质体)，和脂质 肽，其包括Pam3Cys，特别是铝盐，诸如Adju-phos，铝胶(Alhydrogel)，Rehydragel ；乳状 液，其包括 CFA，SAF, IFA, MF59, Provax, TiterMax, Montanide, Vaxfectin ；共聚物，其包 括 Optivax (CRL1005)，L121, Poloaxmer4010)，等；脂质体，其包括 Stealth，cochleates, 包括BIORAL ；植物来源的佐剂，其包括QS21，Quil A，Iscomatrix, ISCOM ；适于共刺激的佐剂，其包括番茄素，生物聚合物，其包括PLG，PMM，菊粉；微生物来源的佐剂，其包括罗莫肽，DET0X，MPL，CWS，甘露糖，CpG核酸序列，CpG7909，人TLR 1-10的配体，鼠TLR 1-13的配体， ISS-1018, IC31，咪唑并喹啉，阿普林津，Ribi529, IMOxine, IRIVs, VLPs，霍乱毒素，热变性 毒素，Pam3Cys，鞭毛蛋白，GPI锚定子，LNFPII I/LewisX,抗微生物肽，UC-1V150, RSV融合蛋 白，cdiGMP ；和适合用作拮抗剂的佐剂，包括CGRP神经肽。合适的佐剂还可以选自阳离子或聚阳离子化合物，其中所述佐剂优选地当本发明 的活性(免疫刺激性组合物)的所述至少一种RNA与所述阳离子或聚阳离子化合物复合 时制备。所述活性(免疫刺激性)组合物的RNA与本文定义的阳离子或聚阳离子化合物 的缔合或复合优选地为佐剂提供特性，并且赋予所述活性(免疫刺激性)组合物的所述 至少一种RNA的稳定作用。特别地，所述优选的阳离子或聚阳离子化合物选自阳离子或 聚阳离子肽或蛋白，其包括鱼精蛋白，核仁蛋白，精胺或亚精胺，或其它阳离子肽或蛋白， 诸如聚-L-赖氨酸(PLL)，聚-精氨酸，碱性多肽，穿透细胞的肽(CPPs)，其包括HIV-结 合肽，Tat, HIV-ITat (HIV)，Tat-衍生的肽，Penetrain, VP22来源的或类似物肽，HSV VP22(单纯疱疹)，MAP，KALA或蛋白转导结构域(PTDs，PpT620，富含脯氨酸的肽，富含精 氨酸的肽，富含赖氨酸的肽，MPG-肽，Pep-1, L-寡聚物，降钙素肽，触角足来源的肽(特 另1J是来自 Drosophila antennapedia)，ρAntp, plsl, FGF，乳铁转运蛋白，Transportan, Buforin-2, Bac715_24，SynB, SynB (1)，pVEC，hCT-来源的肽，SAP，鱼精蛋白，精胺，亚精 胺，或组蛋白。其它优选的阳离子或聚阳离子化合物可以包括阳离子多糖，例如，脱乙酰 壳多糖，polybrene，阳离子聚合物，例如聚氮丙啶(PEI)，阳离子脂质，例如DOTMA [1_(2， 3-sioleyloxy)丙基)]-N，N, N-三甲基氯化铵，DMRIE，二 -C14-脒，DOTIM，SAINT，DC-Chol， BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE 二油基磷脂酰乙醇胺，DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS Dioctadecylamidoglicylspermin, DIMRI 二肉豆蔻酰-氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵， DOTAP 二油酰氧基-3-(三甲基氨溶)丙烷，DC-6-14 :0，O-双十四烷酰_Ν_( α -三甲基氨 溶乙酰基)二乙醇胺氯，CLIPl 外消旋-[(2，3_双十八烷基氧基丙基)(2-羟基乙基)]-二 甲基氯化铵，CLIP6:外消旋-[2(2，3_双十六烷基氧基丙基-羟甲基氧基)乙基]三甲基 铵，CLIP9:外消旋-[2 (2，3-双十六烷基氧基丙基-羟基琥珀酰氧基)乙基]-三甲基铵， oligofectamine，或阳离子或聚阳离子聚合物，例如改性聚氨基酸，诸如β -氨基酸-聚 合物或反转聚酰胺，等，改性聚乙烯，诸如PVP (聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶鐺))，等， 改性丙烯酸脂，诸如pDMAEMA(聚(二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯))，等，改性酰氨基胺 (Amidoamines)诸如pAMAM(聚(酰氨基胺))，等，改性聚β氨基酯(PBAE)，诸如二胺末端 改性的1，4 丁二醇二丙烯酸酯-共-5-氨基-1-戊醇聚合物，等，树状聚体，诸如聚丙胺树 状聚体或基于PAMAM的树状聚体，等，聚亚胺，诸如PEI 聚(乙烯亚胺)，聚(丙烯亚胺)， 等，聚烯丙基胺，基于糖骨架的聚合物，诸如基于环糊精的聚合物，基于葡萄糖的聚合物，脱 乙酰壳聚糖，等，基于硅烷(silan)骨架的聚合物，诸如PMOXA-PDMS共聚物，等，嵌段聚合 物，其由一个或多个阳离子嵌段(例如，选自如上文提及的阳离子聚合物)的组合和一个或 多个亲水_或疏水_嵌段(例如，聚乙二醇)的组合组成；等。另外，可以通过与所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA复合而 用作佐剂的优选的阳离子或聚阳离子蛋白或肽，可以选自具有下述总式(I)的蛋白或肽 (Arg)1 ； (Lys) m ； (His)n ； (Orn)。；(Xaa)x，其中 l+m+η+ο+χ = 8-15，并且 1，111，11或0 彼此独立地可以是选自 0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15 的任一数字，条件是 Arg，Lys， His和Orn的总含量占该寡肽的所有氨基酸的至少50% ；并且Xaa可以是选自除Arg，Lys, His或Orn外的天然(=天然存在的)或非天然氨基酸的任何氨基酸；并且χ可以是选自 0，1，2，3或4的任一数字，条件是Xaa的总含量不超过该寡肽所有氨基酸的50%。在该情 形中特别优选的低聚精氨酸是，例如，Arg7, Arg8, Arg9, Arg7, H3R9，R9H3, H3R9H3, YS SR9S SY, (RKH)4, Y (RKH)2R,等。此外，合适的佐剂可以选自具有式(II)的核酸=G1XmGn，其中G是鸟苷，尿嘧啶或 是鸟苷或尿嘧啶的类似物；χ是鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述提及的核苷酸的类 似物；1是1-40的整数，其中当1 = 1时，G是 鸟苷或其类似物，当1 > 1时，至少50%的核 苷酸是鸟苷或其类似物；m是整数，并且至少为3 ;其中当m= 3时，X是尿嘧啶或其类似物， 当m > 3时，存在至少3个连续的尿嘧啶或其类似物；η是1_40的整数，其中当η = 1时，G 是鸟苷或其类似物，当η > 1时，至少50%的核苷酸是鸟苷或其类似物。其它合适的佐剂还可以选自具有式(III)的核酸=C1XmCn，其中C是胞嘧啶、尿嘧 啶或者是胞嘧啶或尿嘧啶的类似物；X是鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述提及的核 苷酸的类似物；1是1-40的整数，其中当1 = 1时，C是胞嘧啶或其类似物，当1 > 1时，至 少50%的核苷酸是胞嘧啶或其类似物；m是整数，并且至少为3 ；其中当m = 3时，X是尿嘧 啶或其类似物，当m > 3时，存在至少3个连续的尿嘧啶或其类似物；η是1_40的整数，其 中当η = 1时，C是胞嘧啶或其类似物，当η > 1时，至少50%的核苷酸是胞嘧啶或其类似 物。按照一个优选实施方案，本发明还可以提供包含本发明所述的活性(免疫刺激 性)组合物的疫苗。本发明的疫苗可以另外包含药用载体和/或其它辅助物质和添加剂和/ 或佐剂。按照特别优选的实施方案，由包含在本发明的疫苗中的所述活性(免疫刺激性)组 合物的所述至少一种RNA编码的抗原选自上述提及的组或亚组。按照甚至更优选的实施方 案，蛋白抗原选自下述亚组的任一种抗原，其包括=NY-ESOl [登记号NM_001327]，hTERT [登 记号NM_198253]，存活蛋白[登记号AF077350]，5T4 [登记号NM_006670]和WTl [登记 号NM_000378]，和/或选自下述亚组的任一种抗原，其包括如本文所定义的MAGE-Cl和 MAGE-C2，和/或选自下述亚组的任一种抗原，其包括如本文所定义的MAGE-A2和MAGE-A3。本发明的疫苗典型地包括安全和有效量的如上述定义的所述活性(免疫刺激性) 组合物的所述至少一种RNA，其如上述定义编码至少两种抗原，更优选地编码选自上述组或 亚组的任一项的至少两种抗原，最优选地以所示组合的任一种。当用于本文时，“安全和有 效量”意指如上定义的疫苗中所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA的量，所 述量足以显著诱导待治疗的肺癌、优选非小细胞肺癌(NSCLC)相关病症、更优选与三种主 要亚型的非小细胞肺癌(NSCLC)相关的病症的积极缓和，所述三种主要亚型的非小细胞肺 癌(NSCLC)包括但不限于鳞状细胞肺癌、腺癌和大细胞肺癌。然而，同时，“安全和有效量”是 足以避免严重副作用的少量，即，足以允许优点和风险之间的合理关系。这些限制的确定典 型地在合理的医学判断的范围之内。关于本发明的疫苗，表述“安全和有效的量”优选地意 指这样的RNA量(和所编码的至少两种抗原的量)，其适于以这样的方式刺激适应性免疫系 统，以致不获得过量的或破坏性的免疫反应，但是，优选地，也没有低于可测量水平的这样 的免疫反应。如上文定义的疫苗中活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA的所述“安全和有效量”还可以取决于RNA的类型进行选择，例如，单顺反子、双-或甚至多顺反子 RNA,这是因为双-或甚至多顺反子RNA可以导致比使用等量单顺反子RNA显著更高的编码 抗原的表达。包含在本发明疫苗中的如上文定义的活性(免疫刺激性)组合物的至少一种 RNA的“安全和有效量”，还将与待治疗的特定病症相关而不同，并且还与待治疗的患者的年 龄和身体条件、病症的严重性、治疗的持续时间、伴随治疗的性质、所用的特定药用载体、以 及类似因素相关，这在陪同医师的知识和经验范围内。按照本发明的疫苗可以按照本发明 作为药物组合物或作为疫苗用于人以及用于兽医医学目的。按照本发明的疫苗典型地包含药用载体。当用于本文时，表述“药用载体”优选地 包括基于液体或非液体的本发明的疫苗。如果本发明的疫苗以液体形式提供，则载体典型 地是无热原的水；等渗盐水或缓冲的(水性)溶液，例如，磷酸盐_、柠檬酸盐-缓冲溶液，等 等。特别地对于本发明疫苗的注射，可以使用水，或者优选地使用缓冲液，更优选地使用水 性缓冲液，其包含钠盐，优选至少50mM的钠盐，钙盐，优选至少0，OlmM的钙盐，和任选地钾 盐，优选至少3mM的钾盐。按照优选实施方案，所述钠、钙和任选地钾盐可以以它们的卤化 物形式存在，例如，氯化物、碘化物或溴化物，以它们的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐、或硫酸 盐等形式存在。不限于此，钠盐的实例包括，例如NaCl，NaI，NaBr, Na2CO3,NaHCO3,Na2SO4,任 选地钾盐的实例包括，例如KC1，KI，KBr，K2C03, KHCO3, K2SO4,和钙盐的实例包括例如CaCl2, CaI2, CaBr2, CaCO3, CaSO4, Ca(OH)2。此外，缓冲液中可以包含前述阳离子的有机阴离子。按 照更优选的实施方案，如上文定义适于注射目的的缓冲液可以包含选自氯化钠(NaCl)，氯 化钙(CaCl2)和任选地氯化钾(KCl)的盐，其中除了氯化物之外可以存在其它阴离子。CaCl2 也可以被另一种盐如KCl替换。典型地，注射缓冲液中的盐以至少50mM氯化钠(NaCl)，至 少3mM氯化钾(KCl)和至少0，OlmM氯化钙(CaCl2)的浓度存在。所述注射缓冲液可以相对 于特定的参照介质是高渗的、等渗的或低渗的，即，相对于特定的参照介质，所述缓冲液可 以具有更高、相等或更低的盐含量，其中优选地可以使用前文提及的盐的所述浓度，其不导 致由于渗透或其它浓度影响引起的对细胞的损伤。参照介质为，例如，在“体内”方法中存在 的液体，如血液、淋巴、细胞质液体、或其它体液，或者例如可以在“体外”方法中用作参照介 质的液体，诸如普通缓冲剂或液体。所述普通缓冲剂或液体是技术人员已知的。林格-乳 酸盐溶液特别优选地用作液体基础。然而，还可以使用适用于施用给人的一种或多种相容的固体或液体填充剂或稀释 剂或包封化合物。术语“相容”用在本文意指本发明疫苗的组成能够以在典型的使用条件 下不发生显著降低本发明疫苗的药物效用的相互作用的方式与所述活性(免疫刺激性)组 合物的、编码如上文定义的至少两种抗原的所述至少一种RNA相混合。当然，药用载体、填 充剂和稀释剂必需具有充分高的纯度和充分低的毒性，以使得它们适用于施用给待治疗的 人。可以用作药用载体、填充剂或其组分的化合物的一些实例为糖，诸如例如，乳糖、葡萄 糖和蔗糖；淀粉，诸如例如玉米淀粉或马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如例如，羧甲基 纤维素钠，乙基纤维素，醋酸纤维素；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；牛脂；固体助流剂，诸如例 如，硬脂酸，硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，诸如例如，花生油，棉籽油，芝麻油，橄榄油，玉米油 和可可油；多元醇，诸如例如，聚丙二醇，甘油，山梨糖醇，甘露醇和聚乙二醇；海藻酸。药用载体的选择主要由施用本发明疫苗的方式决定。例如，本发明的疫苗可以系 统性或口服施用。系统性施用的途径通常包括，例如，透皮、口服、肠胃外途径，包括皮下、静脉内、肌内、动脉内、皮内和腹膜内注射和/或鼻内施用途径。局部施用途径通常包括，例 如，局部施用途径以及皮内、透皮、皮下、或肌内注射或损伤内、颅骨内、肺内、心脏内、和舌 下注射。更优选地，疫苗可以通过皮内、皮下、或肌内途径施用。因此，组合物/疫苗优选地 配制为液体或固体形式。本发明的疫苗施用的适合量可以通过用动物模型进行常规实验确 定。所述模型包括，但不暗示任何限制，兔、绵羊、小鼠、大鼠、狗和非人灵长动物模型。优选 的用于注射的单位剂型包括无菌水溶液、生理盐水或它们的混合物。所述溶液的PH应该调 节为约7. 4。用于注射的合适载体包括水凝胶、可控或延迟释放的装置、聚乳酸和胶原基质。 用于局部应用的合适的药用载体包括适合用在洗液、膏剂、凝胶等中的那些。如果本发明的 疫苗应该经口施用，片剂、胶囊等是优选的单位剂型。用于制备可以用于口服施用的单位剂 型的药用载体在现有技术中是公知的。其选择取决于次要的考虑，如口味、成本和保存性， 其对于本发明的目的不是至关重要的，并且可以由本领域的技术人员不费力的确定。本发明的疫苗可以另外包含一种或多种辅助物质，以进一步增加免疫原性。由此 优选地获得如上文定义的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA和如上文所述 还可以任选地包含在本发明疫苗中的辅助物质的协同作用。取决于辅助物质的各种类型， 在这一方面可以考虑多种机制。例如，允许树突细胞(DCs)成熟的化合物，例如脂多糖， TNF-α或⑶40配体，形成第一类合适的辅助物质。通常，可以使用以“危险信号”(LPS， GP96，等)方式影响免疫系统的任何试剂或以靶向方式允许由本发明所述的免疫刺激佐剂 引起的免疫反应被增强和/或被影响的细胞因子如GM-CFS作为辅助物质。特别优选的辅 助物质为细胞因子，诸如，单核因子，淋巴因子，白介素或趋化因子，其一一除了通过所编 码的至少两种抗原诱导适应性免疫反应之外促进先天性免疫反应，诸如IL-1，IL-2， IL-3, IL-4, IL-5, IL-6， IL-7， IL-8， IL-9， IL-10， IL-12， IL-13， IL-14， IL-15， IL-16， IL-17, IL-18, IL-19, IL-20， IL-21， IL-22， IL-23， IL-24， IL-25， IL-26， IL-27， IL-28， IL-29, IL-30, IL-31, IL-32，IL-33，INF-α，IFN-β，INF- y , GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-β 或TNF-α，生长因子，如hGH。可以包含在本发明的疫苗中的其它添加剂为乳状液，诸如例如，Tween ^润剂， 诸如例如，十二烷基硫酸钠；着色剂；口味赋予剂，药用载体；片剂形成剂；稳定剂；抗氧化 剂；防腐剂。本发明的疫苗还可以另外包含任何其它化合物，已知其由于其针对人Tol 1-样受 体 TLR1，TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLRlO 的结合亲和力(作为配 体)、或由于其针对鼠 Toll-样受体 TLRl，TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLRl 1，TLR12或TLR13的结合亲和力(作为配体)而是免疫刺激性的。在该情形中，可以添加到本发明疫苗中的另一类化合物可以是CpG核酸，特别 是 CpG-RNA 或 CpG-DNA。CpG-RNA 或 CpG-DNA 可以是单链 CpG-DNA (ss CpG-DNA)，双链 CpG-DNA (dsDNA)，单链 CpG-RNA (ss CpG-RNA)或双链 CpG-RNA (ds CpG-RNA)。CpG 核酸优选 地以CpG-RNA形式存在，更优选地以单链CpG-RNA (ss CpG-RNA)形式存在。CpG核酸优选地 包含至少一个或多个(促有丝分裂的)胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸序列(CpG基序)。按照第 一个优选的备选方案，包含在这些序列中的至少一个CpG基序，即CpG基序的C(胞嘧啶) 和G(鸟嘌呤)，是未甲基化的。任选地包含在这些序列中的所有其它胞嘧啶或鸟嘌呤可以 是甲基化的或未甲基化的。然而，按照更优选的备选方案，CpG基序的C(胞嘧啶)和G(鸟嘌呤)还可以以甲基化形式存在。按照本发明另一个优选的目的，如本文定义的本发明的活性(免疫刺激性)组合物或编码至少两种(优选地)不同的抗原的所述至少一种RNA可以(用于制备)用于 治疗肺癌，优选地非小细胞肺癌(NSCLC)相关的病症，更优选地与三种主要亚型的非小细 胞肺癌(NSCLC)相关的病症(的本发明所述的疫苗)，所述三种主要亚型的非小细胞肺癌 (NSCLC)包括，但不限于，鳞状细胞肺癌、腺癌和大细胞肺癌。按照本发明的另一个优选目的，本发明的疫苗或如本文定义的编码至少两种(优 选地)不同抗原的至少一种RNA可以用于治疗肺癌，优选地非小细胞肺癌(NSCLC相关疾 病，更优选地与三种主要亚型的非小细胞肺癌(NSCLC)相关的病症，所述病症包括但不限 于，鳞状细胞肺癌，腺癌和大细胞肺癌。在该情形中，治疗肺癌、优选地非小细胞肺癌(NSCLC)相关的病症、更优选地与三 种主要亚型的非小细胞肺癌(NSCLC)相关的病症的方法也包含在本发明中，所述三种主要 亚型的非小细胞肺癌(NSCLC)包括，但不限于，鳞状细胞肺癌、腺癌和大细胞肺癌，所述方 法通过向需要其的患者施用药物有效量的本发明的疫苗、或药物有效量的本发明的活性 (免疫刺激性)组合物进行。所述方法典型地包括制备本发明的活性(免疫刺激性)组合 物、或本发明的疫苗的任选的第一步骤，和第二步骤，其包括向需要其的患者施用(药物有 效量的)所述本发明的活性(免疫刺激性)组合物或所述本发明的疫苗。需要其的患者典 型地选自任何哺乳动物。在本发明的情形中，哺乳动物优选地选自包括但不限于下列各项 的组例如，山羊、牛、猪、狗、猫、猴、猿，啮齿动物如小鼠、仓鼠、兔，以及特别是人，其中所述 哺乳动物典型地患有肺癌，优选地非小细胞肺癌(NSCLC)相关的病症，更优选地与三种主 要亚型的非小细胞肺癌(NSCLC)相关的病症，所述三种主要亚型的非小细胞肺癌(NSCLC) 包括，但不限于，鳞状细胞肺癌、腺癌和大细胞肺癌或与其相关的病症。本发明还涉及如本文定义的本发明的活性(免疫刺激性)组合物或编码至少两种 (优选地)不同抗原的所述至少一种RNA (用于制备本发明的疫苗)、优选地用于在哺乳动 物中引发免疫反应、优选地用于治疗肺癌、更优选地用于治疗如本文定义的非小细胞肺癌 (NSCLC)相关病症的应用。类似地，本发明还涉及如本文定义的本发明的疫苗本身或编码至少两种(优选 地)不同抗原的所述至少一种RNA用于在哺乳动物中引发适应性免疫反应、优选地用于治 疗肺癌、更优选地用于治疗如本文定义的非小细胞肺癌(NSCLC)相关病症的应用。在需要其的患者中预防或治疗肺癌、优选地如本文定义的非小细胞肺癌(NSCLC) 相关病症可以通过一次性或以时间交错方式施用本发明的活性(免疫刺激性)组合物和/ 或本发明的疫苗而进行，例如，作为多部件的试剂盒，每个部件包含至少一种优选不同的抗 原。对于施用，优选地可以使用如上文定义的任何施用途径。例如，人们可以通过基于由本 发明活性(免疫刺激性)组合物的至少一种RNA编码的至少两种(特别选择的)抗原诱 导或增强适应性免疫反应而治疗肺癌，优选地如本文定义的非小细胞肺癌(NSCLC)相关病 症。然后，可以在施用如本文定义的另一种本发明的创造性活性(免疫刺激性)组合物和 /或本发明的疫苗之前、同时和/或随后进行施用本发明的活性(免疫刺激性)组合物和/ 或本发明的疫苗，其中所述另一种本发明的创造性活性(免疫刺激性)组合物和/或本发 明的疫苗可以包含编码不同抗原的另一种RNA组合，其中由本发明活性(免疫刺激性)组合物的至少一种RNA编码的每种抗原可以优选地适用于治疗肺癌，更优选地适用于治疗如 本文定义的非小细胞肺癌(NSCLC)相关病症。在该情形中，如本文定义的治疗还可以包括 与肺癌相关的疾病、优选如本文定义的非小细胞肺癌(NSCLC)相关疾病的调节。
按照另一个实施方案，本发明还包括所述活性(免疫刺激性)组合物(用于制备) 用于在哺乳动物中调节、优选诱导或增强如本文定义的免疫反应的、更优选地支持肺癌、特 别是如本文定义的NSCLC的治疗(本发明的疫苗的)应用。在该情形中，肺癌，尤其是如本 文定义的NSCLC的治疗的支持可以是用于肺癌，尤其是本文定义的NSCLC的常规癌症治疗 的任何组合，诸如放射治疗、化疗、质子治疗、激素治疗、抗体治疗、佐剂治疗、包括除本发明 疫苗之外的其它疫苗的治疗、包括激酶抑制剂或小核苷酸的治疗等，或者这些中的一些的 组合，和使用如本文定义的本发明活性(免疫刺激性)组合物或本发明疫苗的治疗。对肺 癌、特别是如本文定义的NSCLC的治疗的支持还可以在本文定义的任意其它实施方案中讨 论。如本文定义的本发明的活性(免疫刺激性)组合物或编码至少两种(优选地)不 同的抗原的至少一种RNA或本发明的疫苗的施用可以在时间交错治疗中进行。时间交错的 治疗可以是，例如，在治疗肺癌、特别是NSCLC之前、同时和/或随后施用如本文定义的本发 明的活性(免疫刺激性)组合物或编码至少两种(优选地)不同的抗原的至少一种RNA或 本发明的疫苗，例如，通过在治疗性适于治疗肺癌、特别是如本文定义的NSCLC的治疗或施 用之前、同时和/或随后施用本发明的活性(免疫刺激性)组合物或疫苗。所述时间交错 的治疗可以使用例如试剂盒、优选如下文定义的多部件的试剂盒进行。时间交错的治疗可以另外或备选地还包括以这样的形式施用本发明的活性(免 疫刺激性)组合物或疫苗、优选地如上述定义的编码至少两种(优选不同的)抗原的至少 一种RNA，其中如上文定义的编码至少两种(优选不同的)抗原的至少一种RNA(其优选地 形成本发明的活性(免疫刺激性)组合物或疫苗的一部分)与如上文定义的编码至少两种 (优选不同的)抗原的另一种至少一种RNA(其优选地形成同一份本发明的活性(免疫刺 激性)组合物或疫苗的一部分)平行、在其之前或之后施用。优选地，(所有至少一种RNA 的)施用在1小时内、更优选在30分钟内、甚至更优选地在15，10，5，4，3，或2分钟或者甚 至1分钟内进行。所述时间交错的治疗可以使用例如试剂盒、优选如下文定义的多部件的 试剂盒进行。 按照最后一个实施方案，本发明还提供试剂盒，特别是多部件的试剂盒，其包括所 述活性本发明的(免疫刺激性)组合物、和/或本发明的疫苗，和任选地具有所述本发明的 活性(免疫刺激性)组合物和/或本发明的疫苗的施用和剂量的信息的技术说明书。所述 技术说明书可以包含关于本发明的活性(免疫刺激性)组合物、和/或本发明的疫苗的施 用和剂量的信息。所述试剂盒、优选多部件的试剂盒，可以用于，例如，任何上文提及的应用 或用途，优选地用于至少一种本发明的活性(免疫刺激性)组合物(用于制备)治疗肺癌、 特别是如本文定义的NSCLC (的本发明的疫苗)的应用。所述试剂盒还可以用于至少一种本 发明的活性(免疫刺激性)组合物(用于制备)治疗肺癌、优选是如本文定义的NSCLC(的 本发明的疫苗)的应用，其中本发明的活性(免疫刺激性)组合物)和/或所述疫苗由于 所编码的至少两种抗原可以能够在如上文定义的哺乳动物中诱导或增强免疫反应。所述试 剂盒还可以用于至少一种本发明的活性(免疫刺激性)组合物(用于制备)在如上文定义的哺乳动物中调节、优选引发、例如诱导或增强免疫反应、且优选地支持肺癌、特别是NSCLC 治疗(的本发明的疫苗)的应用。多部件的试剂盒，作为试剂盒的特殊形式，可以在试剂盒 的不同部件中包含一种或多种相同或不同的活性本发明的(免疫刺激)组合物和/或一种 或多种相同或不同的本发明的疫苗。多部件的试剂盒还可以在试剂盒的不同部件中包含 (例如一种)活性本发明的(免疫刺激性)组合物、(例如一种)本发明的疫苗和/或如上 文定义编码至少一种抗原的至少一种RNA，例如，试剂盒的每个部件包含编码优选不同的抗 原的至少一种RNA。另外，两种类型的多部件试剂盒的组合是可以的。例如，当考虑时间交错 治疗时，例如，当在同一体内治疗过程中使用不同配制和/或增加浓度的活性本发明的(免 疫刺激性)组合物、本发明的疫苗和/或如上文定义的编码至少一种抗原的至少一种RNA 时，可以使用多部件试剂盒。还可以在考虑本发明活性(免疫刺激性)组合物的不同抗原 (例如，在多部件中)的分开的配制或施用时或有此需要时(例如，为了技术原因)，但是例 如仍然实现不同抗原在体内的组合存在时，使用多部件试剂盒。特别地，考虑作为特殊形式 的试剂盒的多部件试剂盒，其中所述试剂盒的每个部件包含如上文定义的至少一种优选不 同的抗原，所述多部件试剂盒的所有部件优选形成如本文定义的所述活性本发明的(免疫 刺激性)组合物或本发明的疫苗。所述特殊的多部件试剂盒可以特别是合适的，例如，如果 不同抗原作为该试剂盒的不同部分分别配制，但是然后一起一次性或以时间交错方式施用 至需要其的哺乳动物。在后一种情形中，所述试剂盒的所有不同部件的施用典型地在短时 间限制内施用，以致所有抗原在紧随试剂盒最后部件的施用之后几乎同时存在于哺乳动物 中。上述任一种试剂盒可以用作如上文所述的治疗中。本发明的优点本发明提供用于治疗肺癌、特别是非小肺癌(NSCLC)的活性(免疫刺激性)组合 物，其中所述组合物包括至少一种RNA、优选mRNA，其编码能够在哺乳动物中引发(适应 性)免疫反应的至少两种(优选不同的)抗原，其中所述抗原选自由下列各项组成的组 hTERT, WTl，MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白，MAGE-C1， 或MAGE-C2。所述活性(免疫刺激性)组合物允许肺癌、特别是非小肺癌(NSCLC)的有效治 疗，或者当使用常规治疗时的补充治疗。此外，它通过利用RNA作为医疗方法的途径而避免 所引入的DNA序列的不可控增殖的问题。用在本发明的活性(免疫刺激性)组合物的RNA 比DNA表达系统具有其它相当多的优点，例如，在免疫反应、免疫或接种中。这些优点特别 包括引入到细胞中的RNA不整合到基因组中。这避免该基因的突变的风险，其另外可以完 全或部分被灭活或者产生错误信息。它还避免使用DNA作为诱导免疫反应的试剂(例如， 作为疫苗)的其它风险，诸如在已经引入外源DNA的患者中诱导病原性抗-DNA抗体，因此 导致(可能是致死性的)免疫反应。相反，尚未检测到抗-RNA抗体。附图下述附图意欲进一步举例说明本发明。它们不意欲另外限制本发明的主题。图1 描述编码MUCl(HsMUCl-5xVNTR(野生型序列通常表示40个串联重复。这 些出于克隆原因减少为5个串联重复))的RNA序列(SEQ ID N0:1)(起始序列 基于野生型)。GC含量61. 27% ；长度1668bp)。图 2 描述编码 MUCl 的(GC)稳定 RNA 序列(SEQ ID NO 2) (HsMUClGC-5xVNTR, 1.GC最大化，2.密码子应用)GC含量73. 56% ；长度1668bp。与基本序列(图1 (SEQ IDNO 1))的不同398/1668 个碱基=23. 86%。图3 描述编码5T4 (Hs5T4 (滋养层糖蛋白TPBG)的RNA序列(SEQID NO 3)(起始序列基于野生型)；GC含量61.60% ；长度1263bp。图4 描述编码 5T4 的(GC)稳定 RNA 序列(SEQ ID NO 4) (Hs5T4GC，1. GC-最大化， 2.密码子应用)；GC含量70. 47%;长度1263bp。与基本序列(图3 (SEQ ID NO 3))的不 同247/1263 个碱基=19. 56%。图5 描述编码Her-2/neu (HsHer2/neu (v-erb_b2成红血细胞白血病病毒癌基因 同源物2))的RNA序列(SEQ ID NO 5)(起始序列基于野生型)；GC含量60· 78% ；长度 3768bp。图 6 描述编码 Her-2/neu 的(GC)稳定 RNA 序列(SEQ ID NO 6) (HsHer2/neu GC, 1.GC-最大化，2.密码子应用)；GC含量70. 54%;长度3768bp。与基本序列(图5 (SEQ ID NO 5))的不同:772/3768 个碱基=20.49%。图7 描述编码hTERT (HsTERT (端粒末端转移酶反转录酶)的RNA序列(SEQ ID NO 7)(起始序列基于野生型)；GC含量66. 08% ；长度3399bp。图 8 描述编码 hTERT 的(GC)稳定 RNA 序列(SEQ ID NO 8) (HsTERT GC, 1. GC-最 大化，2.密码子应用)；GC含量72.96% ；长度3399bp，与基本序列(图7 (SEQ ID NO 7)) 的不同566/3399个碱基=16. 65%。图9 描述编码WTl (HsffTl (维尔姆斯瘤1))的RNA序列(SEQ IDNO 9)(起始序列 基于野生型)；GC含量61.78% ；长度1554bp。图10 图10A)描述编码WTl (HsWTl (维尔姆斯瘤1))的RNA序列(SEQ ID NO 10)， 其与野生型序列相对应的区域相比较，在所述序列的区域325-408表现出具有减少的GC含 量的序列。图10B)，C)和D)显示相对应的区域325-408的比较在B)中，图9 (SEQ ID NO: 9)所述的野生型序列，在C)中，图11 (SEQ ID NO :11)所述的GC-最大化的序列，和在D) 中，图10 (SEQ ID NO 10)所述的GC-减少的序列，其均表现出不同的GC-模式。图11 描述编码 WTl 的(GC)稳定 RNA 序列(SEQ ID NO 11) (HsffTlGC, 1. GC-最大 化，2.密码子应用)；GC含量72. 59% ；长度1554bp。与基本序列(图9(SEQ ID NO 9)) 的不同=322/1554个碱基=20. 72%。图12 描述编码 CEA (CEA (癌胚抗原)HsCEACAM5)的 RNA 序列(SEQ ID NO 12)(起 始序列基于野生型)；GC含量52. 20% ；长度:2109bp。图 13 描述编码 CEA 的(GC)稳定 RNA 序列(SEQ ID NO 13) (CEACAM5GC, 1. GC-最 大化，2.密码子应用，已经在适当的位置)；GC含量66.24% ；长度2109bp。与基本序列 (图 12 (SEQ ID NO 12))的不同495/2109 个碱基=23. 47%。图14 描述编码 MAGE-A2 (HsMAGE_A2 (黑素瘤抗原家族 A，2) HsMAGE_A2B)的 RNA 序 列(SEQ ID NO 14)(起始序列基于野生型)。GC含量55. 87% ；长度945bp。图 15 描述编码 MAGE-A2 的(GC)稳定 RNA 序列(SEQ ID NO 15) (HsMAGE_A2B GC, 1.GC-最大化，2.密码子应用)；GC含量68. 57%;长度945bp。与基本序列(图14 (SEQ ID NO 14))的不同187/945 个碱基=19.79%。图16 描述编码MAGE-A3 (MAGE-A3 (黑素瘤抗原家族A，3)MAGE_A3)的RNA序列 (SEQ ID NO 16)(起始序列基于野生型)，GC含量56. 30% ；长度945bp。
图 17 描述编码 MAGE-A3 的(GC)稳定 RNA 序列(SEQ ID NO 17) (MAGE-A3GC, 1.GC-最大化，2.密码子应用，已知富含GC的)；GC含量69.00% ；长度945bp。与基本序 列(图 16(SEQID NO: 16))的不同190/945 个碱基=20. 11%。图18 :描述编码存活蛋白(存活蛋白(包含杆状病毒IAP重复5，BIRC5) HsSurvivin(Wt))的 RNA 序列(SEQ ID NO 18)(起始序列基于野生型)；GC 含量52· 68% ； 长度429bp。图19 描述编码存活蛋白的(GC)稳定RNA序列(SEQ ID NO 19) (HsSurvivin(GC), 1.GC-最大化，2.密码子应用，已知富含GC的)；GC含量65. 27%;长度: 429bp。与基本序列(图 18(SEQID NO 18))的不同72/429 个碱基=16. 78%。图 20 描述编码 NY-ES0-1 (智人(Homo sapiens) NY-ESO-I (NY-ESO-l (wt))的 RNA 序列(SEQ ID NO 20)(起始序列基于野生型)；GC-含量67. 4%。
图 21 描述编码 NY-ES0-1 的(GC)稳定 RNA 序列(SEQ ID NO 21) (NY-ESO-l (GC)， GC-含量79. 56%，(已知富含GC的)；与野生型(图20 (SEQ ID NO 20))的不同112/543 个碱基，20. 63%。图22 描述编码 MAGE-Cl (HsMAGECl (黑素瘤抗原家族 C，1)HsMAGEC 1 (wt))的 RNA 序列(SEQ ID NO 22)(起始序列基于野生型)，GC含量51. 86% ；长度3429bp。图 23 描述编码 MAGE-C 1 的(GC)稳定 RNA 序列(SEQ ID NO 23) (HsMAGECl (GC)， 1.GC-最大化，2.密码子应用)。GC含量68. 73% ；长度3429bp。与基本序列(图22 (SEQ ID NO 22))的不同964/3429 个碱基=28. 11%图24 描述编码截短的MAGE-Cl的(GC)稳定RNA序列(SEQ IDNO 24) (HsMAGECl (GC)，1. GC-最大化，2.密码子应用)。与基本序列(图22 (SEQ ID NO 22))相 比较，删除重复区，并且按照图24的序列，在最初的起始密码子(ATG)之后，以613个aa的 GC-最大化的野生型序列开始(图23 (SEQ ID NO :23))。图25 描述编码 MAGE-C2 (HsMAGE_C2 (黑素瘤抗原家族 C，2) HsMAGE_C2)的 RNA 序 列(SEQ ID NO :25)(起始序列基于野生型)；GC含量50. 81% ；长度1122bp。图 26 描述编码 MAGE-C2 的(GC)稳定 RNA 序列(SEQ ID NO 26) (HsMAGE_C2GC， 1.GC-最大化，2.密码子应用)；GC含量66. 58%;长度1122bp，与基本序列(图25 (SEQ ID NO 25))的不同:264/1122 个碱基=23. 53%。图27显示在用由5种成分组成的mRNA疫苗接种的小鼠中对肿瘤抗原NY_ES0_1 特异性的IgGl抗体的存在，所述5种成分分别包含与鱼精蛋白以4 1的质量比例配制的 编码一种 NSCLC 相关抗原(NY-ES0-1，MAGE-Cl ,MAGE-C2，存活蛋白和 5T4)的 mRNA。图28 显示在用由5种成分组成的mRNA疫苗接种的小鼠中对肿瘤抗原NY_ES0_1 特异性的IgG2a抗体的存在，所述5种成分分别包含与鱼精蛋白以4 1的质量比例配制 的编码一种NSCLC相关抗原(NY-ES0-1，MAGE-Cl, MAGE-C2，存活蛋白和5T4)的mRNA。图29 显示在用由5种成分组成的mRNA疫苗接种的小鼠中对肿瘤抗原MAGE-Cl特 异性的IgGl抗体的存在，所述5种成分分别包含与鱼精蛋白以4 1的质量比例配制的编 码一种 NSCLC 相关抗原(NY-ES0-1，MAGE-Cl, MAGE-C2，存活蛋白和 5T4)的 mRNA。图30 显示在用由5种成分组成的mRNA疫苗接种的小鼠中对肿瘤抗原MAGE-Cl特 异性的IgG2a抗体的存在，所述5种成分分别包含与鱼精蛋白以4 1的质量比例配制的编码一种 NSCLC 相关抗原(NY-ESO-1，MAGE-Cl, MAGE-C2，存活蛋白和 5T4)的 mRNA。图31显示在用由5种成分组成的mRNA疫苗接种的小鼠中对肿瘤抗原MAGE-C2特 异性的IgGl抗体的存在，所述5种成分分别包含与鱼精蛋白以4 1的质量比例配制的编 码一种 NSCLC 相关抗原(NY-ES0-1，MAGE-Cl，MAGE-C2，存活蛋白和 5T4)的 mRNA。 图32 显示在用由5种成分组成的mRNA疫苗接种的小鼠中对肿瘤抗原MAGE-C2特 异性的IgG2a抗体的存在，所述5种成分分别包含与鱼精蛋白以4 1的质量比例配制的 编码一种 NSCLC 相关抗原(NY-ES0-1，MAGE-Cl ,MAGE-C2，存活蛋白和 5T4)的 mRNA。图33 显示在用由5种成分组成的mRNA疫苗接种的小鼠中针对肿瘤抗原5T4的 抗原特异性T淋巴细胞的诱导，所述5种成分分别包含与鱼精蛋白以4 1的质量比例配 制的编码一种NSCLC相关抗原(NY-ES0-1，MAGE-Cl, MAGE-C2，存活蛋白和5T4)的mRNA。图34 显示在用由5种成分组成的mRNA疫苗接种的小鼠中针对肿瘤抗原 NY-ES0-1的抗原特异性T淋巴细胞的诱导，所述5种成分分别包含与鱼精蛋白以4 1的 质量比例配制的编码一种NSCLC相关抗原(NY-ES0-1，MAGE-Cl, MAGE-C2，存活蛋白和5T4) 的 mRNA。
实施例下述实施例意欲进一步举例说明本发明。它们不意欲另外限制本发明的主题。1.制备编码的质粒在下述实验中，分别制备对应于编码下述抗原的各自mRNA序列末端的DNA序列· hTERT,‘ WTl,· MAGE-A2,· 5T4,· MAGE-A3,‘ MUCl,· Her-2/neu,· NY-ES0-1，· CEA， 存活蛋白，· MAGE-Cl，或·ΜΑ6Ε_〇2。并且用于体外转录和转染实验。由此，对应于天然抗原编码mRNA的DNA序列增加 GC-含量且是密码子-优化的。然后，将编码序列转移至RNActive构建体(库瑞瓦格有限 责任公司，Tubingen，德国)中，其已经用聚腺苷酸标记和聚胞苷酸标记(A70-C30)进行了 修饰。2.体外转录基于在实施例1中获得的重组质粒DNA，通过体外转录制备RNA序列。因此，将所 述重组质粒DNA线性化，并且随后使用T7RNA聚合酶在体外转录。然后通过DNA酶I消化 降解DNA模板，并且通过LiCl沉淀回收RNA，并且通过HPLC提取(PUREMessenger ，库瑞瓦格有限责任公司，Tubingen，德国)进一步纯化。3.与龟精蛋白复合为了将所述RNA转染至细胞和生物体中，将通过体外转录获得的RNA优选地复合， 更优选地当将所述RNA与鱼精蛋白混合时与鱼精蛋白复合。4.接种实验对于接种，将通过如上述体外转录实验获得的RNA(见实验2)转染到小鼠(小鼠 C57 BL/6)中，优选地在与鱼精蛋白复合时进行(见实验3)。转染发生在不同组中，其中每 组5只小鼠(C57BL/6)在3周内用本发明的mRNA混合物即与鱼精蛋白复合的mRNA的混合 物皮内免疫 8 次，其中所述 RNA 编码抗原 hTERT，WT1，MAGE-A2，5T4，MAGE-A3, MUC1，Her_2/ neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白，MAGE-Cl，或 MAGE-C2 中的至少两种。5. nm^M-^n^f^m. (n-mm^^m.)抗原-特异性免疫反应(B-细胞免疫反应)的检测通过检测抗原_特异性抗体进 行。因此，在最后一次接种后一周从接种的小鼠采集血液样品，并且制备血清。将MaxiSorb 板(Nalgene Nunc International)用由所述mRNA-混合物编码的抗原蛋白(0. 5 μ g/孔) 包被。在用包含0.05%吐温-20和1%BSA的IX PBS封闭之后，将板用稀释的小鼠血清 (1 30,1 90，1 270,1 810)温育。随后，加入生物素-偶联的二抗(抗-小鼠_IgG2a Pharmingen)。洗涤后，将板用辣根过氧化物酶_链霉抗生物素蛋白温育，并且随后测量 ABTS底物(2，2’ -连氮基-二(3-乙基-苯噻唑啉-6-磺酸)的转化。6.诵i寸ELISP0T检测丨杭原-特异件细胞为,疮反应(T细胞为,疮反应)在最后一次接种后2周，将小鼠处死，去除脾并且分离脾细胞。在存在来自上述抗 原的肽(肽文库)的条件下或与由用编码所述抗原的RNA电穿孔的天然同系小鼠的骨髓细 胞产生的树突细胞共温育，将所述脾细胞再刺激7天。为了确定抗原-特异性细胞免疫反 应，在再刺激后测量INFy分泌。为了检测INFy，将包被多筛选平板(Millipore)用包括 针对INF γ的抗体(BD Pharmingen，Heidelberg，德国)的包被缓冲液0. IM碳酸盐-碳酸 氢盐缓冲液PH 9.6,10. 59g/l Na2CO3,8. 4g/l NaHCO3)温育过夜。在所述平板中以1 20 的比例温育刺激和效应细胞24小时。将板用IXPBS洗涤，并且用生物素-偶联的二抗温 育。在用lXPBS/0.05%吐温-20洗涤后，向板中加入底物(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸/ 氮蓝四唑液体底物系统，来自SigmaAldrich (西格玛奥德里奇)，Taufkirchen，德国)，并且 可以视觉检测底物的转化。7.肿瘤攻击免疫在最后一次免疫后一周，将IMio B16黑素瘤细胞或TRAMP-Cl细胞皮下注射至小 鼠中。分别在2周(B16)或7周(TRAMP-Cl)内，确定肿瘤体积。8.制备mRNA疫苗按照上述公开内容，在下述制备本发明的活性(免疫刺激性)组合物的特定实例， 其包括一些抗原的组合，用作用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的疫苗。所述示例性的本发 明的活性(免疫刺激性)组合物由5种成分组成，每种成分包含与鱼精蛋白以4 1的质 量比例配制的编码一种NSCLC相关抗原(NY-ES0-1，MAGE-Cl, MAGE-C2，存活蛋白和5T4，按 照 SEQ ID NOs :4，19，21，24 和 26 (富含 GC 的序列))的 mRNA。接种
将C57BL/6小鼠用由5种成分组成的mRNA疫苗皮内接种，每种成分包含编码一种 NSCLC相关抗原(NY-ES0-1，MAGE-Cl,MAGE-C2，存活蛋白和 5T4，按照 SEQ ID NOs :4，19，21， 24和26 (GC-富集的序列))的mRNA，所述抗原用鱼精蛋白配制(64 μ g/抗原/周期，分成 4次注射/周期)。对照接种使用响应总剂量的编码LacZ的RNA(对照mRNA IacZ)进行。 接种包括三个免疫周期(第1、3和5周)。组、小鼠数目和小鼠品系显示在下表中
"II小鼠品系I小鼠数目
mRNA 疫苗C57BL/6 10 只
5只用于Elispot，5只用 于通过ELISA检测血清 中的抗体
对照 mRNA IacZ C57BL/6 5K
3只用于Elispot，所有5 只用于通过ELISA检测 血清中的抗体检测抗原_特异性的抗体最后一次接种后6天，后眼窝采集血液样品(200 μ 1)，并且使用ELISA分析血清中 抗原特异性抗体亚型IgGl和IgG2a的存在。将96-孔ELISA板用重组蛋白(在包被缓冲 液中1(^8/!111，在371温育4小时)包被，并且每孔用200 μ 1封闭缓冲液在4°C封闭过夜。 随后，将样品用从每组小鼠收集的血清温育，并且在室温下在1 3-1 48范围内的稀释 液中滴定4小时。在用针对小鼠IgGl或IgG2a的特异性抗体(在封闭缓冲液中1 300) 温育和用HRP-偶联的二次抗体(在封闭缓冲液中1 500)温育后，加入TMB-底物。使用 ELISA 读数仪(Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim，德国)在 450nm 处测量比色反应。ELISPOT为了检测细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)反应，使用ELISPOT技术，可以在单细胞水 平显现响应特定刺激的效应器细胞因子IFN-Y的分泌的分析。在最后一次接种后6天，分离来自抗原_接种的和对照小鼠的脾细胞，然后转移至 用抗-IFN-γ捕捉抗体(10yg/ml)包被的96-孔ELISPOT板中。然后，将细胞在37°C用相 关的抗原_来源的肽文库或用HIV-来源的文库或所述肽的溶剂DMSO刺激24小时，或在纯 培养基中温育作为对照。所有文库均以Iyg/肽/ml的浓度使用。在温育期间之后，从板 洗掉细胞，并且使用针对小鼠IFN-Y的生物素酰化的二次抗体(lyg/ml)、然后是链霉抗 生物素蛋白-AKP检测由该细胞分泌的IFN- γ。使用BCIP/NBT底物显现点，并且使用自动 ELISPOT 读数仪(Immunospot Analyzer, CTL AnalyzersLLC)计数。统计学分析使用 Graph Pad Prism 5. 01 (GraphPad Software, Inc. (GraphPad 软件公司))进 行统计学分析。所有结果表示为平均值(或中值)士平均值的标准误差。对于Elispot测 定，由于基本活化是强烈的个体依赖性的事实，通过从所有其它数值中减去培养基孔的点 数分别进行每只小鼠的背景校正。使用双尾Marm-Whitney检验来分析测试组之间的不同，显著水平为5%。结果和讨论小鼠用如上述定义包含5种成分的mRNA疫苗、特别是分别独立地与阳离子肽鱼精 蛋白以4 1的质量比例配制的编码NSCLC-相关抗原NY-ES0-1，MAGE-C2, MAGE-C1，存活 蛋白和5T4，(按照SEQ ID而8:4，19，21，24和26(富含6(的序列))的富含6(的1111 離 接种。对照小鼠用与鱼精蛋白以与所述mRNA疫苗相同的比例配制的编码LacZ的不相关的 RNA进行处理。使用分离自采自抗原_接种的和对照小鼠的血液的血清，我们检测了针对所 述抗原的特异性抗体的诱导。对于五种分析的蛋白中的三种，即，MAGE-Cl, MAGE-C2和 NY-ES0-1，我们在用所述mRNA疫苗接种的小鼠血清中检测到抗原特异性抗体，这表明所述 mRNA在体内是功能性的和免疫原性的。检测抗体所需要的蛋白在大肠杆菌(E.coli)中生 产。因为在大肠杆菌中的蛋白生产可以影响翻译后修饰，并且对于所用的抗原，没有充分描 述这些，这可解释对于其余蛋白观察到的响应的缺乏。然后，分析了响应所述mRNA疫苗的施用的细胞毒性T细胞的激活。IFN-γ是Thl 反应的主要调控子，并且由激活的CTL分泌。因此，使用ELISP0T技术，研究抗原-特异性 细胞毒性T细胞在来自接种的小鼠的脾细胞中的存在。使用限制性肽文库作为脾细胞的抗 原刺激物。因为所用的人抗原针对小鼠MHC(在C57BL/6小鼠中H_2Kb和H_2Db)的独特表 位是未知的，所以我们必须使用通过搜索SYFPEITHI数据库由于潜在的结合亲和性所选择 的假设的肽选择。从肽文库(15mers，其中11个氨基酸重叠)，淘选蛋白的完整序列，选择 那些包含假设最佳表位的15mers，并且合并至最多18个肽。然而，这些选择可能不必需包 含正确的表位，以致在这些工具辅助下的免疫反应检测可能容易地产生假阴性结果。然而， 用起源于NY-ES0-1和5T4的这些文库中的两种刺激，在来自用所述mRNA疫苗接种的小鼠 的脾细胞中导致高IFN-Y分泌，且在来自用编码不相关蛋白β-半乳糖苷酶的mRNA接种 的对照小鼠的脾细胞中没有。所述脾细胞没有一种与HIV-来源的对照肽文库反应。仅在 培养基中温育的脾细胞的IFN-Y点数表示新鲜分离的细胞的基本激活。由于基本激活是 强烈个体依赖性的事实，所以通过从所有其它数值中减去培养基孔的点数而独立进行背景 校正。三次实验的结果显示在图27-34中。
权利要求
活性(免疫刺激性)组合物，其包括编码至少两种不同抗原的至少一种RNA，a)其中所述至少两种抗原中的至少一种选自·NY-ESO-1，·MAGE-C1，和/或·MAGE-C2；和b)其中其它抗原选自这样的至少一种抗原，所述至少一种抗原选自下述组·hTERT，·WT1，·MAGE-A2，·5T4，·MAGE-A3，·MUC1，·Her-2/neu，·NY-ESO-1，·CEA，·存活蛋白，·MAGE-C1，和/或·MAGE-C2。
2.按照权利要求1的活性(免疫刺激性)组合物，其中按照a)的所述至少两种不同的 抗原中的至少一种选自 MAGE-CLiP / 或 MAGE-C2。
3.按照权利要求1或2的活性(免疫刺激性)组合物，其中按照b)的所述其它抗原专 一地选自下述抗原组合 hTERT 和 WTl ；或 hTERT 和 MAGE-A2 ；或 hTERT 和 5T4 ；或 hTERT 禾口 MAGE-A3 ；或 hTERT和 MUCl ；或 hTERT 禾口 Her-2/neu ；或 hTERT 和 NY-ES0-1 ；或 hTERT 和 CEA ；或 hTERT和存活蛋白；或 hTERT 和 MAGE-Cl ；或 hTERT 和 MAGE-C2 ；或 WTl 禾口 MAGE-A2 ；或 WTl 禾口 5T4 ；或 WTl 和 MAGE-A3 ；或 WTl 禾口 MUCl ；或 WTl 禾口 Her-2/neu ；或 WTl 禾口 NY-ESO-I ；或 WTl 禾口 CEA ；或 WTl和存活蛋白；或 WTl 禾口 MAGE-Cl ；或 WTl 禾口 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2 和 5T4 ；或 MAGE-A2 禾口 MAGE-A3 ；或 MAGE-A2 禾口 MUCl ；或 MAGE-A2 禾口 Her-2/'neu ；或 MAGE-A2 和 NY-ES0-1 ；或 MAGE-A2 和 CEA ；或 MAGE-A2和存活蛋白；或 MAGE-A2 禾口 MAGE-Cl ；或 MAGE-A2 和 MAGE-C2 ；或 5T4 禾口 MAGE-A3 ；或 5T4 和 MUCl ；或 5T4 禾口 Her-2/neu ；或 5T4 和 NY-ES0-1 ；或 5T4 和 CEA ；或 5T4和存活蛋白；或 5T4 禾口 MAGE-Cl ；或 5T4 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3 禾口 MUCl ；或 MAGE-A3 禾口 Her-2/'neu ；或 MAGE-A3 禾口 NY-ES0-1 ；或 MAGE-A3 和 CEA ；或 MAGE-A3和存活蛋白；或 MAGE-A3 禾口 MAGE-Cl MAGE-A3 禾口 MAGE-C2 MUCl 和 Her-2/neu ；或 MUCl 和 NY-ES0-1 ；或 MUCl 禾口 CEA ；或 MUCl和存活蛋白；或 MUCl 和 MAGE-Cl ；或 MUCl 禾口 MAGE-C2 ；或 HER-2/NEU 和 NY-ES0-1 ；或 HER-2/NEU 和 CEA ；或 HER-2/NEU和存活蛋白； 或 HER-2/NEU 和 MAGE-Cl ；或 HER-2/NEU 和 MAGE-C2 ；或 NY-ESO-I 和 CEA ；或 NY-ES0-1和存活蛋白；或 NY-ES0-1 和 MAGE-Cl ；或 NY-ES0-1 和 MAGE-C2 ；或 CEA和存活蛋白；或 CEA 和 MAGE-Cl ；或 CEA 和 MAGE-C2 ；或 存活蛋白和MAGE-Cl ；或 存活蛋白和MAGE-C2 ；或 MAGE-Cl 和 MAGE-C2 ； 或 hTERT, WTl 和 MAGE-A2 ；或 hTERT, WTl 和 5T4 ；或 hTERT, WTl 和 MAGE-A3 ；或 hTERT, WTl 和 MUCl ；或 hTERT, WTl和 Her-2/neu ；或 hTERT, WTl 和 NY-ES0-1 ；或 hTERT, WTl 和 CEA ；或 hTERT, WTl和存活蛋白；或 hTERT, WTl 和 MAGE-Cl ；或 hTERT, WTl 和 MAGE-C2 ；或 WT1,MAGE-A2 和 5T4 ；或 WT1，MAGE-A2 和 MAGE-A3 ；或 WT1，MAGE-A2 和 MUCl ；或 WT1，MAGE-A2 和 Her-2/neu ；或 WTl，MAGE-A2 和 NY-ES0-1 ；或 WTl, MAGE-A2 和 CEA ；或 WTl，MAGE-A2和存活蛋白；或 ffTl，MAGE-A2 和 MAGE-C1 ；或 WT1，MAGE-A2 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2, 5T4 和 MAGE-A3 ；或 MAGE-A2，5T4 禾口 MUCl ；或 MAGE-A2 , 5T4 和 Her-2/neu ；或 MAGE-A2 , 5T4 和 NY-ESO-1 ；或 MAGE-A2，5T4 和 CEA ；或 MAGE-A2，5T4和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A2, 5T4 和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3 禾口 MUCl ；或 5T4, MAGE-A3 和 Her-2/neu ；或 5T4, MAGE-A3 禾口 NY-ESO-1 ；或 5T4, MAGE-A3 禾口 CEA ；或 5T4，MAGE-A3和存活蛋白；或 5T4, MAGE-A3 禾口 MAGE-Cl ；或 5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3, MUCl 和 Her-2/neu ；或 MAGE-A3, MUCl 禾口 NY-ES0-1 ；或 MAGE-A3, MUCl 禾口 CEA ；或 MAGE-A3, MUCl和存活蛋白；或 MAGE-A3, MUCl 禾口 MAGE-C1 ；或 MAGE-A3, MUCl和 MAGE-C2 ；或 MUCl，Her-2/neu 和 NY-ES0-1 ；或 MUCl，Her-2/neu 和 CEA ；或 MUCl，Her-2/neu和存活蛋白；或 MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-Cl ；或 MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-C2 ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1 和 CEA ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1 和存活蛋白；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1 和 MAGE-C1 ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1 和 MAGE-C2 ；或 NY-ES0-1, CEA和存活蛋白；或 NY-ES0-1，CEA 禾口 MAGE-Cl -M NY-ES0-1，CEA 和 MAGE-C2 ；或 CEA，存活蛋白和MAGE-Cl ；或 CEA，存活蛋白和MAGE-C2 ；或 存活蛋白，MAGE-Cl 和 MAGE-C2 ； 或 hTERT, WT1，MAGE-A2 和 5T4 ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2 和 MAGE-A3 ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2 禾口 MUCl ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2 和 Her-2/neu ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2 和 NY-ESO-l ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2 和 CEA ；或 hTERT, WTl，MAGE-A2 和存活蛋白；或 hTERT, WT1，MAGE-A2 和 MAGE-C1 ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2 和 MAGE-C2 ；或‘WTl, MAGE-A2, 5Τ4 禾口 MAGE-A3 ；或 ‘WTl, MAGE-A2, 5Τ4 禾口 MUCl ；或 WT1，MAGE-A2, 5Τ4 和 Her-2/neu ；或 WT1，MAGE-A2, 5Τ4 禾口 NY-ESO-1 ；或 ‘WTl, MAGE-A2, 5Τ4 禾口 CEA ；或 WTl，MAGE-A2,5T4和存活蛋白；或 ‘WTl, MAGE-A2, 5T4 禾口 MAGE-Cl ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2,5T4, MAGE-A3 禾口 MUCl ；或 MAGE-A2,5T4, MAGE-A3 和 Her-2/neu ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 NY-ESO-1 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 CEA ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A2,5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，禾口 Her-2/neu ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl 禾口 NY-ESO-1 ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl 禾口 CEA ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl和存活蛋白；或 5T4, MAGE-A3, MUCl 禾口 MAGE-Cl ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 NY-ESO-1 ；或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 CEA ；或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和存活蛋白；或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-Cl ；或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-C2 ；或 MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 CEA ；或 MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1 和存活蛋白；或 MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-C1 ；或 MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-C2 ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1，CEA 和存活蛋白；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1，CEA 和 MAGE-Cl ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1，CEA 和 MAGE-C2 ；或 NY-ES0-1，CEA，存活蛋白和 MAGE-Cl ；或 NY-ES0-1，CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 CEA,存活蛋白，MAGE-Cl 和 MAGE-C2 ； 或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4 和 MAGE-A3 ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4 和 MUCl ； 或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4 和 Her-2/neu ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4 和 NY-ESO-1 ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4 和 CEA ；或 hTERT, WTl，MAGE-A2,5T4 和存活蛋白；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4 和 MAGE-C1 ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4 和 MAGE-C2 ；或 ‘WTl, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 禾口 MUCl ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 Her-2/neu ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 NY-ESO-1 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 CEA ；或 WTl，MAGE-A2,5T4, MAGE-A3 和存活蛋白；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C1 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 Her-2/neu ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 NY-ESO-1 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 CEA ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 MAGE-Cl ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 NY-ESO-1 ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 CEA ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和存活蛋白；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-Cl ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 CEA ；或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1 和存活蛋白；或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-C2 ；或 MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA 和存活蛋白；或 MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA 和 MAGE-C1 ；或 MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA 和 MAGE-C2 ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1，CEA，存活蛋白和 MAGE-Cl ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 NY-ES0-1，CEA，存活蛋白，MAGE-Cl 和 MAGE-C2 ； 或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 MUCl ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 Her-2/neu ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 NY-ESO-1 ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 CEA ；或 hTERT, WTl，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和存活蛋白；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C1 ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C2 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 Her-2/neu ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 NY-ESO-1 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 CEA ；或 WTl，MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl 和存活蛋白；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 MAGE-Cl ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 NY-ESO-1 ； 或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 CEA ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-Cl ； 或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-C2 ； 或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 CEA ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1 和存活蛋白；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-C1 ； 或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-C2 ； 或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA 和存活蛋白； 或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA 和 MAGE-C1 ； 或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA 和 MAGE-C2 ； 或 MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-C1 ；或 MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1，CEA，存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ； 或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 Her-2/neu ； 或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 NY-ESO-1 ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 CEA ；或 hTERT, WTl，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和存活蛋白； 或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 MAGE-Cl ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 MAGE-C2 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 NY-ESO-1 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 CEA ； 或 WTl，MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和存活蛋白；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-Cl ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 CEA ；或 MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl, Her-2/neu, NY-ES0-1 和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA 和存活蛋白；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA 和 MAGE-C1 ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-Cl ；或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ； 或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 NY-ESO-1 ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 CEA ；或 hTERT, WTl，MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和存活蛋白；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-Cl ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-C2 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 CEA ；或 WTl, MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl, Her-2/neu, NY-ES0-1 和存活蛋白；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-C1 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA 和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA 和 MAGE-Cl ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA 和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-Cl ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3, MUCl, Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ； 或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 CEA ；或 hTERT, WTl，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1 和存活蛋白；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-Cl ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-C2 ； 或 WTl，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-I, CEA 和存活蛋白；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA 和 MAGE-Cl ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-Cl ；或 MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl, Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ； 或 hTERT, WTl，MAGE-A2，5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA 和存活蛋白；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA 和 MAGE-Cl ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA 和 MAGE-C2 ；或 WTl，MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-C1 ；或 WTl，MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl, Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA,存活蛋白，MAGE-Cl 禾口 MAGE-C2 ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA，存活蛋白和 MAGE-Cl ；或 hTERT, WTl, MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl, Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 WT1,MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白，MAGE-C1 禾口 MAGE-C2 ；或 hTERT, WTl, MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl, Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA,存活蛋白， MAGE-Cl 禾口 MAGE-C2。
4.按照权利要求1-3中任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少一种RNA 包括250-20000个核苷酸的长度。
5.按照权利要求1-4中任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少一种RNA 为 mRNA。
6.按照权利要求1-5中任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少一种RNA 为单顺反子、双顺反子或甚至是多顺反子RNA。
7.按照权利要求5的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少两种抗原每种由单顺 反子RNA编码。
8.按照权利要求6的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少两种抗原由单顺反子、 双顺反子和/或甚至多顺反子RNAs的混合物编码。
9.按照权利要求1-8中任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少一种RNA 包括选自编码权利要求1-3中任一项定义的抗原的片段、变体或表位的RNA。
10.按照权利要求1-9中任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少一种RNA包括选自与按照SEQ ID NOs :1，3，5，7，9，12，14，16，18，20，22或25的RNA序列相同或至少 5%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，或 80%相同的 RNA 的 RNA。
11.按照权利要求1-10中任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少一种RNA 是修饰的RNA，特别是稳定的mRNA。
12.按照权利要求11的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少一种RNA编码区的 G/C含量与野生型RNA编码区的G/C含量相比增加，与野生型RNA编码的氨基酸序列相比 较，所述至少一种RNA编码的氨基酸序列优选地不被改变。
13.按照权利要求11-12中任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少一种 RNA的核糖体结合位点环境中的A/U含量与野生型RNA的核糖体结合位点环境中的A/U含 量相比较增加。
14.按照权利要求11-13中任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述修饰的mRNA 的编码区和/或5'和/或3'非翻译区与野生型RNA相比较被修饰，以致其不包含促降解 序列元件，与野生型RNA相比较，所述修饰的mRNA编码的氨基酸序列优选地不被改变。
15.按照权利要求11-14中任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述修饰的mRNA 具有5'帽结构和/或聚腺苷酸尾，优选地为10-200个腺苷核苷酸，和/或聚胞苷酸尾，优 选地为10-200个胞嘧啶核苷酸，和/或至少一个IRES和/或至少一个5 ‘和/或3 ‘稳定 序列。
16.按照权利要求1-15中任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少一种 RNA，优选所有mRNAs，包括选自与按照 SEQ ID NOs :2，4，6，8，10，11，13，15，17，19，21，23，24 或26的RNA序列相同或至少80%相同的RNA的RNA。
17.按照权利要求1-16中任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少一种RNA 与一种或多种聚阳离子复合，优选地与鱼精蛋白或oligofectamine、最优选与鱼精蛋白复口 O
18.按照权利要求1-17中任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述活性组合物 另外包括至少一种佐剂。
19.按照权利要求18的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少一种佐剂选自由下 列各项组成的组阳离子或聚阳离子化合物，其包括阳离子或聚阳离子肽或蛋白，包括鱼精蛋白，核仁蛋 白，精胺或亚精胺，聚-L-赖氨酸(PLL)，聚-精氨酸，碱性多肽，穿透细胞的肽(CPPs)，其包 括HIV-结合肽，Tat, HIV-I Tat (HIV)，Tat-衍生的肽，Penetratin, VP22来源的或类似物 肽，HSV VP22(单纯疱疹)，MAP, KALA或蛋白转导结构域(PTDs，PpT620,富含脯氨酸的肽， 富含精氨酸的肽，富含赖氨酸的肽，MPG-肽，Pep-1, L-寡聚物，降钙素肽，触角足来源的肽 (特别是来自 Drosophila antennapedia), ρAntp, plsl, FGF,乳铁转运蛋白，Transportan, Buforin-2, Bac715_24，SynB, SynB (1)，pVEC，hCT-来源的肽，SAP，鱼精蛋白，精胺，亚精 胺，或组蛋白，阳离子多糖，其包括脱乙酰壳多糖，polybrene，阳离子聚合物，其包括聚氮丙 啶(PEI)，阳离子脂质，其包括DOTMA :[1_(2，3-sioleyloxy)丙基)]_N，N, N-三甲基氯化 铵，DMRIE，二 -C14-脒，DOTIM, SAINT, DC-Choi, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE 二油基磷 月旨酰乙醇胺，DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS =Dioctadecylamidoglicylspermin, DIMRI 二肉豆蔻酰-氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵，DOTAP 二油酰氧基-3-(三甲基氨溶)丙烷，DC-6-14:0，0-双十四烷酰-Ν-(α-三甲基氨溶乙酰基)二乙醇胺氯化物，CLIPl 外消 旋-[(2,3-双十八烷基氧基丙基)(2-羟基乙基)]_ 二甲基氯化铵，CLIP6 外消旋-[2(2， 3-双十六烷基氧基丙基-羟甲基氧基)乙基]三甲基铵，11 9:外消旋-[2(2，3-双十六 烷基氧基丙基-羟基琥珀酰氧基)乙基]-三甲基铵，oligofectamine，或阳离子或聚阳离 子聚合物，其包括改性聚氨基酸，包括β “氨基酸_聚合物或反转聚酰胺，改性聚乙烯，包括 PVP (聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶鐺))，改性丙烯酸脂，包括pDMAEMA (聚(二甲基氨基 乙基甲基丙烯酸酯))，改性酰氨基胺(Amidoamines)，包括pAMAM(聚(酰氨基胺))，改性聚 β氨基酯(ΡΒΑΕ)，包括二胺末端改性的1，4 丁二醇二丙烯酸酯-共-5-氨基-1-戊醇聚合 物，树状聚体，包括聚丙胺树状聚体或基于PAMAM的树状聚体，聚亚胺，包括PEI 聚(乙烯 亚胺)，聚(丙烯亚胺)，聚烯丙基胺，基于糖骨架的聚合物，包括基于环糊精的聚合物，基于 葡萄糖的聚合物，脱乙酰壳多糖，等，基于硅烷(silan)骨架的聚合物，诸如PMOXA-PDMS共 聚物，等，嵌段聚合物，其由选自如前文提及的阳离子聚合物的一个或多个阳离子嵌段的组 合与一个或多个亲水_或疏水嵌段(例如，聚乙二醇)的组合组成；或阳离子或聚阳离子蛋白或肽，其选自具有下述总式(I)的蛋白或肽(Arg)1; (Lys)m; (His)n; (Orn)。；(Xaa)x，其中l+m+η+ο+χ = 8-15，并且l，m，n或ο彼此独立地可以是选自0， 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14 或 15 的任一数字，条件是 Arg，Lys, His 和 Orn 的总 含量占该寡肽的所有氨基酸的至少50% ；并且Xaa可以是选自除Arg，Lys, His或Orn外的 天然(=天然存在的)或非天然氨基酸的任何氨基酸；并且χ可以是选自0，1，2，3或4的 任一数字，条件是Xaa的总含量不超过该寡肽所有氨基酸的50% ；或具有式(II)的核酸=G1XmGn，其中G是鸟苷，尿嘧啶或是鸟苷或尿嘧啶的类似物；X是 鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述提及的核苷酸的类似物；1是1-40的整数，其中当 1 = 1时，G是鸟苷或其类似物，当1 > 1时，至少50%的核苷酸是鸟苷或其类似物；m是整 数，并且至少为3 ；其中当m = 3时，X是尿嘧啶或其类似物，当m > 3时，存在至少3个连续 的尿嘧啶或尿嘧啶类似物；11是1-40的整数，其中当η = 1时，G是鸟苷或其类似物，当11 > 1时，至少50%的核苷酸是鸟苷或其类似物；或具有式(III)的核酸=C1XmCn，其中C是胞嘧 啶、尿嘧啶或者是胞嘧啶或尿嘧啶的类似物；X是鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述 提及的核苷酸的类似物；1是1-40的整数，其中当1 = 1时，C是胞嘧啶或其类似物，当1 > 1时，至少50%的核苷酸是胞嘧啶或其类似物；m是整数，并且至少为3 ；其中当m = 3时，X 是尿嘧啶或其类似物，当m > 3时，存在至少3个连续的尿嘧啶或尿嘧啶类似物；η是1_40 的整数，其中当η = 1时，C是胞嘧啶或其类似物，当η > 1时，至少50%的核苷酸是胞嘧啶 或其类似物。
20.疫苗，其包括按照权利要求1-19中任一项的活性(免疫刺激性)组合物。
21.按照权利要求20的疫苗，其中按照要求1-19中任一项的活性(免疫刺激性)组合 物引发适应性免疫反应。
22.按照权利要求20和21中任一项的疫苗，其中所述疫苗还包括药用载体。
23.按照权利要求1-19中任一项的活性(免疫刺激性)组合物用于制备疫苗的应用， 所述疫苗用于治疗肺癌、优选非小细胞肺癌(NSCLC)相关病症、更优选与三种主要亚型的非小细胞肺癌(NSCLC)相关的病症，所述三种主要亚型的非小细胞肺癌(NSCLC)包括鳞状 细胞肺癌、腺癌和大细胞肺癌。
24.试剂盒，优选多部件的试剂盒，其包括按照权利要求1-19中任一项的活性(免疫刺 激性)组合物，和/或按照权利要求20-22中任一项的疫苗，和任选地具有所述活性(免疫 刺激性)组合物和/或所述疫苗的施用和剂量的信息的技术说明书。
全文摘要
本发明涉及活性(免疫刺激性)组合物，其包括至少一种RNA，优选mRNA，其编码至少两种(优选不同的)能够在哺乳动物中引发(适应性)免疫反应的抗原。本发明还涉及包括所述活性(免疫刺激性)组合物的疫苗，涉及所述活性(免疫刺激性)组合物(用于制备疫苗)的应用和/或所述疫苗用于引发(适应性)免疫反应以用于治疗肺癌、特别是非小细胞肺癌(NSCLC)、或与其相关的病症的应用，所述肺癌优选选自三种主要亚型的鳞状细胞肺癌、腺癌和大细胞肺癌。最后，本发明涉及包含所述活性(免疫刺激性)组合物和/或所述疫苗的试剂盒，特别是多部件的试剂盒。
文档编号A61K39/00GK101820899SQ200880110920
公开日2010年9月1日 申请日期2008年10月8日 优先权日2007年10月9日
发明者托马斯·兰德尔, 约亨·普罗布斯特, 英马尔·霍伊尔, 马里耶克·贝尔纳 申请人:库瑞瓦格有限责任公司