专利名称：含有中和乙型肝炎病毒的人抗体的药物制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有稳定的中和乙型肝炎病毒(HBV)的人抗体的药物液体制剂。
背景技术：
由于例如在长期储存过程中，特别是当蛋白被制成液体组合物时可溶的/不溶的 颗粒的形成，蛋白药物倾向于降解、沉淀或构象的改变。为了防止这样的问题，就目的蛋白 药物的物理性质已经开发各种技术以保存蛋白的功能性基团和与蛋白活性相关的结构。为了保存抗体药物，通常使用冷冻干燥方法(W0 98/22136)。但是，在使用前储存 冷冻干燥产品的过程可以带来严重的不可再生性的问题。相反，主要使用液体制剂是因为 其使用的方便性。欧洲专利号73371公开了可静脉内注射的液体制剂，其含有维持在pH 3. 5-5. 0的 免疫球蛋白。但是，当注射时，这样的具有低PH的制剂可以产生不想要的作用。美国专利号6，171，586公开了水质抗体制剂，其含有pH 4. 48-5. 5的乙酸盐缓冲 液、表面活性剂和多元醇。这一不含等渗控制剂的制剂也可以产生有害的副作用。韩国专利公开号2006-110305公开了水质药物制剂，其含有针对上皮生长因子受 体(EGF受体)的抗体，且所述制剂含有增强抗体长期储存稳定性的功能的氨基酸。另外，韩国专利公布号2006-7016023公开了含有抗EGFR抗体的高浓缩的液体制 剂，但是该制备制剂的方法包括通过超滤浓缩制剂的步骤，这使得该过程非常不经济。
发明内容
因此本发明的目的是提供一种药物制剂，其可以在长期储存过程中稳定分散在液 相中的中和乙型肝炎病毒(HBV)的人抗体。根据本发明的一个方面，提供了一种药物制剂，其含有用于预防或治疗乙型肝炎 的中和乙型肝炎病毒(HBV)的人抗体、缓冲液、等渗调节剂和表面活性剂。
具体实施例方式本发明的制剂含有中和乙型肝炎病毒(HBV)的人抗体、缓冲液、等渗调节剂和表 面活性剂。本发明的液体制剂的一部分溶剂可以是水。中和HBV的人抗体可以是重组抗体，优选地是从细胞系HBAb_49(登录号 (Accession No.) :KCLRF-BP-00054)中产生的针对HBV表面抗原Ofepabig基因)的抗体。另外，抗体优选是人抗体，其包含具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列的重链可变区 (Vh)和具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的轻链可变区(Vl)。本发明的制剂的抗体浓度范围为0. l-50mg/ml，优选地为2-lOmg/ml，最优选为 5mg/mlο缓冲液可以是具有生理性药物耐受性和pH控制能力的任何材料，例如柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或其游离酸或碱的形式或其混合物。本文中的术语“混合物”包括由不同酸 衍生的盐的混合物例如柠檬酸盐和乙酸盐的混合物；以及由一个酸衍生的不同盐的混合物 例如不同柠檬酸盐的混合物。优选地，缓冲液可以是柠檬酸盐、乙酸盐或其游离酸。柠檬酸 盐的游离酸可以包括柠檬酸、柠檬酸盐一水合物、无水柠檬酸三钠和柠檬酸钾一水合物，乙 酸的游离酸可以包括乙酸、乙酸钠和三水合乙酸钠。在本发明的制剂中，缓冲液的浓度范围 为 10-100mmol/l，优选地为 2-50mmol/l，最优选地为 20mmol/l。等渗调节剂可以是具有生理性药物耐受性的盐，如氯化钠或氯化钾，优选地为氯 化钠。在本发明的制剂中，等渗调节剂的范围为20-250mmol/l，优选地为100-200mmol/l。表面活性剂可以是通常用于药物制剂的任何表面活性剂，优选为聚氧乙烯失水山 梨糖醇酐脂肪酸酯(Tween 80)，例如聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸酯(polyoxyethylene sorbitan monolaurate)、聚氧乙炼山梨糖醇野单掠推 1 酸酉旨(polyoxyethylene sorbitan monopalmitate)、聚氧乙；I；希山梨醇野单硬月旨酸酉旨(polyoxyethylene sorbitan monostearate)或聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酉旨(polyoxyethylene sorbitan monooleate)，优选为聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸酯或或聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯，最 优选为聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯。在本发明的制剂中，表面活性剂的浓度范围为0.001-1. 0重量％。当聚氧乙烯失 水山梨糖醇酐脂肪酸酯用作制剂中的表面活性剂时，其浓度范围为0. 005-0. 1重量％，优 选为约0. 05重量％。另外，为了增强对胃肠外给药的耐受性，本发明的药物制剂具有的克分子渗透压 浓度范围为250-350m0smOl/kg。因此，可无遭受疼痛地将制剂直接给予至静脉或动脉、皮下 组织或肌肉。制剂的PH可以是4. 0-7.0，优选地为5. 0-6.0，最优选为5.5。在本发明的特别优选的实施例中，药物制剂含有10，000单位(5mg/ml)H印abig基 因、20mmol/l乙酸盐缓冲液(pH 5. 5) U50mmol/1氯化钠和0. 05重量％的聚氧乙烯失水山 梨醇单油酸酯。根据本发明的药物制剂可以通过将含有抗体或另一个氯化钠溶液的乙酸盐缓冲 液(pH5. 5)与作为补充物的其余成分混合而制备。可以将特定剂量的含有补充物的储存溶液加入含有特定抗体量的溶液中，如果需 要，可以用水或缓冲溶液稀释混合物至预定的浓度。另外，可以将固体形式的补充物加至含 有抗体的起始溶液中。另外，当抗体是固体形式时，例如冷冻干燥的产品，本发明的制剂可 以通过将抗体溶解于水中或含有至少一种成分的溶液中，然后以需要量加入含有该成分、 固体补充物和/或水的储存溶液而制备。另外，抗体可以直接溶于含有所有成分的溶液中。在重组抗体制备的过程中或在最后的步骤中可以可选地加入本发明的药物制剂 的至少一种成分。在本发明的一个实施例中，在最后纯化步骤中将H印abig基因直接溶于 含有至少一种成分或所有成分的溶液中。另外，本发明的制剂可以可选地包括小量的具有 生理性药物耐受性的另外的补充物例如抗氧化剂如抗坏血酸和谷胱甘肽；防腐剂如苯酚、 间甲酚、甲基-或对羟基苯甲酸丙酯、三氯叔丁醇、硫柳汞和苯扎氯铵、聚乙二醇(PEG)如 PEG 400,PEG 3000,PEG 3500,PEG 4000和PEG 6000 ；二糖如海藻糖和蔗糖；或环糊精如羟 丙基-β -环糊精、磺丁基乙基-β -环糊精(sulfobutylethyl- β -cyclodextrin)、a_ 环糊 精和Y-环糊精。最优选地，在用于抗体制备的纯化的最后步骤中将另外的补充物直接溶于含有所有成分的溶液中。另外，当含有抗体和其它成分的溶液不具有想要的PH时，可以 通过加入酸或碱，优选已经存在于缓冲液中的酸或碱而调整PH。另外，调整了 PH的溶液可 以进行无菌过滤。本发明的药物制剂可以容易地被制备并具有优异的生理性药物耐受性、高给药准 确性和稳定性从而使其将储存过程中的降解产品和聚集体的形成最小化。本发明的制剂当 储存在2-8°C时能够维持抗体稳定性1年或更长，或当储存在25°C和60%的相对湿度时能 够维持3个月或更长。本发明的药物制剂可以用于预防或治疗乙型肝炎，优选用于通过中和HBV的肝移 植或慢性乙型肝炎的治疗。下列实施例是为了说明本发明而不限制其范围。比较性实施例IA =Hepabig基因制剂的制备将10，000单位的!fepabig基因(Greencross，Korea)和麦芽糖溶于蒸馏水至浓度 分别为5mg/ml和10重量％。向其中加入HCl以调整pH至4. 0。将所得溶液无菌过滤，将 滤液储存在25°C和60%的相对湿度下。比较性实施例IB =Hepabig基因制剂的制备重复比较性实施例IA的过程，除了将溶液储存在5°C。比较性实施例2A =Hepabig基因制剂的制备制备含有10，000单位(5mg/ml)的Hepabig基因、10mmol/l磷酸钠缓冲液(1. 2g/ 1磷酸二氢钠)(PH 7. 2)和150mmol/l氯化钠的溶液，进行无菌过滤。将滤液储存在25°C 和60%的相对湿度下。比较性实施例2B =Hepabig基因制剂的制备重复比较性实施例2A的过程，除了将溶液储存在5°C。比较性实施例3A =Hepabig基因制剂的制备制备含有10，000单位(5mg/ml)的!fepabig基因、25mmol/l柠檬酸盐缓冲液(包 括7. 3525g/l 二水合柠檬酸三钠)(pH 6. 5)和150mmol/l氯化钠的水溶液，进行无菌过滤。 将滤液储存在25°C和60%的相对湿度下。比较性实施例3B =Hepabig基因制剂的制备重复比较性实施例3A的过程，除了将溶液储存在5°C。比较性实施例4A =Hepabig基因制剂的制备制备含有10，000单位(5mg/ml)的!fepabig基因、20mmol/l乙酸盐缓冲液(包括 2. 7216g/l三水合乙酸钠)(pH 5. 5)和150mmol/l氯化钠的水溶液，并进行无菌过滤。将滤 液储存在25°C和60%的相对湿度下。比较性实施例4B =Hepabig基因制剂的制备重复比较性实施例4A的过程，除了将溶液储存在5°C。实施例IA =Hepabig基因制剂的制备制备含有10，000单位(5mg/ml)的Ifepabig基因、10重量％的麦芽糖和0. 05重 量％的聚氧乙烯(80)失水山梨醇单油酸酯的水溶液，将其pH调整至4.0。将所得溶液无菌 过滤，将滤液储存在25°C和60%的相对湿度下。实施例IB =Hepabig基因制剂的制备
5
重复实施例IA的过程，除了将溶液储存在5°C。实施例2A =Hepabig基因制剂的制备制备含有10，000单位(5mg/ml)的Hepabig基因、10mmol/l磷酸钠缓冲液(1. 2g/ 1磷酸二氢钠)(pH 7. 2)、150mmol/l氯化钠和0. 05重量％的聚氧乙烯(80)失水山梨醇单 油酸酯的水溶液，并进行无菌过滤，将滤液储存在25°C和60%的相对湿度下。实施例2B =Hepabig基因制剂的制备重复实施例2A的过程，除了将溶液储存在5°C。实施例3A =Hepabig基因制剂的制备制备含有10，000单位(5mg/ml)的Ifepabig基因、25mmol/l柠檬酸盐缓冲液 (7. 3525g/l 二水合柠檬酸三钠)(pH 6. 5)、150mmol/l氯化钠和0. 05重量％的聚氧乙烯 (80)失水山梨醇单油酸酯的水溶液，并进行无菌过滤，将滤液储存在25°C和60%的相对湿 度下。实施例3B =Hepabig基因制剂的制备重复实施例3A的过程，除了将溶液储存在5°C。实施例4A =Hepabig基因制剂的制备制备含有10，000单位(5mg/ml)的！fepabig基因、20mmol/l乙酸盐缓冲液 (2. 7216g/l三水合乙酸钠)(pH 5. 5)、150mmol/l氯化钠和0. 05重量％的聚氧乙烯(80)失 水山梨醇单油酸酯的水溶液，并进行无菌过滤。将滤液储存在25°C，60%的相对湿度下。实施例4B =Hepabig基因制剂的制备重复实施例4A的过程，除了将溶液储存在5°C。测试实施例1 制剂的稳定性测试实施例IA至4B以及比较性实施例IA至4B的每种溶液的老化特征通过测定老 化前和老化后的蛋白的量而确定，其通过下列方法测定目测评估、吸收度测定(280nm)、 通过ELISA的滴度测定、HPLC尺寸排阻色谱法(SEC)、还原的和非还原的电泳分析 (SDS-PAGE), western印迹、等电聚集(IEF)分析和pH测定。结果显示于表1和2中。(1)目测评估室温在白色荧光灯下目测检查含有样品制剂的每个小瓶以评估溶液的颜色、外观 和透明度。(2)蛋白的量将每个溶液稀释5-10倍、15-30倍或更多，用分光光度计测定其吸光度(280nm)以 通过测定1. 40 (HigAiir1Cnr1的吸收系数确定蛋白的浓度。(3)滴度测定根据[ShinYW 等人，Antiviral Research, 75, pi 13-120，2007]中描述的方法测
定每个样品的滴度。(4)通过SEC的聚集体和片段的测定使用柱(TSKG3000 SWXL , 7. 8 X 300mm), Gi 1 son 321 泵和 UV/VIS-155 系统进行 尺寸排阻色谱(SEC)。用流动相(50mmol/l MES, 150mmol/l氯化钠，1. 5mole/l L-精氨酸盐 酸盐；pH 6. 0)稀释样品溶液至lmg/ml的浓度，以0. 5ml/分钟等强度洗脱(isocratically eluted)30分钟(注射体积50μ 1)。检测在280nm的洗脱溶液的吸光度，使用GilsonTrillution LC 1. 4软件进行积分。(5)电泳(SDS-PAGE)在缓冲液中在70°C加热样品溶液5分钟，将5μ g所得蛋白加载至蛋白电泳凝胶 (Invitrogen, USA)上。用考马斯将所得凝胶染色和脱色以观察得到的条带。(6) Western 印迹在缓冲液中在70°C加热样品溶液5分钟，将1 μ g所得蛋白加载至蛋白电泳凝胶 (Invitrogen, USA)上。将凝胶上的蛋白电转移至硝酸纤维素(NC)膜上，所述膜用5%脱 脂奶粉/PBS封闭1小时，与山羊抗人IgG过氧化物酶反应，并用PBST洗涤3次。在此处理 TMB膜底物(KPL，USA)而使条带显影。(6)等电聚焦(IEF)使用Ampholine PAGplate 凝胶(pH 3. 5 9. 5)和 Multiphor II 系统(GE healthcare, Sweden)进行等电聚焦分析。(7) DH 泖丨定根据韩国Pharmacopoeia (第8版)通用测试方法“pH测定方法”进行样品溶液的 PH测定。分析在25°C和60%的相对湿度下储存达6个月的实施例IA至4A和比较性实施 例IA至4A的药物制剂。另外，在储存在5°C的制剂中，在达6个月的储存期中观察不含表面活性剂的比较 性实施例IB至4B的制剂。在达12个月的储存期中观察含有所有成分的实施例IB至4B 的制剂。表1 比较性实施例 表2:实施例 如在表1和2中显示的储存在25°C和60%的相对湿度下的实施例IA至4A，特别 是实施例4A的制剂显示出优异的稳定性。另外，在不含表面活性剂并储存在5°C的比较性实施例IB至4B的制剂中，形成了 颗粒和沉淀，含有所有成分的实施例IA至4A的制剂维持稳定性达12个月。因此，当抗体储存在液相中时，本发明的制剂可以长期维持抗体的稳定性。测试实施例2 制剂安全性的测试为了测定本发明的制剂在给予人体时的安全性，通过使制剂与猴或人的血反应而确定其溶血的可能性。具体地用相同体积的猴或人的血处理下列物质中的每一种实施例4A(1，5或 10mg/ml)的制剂、从制剂中去除抗体的液体组合物(20mM乙酸钠，150mM氯化钠和0. 05 % Tween 80 ；pH 5. 5)、1 %皂角苷(阳性对照)和猴血浆(阴性对照)或人血浆(阴性对照)。 将从此获得的化合物离心，分离上清液并通过用分光光度计测定发生溶血的红细胞的血红 蛋白浓度而分析上清液。结果显示于表3中。表3:溶血的可能性 如表3中显示的，当用猴或人血处理时，本发明的抗体不显示溶血。另外，为了检查本发明的制剂与血浆的相容性，将实施例4A的制剂(1，5或IOmg/ ml)或从制剂中去除抗体的液体组合物与相同体积的猴或人血浆混合，评估得到的混合物 从而判断聚集或沉淀是否作为结果而发生。结果显示于表4中。
表4 血浆相容性 如在表4中显示的，本发明的制剂不与猴或人的血浆显示任何的不相容性。因此， 本发明的制剂是安全的制剂，其不使猴或人的血溶血。测试实施例3 制剂的安全性测试为了检查本发明的制剂在给予人时的安全性，将样品制剂通过静脉内、静脉周和 动脉内注射进入16周大的雄性新西兰(New Zealand)白兔(Hra (NZW) SPF兔)从而评估 局部区域的耐受性。具体地，如表5中所列，兔被分成组1和组2。对于组1中的每只兔，将1. 0ml和0. 21ml 的实施例4A的制剂(5mg/ml(10，000单位))分别注射进入左耳的静脉(测试区C)和静脉周(测 试区D)，对于对照组中的每只兔，将1. 0ml和0. 21ml的从制剂中去除抗体的液体组合物(20mM 乙酸钠，150mM氯化钠和0. 05% Tween 80 ；pH 5. 5)分别注射进入右耳的静脉(测试区A)和静 脉周(测试区B)。对于组2中的兔，将实施例4A的制剂(5mg/ml (10，000单位))和从制剂中去 除抗体的液体组合物(20mM乙酸钠，150mM氯化钠和0. 05% Tween 80 ；pH5. 5)的每种中的0. 5ml 分别注射进入左耳的静脉(测试区F)。在各种时间点(注射前，注射后4小时、2天和3天)， 观察3只兔的水肿或红斑的出现，具有水肿或红斑的兔的数目列在表6-9中。表5:局部耐受性测试 表6 注射前局部耐受性测试 表7 注射后4小时的局部耐受性测试 表8 注射后2天的局部耐受性测试 表9 注射后3天的局部耐受性测试 如表6-9中显示的，在静脉内、静脉周和动脉内注射后本发明的制剂不显示任何 严重的副作用。虽然已经就上面的特定具体实施方式
描述了本发明，应该理解的是可以做出各种 修饰和改变，所述修饰和改变也落入本发明的范围内，如接下来的权利要求所限定的。
权利要求
一种药物制剂，其含有中和乙型肝炎病毒(HBV)的人抗体、缓冲液、等渗调节剂和表面活性剂。
2.根据权利要求1所述的药物制剂，其中抗体是从细胞系HBAb-49(登录号 KCLRF-BP-00054)获得的针对HBV表面抗原Ofepabig基因)的抗体。
3.根据权利要求1所述的药物制剂，其中抗体的浓度范围是0.l-50mg/ml。
4.根据权利要求1所述的药物制剂，其中缓冲液是柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或其游离 酸或碱的形式，或其混合物。
5.根据权利要求4所述的药物制剂，其中缓冲液是乙酸盐或乙酸。
6.根据权利要求1所述的药物制剂，其中缓冲液的浓度范围是lO-lOOmmol/1。
7.根据权利要求1所述的药物制剂，其中等渗调节剂是氯化钠或氯化钾。
8.根据权利要求1所述的药物制剂，其中等渗调节剂的浓度范围是20-250mmol/l。
9.根据权利要求1所述的药物制剂，其中表面活性剂是聚氧乙烯失水山梨糖醇酐脂肪 酸酯.
10.根据权利要求9所述的药物制剂，其中表面活性剂是聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸 酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂酸酯或聚氧乙烯失水山梨 醇单油酸酯。
11.根据权利要求1所述的药物制剂，其中表面活性剂的浓度范围是0.001-1.0重量％。
12.根据权利要求1所述的药物制剂，其进一步含有具有生理性药物耐受性的补充物。
13.根据权利要求12所述的药物制剂，其中补充物是抗氧化剂、防腐剂、聚乙二醇 (PEG)、二糖或环糊精。
14.根据权利要求1所述的药物制剂，其具有范围为250-350m0smOl/kg的克分子渗透 压浓度和4. 0-7. 0的pH。
15.根据权利要求14所述的药物制剂，其中pH是5.5。
全文摘要
本发明涉及一种含有中和乙型肝炎病毒(HBV)的人抗体、缓冲液、等渗调节剂和表面活性剂的药物制剂，本发明的液体制剂适合于胃肠外给药并能够在长期储存过程中维持抗体的活性。
文档编号A61K39/395GK101896199SQ200880118407
公开日2010年11月24日 申请日期2008年11月21日 优先权日2007年11月30日
发明者吴宣姃, 奉纪兑, 崔真设, 张基奂, 徐东赫, 柳憬桓, 洪广元, 辛庸源, 辛龙男, 金世镐, 金判劲 申请人:株式会社绿十字