针对流感病毒的多种亚型的新颖疫苗的制作方法

专利名称：针对流感病毒的多种亚型的新颖疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及改进的流感疫苗、改进的用于诱导针对流感的免疫反应和用于预防性 地和/或治疗性地针对流感免疫个体的方法。背景已研究接种针对动物和人类疾病的核酸序列的使用。研究已集中于有效力和有效 率的递送手段以产生期望抗原的必要表达，产生免疫原性反应和最后这项技术的成功。一 种用于递送核酸序列例如质粒DNA的方法是电穿孔(EP)技术。该技术已被用于人临床试 验以递送抗癌药物例如博来霉素并用于对大量动物物种的许多临床前研究中。流感病毒基因组包含在编码i^一种蛋白(HA、NA、NP、Ml、M2、NS1、NEP、PA、PB1、 PB1-F2、PB2)的八个单(非成对的)RNA链上。基因组的分段性质允许不同病毒菌株的全部 基因在细胞共居过程中交换。八个RNA区段是HA，它编码血球凝集素(需要大约500个血 球凝集素分子组成一个病毒粒子)；NA，它编码神经氨酸酶(需要大约100个神经氨酸酶分 子组成一个病毒粒子)；NP，它编码核蛋白；M，它通过使用来自相同RNA区段的不同阅读框 来编码两种基质蛋白(Ml和M2)(需要大约3000个基质蛋白分子组成一个病毒粒子)；NS， 它通过使用来自相同RNA区段的不同阅读框来编码两种不同的非结构蛋白(NS1和NEP)； PA，它编码RNA聚合酶；PB1，它通过使用来自相同RNA区段的不同阅读框来编码RNA聚合物 和PB1-F2蛋白(诱导凋亡)；以及PB2，它编码RNA聚合酶。流感病毒血球凝集素(HA)在流感病毒粒子的表面表达并且负责该病毒与其宿主 细胞之间的最初接触。HA是一种公知的免疫原。甲型流感菌株H5W为一种禽流感菌株，因 其HA蛋白(H5)而特别地威胁人类种群，如果通过自然突变稍微遗传重配，它相比于病毒的 其他菌株具有大大提高的对人类细胞的传染性。婴儿和老人或无免疫应答的成人感染病毒 H5N1菌株通常与差的临床结果相关联。因此，公众非常需要针对流感H5W菌株的保护。有两类可利用的抗流感剂，甲型流感细胞进入/脱壳抑制剂(例如抗病毒药金刚 烷胺和金刚乙胺)和神经氨酸酶抑制剂(例如抗病毒药奥塞米韦、扎那米韦)。这些抗病毒 剂抑制甲型和乙型流感病毒的细胞释放。由于对这些药剂有抵抗力的病毒菌株的发现，已 报道了对使用这些药剂的忧虑。流感疫苗是流行性季节性疫苗，许多人经历过此类接种。然而，接种的保护结果是 有限的，因为疫苗对某些病毒亚型是特异性的。疾病控制与预防中心推进用“流感针(flu shot)”接种，所述流感针是包含三种流感病毒(灭活病毒)的疫苗一种甲型(H3N2)病毒、 一种甲型(H1N1)病毒和一种乙型病毒。每年他们还基于国际监督和科学家对于在给定年 中病毒的哪种型和菌株将流行的估测来报道在该疫苗中的病毒改变。因此，很明显接种疫 苗受限于亚型的预测和针对那种亚型的特定疫苗的可用性。
对于经济的和在许多亚型都有效的有效流感疫苗仍存有需求。此外，为了在预防 上或治疗上提供针对流感的免疫，对于向哺乳动物施用DNA疫苗的有效方法存有需求。发明概述本发明的一个方面涉及能够在哺乳动物中产生针对多种流感病毒亚型的免疫反 应的DNA质粒疫苗，包含DNA质粒和药学上可接受的赋形剂。所述DNA质粒能够在哺乳动 物的细胞中以有效引发哺乳动物中免疫反应的量表达共有流感抗原，其中所述共有流感抗 原包括共有的血球凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白、核蛋白、M2胞外结构域核蛋白 (M2e-NP)或它们的组合。优选地，所述共有流感抗原包括HA、NA、M2e-NP或它们的组合。所 述DNA质粒包含与编码所述共有流感抗原的编码序列可操作地连接的启动子。优选地，所 述DNA质粒疫苗是具有lmg/ml或更大的总DNA质粒浓度的疫苗。本发明的另一方面涉及能够在哺乳动物细胞中表达共有流感抗原的DNA质粒，所 述共有流感抗原包括共有的血球凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白、核蛋白、M2胞外 结构域核蛋白(M2e-NP)或它们的组合。优选地，所述共有流感抗原包括HA、NA、M2e-NP或 它们的组合。所述DNA质粒包含与编码所述共有流感抗原的编码序列可操作地连接的启动 子。本发明的另一方面涉及在哺乳动物中引发针对多种流感病毒亚型的免疫反应的 方法。所述方法包括向所述哺乳动物的组织递送DNA质粒疫苗并且用有效允许DNA质粒进 入细胞的恒定电流的能量脉冲将所述组织的细胞电穿孔，所述DNA质粒疫苗包括能够在哺 乳动物的细胞中表达共有流感抗原以引发在哺乳动物中的免疫反应的DNA质粒，所述共有 流感抗原包括共有的HA、NA、M2e-NP或它们的组合。附图简述通过参考附图本领域的技术人员可以更好地理解本发明的许多目的和优点，其 中

图1展示了本文所述研究中使用的DNA质粒构建体的示意图(质粒图谱)。通过 分析来自16种H5病毒和超过40种人类m病毒(美国洛斯阿拉莫斯国家实验室流感病毒 序列数据库)的主要病毒序列产生了共有HA、NA和M2e-NP的构建体，所述16种H5病毒 最近几年中已被证明对人具有致死性。在产生共有序列之后，对所述构建体进行优化用于 哺乳动物表达，包括加入Kozak序列、密码子优化和RNA优化。然后将这些构建体亚克隆到 pVAX 载体(Invitrogen, Carlsbad, CA)中。示出 了质粒 pGX2001 (共有 HA)、pGX2002 (共有 NA)、pGX2003 (共有M2e-NP)。所展示的质粒pCMVSEAP编码报告蛋白分泌型胚胎碱性磷酸 酶(SEAP)。图2展示了在注射后第35天猪血清HI滴度的结果的条形图。在施用了 2mg表达 HA的质粒、以0. 5A的电流设置的组中发现最高滴度(120士40 ；*P = 0. 11相对于2mg/0. 3A 和乍=0. 02相对于2mg/0. 1A)。施用递减剂量质粒并以0. 5A电穿孔的三组也表现出递减 的HI滴度。图3展示了 IFN- y的酶联免疫斑点计数的条形图。计数在施用2mg的HA和2mg 的NA质粒疫苗(总计4mg质粒)并以0.3A的电流电穿孔的猪中(2000个斑点)以及在施 用0. 8mg的HA和0. 8mg的NA质粒疫苗(总计1. 6mg质粒)并以0. 5A的电流电穿孔的组 中(934个斑点)是最高的。出于比较的目的，描绘了未免疫的对照组的细胞免疫反应。
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图4A和4B展示了示出来自第14天和第35天处理的猪的肌肉活组织检查的结果 的条形图图4A展示了示出所有组的平均病理学得分的条形图。图4B展示了示出肌肉坏死 和纤维化的得分的条形图。以6mg的总质粒注射并且在0. 5A电穿孔的组显示出最高的平均 病理学得分(相比于对照 *P < 0. 0002)。除了 0. 3mg/0. 3A 组(P = 0. 057)和 2. 4mg/0. 1A 组(P = 1. 0)之外在所有组中第35天相比于第14天的病理学得分均显著降低(P < 0. 05)。图 5 展示了在以 H5N1 病毒(甲型 / 越南/1203/2004(H5N1)/PR8-IBCDC-RG)攻击 后雪貂体重的变化百分比。在攻击后9天的时间内，以HA、HA+M2e-NP或HA+M2e_NP+NA接 种的雪貂损失的体重显著小于对照动物(相对于对照乍< 0. 005)。HA疫苗组中一只动物 实际上在攻击后增加了体重。图6展示了示出在攻击后9天期间的雪貂体温的图。对照动物显示比接种动物体 温更高。没有描绘第5天的体温，因为它是在那天的不同时间测量的，并且不论哪组所有温 度都更低。图7展示了来自雪貂接种后HI滴度结果的条形图；使用从疾病控制中心获得的重 配病毒进行测定甲型/越南/1203/04或印度尼西亚/05/2005流感菌株。图8展示了来自第二次免疫后三周测量的HI滴度的结果的条形图。皮内(ID)免 疫仅接着电穿孔(EP)的猕猴示出比所有其他组显著更高的HI滴度(P < 0. 03)。无处理的 对照没有显示出任何HI滴度。优选实施方案的详细描述给出下述简略或简短的定义以帮助理解本发明的优选实施方案。这里所给出的简 略的定义绝不是穷举性的，它们与本领域理解的定义或字典含义也绝不矛盾。在这里给出 简略的定义是为了补充或更清晰地界定本领域中已知的定义。定义如本文使用的核苷酸和氨基酸的序列同源性可使用FASTA、BLAST和Gapped BLAST (Altschul等人，Nuc. Acids Res.，1997，25，3389，其以全文通过引用并入本文)以 及 PAUP*4. OblO 软件(D. L. Swofford,SinauerAssociates,Massachusetts)确定。简言之， BLAST算法代表基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)，它适合于 确定序列相似性(Altschul等人，J. Mol. Biol.，1990，215，403-410，其以全文通过引用并 入本文)。用于执行BLAST分析的软件是通过美国国家生物技术信息中心(http://WWW. ncbi.nlm.nih.gov)公共可利用的。由BLAST算法提供的一个相似性量度是最小和概率 (P (N))法，它提供了在两条核苷酸序列之间的匹配将偶然发生的概率的指示。例如，如果在 测验核酸与另一种核酸的比较中最小和概率小于大约1、优选地小于大约0. 1、更优选地小 于大约0. 01、以及最优选地小于大约0. 001，那么认为该核酸与所述另一种核酸是相似的。 可使用 PAUP*4. OblO 软件(D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)计算“相 似性的百分比”。计算出与系统进化树中的所有序列相比共有序列的平均相似性。如本文使用的术语“基因构建体”或“核酸构建体”可被互换使用并且都是指包含 编码蛋白的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列或“编码核酸序列”包括可操作地与 调控元件连接的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用了所述核酸分子的个 体的细胞中指导表达的启动子和聚腺苷酸化信号。如本文使用的术语“可表达的形式”是指包含必要调控元件的核酸构建体，所述调控元件与编码蛋白的编码序列可操作的连接以使得当所述编码序列存在于个体的细胞中 时将被表达。本文使用术语“恒定电流”来定义由组织或界定所述组织的细胞在递送到相同组 织的电脉冲的持续期间所接受或经历的电流。所述电脉冲是从本文所述的电穿孔装置中递 送的。这种电流在电脉冲的存在期在所述组织中保持恒定安培数，因为本文提供的电穿孔 装置具有反馈元件，优选地具有瞬时反馈。所述反馈元件能够测量整个脉冲持续期间组织 (或细胞)的阻抗并引起电穿孔装置改变其电能输出(例如增加电压)，所以相同组织中的 电流在整个电脉冲(微妙数量级)以及从脉冲到脉冲中保持恒定。在一些实施方案中，反 馈元件包括控制器。术语“反馈”或“电流反馈”可被互换使用并且表示所提供的电穿孔装置的主动反 应，所述反应包括测量在电极之间的组织中的电流并且因此改变由EP装置递送的能量输 出以保持电流在恒定水平。这个恒定水平是由使用者在脉冲序列或电处理开始之前预先设 定。优选地，反馈是由电穿孔装置的电穿孔部件例如控制器完成的，因为其中的电路能够连 续地监测在电极之间的组织中的电流并将被监测的电流(或组织内的电流)与预设电流进 行比较，并且能够连续地进行能量输出调整以保持监测的电流在预设水平。在一些实施方 案中，所述反馈环路是瞬时的，因为它是类似物闭合环路反馈。如本文可互换使用的术语“电穿孔”、“电渗透”或“电动力学增强”(“EP”)是指 使用跨膜电场脉冲来诱导生物膜中的微观途径(孔)；这些微观途径的存在允许生物分子 例如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水从细胞膜的一侧通过到另一侧。本文使用术语“分散电流”来定义从本文所述的电穿孔装置的各个针电极阵列中 递送的电流模式，其中所述模式使得在被电穿孔的组织的任何区域上的电穿孔相关的热应 激的发生减到最小或者优选地将其消除。如本文使用的术语“反馈机制”是指通过软件或硬件(或固件)执行的过程，所述 过程接收期望组织的阻抗(在递送能量脉冲之前、期间中和/或之后)并将其与现值(优 选地是当前值)进行比较，并且调整递送的能量脉冲以达到预设值。当讨论反馈机制时术 语“阻抗”被本文使用并且能够根据欧姆定律被转换为电流值，由此能够与预设电流比较。 在一个优选的实施方案中，“反馈机制”是通过类似物闭合环路执行的。本文使用术语“免疫反应”来表示宿主的免疫系统例如哺乳动物的免疫系统的激 活，作为对通过所提供的DNA质粒疫苗引入流感共有抗原的反应。免疫反应可以是细胞反 应或体液反应的形式或二者兼有。本文使用术语“共有”或“共有序列”来表示基于特定流感抗原的多个亚型的比对 的分析而构建的合成的核酸序列或对应的多肽序列，其可被用来诱导针对特定流感抗原的 多个亚型或血清型的广泛的免疫性。共有流感抗原包括HA(包括共有的H1、H2、H3或H5)、 NA、NP、基质蛋白和非结构蛋白。同样，可将合成的抗原例如融合蛋白(例如M2e-NP)操作 为共有序列(或共有抗原)。本文使用术语“佐剂”来表示加到本文所述的DNA质粒疫苗中以增强由所述DNA质 粒和下文所述的编码核酸序列所编码的流感抗原的抗原性的任何分子。术语“亚型”或“血清型”可被本文互换使用并且是关于流感病毒，表示流感病毒抗 原的遗传变体以致于一个亚型被免疫系统识别以区别于一个不同的亚型(或者换句话说，
8每个亚型与不同亚型在抗原特征上是不同的)。在一些实施方案中，具有能够在哺乳动物细胞中表达共有流感抗原的DNA质粒， 所述共有流感抗原包括共有的血球凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白、核蛋白、M2胞 外结构域核蛋白(M2e-NP)或它们的组合。优选地，共有流感抗原包括HA、NA、M2e-NP或它 们的组合。DNA质粒包含与编码共有流感抗原的编码序列可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，本发明提供了能够在哺乳动物中产生针对多种流感病毒亚型 的免疫反应的DNA质粒疫苗，所述DNA质粒疫苗包含DNA质粒和药学上可接受的赋形剂。所 述DNA质粒能够以有效引发该哺乳动物中免疫反应的量在哺乳动物细胞中表达共有流感 抗原，其中所述共有流感抗原包括共有的血球凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白、核 蛋白、M2胞外结构域核蛋白(M2e-NP)或它们的组合。优选地，所述共有流感抗原包括HA、 NA、M2e-NP或它们的组合。所述DNA质粒包含与编码所述共有流感抗原的编码序列可操作 地连接的启动子。在一些实施方案中，所述DNA质粒疫苗是具有lmg/ml或更大的总DNA质 粒浓度的疫苗。所述免疫反应可以是细胞反应或体液反应或二者兼有；优选地，所述免疫反 应是细胞和体液二者兼有。在一些实施方案中，DNA质粒能够还包括与编码序列的N端末端相连并与启动子 可操作地连接的IgG前导序列。此外，在一些实施方案中，DNA质粒能够还包括与编码序列 的C端末端相连的聚腺苷酸化序列。在一些实施方案中，DNA质粒是密码子优化的。在本发明的一些实施方案中，DNA质粒疫苗能够还包括佐剂。在一些实施方案中， 佐剂选自以下组成的组a-干扰素、干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNF_a、 TNF-0、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达的 趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL_15、MHC、⑶80、⑶86，包括具有 被删除信号序列的IL-15并任选地包括来自IgE的信号肽。可能是有用的佐剂的其他基因 包括编码以下的基因MCP-l、MIP-la、MIP-lp、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、 E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac_l、pl50. 95、PECAM、ICAM-1、 ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18 的突变形式、CD40、CD40L、血管生 长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Fit、 Apo-l、p55、WSL-l、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、 DR6、胱天蛋白酶比￡、？08、(；-」1111、5 -14 -14 -24384651^1、]\^088、11^1(、11^ 6、11^、无 活性 NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素反应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、 TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK 配体、0x40、0x40 配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、 NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及它们的功能片段。在一些优选的实施方案中，佐剂选 自 IL-12、IL-15、CTACK、TECK 或 MEC。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是转染促进剂，它可包括以下转染促 进剂表面活性剂例如免疫刺激复合物(ISC0MS)；弗氏不完全佐剂；LPS类似物，包括单 磷酰脂质A ；胞壁酰肽；醌类似物；小囊泡(vesicle)例如角鲨烯和菠菜烯(squalene and squalene)；透明质酸；脂质；脂质体；韩离子；病毒蛋白；聚阴离子；聚阳离子；或纳米颗粒 或者其他已知的转染促进剂。优选地，转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子、包括聚L谷氨酸 (LGS)或脂质。优选地，转染促进剂是聚L谷氨酸，并且更优选地，聚L谷氨酸以小于6mg/ ml的浓度存在于DNA质粒疫苗中。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗中聚L谷氨酸的浓度小于 4mg/ml、小于 2mg/ml、小于 lmg/ml、小于 0. 750mg/ml、小于 0. 500mg/ml、小于 0. 250mg/ ml、小于 0. 100mg/ml、小于 0. 050mg/ml 或小于 0. 010mg/mlo在一些实施方案中，DNA质粒疫苗可包括多种不同的DNA质粒。在一些实施例中， 不同的DNA质粒包括含有编码共有HA的核酸序列的DNA质粒、含有编码共有NA的序列的 DNA质粒和含有编码共有M2e-NP的序列的DNA质粒。在一些实施方案中，共有HA是共有 HI、共有H2、共有H3或共有H5。优选地，共有HA是核苷酸序列，所述核苷酸序列是SEQ ID NO 1 (H5N1HA 共有 DNA)、SEQ ID NO 9(共有 HI 的 DNA)、SEQID N0 11(共有 H3 的 DNA)或 SEQ ID 而13(共有115)。共有 HA 还可以是对序列 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO: 10、SEQ ID N0:12或SEQ ID NO: 14的多肽进行编码的核苷酸序列。在一些实施方案中，共有NA是为 SEQ IDN0 :3的核苷酸序列或对序列SEQ ID NO :4的多肽进行编码的核苷酸序列。在一些 实施方案中，共有M2e-NP是为SEQ ID NO 7的核苷酸序列或对序列SEQ ID NO 8的多肽进 行编码的核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，DNA质粒疫苗包括包含编码共有HI的序 列的DNA质粒、包含编码共有H2的序列的DNA质粒、包含编码共有H3的序列的DNA质粒、 包含编码共有H5的序列的DNA质粒、包含编码共有NA的序列的DNA质粒和包含编码共有 M2e-NP的序列的DNA质粒。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗可包括多种不同的DNA质粒，所述DNA质粒包括 能够表达共有流感抗原的至少一种DNA质粒和能够表达一种流感亚型抗原的至少一种DNA 质粒。在一些实施例中，表达共有抗原的不同的DNA质粒包括含有编码共有HA的核酸序列 的DNA质粒、含有编码共有NA的序列的DNA质粒和含有编码共有M2e_NP的序列的DNA质 粒。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗包括能够表达共有HA抗原例如共有的HI、H3或H5 的DNA质粒和能够表达以下甲型流感抗原中的任何一种的DNA质粒H1、H2、H3、H4、H5、H6、 H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、NP、M1、M2、 NS1或NEP，或其组合。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗包括能够表达共有NA抗原的DNA 质粒和能够表达以下甲型流感抗原的任一种的DNA质粒HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、 H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、NP、M1、M2、NS1 或 NEP， 或其组合。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗包括能够表达共有M2e-NP的DNA质粒和能够 表达以下甲型流感抗原中的任何一种的DNA质粒H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、 H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、NP、M1、M2、NS1 或 NEP，或其 组合。在一些实施方案中，可以将DNA质粒疫苗递送给哺乳动物以弓丨发免疫反应；优选 地，哺乳动物是灵长类动物，包括人类和非人类的灵长类动物、牛、猪、鸡、狗或雪貂。更优选 地，哺乳动物是人类灵长类动物。本发明的一个方面涉及在哺乳动物中引发针对多种流感病毒亚型的免疫反应的 方法。所述方法包括向所述哺乳动物的组织递送DNA质粒疫苗并且用有效允许DNA质粒进 入细胞的恒定电流的能量脉冲将所述组织的细胞电穿孔，所述DNA质粒疫苗包括能够在哺 乳动物的细胞中表达共有流感抗原以引发在哺乳动物中的免疫反应的DNA质粒，所述共有 流感抗原包括共有的HA、NA、M2e-NP或它们的组合。在一些实施方案中，本发明的方法包括递送步骤，所述递送步骤包括将DNA质粒 疫苗注射到皮内、皮下或肌肉组织中。优选地，这些方法包括使用体内电穿孔装置来预先设定期望被递送到组织的电流；并且以等于预设电流的恒定电流的能量脉冲将所述组织的细 胞电穿孔。在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括测量电穿孔的细胞中的阻抗；相对于测 量的阻抗调整能量脉冲的能量水平以保持电穿孔细胞中的恒定电流；其中测量和调整步骤 发生在能量脉冲的存在期内。在一些实施方案中，电穿孔步骤包括根据以分散模式递送能量脉冲的脉冲序列模 式将能量脉冲递送至多个电极。在一些实施方案中，本发明的DNA质粒流感疫苗包括编码共有HA或共有HA的核 苷酸序列和编码选自以下组成的组的流感蛋白的核酸序列SEQ ID N0:4、6和8。SEQ ID NO 1和13分别包括编码流感病毒的共有H5m HA和H5的核酸序列。SEQ ID NO 2和14分 别包括流感病毒的共有H5W HA和H5的氨基酸序列。在本发明的一些实施方案中，本发明 的疫苗包含 SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :4。SEQ ID NO :3 包含编码流感Hmi 和 H5m (H1N1/ H5N1)的NA共有序列的核酸序列。SEQ ID NO :4包含流感H1N1/H5m的NA共有序列的氨 基酸序列。在本发明的一些实施方案中，本发明的疫苗包含SEQ ID NO :5或SEQ ID NO 6。SEQ ID NO :5包含编码流感H1N1/H5m的Ml共有序列的核酸序列。SEQ ID NO :6包含 流感Hmi/H5m的Ml共有序列的氨基酸序列。在本发明的一些实施方案中，本发明的疫苗 包含SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :8。SEQ ID NO :7包含编码流感H5m的M2E-NP共有序列 的核酸序列。SEQ ID NO :8包含流感H5m的M2E-NP共有序列的氨基酸序列。在本发明的 一些实施方案中，本发明的疫苗包含SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :10。SEQ ID NO 9包含编 码流感Hmi的HA共有序列的核酸序列。SEQ ID NO 4包含流感Hmi的NA共有序列的氨 基酸序列。在本发明的一些实施方案中，本发明的疫苗包含SEQ ID N0:11或SEQ ID NO: 12。SEQ ID NO : 11包含编码流感H3m的HA共有序列的核酸序列。SEQ ID N0:12包含流 感H3m的HA共有序列的氨基酸序列。流感病毒菌株H5W的HA共有序列包括SEQ IDN0 1 或SEQ ID NO 13中列出的免疫优势表位。由SEQ ID NO 1编码的流感病毒H5W的HA氨 基酸序列是SEQ ID N0 2并且由SEQ ID NO 13编码的流感病毒H5W的HA氨基酸序列是 SEQ ID NO :140流感病毒H1N1/H5m的NA共有序列包括SEQ ID NO :3中列出的免疫优势 表位。由SEQ ID NO :3编码的流感病毒菌株Hmi/H5m的NA氨基酸序列是SEQ ID NO :4。 流感病毒菌株Hmi/H5m的Ml共有序列包括SEQ IDN0 5中列出的免疫优势表位。由SEQ ID NO 5编码的流感病毒H1N1/H5m的Ml氨基酸序列是SEQ ID NO :6。流感病毒H5W的 M2E-NP共有序列包括SEQ ID NO :7中列出的免疫优势表位。由SEQ ID NO :7编码的流感 病毒H5W的M2E-NP氨基酸序列是SEQ ID NO :8。本发明的疫苗可包括由以上定义核酸分 子所编码的蛋白质产物或任何的蛋白质片段。本发明还包括编码能够在哺乳动物中引发免疫反应的多肽的DNA片段，所述免疫 反应基本上类似于至少一种流感亚型的非片段的免疫反应。当所述DNA片段应用于本文提 供的特定编码核酸序列时，它是选自于本发明的各种编码核苷酸序列的至少一种的片段， 包括SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll和13，并且可以是以下所述DNA片段中的任一种。在一些实 施方案中，DNA片段可包含30个或更多、45个或更多、60个或更多、75个或更多、90个或更 多、120个或更多、150个或更多、180个或更多、210个或更多、240个或更多、270个或更多、 300个或更多、360个或更多、420个或更多、480个或更多、540个或更多、600个或更多、660 个或更多、720个或更多、780个或更多、840个或更多、900个或更多、960个或更多、1020个
11或更多、1080个或更多、1140个或更多、1200个或更多、1260个或更多、1320个或更多、1380 个或更多、1440个或更多、1500个或更多、1560个或更多、1620个或更多、1680个或更多或 者1740个或更多的核苷酸。在一些实施方案中，DNA片段可包括免疫球蛋白E(IgE)前导 序列的编码序列。在一些实施方案中，DNA片段可包括少于60、少于75、少于90、少于120、 少于150、少于180、少于210、少于240、少于270、少于300、少于360、少于420、少于480、少 于540、少于600、少于660、少于720、少于780、少于840、少于900、少于960、少于1020、少 于1080、少于1140、少于1200、少于1260、少于1320、少于1380、少于1440、少于1500、少于 1560、少于1620、少于1680或者少于1740个核苷酸。优选地，DNA片段是SEQ ID NO :1、3、 7、9、11或13的片段，并且更优选地是SEQ ID N0:l、5、9、ll或13的片段，并且甚至更优选 地是SEQ ID N0S :1、9或13的片段。本发明还包括能够在哺乳动物中引发免疫反应的多肽片段，所述免疫反应基本上 类似于至少一种流感亚型的非片段的免疫反应。当所述多肽片段应用于本文提供的特定多 肽序列时，它们选自于本发明的各种多肽序列的至少一种，包括SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12 和14，并且可以是以下所述多肽片段中的任一种。在一些实施方案中，多肽片段可包括15 个或更多、30个或更多、45个或更多、60个或更多、75个或更多、90个或更多、105个或更 多、120个或更多、150个或更多、180个或更多、210个或更多、240个或更多、270个或更多、 300个或更多、360个或更多、420个或更多、480个或更多、540个或更多或者565个或更多 的氨基酸。在一些实施方案中，多肽片段可包括少于30、少于45、少于60、少于75、少于90、 少于120、少于150、少于180、少于210、少于240、少于270、少于300、少于360、少于420、少 于480、少于540或者少于565个氨基酸。优选地，多肽片段是SEQ ID NO :2、4、8、10、12或 14的片段，并且更优选地是SEQ ID NO :2、6、10、12或14的片段，并且甚至更优选地是SEQ ID N0S :2、10 或 14 的片段。在哺乳动物中引发基本上类似于至少一种流感亚型的非片段的免疫反应的免疫 反应的片段的确定，可容易地由本领域普通技术人员确定。如由公共可利用的数据库例如 美国洛斯阿拉莫斯国家实验室流感病毒序列数据库所提供的，可分析所述片段以包含至少 一个、优选地更多个抗原表位。此外，可使用小鼠和HI滴度以及酶联免疫斑点分析常规地 评估免疫反应研究，例如在下文实施例中所示。根据本发明的一些实施方案，在哺乳动物中诱导或引发针对多种流感病毒的免疫 反应的方法包括向所述哺乳动物施用a)流感菌株H5m共有HA蛋白、其功能片段或其可 表达的编码序列；和b) —种或多种本文所提供的分离的编码核酸分子、由此类核酸分子编 码的蛋白或其片段。根据本发明的一些实施方案，在哺乳动物中诱导或引发针对多种流感病毒的免疫 反应的方法包括向所述哺乳动物施用a)流感菌株Hmi和流感菌株H5m共有NA蛋白、其 功能片段或其可表达的编码序列；和b) —种或多种本文所提供的分离的编码核酸分子、由 此类核酸分子编码的蛋白或其片段。根据本发明的一些实施方案，在哺乳动物中诱导或引发针对多种流感病毒的免疫 反应的方法包括向所述哺乳动物施用a)流感菌株Hmi和流感菌株H5m共有Ml蛋白、其 功能片段或其可表达的编码序列；和b) —种或多种本文所提供的分离的编码核酸分子、由 此类核酸分子编码的蛋白或其片段。
根据本发明的一些实施方案，在哺乳动物中诱导或引发针对多种流感病毒的免疫 反应的方法包括向所述哺乳动物施用a)流感菌株H5m的M2E-NP共有蛋白、其功能片段 或其可表达的编码序列；和b) —种或多种本文所提供的分离的编码核酸分子、由此类核酸 分子编码的蛋白或其片段。根据本发明的一些实施方案，在哺乳动物中诱导或引发针对多种流感病毒的免疫 反应的方法包括向所述哺乳动物施用a)流感菌株Him的HA共有蛋白、其功能片段或其 可表达的编码序列；和b) —种或多种本文所提供的分离的编码核酸分子、由此类核酸分子 编码的蛋白或其片段。根据本发明的一些实施方案，在哺乳动物中诱导或引发针对多种流感病毒的免疫 反应的方法包括向所述哺乳动物施用a)流感菌株H3m的HA共有蛋白、其功能片段或其 可表达的编码序列；和b) —种或多种本文所提供的分离的编码核酸分子、由此类核酸分子 编码的蛋白或其片段。在本发明的一些实施方案中，本发明的疫苗包括以下序列的至少两种SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ IDNO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ IDNO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13和SEQ ID NO :14，或者上述名单中的两种或多种序列的任何组合。疫苗在一些实施方案中，本发明通过提供蛋白和编码具有如下表位的蛋白的基因构建 体而提供了改进的疫苗所述表位使得蛋白作为免疫原是特别有效的，针对所述免疫原免 疫反应可被诱导。因此，可提供疫苗以诱导治疗性或预防性免疫反应。根据本发明的一些实施方案，将根据本发明的疫苗递送给个体来调节个体免疫系 统的活性并由此增强免疫反应。当编码所述蛋白的核酸分子被所述个体的细胞摄取时，所 述核苷酸序列在细胞中被表达并且所述蛋白由此被递送给个体。本发明的各方面提供了在 核酸分子例如质粒上递送蛋白的编码序列的方法。根据本发明的某些方面，提供了预防性和/或治疗性免疫个体的组合物和方法。当被细胞摄取时，DNA质粒能够作为分离的遗传物质留在细胞中。可替代地，RNA 可被施用至细胞。还可虑提供作为线性微小染色体的基因构建体，包括着丝粒、端粒和复制 起点。基因构建体包括核酸分子的基因表达必需的调控元件。所述元件包括启动子、起始 密码子、终止密码子和聚腺苷酸化信号。此外，增强子通常为编码靶蛋白或免疫调节蛋白的 序列的基因表达所需。有必要将这些元件与编码期望蛋白的序列可操作地连接并且调节元 件可操作地处于它们被施用的个体中。一般认为起始密码子和终止密码子是编码期望蛋白的核苷酸序列的一部分。然 而，有必要的是这些元件在施用核酸构建体的哺乳动物中是有功能的。起始密码子和终止 密码子必须与编码序列处于框内。所使用的启动子和聚腺苷酸化信号必须是在个体细胞中有功能的。实施本发明尤其是在人基因疫苗的生产中有用的启动子的实例包括但不限于来 自猿猴病毒40 (SV40)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)例如牛 免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)的启动子、莫洛尼(Moloney)病毒、禽白血病病毒 (ALV)、巨细胞病毒(CMV)例如CMV立即早期启动子、EB病毒(EBV)、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)的启动子，以及来自人类基因例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人 金属硫蛋白(metalothionein)的启动子；在其他实施方案中，启动子可以是组织特异性启 动子例如肌肉或皮肤特异性启动子，天然的或合成的。此类启动子的实例描述于美国专利 申请公开号US20040175727中，其以全文由此并入本文。实施本发明尤其是在人基因疫苗的生产中有用的聚腺苷酸化信号的实例包括但 不限于SV40聚腺苷酸化信号、LTR聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号、人 生长激素(hGH)聚腺苷酸化信号和人珠蛋白聚腺苷酸化信号。具体而言，可使用pCEP4 质粒(Invitrogen，SanDiego, CA)中的SV40聚腺苷酸化信号，称为SV40聚腺苷酸化信号。除了 DNA表达所需的调控元件之外，其他元件也可以被包括在DNA分子中。此类另 外的元件包括增强子。增强子可选自于包括但不限于以下的组人肌动蛋白、人肌球蛋白、 人血红蛋白、人肌肉肌酸和病毒增强子例如来自CMV、RSV和EBV的增强子。基因构建体可以被提供哺乳动物复制起点以便使构建体保持在染色体外并且在 细胞中产生构建体的多个拷贝。来自Invitrogen (San Diego, CA)的质粒pVAXl、pCEP4和 pREP4包含EB病毒的复制起点和产生高拷贝的未整合附加型复制的核抗原EBNA-1编码区。为了使蛋白的产生达到最大，可选择如下调控序列很好地适合于在构建体被施 入的细胞中的基因表达。此外，可选择如下编码所述蛋白的密码子在所述宿主细胞中被最 有效率地转录。本领域普通技术人员可生产在细胞中有功能的DNA构建体。在一些实施方案中，可提供如下核酸构建体其中本文所述蛋白的编码序列与 IgE信号肽相连。在一些实施方案中，本文所述的蛋白与IgE信号肽相连。在使用蛋白的一些实施方案中，例如，本领域普通技术人员可使用公知技术生产 并使用公知技术分离本发明的蛋白。在使用蛋白的一些实施方案中，例如，本领域普通技术 人员可使用公知技术将编码本发明的蛋白的DNA分子插入到在公知表达系统中使用的可 商购获得的表达载体中。例如，可商购获得的质粒PSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.) 可被用于在大肠杆菌(E.coli)中生产蛋白。例如，可商购获得的质粒pYES2 (Invitrogen， San Diego, Calif.)可被用于在酵母的酿酒酵母菌株中的生产。例如，可商购获得的 MAXBAC 完整的杆状病毒表达系统(Invitrogen，San Diego, Calif.)可用于在昆虫细胞中 的生产。例如，可商购获得的质粒pcDNA I或pcDNA3 (Invitrogen，San Diego，Calif.)可 用于在哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢(CH0)细胞中的生产。本领域普通技术人员可使用 这些商品化表达载体和系统或以其他方式通过常规技术和可容易获得的起始材料生产蛋 白(参见例如 Sambrook 等人，Molecular Cloning a Laboratory Manual (分子克隆实验 指南)，第二版.Cold Spring Harbor Press (1989))。因此，可以在原核和真核系统中制备 期望蛋白，产生蛋白的各种加工形式。本领域普通技术人员可使用其他可商购获得的表达载体和系统或者使用公知方 法和容易获得的起始材料来生产载体。包含必要的调控序列例如启动子和聚腺苷酸化信号 以及优选地增强子的表达系统可容易地获得并且在本领域中对于各种宿主是已知的。参见 例如，Sambrook 等人，Molecular Cloning a Laboratory Manual (分子克隆实验指南)，第 二版.ColdSpring Harbor Press (1989)。基因构建体包括与启动子可操作地连接的蛋白编 码序列，所述启动子在构建体被转染的细胞系或靶组织的细胞中是有功能的。组成型启动 子的实例包括来自巨细胞病毒(CMV)或SV40的启动子。诱导型启动子的实例包括小鼠乳腺白血病病毒或金属硫蛋白的启动子。本领域普通技术人员可从容易获得的起始材料中容 易地生产对于用编码本发明的蛋白的DNA转染细胞有用的基因构建体。将包括编码蛋白的 DNA的表达载体用来转化相容的宿主，然后将所述宿主培养并保持在其中发生外源DNA的 表达的条件下。按照对本领域技术人员来说适当且已知的，通过溶解细胞或者从培养基中将产生 的蛋白从培养物中回收。本领域普通技术人员可使用公知技术来分离使用此类表达系统 生 产的蛋白。使用与以上所述的特定蛋白特异性结合的抗体从自然来源中纯化蛋白的方法可 同样地应用于通过重组DNA方法产生的纯化蛋白。除了通过重组技术生产蛋白之外，还可以采用自动化肽合成器来生产分离的、基 本上纯的蛋白。此类技术对于本领域普通技术人员是公知的，并且如果具有取代的衍生物 没有为DNA编码的蛋白的生产中提供的话，此类技术是有用的。可使用几种公知技术中的任一种递送核酸分子，所述技术包括有和没有体内电 穿孔的DNA注射(也称为DNA接种)，脂质体介导，纳米颗粒推进，重组载体例如重组腺病 毒、病毒相关的重组腺病毒和重组牛痘苗。优选地，本文所述的核酸分子例如DNA质粒是通 过DNA注射以及与体内电穿孔共同递送的。施用途径包括但不限于肌内、鼻内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和 口服以及局部地、经皮、通过吸入或栓剂或者至粘膜组织，例如通过灌洗至阴道、直肠、尿 道、口腔或舌下的组织。优选的施用途径包括肌内、腹膜内、皮内和皮下注射。基因构建 体可以通过如下手段施用，包括但不限于传统注射器、无针注射装置、“微弹轰击基因枪 (microprojectile bombardment gone gun) ”或其他物理方法例如电穿孔(“EP”)、“流体 动力学方法”或超声。用于促进本发明的DNA疫苗的递送的优选的电穿孔装置和电穿孔方法的实 例包括在Draghia-Akli等人的美国专利号7，245,963、Smith等人递交美国专利公布 2005/0052630中描述的那些，两篇文献的内容均以全文通过引用并入本文。用于促进下 述文献中提供的DNA疫苗的递送的电穿孔装置和电穿孔方法也是优选的2007年10月17 号提交的共同待审和共有拥有的美国专利申请系列号11/874072，它要求享有美国法典第 35条119款之下对2006年10月17日提交的美国临时申请序列号60/852，149和2007年 10月提交的60/978，982的权益，所有这些文献均以全文并入本文。优选的，电穿孔装置是 CELLECTRA 装置(VGX Pharmaceuticals, Blue Bell, PA)，包括肌内(IM)和皮内(ID)模 型。Draghia-Akli等人的美国专利号7，245，963描述了模块化电极系统和它们用于 促进将生物分子引入到身体或植物内的选定组织的细胞中的用途。模块化电极系统包括多 个针状电极；皮下的针；提供从程序化恒定电流脉冲控制器到所述多个针状电极的导电连 接的电连接器；以及电源。操作者可以抓住装在支撑结构上的多个针状电极并将它们牢固 地插入到身体或植物内的选定组织中。然后将生物分子通过皮下的针递送到选定组织中。 程序化恒定电流脉冲控制器被激活并且恒定电流的电脉冲被应用到多个针状电极。应用的 恒定电流电脉冲促进将生物分子引入到多个电极之间的细胞中。美国专利号7，245，963的 全部内容通过引用并入本文。Smith等人递交的美国专利公布2005/0052630描述了可被用来有效促进将生物分子引入到身体或植物内的选定组织的细胞中的电穿孔装置。所述电穿孔装置包括由软件 或固件限定操作的电动力学装置(“EKD装置”)。EKD装置基于使用者的控制和脉冲参数 的输入在阵列中的电极之间产生一系列可程序化的恒定电流脉冲模式并且允许电流波形 数据的存储和获取。电穿孔装置还包括具有针状电极阵列的可替代的电极盘、用于注射针 的中心注射通道以及可移去的引导盘。美国专利公布2005/0052630的全部内容通过引用 并入本文。在美国专利号7，245，963和美国专利公布2005/0052630中描述的电极阵列和方 法被修改以用于深深穿入不仅例如肌肉的组织而且还有其他组织或器官。因为电极阵列的 配置，注射针(递送选择的生物分子)也被完全插入到靶器官中，并且注射被垂直施用至由 电极预先划定的区域中的靶组织，在美国专利号7，245，963和美国专利公布2005/005263 中描述的电极优选地是20mm长以及21规格(gauge)。以下是本发明的方法的一个实例，并且在以上讨论的专利参考文献中更详细地被 讨论可以配置电穿孔装置来将产生恒定电流的能量脉冲递送至哺乳动物的期望组织，所 述恒定电流类似于使用者输入的预设电流。电穿孔装置包括电穿孔部件和电极组件或手柄 组件。电穿孔部件可包括并结合电穿孔装置的各种元件中的一个或多个，包括控制器、电 流波形发生器、阻抗测验器、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、记忆部件、电 源和电源开关。电穿孔部件能够作为电穿孔装置的一个元件发挥作用，并且其他元件是与 电穿孔部件保持联系的分开的元件(或部件)。在一些实施方案中，电穿孔部件不只能够作 为电穿孔装置的一个元件发挥作用，它还能够与电穿孔装置的其他元件保持联系，所述其 他元件与电穿孔部件是分开的。本发明不受作为一个机电或机械装置的零件而存在的电穿 孔装置的元件限制，因为所述元件能够作为一个装置或者作为彼此保持联系的分开的元件 起作用。电穿孔部件能够递送在期望组织中产生恒定电流的能量脉冲并且包括反馈机制。 电极组件包括在空间布置中具有多个电极的电极阵列，其中所述电极组件接收来自电穿孔 部件的能量脉冲并且将此能量脉冲通过电极递送到期望组织。多个电极中的至少一个在递 送能量脉冲的过程中是中性的，并且测量期望的组织中的阻抗，并且将该阻抗传递到电穿 孔部件。反馈机制能够接收测量的阻抗并且能调整由电穿孔部件递送的能量脉冲以保持恒 定电流。在一些实施方案中，所述多个电极能够以分散模式递送能量脉冲。在一些实施方 案中，所述多个电极能够通过控制电极于程序化顺序以分散模式递送能量脉冲，并且所述 程序化顺序是由使用者向电穿孔部件输入。在一些实施方案中，程序化顺序包括按顺序递 送的多个脉冲，其中多个脉冲中的每个脉冲是通过具有测量阻抗的一个中性电极的至少两 个活性电极递送，并且其中多个脉冲中的随后的脉冲是通过具有测量阻抗的一个中性电极 的至少两个活性电极中的不同的一个递送。在一些实施方案中，反馈机制是通过硬件或软件执行的。优选地，反馈机制是通过 类似物闭合环路执行的。优选地，这种反馈每50i! s、20i! s、10i! s或1 i! S发生，但优选地 是实时反馈或是瞬时的(即如通过用于确定反应时间的可获得的技术所确定的基本上瞬 时)。在一些实施方案中，中性电极测量期望组织中的阻抗并且将该阻抗传递至反馈机制， 该反馈机制对该阻抗作出反应并调整能量脉冲以将恒定电流保持在与预设电流类似的值。 在一些实施方案中，反馈机制在递送能量脉冲的过程中连续地并瞬时地保持恒定电流。
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药学上可接受的赋形剂可包括例如运载体(vehicle)、佐剂、载体(carrier)或稀 释剂这类公共已知并且可容易获得的功能分子。优选地，药学上可接受的赋形剂是佐剂或 转染促进剂。在一些实施方案中，将核酸分子或DNA质粒与施用多核苷酸功能增强剂或基 因疫苗促进剂(或转染促进剂)联合递送至细胞。多核苷酸功能增强剂描述于美国系列号 5，593，972、5，962，428和1994年1月26日提交的国际申请系列号PCT/US94/00899中，这 些文献各自通过引用并入本文。基因疫苗促进剂描述于1994年4月1日提交的美国系列号 021，579中，其通过引用并入本文。转染促进剂能够作为与核酸分子的混合物与核酸分子联 合施用或者在核酸分子施用同时、之前或之后分开施用。转染促进剂的实例包括表面活性 剂例如免疫刺激复合物(ISC0MS)；弗氏不完全佐剂；LPS类似物，包括单磷酰脂质A;胞壁 酰肽；醌类似物以及小囊泡例如角鲨烯和菠菜烯；并且也可以使用透明质酸与基因构建体 联合施用。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗还可以包括转染促进剂例如脂质；脂质体，包 括卵磷脂脂质体或本领域已知的其他脂质体，为DNA脂质体混合物(参见例如W09324640)； 钙离子；病毒蛋白；聚阴离子；聚阳离子或纳米颗粒；或者其他已知的转染促进剂。优选地， 转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子、包括聚L谷氨酸(LGS)或脂质。在一些优选的实施方案中，将DNA质粒与佐剂一起递送，所述佐剂是进一步增强 针对此类靶蛋白的免疫反应的蛋白的基因。此类基因的实例是那些编码其他细胞因子和淋 巴因子的基因，所述细胞因子和淋巴因子例如a-干扰素、干扰素、血小板衍生生长因 子(PDGF)、TNF-a、TNF-3、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-10、IL-12、IL-18、MHC、CD80、CD86和IL-15，包括具有被删除信号序列的IL-15并任选 地包括来自IgE的信号肽。可能有用的其他基因包括编码以下的基因MCP-l、MIP-la、 MIP-lp、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、 LFA-l、VLA-l、Mac-l、pl50. 95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、 IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长 因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF 受体、Fit、Apo_l、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo_3、AIR、 LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶 ICE、Fos、c_jun、Sp_l、 Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性 NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素 反应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK 配 体、0x40、0x40 配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2 以 及它们的功能片段。根据本发明的药物组合物包含的DNA量为从约1纳克到100毫克；约1微克到约 10毫克；或者优选地约0. 1微克到约10毫克；或者更优选地约1毫克到约2毫克。在一些 优选的实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约5纳克到约1000微克的DNA。在一些 优选的实施方案中，药物组合物含有约10纳克到约800微克的DNA。在一些优选的实施方 案中，药物组合物含有约0. 1到约500微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物 含有约1到约350微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物含有约25到约250 微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物含有约100到约200微克DNA。根据本发明的药物组合物是根据待使用的施用方式而配制。在药物组合物是可注 射的药物组合物的情况中，它们是灭菌的、无热原的和无颗粒的。优选地使用等渗制剂。一 般来说，用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在一些情况中，等渗溶液例如磷酸盐缓冲盐水是优选的。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案 中，将血管收缩剂加到制剂中。在一些实施方案中，使得制剂在室温或环境温度稳定延长时 段的稳定剂例如LGS或其他聚阳离子或聚阴离子被加到制剂中。在一些实施方案中，在哺乳动物中弓丨发针对共有流感抗原的免疫反应的方法包括 诱导粘膜免疫反应的方法。此类方法包括向所述哺乳动物施用CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC 蛋白和它们的功能片段或它们的可表达的编码序列中的一种或多种，结合包括以上所述的 共有流感抗原的DNA质粒。CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白和它们的功能片段中的一种或 多种可以在本文提供的DNA质粒流感疫苗的施用之前、同时或之后施用。在一些实施方案 中，向哺乳动物施用分离的核酸分子，所述核酸分子编码一种或多种选自由以下组成的组 的蛋白CTACK、TECK、MEC和它们的功能片段。实施例 在以下实施例中进一步举例说明了本发明。应当理解这些实施例当指出本发明的 优选实施方案时仅通过举例说明方式被给出。从以上讨论和这些实施例，本领域技术人员 能够确定本发明的必要特征，并且在不背离本发明的精神和范围的情况下能够对本发明作 出各种变动和修改以使其适合于各种运用和条件。因此，从上述描述，本发明的各种修改除 了本文示出并描述的那些之外对本领域技术人员将是明显的。此类修改也旨在落入所附权 利要求的范围之内。优选地，供本文所述的肌肉或皮肤EP装置使用的DNA制剂具有高DNA浓度，优选 包括毫克到数十毫克量并且优选数十毫克量的DNA的浓度，以对于递送到皮肤最适的小体 积、优选小注射体积、理想的是25-200微升(yL)。在一些实施方案中，所述DNA制剂具有 高DNA浓度，例如lmg/mL或更大(mg DNA/制剂的体积)。更优选地，DNA制剂具有的DNA 浓度提供了 200 μ L的配方中克量的DNA，并且更优选100 μ L的配方中克量的DNA。可使用已知装置与技术的组合配制或制造供本发明的EP装置使用的DNA质粒，但 优选使用在以下文献中所述的优化的质粒制造技术来制造它们共同拥有的、共同待审的 美国临时申请美国系列号60/939，792，它于2007年5月23日提交。在一些实施例中，在这 些研究中使用的DNA质粒能够在大于或等于lOmg/mL的浓度配制。制造技术还包括或结合 了本领域普通技术人员通常知道的各种装置和方案，除了在美国系列号60/939792中描述 的那些之外还包括在下述文献中描述的装置和方案2007年7月3日授予的共同拥有的专 利美国专利号7，238，522。供本文描述的皮肤EP装置和递送技术使用的高浓度质粒允许质 粒以合理低体积施用到ID/SC空间中并且帮助增强表达和免疫的效应。共同拥有的申请和 专利美国系列号60/939，792和美国专利号7，238，522分别以全文并入本文。实施例1 质粒构建体普遍存在的巨细胞病毒(CMV)启动子驱使pCMV-SEAP载体中人分泌型胚胎 碱性磷酸酶(SEAP)报告转基因产物表达。使用可商购获得的试剂盒(Qiagen Inc., Chatsworth，CA)获得质粒。内毒素水平为小于0. OlEU/μ g，如通过Kinetic Chromagenic LAL (Endosafe，Charleston，SC)所测量的。通过分析来自16种H5病毒和超过40种人附病 毒的主要病毒序列产生了共有的HA和NA构建体，所述16种H5病毒已在近年中被证明对人 具有致死性。这些序列从美国洛斯阿拉莫斯国家实验室流感病毒序列数据库下载。在产生 共有序列之后，对所述构建体进行优化用于哺乳动物表达，包括加入Kozak序列、密码子优化和RNA优化。然后这些构建体亚克隆到pVAX载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。除非 另外指明，将质粒制品在无菌水中稀释并且以聚L谷氨酸钠盐(LGS)(平均MW= 10. 5kDa) (Sigma, St. Louis,MO)配制 1 %重量 / 重量，在 VGX Pharmaceuticals 免疫治疗剂分部(The Woodlands, TX)进一步 HPLC 纯化。实施例2猪的处理将猪分成10组每组4头，总计40头猪(表1)。使猪适应环境4天，称重并且在耳 朵做标记。在研究的第0天，对猪称重、采血并使用猪的组合前驱麻醉剂-开他敏-(20mg/ kg)、甲苯噻嗪_(2.2mg/kg)和阿托品(0. 04mg/kg)麻醉，然后使用异氟烷(在5%诱导， 保持在2-3% )麻醉。用0.6mL的CMV-HA(表达共有H5抗原的基于pVAX的构建体)、 CMV-NA (表达共有m抗原的基于pVAX的构建体)和CMV-SEAP (表达报告基因分泌型胚胎碱 性磷酸酶SEAP的构建体)质粒(最后被添加以增加质粒浓度和溶液粘度用于“肌肉损伤” 评定)+1. 0% wt/wt LGS在改变的质粒浓度和电流强度对猪(n = 4/组)进行注射。根据 实施例1中提供的材料和方法制备所述质粒。4s后，使用适合的恒定电流CELLECTRA 肌内 (IM)系统(VGX Pharmaceuticals, Blue Bell, PA)将动物电穿孔，所述系统配有5个针状 电极并以下述脉冲参数操作52毫秒脉冲，脉冲间隔1秒、具有改变电流的3个脉冲(0. 1、 0. 3 和 0. 5A)。表1.猪疫苗实验的组 对每个注射部位周围区域进行纹身用于在注射后第14天和35天快速鉴定活组织 检查。使猪从麻醉中复苏并且紧密监测24小时以确保完全复苏。记录在处理后2到 3小时内没有完全复苏的任何猪。在第10天、21天和35天将猪称重并采血。在第21天 对猪施用第二次接种。将血收集在2个紫色盖子的管中，l.OmL用于CBC和分类(Antech Diagnostics, Irvine, CA) ；lOmL用于针对HA和NA抗原的干扰素-、酶联免疫斑点法；并 将血收集在分开的falcon管中，使其凝块，离心以分离血清，然后将其等分到冰上的管中。 在第35天，在麻醉的外科平面之下给所有的猪放血，并获取注射部位的针孔活组织检查用 于组织学。血球凝集素抑制(HI)测定通过用三份酶稀释一份血清用受体破坏酶(RDE)处理猪血清，并在37 °C水浴中孵 育过夜。通过在56°C孵育30min接着加入六份PBS以最终稀释1/10使酶失活。在V形底 的96孔微量滴定板中进行HI测定，如之前所述使用了病毒的四个HA单位和的马红细 胞(Stephenson, I.，等人 ，Virus Res.，103 (1-2) :91_5 (2004 年 7 月))。在来自以0. 5A的电流设置(120 士40 ；P = 0. 11相对于2mg/0. 3A和P = 0. 02相 对于2mg/0. 1A)施用2mg的表达HA的质粒的组的血清中发现通过HI测定表现出最高滴度 (图2)；使用接收2mg每种质粒的组的电场强度滴度降低；如果此后当前每种质粒的量降 低，那么滴度更加易变并且在组间是不同的。在施用了 2mg的表达HA的质粒并在0. 5A电穿孔的组中HI滴度最高。此外，滴度 随着以0. 5A电穿孔的组中递减的质粒剂量并随着电场强度而降低。更低的质粒量或更低 的电流强度看起来增加了组内可变性。HA和NA的干扰素-Y酶联免疫斑点如之前所述使用干扰素_ Y捕获抗体和检测抗体(MabTech，Sweden)进行酶联免 疫斑点实验(Boyer JD，等人.，J Med Primatol，34(5-6) :262_70 (2005 年十月))。通过从 含有肽的孔中减去阴性对照孔中的斑点数目确定抗原特异性反应。结果被显示为三重孔获 得的平均值(斑点/百万脾细胞)。在0.3A的电流设置施用了 2mg每种质粒(总计4mg)的组达到最高的细胞免疫反 应，如通过每百万细胞537士322SFU的干扰素酶联免疫斑点所测量的。所有其他组的平均反应是在该测定的背景水平之内。图3中凸显了达到最高细胞免疫反应的两只动物的 单独的酶联免疫斑点反应。CBC 结果不考虑电流设置，淋巴细胞在施用最高疫苗剂量的组中在研究的第21天达到最 高水平，尽管具有最高剂量(4mg的总质粒，各2mg)和最高电流设置(0. 5A)的组表现出最 高的淋巴细胞反应，比对照高40% (分别为12670士 1412对7607士 1603淋巴细胞计数/100 血液；P < 0. 002)。肌肉組织病理学在给猪放血处理后第14天和第35天识别注射部位并且获取打孔活组织检查。将 组织固定在缓冲的福尔马林中24小时，然后在PBS中洗涤3次并储存在70%乙醇中。将 活组织检查样品交付给Antech Diagnostics，在那里样品被加工并且切片用苏木精和曙红 (H&E)染色。一位委员会认证的病理学家评价了所有的玻片，根据各个组织层(表3)中的 病理学标准(表2)为它们评分为0至5。在每个时间点计算出每组的平均得分。表2.活组织检查病理学评分参数 表3.活组织检查组织层和病理学参数
从质粒注射后第14天和35天的肌肉活组织检查(图4A)和基于0到5等级标准 (表2)的EP对组织病理学评分。在电穿孔后总的病理学得分在第14天到第35天的组织 层(表3)中下降。在0. 3A的设置接受6mg的总质粒的组在第14天展示出最高的总病理学 得分(18. 3 士6. 4，相比于对照P < 0. 0002)，与最高的平均淋巴细胞反应相关。在第35天的 所有病理学得分接近非处理的对照水平的水平(6. 67到4. 25的范围)。尽管如此，当肌肉 坏死和纤维化(通常与EP程序有关)(Gronevik E，等人.，J Gene Med, 7 (2) =218-27(2005 年2月))被分开分析时(图4B)，得分范围在1和2之间，组间或处理组与对照之间没有差 异，而由于免疫反应更高的得分与淋巴的、浆细胞的或嗜酸性炎症有关。显著地，这些得分 也从处理后第14天到第35天下降。数据分析使用微软Excel统计软件包分析数据。图中示出的值是平均值士SEM。使用单因 素ANOVA和随后的t检验通过比较获得了具体的值。将ρ < 0. 05的值设定为统计显著性 的水平。实施例3:雪貂的处理将4-6月龄或至少Ikg体重的二十只雄性雪貂(Triple F Farms, Sayre，PA)用于 本研究中并且饲养在BI0QUAL公司(Rockville，MD)。在表4中是雪貂的研究设计。使动 物在研究之前适应环境两周。在第0、4和9周免疫动物(在麻醉之下)。每2周抽一次血。 在第三次免疫后，将动物移至BSL-3设施中并且在第13周用非常有力的禽流感菌株(H5W) 攻击，然后攻击后又过两周。在攻击后的两周，每天监测动物，并且记录体重、温度和临床得 分。监测并记录活性水平；记载死亡。这项研究在雪貂的流感攻击模型中测验了肌内接着是电穿孔递送的HA、NA和 M2e-NP的DNA疫苗的效力，所述电穿孔使用了 CELLECTRA 适合的恒定电流电穿孔肌内 (IM)系统(VGXPharmaceuticals，Blue Bell，PA)。根据实施例1中提供的材料和方法制备 了 DNA质粒。如在表4中概述，在组2、3和4中的动物接受了 0. 2mg的各自的流感质粒疫苗。为了校正剂量，接受1种质粒疫苗的组(组2和组3)或未接受疫苗的组(对照组1)， 通过pVAX空载体弥补差额以使得每组中的所有动物都接受0. 6mg总剂量的质粒。使用5 个针状电极阵列的电穿孔的条件是0. 5安培、52毫秒脉冲宽度、脉冲间隔1秒、注射与电穿 孔之间4秒延迟。表4.雪貂中流感攻击实验的组 血球凝集素抑制(HI)分析通过用三份酶稀释一份血清用受体破坏酶(RDE)处理血清，并在37 °C水浴中孵育 过夜。通过在56°C孵育30min接着加入六份PBS以最终稀释1/10使酶失活。在V形底的 96孔微量滴定板中进行HI测定，如之前所述使用了病毒的四个HA单位和1 %的马红细胞 (Stephenson, I.，等人 ，VirusRes.，103 (1-2) :91_5 (July 2004))。HI 测定使用的病毒是 我们从疾病控制中心获得的重配菌株甲型/越南/1203/2004(H5N1)/PR8-IBCDC-RG(进化 枝1的病毒)和甲型/印度尼西亚/05/2005(H5Nl)/PR8-IBCDC-RG2(进化枝2的病毒)。 流感感染的雪貂模型被认为更多的反映了人类疾病并且是更为严格的攻击模型。雪貂展示 出与感染流感的人相似的症状和关于人和禽流感病毒的相似组织嗜性。使用整个研究中在 不同时间点收集的血清来检测针对H5W病毒的HI活性。如图7中示出的，含有共有H5的 特定HA构建体的两组在两次免疫后均达到了抗体的保护水平(> 1 40)并且还能抑制 进化枝2的H5W病毒。换言之，该HI测定针对两种毒株是阳性的，尽管共有HA菌株是以 进化枝1的病毒为基础。数据分析使用微软Excel统计软件包分析数据。图中示出的值是平均值士SEM。使用单因 素AN0VA和随后的t检验通过比较获得了具体的值。将p < 0. 05的值设定为统计显著性 的水平。雪貂流感攻击流感攻击的结果描绘于图5和图6中。对照动物在攻击后平均损失25%的体重 (图5)，而接种HA (组1)或HA+M2e-NP+NA (组4)的动物损失了 9%至10% (相比于对照 *P < 0. 004)。体温在对照动物中升高直到发现所有对照动物死亡或到第8天被实施安乐死
在0.6 mL中 的 0.6 mg
在0.6 mL中 的 0.6 mg
在0.6 mL中 的 0.6 mg
在0.6 mL中 的 0.6 mg
24(图6)。所有接种动物，不论哪种疫苗方案，都在攻击下存活并且显示出与对照动物相比更 少的感染体征，如通过其临床得分证明的(表5)。对照动物临床得分恶化(鼻排出物、咳 嗽、昏睡)，并且在攻击后第5天和第7天之间死亡。如表5中所示，接种动物中临床得分的 严重度与抗体滴度呈反向相关(抗体滴度越高，临床得分越低，临床结果越好)。
表5受攻击的雪貂的结果 表5注释描绘了对于攻击后观察期的临床得分。“*”指示出动物被实施安乐死； FD =发现死亡。每一栏中第一个临床得分是鼻的症状0 =无；1 =鼻排出物；2 =由嘴呼 吸。第二个得分是活动0 =睡觉；1 =聪明且警觉；2 =警觉但无反应；3 =昏睡。出于比较的目的，描绘了攻击前3周测量的每只动物的HI滴度。实施例4在灵长类动物中皮内递送与肌内递送的比较在这些研究中免疫了猕猴。使动物在实验开始之前适应环境2个月。该研究如下 进行第0周-进行第一次免疫(质粒剂量施用)和基线采血；第2周进行采血；第3周进 行第二次免疫(质粒剂量施用)；第5周进行采血；第6周进行第三次免疫(质粒剂量施 用)和采血；第8周进行采血。表6 DNA构建体# 编码抗原1无流感抗原的对照质粒6流感H5共有9无流感抗原的对照质粒10无流感抗原的对照质粒将所有质粒在注射用水+1% LGS中配制成10mg/mL，如以上在之前的实施例中描 述的，并且将其混合成每个研究组(在上个表6中的组C、D、G和H)的单一溶液。计算出指 定 IM CELLECTRA EP(VGXPharmaceuticals)、 ID CELLECTRA EP(VGX Pharmaceuticals) 和IM注射器的各组的校正注射体积。对于皮内施用，如果每个位点所需注射体积超过 100 μ L，那么将制剂分成多个注射位点(为2、3或6，取决于施用多少总mg的疫苗)。对接 受IM注射的动物在一单个位点给出全部制剂。在猪实验、雪貂实验和非人类实验中使用的CELLECTRA 合适的恒定电流装置描 述于实施例中。电穿孔条件如下对于IM沣射和电穿孔的组，条件是0. 5安培，52毫秒/ 脉冲，三个脉冲，质粒注射与电穿孔之间4秒延迟。对于ID沣射和电穿孔的组，条件是0. 2 安培，52毫秒/脉冲，三个脉冲，质粒注射与电穿孔之间4秒延迟。血细胞凝集抑制(HI)测定-通过用三份酶稀释一份血清用受体破坏酶(RDE)处 理猴血清，并在37°C水浴中孵育过夜。通过在56°C孵育30min接着加入六份PBS以最终稀 释1/10使酶失活。在V形底的96孔微量滴定板中进行HI测定，使用了病毒的四个HA单位和的马红细胞。本文呈现的数据是第二次免疫后的结果(第三次免疫前采的血)。在第二次免疫后三周测量了 HI滴度。可以看到结果展示在图8的图中。通过ID 注射紧接着电穿孔接受HA质粒疫苗的猴表现出多于两倍的IM+EP组的平均滴度和几乎三 倍的单独的IM组的平均滴度CP < 0. 03)。无处理的对照没有显示出任何HI滴度。实施例5灵长类动物中的交叉保护使用递送方法-ID注射紧接着电穿孔(EP)对于流感疫苗(包括H5、NA和M2e_NP共有抗原，见以上)在非人类灵长类动物中 的研究指明，ID注射紧接着电穿孔引发了比IM注射更高的对疫苗抗原的抗体反应。在我 们的一项非人类灵长类动物研究(NHP)中，根据表7接种动物。 表7.研究设计和条件。在第0、4和8周免疫猕猴。每只动物接受三次接种，并且对相同进化枝和交叉进化枝执行了 HAI滴度和微量 中和。如所示，共有疫苗不仅在相同进化枝内而且在交叉进化枝内提供了广泛的保护。结 果被包含在表8中。 表8.血细胞凝集(HAI)和微量中和测定法的结果。所呈现的值指明了平均滴度、 范围(括号中)和小于5/5 (上标)的反应者数目。注释一般认为在NHP模型中HAI滴度 >1 20有血清保护性。皮内电穿孔装置中的针要短得多(约5mm)、具有较低的规格(gauge)并且在迄今 为止测验的动物中没有引发肌肉收缩或可见的疼痛反应。此外，有效的ID EP所需的电场 比最适肌内递送所需更低。ID注射已显示出更好的对流感疫苗抗原的免疫反应(Holland D，等人.(2008). J Inf Dis. 198:650-58.)。通常，与肌内递送相比皮内递送的疫苗中需要 更低的剂量来达到相似的体液反应。
权利要求
一种能够在哺乳动物中产生针对多种流感病毒亚型的免疫反应的DNA质粒疫苗，包含能够在所述哺乳动物的细胞中以有效引发所述哺乳动物中免疫反应的量表达共有流感抗原的DNA质粒，所述共有流感抗原包括共有的血球凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、M2胞外结构域核蛋白(M2e-NP)或它们的组合，以及药学上可接受的赋形剂；所述DNA质粒包含与编码所述共有流感抗原的编码序列可操作地连接的启动子，并且所述DNA质粒疫苗具有1mg/ml或更大的总DNA质粒浓度。
2.如权利要求1所述的DNA质粒疫苗，其中所述DNA质粒还包含与所述编码序列的N 端末端相连并且与所述启动子可操作地连接的IgG前导序列。
3.如权利要求1-2中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述DNA质粒还包含与所述编 码序列的C端末端相连的聚腺苷酸化序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述DNA质粒是密码子优化的。
5.如权利要求1-4中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述药学上可接受的赋形剂是 佐剂。
6.如权利要求5所述的DNA质粒疫苗，其中所述佐剂选自由IL-12和IL-15组成的组。
7.如权利要求1-6中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述药学上可接受的赋形剂是 转染促进剂。
8.如权利要求7所述的DNA质粒疫苗，其中所述转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子或脂质。
9.如权利要求7所述的DNA质粒疫苗，其中所述转染促进剂是聚L谷氨酸。
10.如权利要求1-9中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述转染促进剂是浓度小于 6mg/ml的聚L谷氨酸。
11.如权利要求1-10中任一项所述的DNA质粒疫苗，包含多种不同的DNA质粒； 其中所述多种DNA质粒之一包含编码共有HA的序列，所述多种DNA质粒之一包含编码共有NA的序列，并且 所述多种DNA质粒之一包含编码共有M2e-NP的序列。
12.如权利要求11所述的DNA质粒疫苗，其中所述共有HA是共有HI、共有H2、共有H3 或共有H5。
13.如权利要求11所述的DNA质粒疫苗，其中所述共有HA是SEQIDNO :2、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12 或 SEQ ID NO :14。
14.如权利要求11所述的DNA质粒疫苗，其中所述共有HA是SEQIDN0 :2。
15.如权利要求11所述的DNA质粒疫苗，其中所述编码共有HA的序列是SEQID NO 1、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:11 或 SEQ ID N0:13。
16.如权利要求11所述的DNA质粒疫苗，其中所述编码共有HA的序列是SEQID NO 1。
17.如权利要求11所述的DNA质粒疫苗，其中所述共有NA是SEQIDN0 :4。
18.如权利要求11所述的DNA质粒疫苗，其中所述编码共有NA的序列是SEQID NO 3。
19.如权利要求11所述的DNA质粒疫苗，其中所述共有M2e-NP是SEQID NO :8。
20.如权利要求11所述的DNA质粒疫苗，其中所述编码共有M2e-NP的序列是SEQID NO :7。
21.如权利要求1-10中任一项所述的DNA质粒疫苗，包括 包含编码共有Hl的序列的DNA质粒，包含编码共有H3的序列的DNA质粒， 包含编码共有H5的序列的DNA质粒， 包含编码共有NA的序列的DNA质粒，以及 包含编码共有M2e-NP的序列的DNA质粒。
22.如权利要求21所述的DNA质粒疫苗，其中所述共有Hl是SEQIDNO :2。
23.如权利要求21所述的DNA质粒疫苗，其中所述编码共有Hl的序列是SEQID NO Io
24.如权利要求21所述的DNA质粒疫苗，其中所述共有H3是SEQIDNO 120
25.如权利要求21所述的DNA质粒疫苗，其中所述编码共有H3的序列是SEQID NO 11。
26.如权利要求21所述的DNA质粒疫苗，其中所述共有NA是SEQIDNO :4。
27.如权利要求21所述的DNA质粒疫苗，其中所述编码共有NA的序列是SEQID NO3。
28.如权利要求21所述的DNA质粒疫苗，其中共有M2e-NP是SEQIDNO :8。
29.如权利要求21所述的DNA质粒疫苗，其中所述编码共有M2e-NP的序列是SEQID NO :7。
30.如权利要求1-29中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述哺乳动物是灵长类。
31.如权利要求1-30中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述免疫反应是体液反应。
32.如权利要求1-30中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述免疫反应是细胞反应。
33.如权利要求1-30中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述免疫反应是联合的体液 反应和细胞反应。
34.一种在哺乳动物中引发针对多种流感病毒亚型的免疫反应的方法，包括 向所述哺乳动物的组织递送DNA质粒疫苗，所述DNA质粒疫苗包含能够在所述哺乳动物的细胞中表达共有流感抗原以在所述哺乳动物中引发免疫反应的DNA质粒，所述共有流 感抗原包含共有的HA、NA、M2e-NP或它们的组合，用有效允许所述DNA质粒进入细胞的恒定电流的能量脉冲将所述组织的细胞电穿孔。
35.如权利要求34所述的方法，其中递送步骤包括 将所述DNA质粒疫苗注射到皮内、皮下或肌肉的组织中。
36.如权利要求34-35中任一项所述的方法，包括 预先设定期望被递送到所述组织的电流；并且用等于预设电流的恒定电流的能量脉冲将所述组织的细胞电穿孔。
37.如权利要求34-36中任一项所述的方法，其中电穿孔步骤还包括 测量被电穿孔的细胞中的阻抗；相对于被测量的阻抗调整所述能量脉冲的能量水平以在所述被电穿孔的细胞中保持恒定电流；其中测量和调整步骤发生在所述能量脉冲的存在期内。
38.如权利要求34-37中任一项所述的方法，其中电穿孔步骤包括根据以分散模式递送所述能量脉冲的脉冲序列模式将所述能量脉冲递送至多个电极。
39.一种能够在哺乳动物的细胞中表达共有流感抗原的DNA质粒，包含包含共有的血球凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、M2胞外结构域核蛋白(M2e-NP)或它 们的组合的编码序列；与所述编码序列可操作地连接的、调控所述共有流感抗原的表达的启动子。
40.如权利要求39所述的DNA质粒，其中所述DNA质粒还包含与所述编码序列的N端 末端相连并且与所述启动子可操作地连接的IgG前导序列。
41.如权利要求39-40中任一项所述的DNA质粒，其中所述DNA质粒还包含与所述编码 序列的C端末端相连的聚腺苷酸化序列。
42.如权利要求39-41中任一项所述的DNA质粒，其中所述DNA质粒是密码子优化的。
43.如权利要求39-42中任一项所述的DNA质粒，其中共有HA是共有HI、共有H2、共有 H3或共有H5。
44.如权利要求39-43中任一项所述的DNA质粒，其中共有HA是SEQID NO :2、SEQ ID N0:10、SEQ ID NO: 12 或 SEQ ID NO: 14。
45.如权利要求39-44中任一项所述的DNA质粒，其中共有HA是SEQID NO :2。
46.如权利要求39-45中任一项所述的DNA质粒，其中编码共有HA的编码序列是SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:11 或 SEQ IDNO :13。
47.如权利要求39-46中任一项所述的DNA质粒，其中编码共有HA的编码序列是SEQ ID NO 1。
48.如权利要求39-47中任一项所述的DNA质粒，其中共有NA是SEQID NO :4。
49.如权利要求39-48中任一项所述的DNA质粒，其中编码共有NA的编码序列是SEQ ID NO :3。
50.如权利要求39-49中任一项所述的DNA质粒，其中共有M2e-NP是SEQID NO :8。
51.如权利要求39-50中任一项所述的DNA质粒，其中编码共有M2e_NP的编码序列是 SEQ ID NO :7。
52.如权利要求39-42中任一项所述的DNA质粒，其中所述DNA质粒包含SEQID NO 15、SEQ ID N0:16 或 SEQ ID NO :17。
全文摘要
本发明的一个方面涉及能够在哺乳动物中产生针对多种流感病毒亚型的免疫反应的DNA质粒疫苗，包含DNA质粒和药学上可接受的赋形剂。所述DNA质粒能够在所述哺乳动物的细胞中以有效引发所述哺乳动物中免疫反应的量表达共有流感抗原，其中所述共有流感抗原包括共有的血球凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白、核蛋白、M2胞外结构域核蛋白(M2e-NP)或它们的组合。优选地，所述共有流感抗原包括HA、NA、M2e-NP或它们的组合。所述DNA质粒包含与编码所述共有流感抗原的编码序列可操作地连接的启动子。另外，本发明的一个方面包括使用提供的DNA质粒疫苗在哺乳动物中引发针对多种流感病毒亚型的免疫反应的方法。
文档编号A61K31/70GK101877965SQ200880118583
公开日2010年11月3日 申请日期2008年11月12日 优先权日2007年11月12日
发明者D·B·韦纳, D·雷蒂, R·德拉奇亚-阿科利, 严健 申请人:宾夕法尼亚州立大学托管会;Vgx制药有限公司