专利名称：芳香酶抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有芳香酶抑制作用的药剂。更具体而言，本发明涉及这样的药剂，其 通过抑制生物体内将男性激素(雄激素)转化为女性激素(雌激素)的酶芳香酶的活性， 进而抑制男性激素的减少或者女性激素的增加，从而不仅在闭经后女性的乳腺癌、还在男 性更年期障碍以及内脏脂肪累积所致代谢综合征等性激素依赖性疾病的治疗和/或预防 方面有效的。
背景技术：
近年来开始获知，在子宫肌瘤、子宫内膜异位症、子宫内膜癌、闭经后乳腺癌等雌 激素依赖性疾病中，在病灶局部区域中雌激素合成亢进(in situ estrogen)，而由此生成 的局部雌激素与病灶的生长和进展密切相关(非专利文献1、2)。一直以来，在闭经后女性的乳腺癌等雌激素依赖性疾病的治疗中，均采用通过与 雌激素受体结合从而展现出抗雌激素作用的药剂它莫西芬(tamoxifen)。但是，该药剂存在 出现抗性的问题，因此，现在，参与雌激素合成的控速酶芳香酶的抑制剂作为治疗药受人瞩 目(非专利文献1、2)。芳香酶是一种控速酶，其通过将男性激素即雄激素(雄烯二酮、睾酮)的类固醇骨 格的A环芳香化，藉此将其转化为女性激素即雌激素(雌酮、雌二醇)，从而参与到性激素生 物合成体系的最终步骤(图1)。在闭经前女性中，主要雌激素供给源是卵巢，而在闭经后女性中，雌激素主要是通 过肌肉、脂肪等末梢组织的芳香酶将由肾上腺分泌的雄激素转化而来。因此，特别是在闭经 后乳腺癌的激素疗法中，芳香酶作为其靶酶受人瞩目。对于在前述闭经后乳腺癌等的治疗中所使用的芳香酶抑制剂，以主要以合成化合 物为中心的研究为多见，现市售或者临床试验中的抑制剂根据其结构可大致分为1型(类 固醇系)和2型(非类固醇系)(图2)。但是，这些合成化合物在临床中会有肝脏损伤、给 药部位疼痛等副作用，并且可能会引发Stevens-Johnson综合征，因此存在服用期间必须 要接受定期检查的问题(非专利文献3)。因此，希望用安全的、没有副作用的天然材料开发出有望具有治疗或预防效果的 医药品或健康食品。还希望在此材料的基础上，发现用于新药开发的新先导化合物。但是，几乎还没有探讨来自具有多种多样成分的天然材料例如生药或植物的芳香 酶抑制剂的研究(非专利文献4)。另一方面，近年来，男性在步入中老年后出现了所谓“男性更年期障碍”的问题。“更年期障碍”以前认为是女性特有的疾病，然而近年来认识到男性也存在更年期 障碍。男性更年期障碍的症状有易疲劳、抑郁、精力减退等，其原因被认为是年龄增加所引 起的男性激素减少(非专利文献5)。在临床中，针对因男性激素减少所引起的男性更年期，进行睾酮等男性激素的补 充疗法，但是这可能会引起肝损伤、前列腺癌、脱毛等副作用(非专利文献6)。
因此，本发明人着眼于将前述男性激素转化为女性激素的酶芳香酶，探讨通过抑 制该酶是否可以防止男性激素的减少。已有报道称，在男性中，男性激素向女性激素的转化率随着年龄的增加而增加 (非专利文献7)。此外，还有报道称，通过向性腺机能低下或者男性激素缺乏症的男性给予 芳香酶抑制剂，血液中的睾酮值得到回复或升高(非专利文献8、专利文献1)。再者，近年来，在男性步入对应更年期年龄的中老年后，除了如上所述的易疲劳、 抑郁、精力减退等诸症状之外，还频繁出现上半身型的脂肪蓄积模式，即内脏脂肪累积，因 此与出现代谢综合征的关系受到人们的瞩目。也就说，这表明代谢综合征的原因之一与睾 酮等男性激素随年龄增加而减少有关(非专利文献9)。
此外，已知在男性中，芳香酶在内脏脂肪中的分布比在其它部位的分布更多，并且 该酶的活性会随年龄的增长而增加(非专利文献10)。还已知内脏脂肪累积的程度与血液 中的睾酮值表现出逆相关。由此认为，内脏脂肪中的芳香酶是作为在睾酮减少所致的内脏 脂肪累积中的重要因子来起作用的(非专利文献11)。另外，给高龄男性补充睾酮会减少体脂肪量、血液中的瘦蛋白(Ieptin)值、食物 摄取量，并使基础代谢亢进。还有报道称，在性腺机能低下症的男性中，发现体脂肪量随年 龄增长而显著增加，并通过给予睾酮来减少体脂肪量(非专利文献12)。因此，本发明人以前述芳香酶为目标，对不仅对闭经后女性的乳腺癌、同时还对男 性更年期障碍和内脏脂肪累积所致的代谢综合征等性激素依赖性疾病展现出治疗和/或 预防效果、并且没有副作用的药剂进行了探寻，从而对具有芳香酶抑制活性的新材料进行 了探索。非专 利文献 1 :Chen S，Aromatase and breast cancer，Frontiersin Bioscience，3 ；d922_933，1998.非专利文献 2 :Simpson ER and Dowsett Μ.，Aromatase and itsinhibitors significance for breast cancer therapy, Recent Prog HormRes. ,57 ；317-38,2002.非专利文献3 磯村八州男、岡田稔、了 口 7夕一七阻害薬O研究開発動向，” r ；u -T V r , 30 卷，754-758，1994.非专利文献 4 :Dietmar G，Gerhard S.，Aromatase inhibitorsfrom Urtica dioca Roots，Planta Med.，61 ；138-140,1995. KimDS, Jeong，HJ, et al.，Aromatase and sulfatase inhibitos from Lepiotaamericana, Planta Med. ,66 ；78-79,2000.Elizabeth TE, Dudley W, UshaM， et al. ， Suppression of aromatase(estrogen synthetase)by red winephytochemicals, Breast Cancer Research and Treatment，67 ; 133—146，2001. Filleur F，Le bail JC, et al.，Antiproliferative, anti—aromatase，anti-17 β -HSD and antioxidant activities of lignansisolated from Myritica argentea， Planta Med.，67 ；700-704，2001. Minami T，Iwamoto M，Ohtus H，et al.，Aromatase inhibitiory activitiesof standishinal and the diterpenoid from the bark of Thuj a standishii，Planta Med.，68 ；742—745，2002.非专利文献 5 ；Lamberts SWJ, et al.，The endocrinology ofaging，Science， 278 ；419-424,1997.伊藤直樹、塚本泰司、男性更年期^概念、医学^ h ^办、205卷； 380-383,2003.岩本晃明等、日本人成人男性 総f 7卜7 f 口 >、遊離f 7卜7 f 口 >乃基準値設定，日泌尿会誌、95卷；751-760，2004.非专利文献6 碓井亜、松原昭郎、男性* ^ ^ >補充療法、医学O A吵 、205卷；407-410,2003.佐藤嘉一、丹田均、男性七 >補充療法^適応^問題点、総合臨床、53 卷；451-457，2004.非专禾Ij 文献 7 :Braunstein GD, Aromatase and gynecomastia, Endocrione-Related Cancer，6 ；315—324，1999.非专 利文献 8 Leder BZ, et al.，Effects of aromatase inhibitior inelderly men with low or borderline-low serum testosterone levels, JClin Endocrinol Metab.，89 ；1174—1180，2004. de Boer H，et al.，Letrozole normalizes serum testosterone in severely abese men withhypogonadotropic hypogonadism, Diabetes ObesMetab，7 ;211—215，2005. Raman JD,et al. ,Aromatase inhibitors formaIe infertility, The Journal of Urology,167 ；624-629,2002.非专利文献9 河源、松田公志、乂夕水丨J义夕〉> 卜、口一 A i亍只卜只亍口 > ^ J t/男性更年期障害、最新医学、61 卷；227-233，2006. Lunenfeld B.，Testosterone deficiency and the metabolicsyndrome, The Aging Male,10 ；53-56,2007.非专利文献 10 :Seidell JiBjorntorp P, et al. ,Visceral fataccumulation is positively associated with insulin， glucose andC—peptide levels but negatively with testosterone levels, Metabolism，39 ；897—901，1990. Kyle UG, Genton L，et al.， Age-related differences infat-free mass， skeletal muscle， body cell mass and fat mass between 18and 94years，Eur J Clin Nutr. ,55 ；663-672,2001. Bjorntorp P， Adiposetissue distribution and function, International Journal ofObesity,15 ； 67—81，1991. Grooren L，Visceral obesity, the metabolie syndrome, androgens and estrogens，The Aging Male,9 ；75-79,2006. Grooren L，Toorians AW, Significance of estrogens in male (patho)physiology, Ann Endocrinol. ,64 ；126-135,2003.非专利文献 11 ；Cohen PG, The hypogonadal-obesity cycle :roleof aromatase in modulating the testosterone—estradiolshunt—a majorfactor in the genesis of morbid obesity, Med Hypotheses, 52 ；49-51,1999. Cohen PG, Holbrook JM, Other pathways to themanifestations of the Metabolic Syndrome in males， Obesity Research,12 ；1536，2004.非专利文献 12 :Rebuffe-Scrive M，Marin P，Bjorntorp P，Effectof testosterone on abdominal adipose tissue in men，Int JObes. , 15 ；791-795,1991. Allan CA, Strauss BJ, et al. ， Testosteronetherapy prevents gain in visceral adipose tissue and loss of skeletalmuscle in non-obese aging men， J Clin Endocrinol Metab. ,20070ctl6,[Epub ahead of print]. Schroeder ET,Zheng L,et al., Effects ofandrogen therapy on adipose tissue and metabolism in older men，JClin Endocrinol Metab. ,89 ；4863-4872,2004. Syder PJ，et al.，Effects oftestosterone replacement in hypogonadal men，J Clin EndocrinolMetab. ,65 ；2670-2677,2000.专利文献1 特表平10-505848号公报
发明内容
发明要解决的问题在对闭经后女性的乳腺癌的治疗中，一直以来都使用通过与乳腺癌细胞的雌激素 受体相结合从而表现出抗雌激素作用的药剂它莫西芬，但是在这种情况下存在因出现耐性 而致使乳腺癌复发的问题。另一方面，近年来，抑制由男性激素合成雌激素的芳香酶抑制剂 作为对上述乳腺癌等雌激素依赖性疾病有效的治疗药物而受人瞩目。但是，在日本，临床使 用上得到承认的芳香酶抑制剂很有限，并且有各种副作用，因此其使用受到了限制。另一方面，最近，人们对因睾酮低下所致的男性更年期障碍格外关注。另外，因内 脏脂肪累积所致的代谢综合征在社会上也得到了极大的关注。还表明，在步入对应男性更 年期的中老年的男性中，睾酮等男性激素低下与内脏脂肪累积有关。但是，几乎还没有对上 述男性更年期障碍或因内脏脂肪累积所致的代谢综合征有效的治疗或者预防方法。本发明的课题是以调节男性激素和女性激素生物合成的最终阶段的酶芳香酶为 目标，从而提供不仅对闭经后女性的乳腺癌、而且对男性更年期障碍和因内脏脂肪累积所 致的代谢综合征等性激素依赖性疾病的治疗和/或预防有效且安全的药剂。解决问题的手段鉴于以上情况，本发明人为了解决上述问题而进行了深入探讨研究。结果在37 种生药即红景天、夏枯草、甘茶、水飞蓟(milk thistle)、茉莉花茶、橡木皮、甜茶、旱莲草、 杨梅皮、法国海岸松、槟榔、芦笋、漏芦、良姜、南非有机茶(rooibos tea)、大黄、普洱茶、 绿茶、黄芩、贯叶连翘、甘草、千里光、冬青、诃子、野梧桐、何首乌、淫羊藿、瓜拉那、樱皮、艾 叶、地黄、山茱萸、细辛、桂皮、芍药、松叶、余甘子(amla)的提取物中发现芳香酶抑制活性， 藉此完成了本发明。还发现淫羊藿的成分淫羊藿苷(icariin)和水飞蓟的成分水飞蓟宾 (silybin)、水飞蓟素(silymarin)同样具有芳香酶抑制活性。即，本发明为1. 一种芳香酶抑制剂，其特征在于含有选自红景天、夏枯草、甘茶、水飞蓟、茉莉花 茶、橡木皮、甜茶、旱莲草、杨梅皮、法国海岸松、槟榔、芦笋、漏芦、良姜、南非有机茶、大黄、 普洱茶、绿茶、黄芩、贯叶连翘、甘草、千里光、冬青、诃子、野梧桐、何首乌、淫羊藿、瓜拉那、 樱皮、艾叶、地黄、山茱萸、细辛、桂皮、芍药、松叶、余甘子或其提取物的1种或2种以上的草 药提取物；2. 一种性激素依赖性疾病的治疗和/或预防剂，其特征在于含有1中记载的芳香 酶抑制剂。发明效果本发明的芳香酶抑制剂通过抑制调节男性激素和女性激素的生物合成的最终阶 段的酶芳香酶，从而抑制男性激素的减少或女性激素的增加，进而不仅可以对闭经后女性 的乳腺癌、还可 以对男性更年期障碍和因内脏脂肪累积所导致的代谢综合征等性激素依赖 性疾病进行有效的治疗和/或预防。此外，本发明的芳香酶抑制剂为源于来自天然材料的 生药的成分，因此没有副作用，可以安全使用。
具体实施例方式本发明人对来自各种天然材料中的抑制芳香酶活性的物质进行了探索，结果发现，红景天、夏枯草、甘茶、水飞蓟、茉莉花茶、橡木皮、甜茶、旱莲草、杨梅皮、法国海岸松、槟 榔、芦笋、漏芦、良姜、南非有机茶、大黄、普洱茶、绿茶、黄芩、贯叶连翘、甘草、千里光、冬青、 诃子、野梧桐、何首乌、淫羊藿、瓜拉那、樱皮、艾叶、地黄、山茱萸、细辛、桂皮、芍药、松叶、余 甘子的提取物会抑制芳香酶活性。下面将对这些生药进行详细说明。(1)红景天(Kokeiten)是将景天科(Crassulaceae)的全瓣红景天(Rhodiola sacra Fu)或其他同属植物的地下部分干燥得到的物质。(2)夏枯草(Kagoso)是将唇形科(Labiaceae)的夏枯草(Prunellavulgaris L. var. Iilacina Nak.)的果穗干燥得到的物质。(3)甘茶(Sweet hydrangea leaf)是将虎耳草科(Saxifragaceae)的落叶矮树 紫阳花(Hydrangea macrophylla Ser. F. normal is)的变禾中甘茶(Hydrangea macrophylla var. thunbergii)的嫩叶熏蒸并揉搓、干燥得到的物质。(4)水飞蓟是将菊科(Asteraceae)的水飞蓟(Silybu m marianum L.，别名 Carduus marianus L.)的瘦果干燥得到的物质。(5)茉莉花茶是将绿茶与茉莉花(Jasminum Sambac(L)Ait.)的花瓣混合并干燥 得到的物质。(6)橡木皮是将壳斗科(Fagaceae)的麻栎(Querus acutissima)或其他近亲植物 的树皮干燥得到的物质。(7)甜茶(Tencha)是将虎耳草科(Saxifragaceae)的腊莲绣球(Hydrangea strigosa Rehd.)或伞形绣球(Hydrangea umbellate Rehd.)的嫩叶干燥得到的物质。(8)旱莲草(Karensou)是将菊科(Compositae)的醴肠(Ecliptaprostrata)的全 草干燥得到的物质。(9)(Youbaihi) 1>|#*_禾4· (Myricaceae)白勺·_ (Myricarubra Sieb. et Zucc.)的树皮干燥得到的物质。(10)法国海岸松是将松科(Pinaceae)的海岸松(Pinus pinaster 或P. maritima) 的树皮干燥得到的物质。(11)槟榔(Binro)是将棕榈科(Arecaceae)的植物槟榔(Arecacatechu L.)的种 子干燥得到的物质。(12)芦笋是将百合科(Liliaceae)的石刁柏(Asparagus offcinalis L.)的根茎 或根干燥得到的物质。(13)漏芦(Rouro)是将菊科(Compositae)的祈州漏芦(Rhaponticum unifIorum DC.)蓝刺头(Echinops latifolius Tausch)的根干燥得到的物质。(14) (Ryoukyou)(Zingiberaceae)白勺(Alpiniaofficinarum Hance)的根茎干燥得到的物质。(15)南非有机茶是将豆科(Leguminosae)的红灌木(Aspalathuslinearis)的针 叶树状的叶干燥得到的物质。(16)大黄(Daiou)是将蓼科(Polygonaceae)的掌叶大黄(Rheumpalmatum L.)、 鸡爪大黄(R. tanguticum Maxim, ex Rgl.)、药用大黄(R. officinale Bailion)或朝鲜大黄 (R. coreanum Nakai)或其种间杂种的根茎干燥得到的物质。(17)普洱茶是将通过加热使氧化发酵停止的绿茶用曲霉(Aspergillus)发酵、干燥得到的物质。(18)绿茶(Green tea)是将山茶科(Theaceae)的茶树(Camelliasinensis Kunt) 的叶干燥得到的物质。(19)黄芩是将唇形科(Labiatae)的黄芩(Scutellaria baicalensisGeorgi)的 根干燥得到的物质。(20)贯叶连翘是将金丝桃科(Hypericaceae)的贯叶连翘(Hypericum perforatum L.)的地上部分干燥得到的物质。(21)甘草(glycyrrhiza)是将豆科(Leguminosae)的甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)或洋甘草(G.glabra L.)的根和匍匐茎干燥得到的物质。(22)千里光(Senrikou)是将菊科(Compositae)的千里光(Senecioscandens Buch. -Ham.)的全草干燥得到的物质。(23)冬青是将杜鹃花科(Ericaceae)的平铺白珠(Gaultheriaprocumbens)的叶 干燥得到的物质。(24)诃子(Kashi)是将使君子科(Combretaceae)的诃子(Terminalia chebula Retz.)的成熟果实干燥得到的物质。(25)野梧桐(Yagotou)是将大戟科(Euphorbiaceae)的野梧桐(Mallotus japonicus)的树皮干燥得到的物质。(26)何首乌(Kashuu)是将蓼科(Polygonaceae)的何首乌(Polygonum multiflorum Thunberg)的块茎干燥得到的物质。(27)淫羊藿是将小檗科(Berberidaceae)的柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens Maximowicz)、淫羊藿(E. brevicornumMaximowicz)、巫山淫羊藿(Ε· wushanense Τ. S. Ying)、三枝九叶草(Ε· sagittatum Maximowicz)、朝鲜淫羊藿(Ε. koreanum Nakai)、大 花(E. gradiflorum Morr.)或常绿淫羊藿(E. sempervirens Nakai)的茎和叶干燥得到的 物质。(28)瓜拉那是将无患子科(Sapindaceae)的瓜拉那(Paullinacupana H. B. K)的 种子干燥得到的物质。(29)樱皮(Ouhi)是将蔷薇科(Rosaceae)的植物樱花(Prunusjamasakura Sieb. ex Koidz.)或同属近亲植物的树皮干燥得到的物质。(30)艾叶(Gaiyou)是将菊科(Compositae)的魁蒿(Artemisiaprinc^ps Pamp.) 或山地蒿(A.montana Pamp.)的全草或叶干燥得到的物质。(31) jft n (Jiou) M ^ 0 ^ (Scrophulariaceae)白勺 Rehmanniaglutinosa Liboschitz var. purpurea Makino 或 R. glutinosa Liboschitz 的根干燥得至丨J的物质。(32)山茱萸(dogwood tree)是将山茱萸科(Cornaceae)的山茱萸(Cornus officinalis Siebold et Zuccarini)的附果的果肉干燥得到的物质。(33)细辛(Saishin)是将马兜铃科(Aristolochiaceae)的华细辛(Asiasarum sieboldii Miq.)或辽细辛(A. heterotropoidesF. Schm. var. mandshuricum F. Maekawa)的 根和根茎干燥得到的物质。(34)桂皮(Cinnamon)是将樟禾斗(Lauraceae)的桂树(Cinnamomumcassia Blume) 的树皮干燥得到的物质。
(35)芍药(Shakuyaku)是将芍药科(Paeoniaceae)的芍药(Paeonialactiflora Pall.)的根干燥得到的物质。(36)松叶(Matsuba)是将松科(Pinaceae)赤松(Pinus densifIoraSieb. et Zucc.)或黑松(P. thunbergii Pari.)的叶干燥得到的物质。(37)余甘子是将大戟科(Euphorbiaceae)的余甘子(Emblicaofficinalis Gaertn)的果实干燥得到的物质。另外，所述生药中的淫羊藿所含有的公知成分淫羊藿苷以及水飞蓟所含有的 公知成分水飞蓟宾、水飞蓟素的化学结构式如下所示。水飞蓟素是水飞蓟宾、水飞蓟亭 (silychristin)、水飞蓟宁(silydiani)等的黄烷酮衍生物的混合物。[化1]
淫羊藿苷的化学结构式 (其中，Rham和Glc各代表鼠李糖和葡萄糖的残基)[化 2]水飞蓟宾的化学结构式 作为本发明所使用生药的材料的各植物的使用部位优选前述部位，但是除此之外 也可使用选自花、花穗、果皮、果实、茎、叶、枝、枝叶、干、树皮、根茎、根皮、根、种子或全草等 的1种或2种以上的部位。此外，作为提取物，除了通过使用溶剂对所述各种生药进行直接 提取获得的物质，通过向实施压榨处理后获得的压榨液和/或向残渣中加入溶剂进行提取 获得的物质也包含在本发明的提取物的定义范围内。本发明中的生药提取物可以通过公知方法制造，例如，可以使用水、甲醇、乙醇等 醇类或其混合溶剂等提取溶剂，通过常温提取或加热提取来制备，也可根据需要进行减压 或者加压提取。所得到的提取物可以直接使用，但是通常使用经浓缩或者冷冻干燥从而被 干燥的物质。
实施例下文通过给出提取例进行说明，但是本发明不限于此。实施例1〔生药提取方法(1)〕向夏枯草(果穗)、甘茶(叶)、茉莉花茶(叶、花)、橡木皮(树皮)、甜茶(叶)、 旱莲草(全草)、杨梅皮(树皮)、法国海岸松(树皮)、槟榔(种子)、漏芦(根)、良姜 (根茎)、南非有机茶(叶)、大黄(根)、普洱茶(叶)、绿茶(叶)、黄芩(根茎)、甘草 (根)、千里光(全草)、冬青(叶)、诃子(果实)、野梧桐(皮)、何首乌(块茎)、淫羊藿 (叶)、樱皮(皮)、艾叶(全草)、地黄(根)、山茱萸(果肉)、细辛(根)、桂皮(皮)、芍 药(根)、松叶(叶)的各干燥物IOOg中各加入300L纯化水，并在80°C加热回流1小时 进行2次提取，并将滤过的提取液通过常规方法进行冷冻干燥。结果获得了干燥固体成 分各 18. 5g、31. 0g、27. 3g、31. 2g、13. 8g、17. 6g、20. 4g、23. 6g、17. 8g、21. 5g、22. 0g、19. 8g、 35. 5g、14. 9g、12. 7g、32. lg、33. 7g、14. 3g、15. lg、21. 4g、24. 3g、35. 3g、15. 2g、21. lg、 12. 3g、33. 6g、30. 8g、29. 3g、25. lg、22. lg、15. 0g。实施例2〔生药提取方法(2)〕 向IOOg芦笋(根茎、根)干燥物中加入300L的30%乙醇/纯化水，向IOOg瓜拉 那(种子)干燥物中加入300L的35%乙醇/纯化水，向IOOg红景天(地下部分)干燥物 中加入300L的50%乙醇/纯化水，向各IOOg贯叶连翘(地上部分)干燥物和余甘子(果 实)干燥物中各加入300L的60%乙醇/纯化水，向IOOg水飞蓟(果皮)干燥物中加入 300L的80%乙醇/纯化水，并在80°C加热回流1小时进行2次提取，将滤过的提取液通过 常规方法冷冻干燥。结果获得了干燥固体成分各16. 4g、17. 9g、30. 3g、27. 5g、26. 3g、3. 5g。实施例3〔被检化合物〕关于淫羊藿中所含公知成分淫羊藿苷和水飞蓟中所含公知成分水飞蓟宾、水飞蓟 素，使用市售的标准品。即，使用淫羊藿苷(LKT，Laboratories,Inc, USA，批次 No. 2591307)、水飞蓟宾 (Extrasynthese,France,批次 No. 02112642)和水飞蓟素(LKT，Laboratories, Inc，USA,批 次 No. 2397805)。实施例4〔芳香酶抑制活性的测定〕芳香酶抑制活性的测定通过已知论文(Sresser DM, Tuner SD, etal.，A High-throughput screen to identify inhibitors ofaromatase(CYP19), Analytical Biochemistry, 284 ；427-430, 2000.)中公开的方法，使用 BD Biosciences 公司(美国)制 造的试剂进行。另外，作为比较例(阳性对照)，使用白杨素(chrysin) (Extrasynthese, France，批次 No. 06042506)(图 2)。S卩，使用96孔微量板，将预先准备的144 μ L NADPH产生体系溶液 (NADPH-Cofactor Mix)和6 μ L被检提取物溶液混合，然后在37°C孵育10分钟，再加入酶 和底物的溶液(Enzyme Substrate Mix) 100 μ L并进行混合，之后使其在37°C反应30分钟。 之后，加入75 μ L反应停止液，所生成的底物代谢物HFC (7-羟基-4-三氟甲基香豆素)的 量用读板器(SPECTRAFluor，TECAN)，通过在激发波长409nm、荧光波长538nm测定荧光强度 来获得。此外，对于空白，在孵育10分钟之后，加入75 μ L反应停止液来替代酶和底物的溶 液。芳香酶抑制率通过式1来计算。
[数1]芳香酶抑制率(%) = (I-(A-B)/A} XlOOA =(没有添加被检试样的酶反应后的吸光度_其空白吸光度)B =(各浓度的被检试样的酶反应后的吸光度_其各空白吸光度)此外，为了避免非特异性抑制作用(例如鞣质所引起的蛋白凝固作用)，将试剂中 附带的对照蛋白质添加到NADPH产生体系溶液中。对于被检试样溶液，将其浓度进行梯度稀释，获得各浓度下的抑制率，并通过内插 法，由此结果获得50%抑制芳香酶活性的试料浓度IC50值。[试验结果]对约400种提取物的芳香酶抑制活性进行了测定，结果发现，以下37种生药提取 物具有浓度依赖的抑制活性，并且在最高浓度为100 μ g/mL时具有50%以上的抑制活性。 表1-4按照抑制作用的强弱顺序给出所述生药提取物的IC50值。S卩，被确认具有抑制作用的物质为红景天、夏枯草、甘茶、水飞蓟、茉莉花茶、橡木 皮、甜茶、旱莲草、杨梅皮、法国海岸松、槟榔、芦笋、漏芦、良姜、南非有机茶、大黄、普洱茶、 绿茶、黄芩、贯叶连翘、甘草、千里光、冬青、诃子、野梧桐、何首乌、淫羊藿、瓜拉那、樱皮、 艾叶、地黄、山茱萸、细辛、桂皮、芍药、松叶、余甘子的提取物共计37种类，其各自的IC50 值为 6. 1 μ g/mL、7. 4 μ g/mL、7. 4 μ g/mL、7. 7 μ g/mL、7. 8 μ g/mL、8. 9 μ g/mL、9. 0 μ g/mL、 10. 1 μ g/mL、10. 3 μ g/mL、10. 7 μ g/mL、1L 3 μ g/mL、13. 2 μ g/mL、13. 4 μ g/mL、15. 2 μ g/mL、 16. 0 μ g/mL、17. 2 μ g/mL、17. 8 μ g/mL、17. 8 μ g/mL>20. 1 μ g/mL>21. 2 μ g/mL>22. 7 μ g/mL> 23. 5 μ g/mL、26. 9 μ g/mL、27. 7 μ g/mL、30. 1 μ g/mL、31. 9 μ g/mL、35. 0 μ g/mL、37. 6 μ g/mL、 37. 8 μ g/mL>40. 4 μ g/mL>44. 7 μ g/mL、52. 0 μ g/mL>58. 0 μ g/mL>59. 3 μ g/mL、72. 5 μ g/mL、 78. 9 μ g/mL、98. 4 μ g/mL (参照表 1-4)。所述37种生药自古以来就在中国和中国以外的国家使用，但是人们至今却完全 不知其具有芳香酶抑制作用，这是本发明首次获得的新发现。另外，对于葛根、枳实、大枣、南天实、桔梗、厚朴、柴胡、陈皮、菟丝子、麦门冬、防 已、荆芥、茯苓、附子、冬虫夏草、泽泻、山药、马钱子、香附子、辛夷、刺五加、红参、竹节参、杜 仲、白术、苍术、缬草、反鼻、生姜、远志、蛇麻、红葡萄叶、羊荆(Agni)、西洋南瓜种子、西洋柳 (西洋Y t < )、洋甘菊、荨麻、欧薄荷、橄榄叶、粟米种子、牛蒡、刺五加了人参)、 西洋蒲公英(西洋々朝鲜蓟、大蒜、蜂花叶、葱种子、石榴种子、西洋山楂、西洋柳、 旱芹种子、百里香、薰衣草、木槿、野玫瑰果、迷迭香、南瓜子、燕麦、小米草、苦瓜、芫花、玉米 须、徐长卿、当归叶、白僵蚕、刺五加、白头翁、王菜( π ^ ~，molokheiya)、地榆、浮萍、 藏木瓜、桑根、青皮、功劳叶、白薇、竹茹、括楼根、金丝草、柚子、野菊花、卷柏、秦皮、龙胆、南 沙参、麻子仁、防风、独活、槐角、蒲公英、缩砂、黄柏、延胡索、牛膝、土贝母、蕺菜、射干、升 麻、桑白皮、茜草、川栋子、山豆根、合欢皮、白芷、辣椒、大腹皮、黄芪、黄连、薏苡仁、山桅子、 柴胡、菊花、高丽参等，发现100 μ g/mL时的芳香酶抑制活性不足50%，或者100 μ g/mL时的 抑制活性虽然在50%以上，但是抑制活性没有浓度依赖性。[表1]
37种植物提取物对芳香酶的抑制活性-1
注抑制率为3次实验求得的平均值。[表2]37种植物提取物对芳香酶的抑制活性_2 注抑制率为3次实验求得的平均值。[表3]37种植物提取物对芳香酶的抑制活性_3
注抑制率为3次实验求得的平均值。[表4]37种植物提取物对芳香酶的抑制活性_4 注抑制率为3次实验求得的平均值。此外，对淫羊藿所含公知成分淫羊藿苷和水飞蓟所含公知成分水飞蓟宾、水飞蓟 素的芳香酶抑制活性进行了探讨，结果每一个都展示出浓度依赖的抑制活性，其IC50值分 别为 0. 754μΜ、4· 86μΜ、3· 79μ M(表5)。另外，这其中的淫羊藿苷与比较例中的白杨素相比展示出更强的芳香 酶抑制活性。所述化合物每一个均为公知成分，但是人们至今完全不知道其具有芳香酶抑制活 性，这是本发明首次获得的新发现。[表 5]3种成分对芳香酶的抑制活性 * 1 抑制率是通过3次试验求得的平均值。* 2 水飞蓟素的分子量使用的是水飞蓟宾、水飞蓟亭和水飞蓟宁的分子量的平均值。[结论]对于本发明首次发现具有芳香酶抑制活性的37种生药提取物，认为含有所述提 取物的医药品或者健康食品，不仅可以帮助治疗和/或预防闭经后女性的乳腺癌，而且还 可以帮助治疗和/或预防男性更年期障碍和因内脏脂肪累积所致代谢综合征等性激素依 赖性疾病。另外，对于所述生药中的淫羊藿所含成分淫羊藿苷和水飞蓟所含成分水飞蓟宾、 水飞蓟素，期待可以通过对其进行化学修饰从而提供用于开发新芳香酶抑制剂的先导化合 物。
图1为芳香酶和男性激素(雄激素)和女性激素(雌激素)的关系示意图。图2为用于治疗闭经后女性的乳腺癌的芳香酶抑制剂的结构式的示意图。图3为本发明中的比较例(阳性对照)白杨素的结构式的示意图。
权利要求
一种芳香酶抑制剂，其特征在于含有选自红景天、夏枯草、甘茶、水飞蓟、茉莉花茶、橡木皮、甜茶、旱莲草、杨梅皮、法国海岸松、槟榔、芦笋、漏芦、良姜、南非有机茶、大黄、普洱茶、绿茶、黄芩、贯叶连翘、甘草、千里光、冬青、诃子、野梧桐、何首乌、淫羊藿、瓜拉那、樱皮、艾叶、地黄、山茱萸、细辛、桂皮、芍药、松叶、余甘子的1种或2种以上的生药提取物。
2.一种性激素依赖性疾病的治疗和/或预防剂，其特征在于含有权利要求1中记载的 芳香酶抑制剂。
全文摘要
本发明的目的是通过抑制将男性激素(雄激素)转化为女性激素(雌激素)的酶芳香酶，从而提供不仅对闭经后女性的乳腺癌，而且对男性更年期障碍和因内脏脂肪累积所致的代谢综合征等性激素依赖性疾病的治疗和/或预防有效且安全的药剂。本发明利用性激素依赖性疾病的治疗和/或预防剂来解决，所述治疗和/或预防剂的特征在于含有选自红景天、夏枯草、甘茶、水飞蓟、茉莉花茶、橡木皮、甜茶、旱莲草、杨梅皮、法国海岸松、槟榔、芦笋、漏芦、良姜、南非有机茶、大黄、普洱茶、绿茶、黄芩、贯叶连翘、甘草、千里光、冬青、诃子、野梧桐、何首乌、淫羊藿、瓜拉那、樱皮、艾叶、地黄、山茱萸、细辛、桂皮、芍药、松叶、余甘子的1种或2种以上的生药提取物。
文档编号A61P35/00GK101868243SQ20088011708
公开日2010年10月20日 申请日期2008年11月20日 优先权日2007年11月21日
发明者森元康夫, 范本文哲 申请人:客乐谐制药株式会社