瘢痕疙瘩和增生性瘢痕根治治疗药的制作方法

专利名称：瘢痕疙瘩和增生性瘢痕根治治疗药的制作方法
技术领域：
本发明涉及弹性纤维形成促进剂以及瘢痕疙瘩和/或增生性瘢痕的根治治疗药。
背景技术：
本说明书中使用的简略符号如下。GAG 葡萄糖胺聚糖 CS 硫酸软骨素CS-A 硫酸软骨素ACS-B 硫酸软骨素BCS-C 硫酸软骨素CCSPG 硫酸软骨素蛋白多糖GAGase 葡萄糖胺聚糖分解酶CSase 软骨素酶(硫酸软骨素分解酶)CSase-ABC 软骨素酶 ABCCSase-B 软骨素酶 BCSase-AC 软骨素酶 AC增生性瘢痕或瘢痕疙瘩可理解为皮肤上产生的创伤在愈合的过程中无法再生原 有的正常组织，而形成纤维性的、被称为“瘢痕组织”的组织，即，所谓的创伤愈合中的异常 (非专利文献1、2)。增生性瘢痕是由于大的深的创伤、或感染·异物混入·不适当的缝合 等妨碍创伤愈合之类的原因而产生，而瘢痕疙瘩如被虫咬或预防接种等由极轻微的创伤产 生，具有超过原有创伤范围扩展的特征(非专利文献2、3)。但是，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的 病变部位的共同点都是以胞外基质的过量蓄积和细胞增殖为主要特征的红肿性病变。病变 部位非常硬，皮肤的伸缩性显著受限。由此，不仅伴随有患部疼痛，特别是病变涉及到关节 部位时，会引起关节活动区域的限制等功能性障碍。患者为幼儿时，可能导致病变部位的生 长障碍，增生性瘢痕或瘢痕疙瘩的治疗不只是由于美容的理由，从其功能性的角度考虑也 很重要。但是目前尚未有增生性瘢痕或瘢痕疙瘩的适当的动物实验模型存在，其病因 病 态的阐明几乎没有大的进展。目前进行的处置方法如下。1)压迫固定疗法通常在病变部位表面直接粘贴一个面上带有粘合剂的海绵(> 7卜>、7 4夕^ 卜 > (注册商标)等)，将其用外科胶带压迫、固定(非专利文献4 6)。病变部位为活动 部位时，进一步在其上缠绕绷带或支撑物，或穿着束带或围腰(非专利文献7)。通过这些压 迫使病变部位平坦，减轻疼痛或痒感，但终止压迫则病变部位再次隆起，疼痛或痒感复发。2)外科疗法病变部位小时、或者为宽度窄的增生性瘢痕时，将其切除，进行适当的形成外科缝 合则症状减轻。但是，拆线后必须进行三个月左右的压迫固定疗法(非专利文献8)。另外，该疗法无法应用于宽度较大的病变部位或热烧伤等涉及广范围的增生性瘢痕。并且为瘢痕 疙瘩时，即使通过切除使病变部位平坦，也会从此处复发，产生比手术前更广范围的病变部 位(非专利文献16)。为防止该复发，必须在切除后进行放射线疗法，放射线疗法仅限于降 低复发率，并不是根治疗法(非专利文献16)。3)覆盖材料疗法 自Perkins等人的报告(非专利文献9)以来，可以采用通过粘贴硅胶片来进行增 生性瘢痕或瘢痕疙瘩的治疗，改善自觉症状。其作用机理据说是保湿效果，但详细情况尚不 明确(非专利文献10)。也有采用水胶体覆盖材料代替硅胶的疗法。但是该疗法仅限于改 善自觉症状，效果不定，并且也有很多连自觉症状的改善也无法确认的病例，并不是根治疗 法。4)药物疗法是对增生性瘢痕或瘢痕疙瘩的病变部位局部注射类固醇药(曲安西龙液)来进行 (非专利文献11)。通过该注射，病变部位平坦，红肿消退，并且可以止痒。但是根据给予量 的不同，可能发生皮肤萎缩、低色素沉着、过度的色素沉着、毛细管扩张等全身性副作用，无 法长时间给予。另外也不适用于广范围的病变(非专利文献12、非专利文献16)。并且对 于女性来说，即使少量给予也会发生月经不调等副作用。并且类固醇药终止注射时，很多患 者会出现复发，因此不是根治疗法，患者只能长期就医。类固醇药的作用是基于抑制细胞因 子等的抗炎症效果和由其引发的瘢痕疙瘩细胞(瘢痕疙瘩中具有特征性形态的大型的成 纤维细胞)数目的减少。类固醇治疗导致的复发显示只是通过抗炎症作用诱导瘢痕疙瘩 细胞数目减少，不能达到根治目的(非专利文献16)。除局部注射之外，还有粘贴含有倍他 米松或氟氢缩松等类固醇的贴剂的方法，但只是可见自觉症状的改善，效果不稳定。另外根 据患者的不同，可能容易发生胶布皮炎(，一7 Α^Λ)。而内服疗法是使用曲尼司特(非 专利文献13)。这也只是可能改善痒等的自觉症状，大多必须服用3个月以上。如上所述，以往的增生性瘢痕或瘢痕疙瘩的疗法即使被称为“治疗”也只是对症疗 法。即，目前的疗法只是使增生性瘢痕或瘢痕疙瘩中隆起的病变部分平坦，或者一过性地改 善自觉症状，使病变组织转化为正常组织的根本性治疗的概念本身在增生性瘢痕或瘢痕疙 瘩的相关医疗领域中尚未存在。因此，目前为止，使增生性瘢痕或瘢痕疙瘩正常化(恢复为 正常组织状态)的治疗药、即根治治疗药并不存在于世上。已知人皮肤的主要构成成分是胶原、弹性纤维、GAG。有报告指出，增生性瘢痕或瘢 痕疙瘩中存在I、III、VI型胶原的过量蓄积(非专利文献14、15)、弹性纤维的正常结构的缺 损(非专利文献17、18)。弹性纤维是富于伸缩性、容易延伸，如果除去力则会复原的、如橡 胶或弹簧的纤维，主要成分是弹性蛋白。弹性纤维的具体形成机理尚不明确，可能是在被称 为微原纤维的纤维周围有弹性蛋白沉积、交联而成。已知微原纤维的主要构成蛋白之一是 原纤蛋白-1。增生性瘢痕或瘢痕疙瘩的病变组织的胞外基质中，弹性蛋白在原纤蛋白-1上 的沉积、交联缺损(非专利文献17)。专利文献1中记载，根据CSase-B或CSase-AC抑制成纤维细胞增殖的试验结果， 可将CSase用于纤维性组织尺寸的减小。但是，即使将其用于瘢痕疙瘩，也只限于抑制成纤 维细胞增殖、使病变部分平坦这样的以往的概念。具有细胞增殖抑制作用的类固醇药如果 中止给予，则瘢痕疙瘩等复发，也无法用于增生性瘢痕或瘢痕疙瘩的根治治疗，这样，只是抑制成纤维细胞增殖，是无法期待病变部分正常化的。瘢痕疙瘩患者病变部位的组织与银屑病患者的病变组织、或小鼠银屑病模型动物 的皮肤组织不同，其特征在于由异常蓄积的胶原构成的致密的胶原纤维束络合，这些胶原 纤维束透明化、CSPG在胞外基质中异常蓄积。另外，瘢痕疙瘩的组织学特征是在人正常组 织中可见的弹性纤维(弹性蛋白沉积在原纤蛋白-ι上并交联所得的纤维)缺失。在人以外的动物中不会产生瘢痕疙瘩等，可以愈合，因此如之前所述，目前无法开 发可以评价对瘢痕疙瘩的根治治疗效果的试验系统。因此如本发明所述，瘢痕疙瘩等病变 组织本身恢复为正常组织的根治治疗的概念并不存在，可以认为上述的恢复是不可能的。
专利文献1 日本特表2004-504262非专利文献1 :Abergel, R. P.，Pizzurro, D. Meeker, C. A.，等人.(1985) Biochemical composition of the connective tissue in keloids andanalysis of collagen metabolism in keloid fibroblast cultures. J. Invest. Dermatol. 84,384 ~ 390.##^lJiIK 2 =Heenan, P. J. (1997) Tumors of the Fibrous TissueInvolving the Skin. In :Lever' s Histopathology of the Skin (eds Elder, D.,等人·)，847 887 .East Washington Square, Philadelphia, Pennsylvania :Lippincott-Raven Publishers.非专利文献3 大浦武彦等人汐口 ^卜"肥厚性瘢痕O定羲& b σ ^分類，形成外 科 36 265 274，1993.非专利文献4 冨士森良輔汐口 4卜·'O压迫瘵法，手術44:3 13，1990.非专禾丨J文献 5 :Costa AM,等人Mechanical Force Induce ScarRemodeling :Am J Pathol. 155 1671 1679，1999.非专利文献6 鈐木茂彦、内藤素子汐α ^卜“、肥厚性瘢痕O治療，日本医事新報 4516 29 32，2003.非专利文献7:鈐木茂彦瘢痕 夂口 ^ K Θ治瘵，MB Derma，67 134 138，2002.非专利文献8 鈐木茂彦夂口 ^ K ·肥厚性瘢痕O手術，50 1557 1561,1996.非专利文献9 :Perkins K,等人Silicone gel :a new treatment forburn scars and contractures. Burns 9 ；201 204,1983.非专利文献10 大浦武彦等人肥厚性瘢痕杉Μσ^τ O 4 K (二对t 3 * U ^ — > y ；ι V 一 F Θ治瘵成續，臨床医薬14 ；2921 2937，1998.非专利文献 11 :Maguire H C Treatment of keloids withtriamcinolone acetonide injected intralesionnally, JAMA,192 :325 329,1956.非专利文献12 鈐木茂彦、冨士森良輔肥厚性瘢痕· > 口 ^ K O痒 O治療，MB Derma,30 14 19，1999.非专利文献13 難波雄哉等人》口 ^ K ^ J: t/肥厚性瘢痕t二对t 3卜，二，7 卜們臨床評価，熱傷18 30 45，1992.非专利文献 14 =Peltonen, J. , Hsiao, L. L. ,Jaakkola, S.等人·(1991) Activation of collagen gene expression in keloids co-localization of type land VI collagen and transforming growth factor-beta 1 mRNA. J. Invest. Dermatol. 97,240 ~ 248.
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发明内容
本发明的课题在于提供可以使人特有的难治性疾病一增生性瘢痕或瘢痕疙瘩恢 复正常组织状态并根治(正常化)的治疗药。本发明人等为解决上述课题进行了深入的努力，结果领先世界，成功地构建了可 以正确评价对瘢痕疙瘩疾病的治疗效果的试验系统。由此，不仅对于瘢痕疙瘩等组织体积 的缩小、对于与瘢痕疙瘩等的根治治疗相关的组织的正常化过程也可进行评价。这里，正常 化的过程是指瘢痕疙瘩组织中弹性纤维结构的再生、异常增殖的瘢痕疙瘩细胞的减少、过 量蓄积的胶原纤维束的减少、透明化的消失、瘢痕疙瘩组织的缩小。该新试验系统是采集 5mm方形瘢痕疙瘩患者病变部位组织，在免疫功能不全一裸小鼠的背部皮下制作最小限度 的皮下袋、以及通过结合使用锚钉缝合(anchoring sutures)等的精密技术进行移植并固 定的方法。该方法中，在动物皮肤的真皮内，瘢痕疙瘩患者病变部位的组织可长时间保持瘢 痕疙瘩的特征，可通过对病变部位给予被检物质进行治疗效果的评价。与瘢痕疙瘩等组织的正常化相关，本发明人等进一步构建了作为体外评价系统的 弹性纤维形成测试(-，7卜/ - +〉7 Τ" 7)。该试验系统是可以测定受验物质抑 制弹性纤维(弹性蛋白在原纤蛋白-ι上沉积并交联所得的纤维)的状态的试验系统。本 发明人等使用上述试验系统进一步进行深入研究，结果发现分解CS-A、CS-B和CS-C的酶 具有促进弹性纤维形成、瘢痕疙瘩或增生性瘢痕的根治治疗等的新的用途，从而完成了本 发明。本发明的主要内容如下。(1)弹性纤维形成促进剂，该弹性纤维形成促进剂含有分解CS-A、CS_B和CS-C的酶。(2)上述⑴所述的弹性纤维形成促进剂，其中，上述酶是来自普通变形菌 (Proteus vulgaris)白勺 CSase—ABC。(3)瘢痕疙瘩和/或增生性瘢痕的根治治疗剂，该根治治疗剂含有分解CS-A、CS_B 和CS-C的酶。(4) (3)所述的根治治疗剂，其特征在于该根治治疗剂促进弹性蛋白与原纤蛋白 的缔合。本发明还涉及分解CS-A、CS-B和CS-C的酶在弹性纤维形成促进剂的制备中的应用，以及分解CS-A、CS-B和CS-C的酶在瘢痕疙瘩和/或增生性瘢痕的根治治疗剂的制备中 的应用。



图1是表示包含瘢痕疙瘩患者病变部位和正常部位的皮肤组织的显微镜观察结 果的图(照片)。斜线的范围是瘢痕疙瘩病变的部位，结构不同的相邻的部位是正常皮肤 组织的图像。左图是苏木精-伊红(HE)染色，右图是弹性van Gieson(EVG)染色的标本。 EVG是可以使弹性纤维染色为黑色的染色方法。图2是表示瘢痕疙瘩组织和正常皮肤组织中弹性纤维构成成分的表达相关的试 验结果的图(照片)。图2A是通过RT-PCR扩增两种组织中的弹性纤维构成成分的mRNA， 进行电泳的结果的图(照片)。图2B是表示通过免疫组织化学染色检测两种组织中弹性纤 维构成成分的蛋白质的表达以及是否在胞外基质中存在的结果的图(照片)。图2B的上图 是对弹性蛋白进行染色的标本。图2B下左图是对原纤蛋白-1进行染色的标本。图2B下 右图是通过苏木精对每个瘢痕疙瘩细胞的核进行染色的标本。图3是表示蓄积在瘢痕疙瘩组织中的CS的分析结果的图(照片)。左上图是不对 正常皮肤组织切片进行酶处理即进行爱茜蓝染色的标本。左下图是不对瘢痕疙瘩组织切片 进行酶处理即进行爱茜蓝染色的标本。右边的三张图自上而下是将瘢痕疙瘩组织切片进行 CSase-ABC, CSase-B或CSase-AC处理，然后进行爱茜蓝染色的标本照片。图4是通过体外弹性纤维形成测试(工，^卜/工 ^ 7七^ )来表示弹性 纤维形成的图(照片)。左图是表示弹性蛋白纤维局部存在于胞外基质中的染色结果，右图 是表示原纤蛋白-ι纤维局部存在于胞外基质中的染色结果。图5是通过体外弹性纤维形成测试来表示弹性纤维形成中各种CS(CS_A、CS-B或 CS-C单独以及各种CS组合所得的CS)的抑制效果的图(图表)。在胞外基质上沉积的弹 性蛋白纤维染色后，可以将弹性蛋白沉积面积转化成数值。图表是将各种CS添加组的弹性 蛋白沉积面积相对于未添加CS组的相对比制成图表。图6是表示体内弹性纤维形成中注射CSase-ABC的治疗效果的观察结果图(照 片)。图6A的两张照片是患者的瘢痕疙瘩病变部位的照片以及病理照片(移植前)。右图 是左图的用圆圈圈起来的部分的放大图。图6B的两张照片是表示将瘢痕疙瘩组织移植到 裸小鼠的背部皮下两处后、注射CSase-ABC得到的治疗效果的观察结果图(照片)。图6B 左图表示刚移植后的结果，图6B右图表示注射CSase-ABC和注射缓冲液的结果。图6C的 两张照片是表示移植后第35天的CSase-ABC注射组的瘢痕疙瘩组织的显微镜观察结果图 (照片)。自上而下分别为缓冲液注射组和CSase-ABC注射组的弹性van Gieson (EVG)染 色图(照片)。图7是表示体内弹性纤维形成中缓冲液注射、CSase-ABC注射、CSase-B注射、 CSase-A注射的治疗效果的观察结果图(照片)。图7A的两张照片是患者病变部位的病理 照片(左)和用圆圈圈起来的部分的放大照片(右)(移植前)。图7B是将瘢痕疙瘩组织 移植到裸小鼠的背部皮下后进行缓冲液注射、CSase-ABC注射、CSase-B注射、CSase-AC注 射，移植后第35天的治疗效果的观察结果图(照片)。图8是在将瘢痕疙瘩组织移植到裸小鼠的背部皮下后进行缓冲液注射、CSase-ABC注射、CSase-B注射、CSase-AC注射，移植后第35天的治疗效果的组织学研究结 果图(照片)。从左到右是表示缓冲液注射、CSase-ABC注射、CSase-B注射、CSase-AC注 射的结果的照片。上部分是拍摄到残留移植组织的面积的低倍率的显微镜照片。中部分是 拍摄到弹性纤维结构的再生状态、胶原纤维束以及透明化状态的中等程度倍率的显微镜照 片。下部分是拍摄到残留瘢痕疙瘩细胞的高倍率的显微镜照片。上部分和中部分是进行了 弹性van Gieson(EVG)染色的照片。下部分是进行了 HE染色的照片。中部分的EVG照片 显示了缓冲液注射、CSase-ABC注射、CSase-B注射、CSase-AC注射中弹性纤维再生的程度。 通过不同倍率的照片，显示了缓冲液注射、CSase-ABC注射、CSase-B注射、CSase-AC注射中 的移植组织片的残留面积、弹性纤维的再生、瘢痕疙瘩细胞。
具体实施方式
以下对本发明进行详细说明。<1>本发明的促进剂本发明的弹性纤维形成促进剂是含有分解CS-A、CS-B和CS-C的酶的弹性纤维形 成促进剂(以下也成为“本发明的促进剂”)。可在本发明的促进剂中使用的分解CS-A、CS_B和CS-C的酶只要是具有分解CS_A、 CS-B和CS-C的作用的酶即可，没有特别限定。即，可以具有分解CS-A、CS-B和CS-C以外 的GAG的作用。本说明书中，分解CS-A是指通过消去反应将CS-A中的N-乙酰基氨基己糖苷键切 断、生成不饱和二糖4-硫酸的作用；分解CS-B是指作用于CS-B、生成不饱和二糖或四糖； 分解CS-C是指通过消去反应将CS-C中的N-乙酰基氨基己糖苷键切断、生成不饱和二糖 (或四糖)6-硫酸。作为在本发明的促进剂中使用的酶，具体可使用CSase-ABC(来自普通变形菌，日 本特开平 6-153947 号公报；T. Yamagata, H. Saito, 0. Habuchi, S. Suzuki, J. Biol. Chem.， 243,1523 (1968) ；S. Suzuki,H. Saito,Τ. Yamagata,K. Anno,N. Seno,Y. Kawai,Τ. Furuhashi, J. Biol. Chem.，243，1543 (1968))。另外，本发明中使用的CSase-ABC可以使用市售商品。例 如有生化学工业株式会社制备的软骨素酶ABC(商品目录编号100332)。作为实施例中可使用的酶，除上述CSase-ABC之外，还已知有=CSase-AC(来 自 月干素黄杆菌(Flavobacterium heparinum) ；T. Yamagata, H. Saito, 0. Habuchi, S. Suzuki, J. Biol. Chem.，243，1523 (1968)) ；CSase-ACII (来自金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens) ；K. Hiyama, S. Okada, J. Biol. Chem. ,250,1824 (1975) ；K. Hiyama, S. Okada, J. Biochem. (Tokyo)，80，1201 (1976)) XSase-ACIII (来自黄杆菌属 Hpl02 (Flavobacterium sp.Hpl02)；宫園博文、菊池博、吉田圭一、森川清志、德安清親，生化学.，61、1023 (1989))、 CSase-B( * 自月干 i H 木干胃；Y. M. Michelacci, C. P. Dietrich, Biochem. Biophys. Res. Commun.，56，973 (1974)、Y. Μ· Michelacci，C. P. Dietrich, Biochem. J.，151，121 (1975)；前 山賢一、多和田明、上野暁子、吉田圭一，生化学.，57，1189(1985))等，也可以使用这些软 骨素酶的任意一种。本发明中使用的上述CSase-ABC除作为主要成分的CSase-ABC (以下也称为“裂解 酶I ”)之外，还已知存在所谓的“软骨素硫酸裂解酶II” (日本特开平10-262660，以下称为“裂解酶II ”)，本发明中使用的酶可以以含有裂解酶II的形式利用，也可以使用只含有各 组分的、高纯度纯化的组分，其中优选使用只含有裂解酶I的、高纯度纯化的组分。上述高纯度CSase-ABC组分(裂解酶I组分)和裂解酶II组分的获得方法例如可 参照日本特开2002-335968或日本特开平10-262660。另外，这里所述的CSase-ABC的“来源”是指以原来保有编码该CSase的基因的生 物作为起源。例如来自普通变形菌的CSase-ABC是指由普通变形菌原来保有的基因所生产 的CSase-ABC。因此，来自普通变形菌的软骨素酶ABC当然包含由普通变形菌本身生产的、 也包含利用由普通变形菌获得的CSase-ABC基因在其它细胞中生产的软骨素酶ABC等。进 一步包含使用利用上述基因制备的突变体CSase-ABC基因所生产的重组突变体CSase-ABC 寸。本发明中使用的酶优选为纯化为可用作药物的程度、实质上不含有不允许作为药 物混入的物质的酶。例如优选具有100U/mg蛋白以上的酶活性的纯化的CSase-ABC，特别优 选使用具有100U/mg蛋白以上的酶活性、实质上不含有内毒素、核酸、蛋白酶含量在检出极 限以下的纯化的CSase-ABC。需要说明的是，本说明书中，CSase的IU (单位)是在最佳pH和最佳温度附近的条 件下，每分钟由CS游离出的1微摩尔反应产物所需的酶量。以下给出各种CSase的IU的定义。CSase-ABC的IU定义为在pH 8. 0、37°C下、每分钟由CS游离出1微摩尔不饱和二 糖所需的酶量。CSase-AC(来自肝素黄杆菌)的IU定义为在pH 7. 3、37°C下、每分钟由CS 游离出1微摩尔不饱和二糖所需的酶量。CSase-B(来自肝素黄杆菌)的IU定义为在pH 8. 0、37°C下，每分钟由CS-B生成 相当于1微摩尔Δ 4-己糖醛酸残基的UV吸收物质所需的酶量。本发明以及实施例中使用的酶的酶活性是在上述各种酶的最佳条件下测定不饱 和二糖生成量，与IU酶所产生的生成量比较而进行定量。例如，通过使用酶活性为100U/mg蛋白以上的软骨素酶ABC，在作为注射用药物给 予生物体内时不会对周边组织产生影响，可以适当地分解目标部位(例如瘢痕疙瘩或增生 性瘢痕)的蛋白多糖的CS，可制成安全性和有效性高的药物。上述CSase-ABC例如可按照 日本特开平6-153947号公报所述的方法获得，也可以使用市售商品。 本发明促进剂也可以用作实验用的试剂。本发明也包含含有分解CSase-A、CSase-B和CSase-C的酶的弹性纤维再生剂(以 下也称为“本发明的再生剂”)的概念。本发明的再生剂中使用的酶优选使用CSase-ABC，其中优选来自普通变形菌的 CSase-ABC，极为优选使用只含有裂解酶I的高度纯化的组分。如之前所述，在瘢痕疙瘩组织中，由于弹性蛋白没有沉积、交联于原纤蛋白-1上， 因此弹性纤维的结构缺失。这里，通过给予本发明的再生剂，可以引发弹性蛋白与原纤蛋白 的缔合，可以再生弹性纤维。本发明的再生剂中使用的“分解CSase-A、CSase-B和CSase-C 的酶”等的说明或优选的给予方法、给予次数等与本发明的治疗药相同。<2>本发明的治疗药本发明的治疗药是含有分解CS-A、CS-B和CS-C的酶的瘢痕疙瘩和/或增生性瘢痕的根治治疗药(以下也称为“本发明的治疗药”)。本发明的治疗药可以只含有分解CS-A、CS_B和CS-C的酶作为有效成分，还可以进 一步与该酶一起配合其它药效成分。需要说明的是，该药效成分通过与该酶配合或组合给 予，只要一种物质不抑制另一种物质原本具有的作用的物质即可，没有特别限定。对本发明的治疗药的给予途径没有特别限定，可以将本发明的有效成分溶解于例 如水、缓冲液、生理盐水等中，注射到皮下、皮内、肌内等。本发明的治疗药可以与局部麻醉药等结合使用。需要说明的是，本发明中，治疗不仅是在罹患对象疾病后事后对患者进行的常规 含义的治疗，也包含为了防止瘢痕疙瘩和/或增生性瘢痕的发生·复发而事前进行的预防 处置。本发明中，根治治疗并不只是使病变部位的尺寸缩小、或作为对症疗法使用，而是 使病变部位恢复为正常组织，根本且完全地治愈。由后述的参考例可知，在CS-A、CS-B和/或CS-C共存的培养体系中，培养瘢痕疙 瘩细胞，则弹性蛋白在胞外基质上的沉积、即，与原纤蛋白的缔合受到抑制。还由实施例可 知，在瘢痕疙瘩组织中，通过给予分解CS-A、CS-B和CS-C的酶，可以使弹性蛋白与原纤蛋白 缔合，由此引发弹性纤维的再生，结果可以进行瘢痕疙瘩和/或增生性瘢痕的根治治疗。本发明的治疗药含有在瘢痕疙瘩和/或增生性瘢痕疾病部位使分解CS-A、CS_B和 CS-C的酶促进弹性蛋白与原纤蛋白的缔合，即，通过使弹性纤维再生来治疗瘢痕疙瘩和/ 或增生性瘢痕的有效量。这里，“有效量”是指在瘢痕疙瘩和/或增生性瘢痕中促进弹性纤维再生、改善瘢痕 疙瘩和/或增生性瘢痕状态并使其正常化、预防复发的有效的量。该量根据患者的症状、病 变部位的体积、年龄等而不同，只要是在瘢痕疙瘩和/或增生性瘢痕中促进弹性纤维形成、 改善 预防瘢痕疙瘩和/或增生性瘢痕状态的有效量即可，没有特别限定，例如每5mm3病变 部位一次给予的本发明的治疗药中，可例举0.0IU以上、0. 02U以上、0.05U以上、0. IU以上、 0. 5U以上、IU以上、2U以上、4U以上等。更具体地，可例举0. 01 5U、0. 01 4U、0. 01 2U、0. 01 1U、0. 01 0. 5U、0. 01 0. 1U、0. 01 0. 05U、0. 01 0. 02U、0. 02 5U、0. 02 4U、0. 02 2U、0. 02 1U、0. 02 0. 5U、0. 02 0. 1U、0. 02 0. 05U、0. 05 5U、0. 05 2U、0. 05 1U、0. 05 0. 5U、0. 05 0. 1U、0. 1 5U、0. 1 4U、0. 1 2U、0. 1 1U、0. 1 0. 5U、0. 5 5U、0. 5 4U、0. 5 1U、1 5U、1 4U、1 2U、2 5U、2 4U、4 5U 的范 围本发明的治疗剂的给予次数可以是1天1次，也可以是1天2 4次或者是分成 更多次给予，可以根据需要每天或在适当的天数内以必要的期间给予进行上述给予。本发明的治疗药的适用对象只要是瘢痕疙瘩和/或增生性瘢痕即可，没有特别限 定，可广泛应用于真性瘢痕疙瘩、瘢痕性瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、成熟瘢痕(例如，可例举青 春痘痕等)等。实施例以下根据实施例更详细地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限定。[参考例1]瘢痕疙瘩病变部位与正常皮肤部位的观察由瘢痕疙瘩患者中摘除含有瘢痕疙瘩病变部位和正常皮肤部位的人组织检样作为组织材料。将检样用4%多聚甲醛在4°C下固定24小时，然后石蜡包埋，制备石蜡块，制 备3μπι的石蜡切片。脱石蜡后进行苏木精-伊红(HE)染色、弹性van Gieson(EVG)染色， 制备标本。使用显微镜观察瘢痕疙瘩组织和正常皮肤组织。结果如图1所示。用线标示的部分是瘢痕疙瘩病变部位，相邻的部分为正常皮肤 部位。通过EVG染色，在瘢痕疙瘩病变部位以外的正常皮肤部位可以确认被染色为黑色的 弹性纤维结构(箭头)，瘢痕疙瘩病变部位的大部分可见透明化，可以确认弹性纤维结构形 成缺失。[参考例2]瘢痕疙瘩病变组织与正常皮肤组织中弹性纤维构成成分的mRNA表达由人检样中摘除瘢痕疙瘩病变组织(4名 )和正常皮肤组织(3名)作为组织材料。 使用RNeasy Plus试剂盒(株式会社* 7 >制备)，由瘢痕疙瘩组织、正常皮肤组织中提 取总RNA。使用advantage RT for PCR试剂盒(日本 夕卜> · fM 7 # > > >株式会社 制备)，由1 μ g总RNA中合成cDNA，对于弹性纤维构成成分的7种蛋白，通过RT-PCR研究 其mRNA的表达。PCR中使用的引物如表1所示。使用Blend Taq-plus (注册商标)(东洋纺织株式会社制备)进行PCR，扩增特异 性序列，通过电泳确认。PCR的条件是变性94°C 30秒、退火58°C 30秒、延伸72°C 1分钟。 DANCE、MFAP-2、GAPDH是进行30个循环，弹性蛋白、原纤蛋白_1、纤维蛋白_1、EMILIN是进 行35个循环。[表 1]
靶DNA序列预测尺寸
_(bp)
原弹性蛋白F 5'AAGCAGCAGCAAAGTTCG3'(SEQIDNO:l)
R 5'ACCTGGGACAACTGGAATCC3'(SEQ ID NO:2)287
原纤蛋白-1F 5'GTGAGATCAACATCAATGGAGC3'(seq ω NO:3)
R r/TTACACACTCCTGGOAACACTTCa'dSEQiDNO^)180
纤维蛋白-1F 5'GATGTCCTCCTGGAGGCCTGCTGTG3'(seq Π) NO:5)
f -,R rj'TTGGGTCGGCAGCGGAAGGATCCCAGa'i SEQ ID NO 6) 783
LDANCEF tVCGGCACATACTTCTGCTCCT3,(SEQiDNO:7)
R 5'TCAGAATGGGTACTGCGACA3'(SEQlDNO:8)549
EMILINF 5'ATTATGACCAGAGACAGGC3'(SEQ ID NO:9)
R 5'CCGAGTGCGCCAGCTGCCCC3'(SEQ ID NO:10)290
MFAP-2F 5'ATGAGAGCTGCCTACCTCTTC3'(SEQID NO:l 1)
R S'CTAGCAGCTCCCACAGCTCCTS'iSEQ ro NO 12)551
GAPDHF 5'TGGTATCGTQGAAGGACTCATGAC3'(SEQ ID NO 13)
R 5'ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC3'(SEQlDNO:l4) 189结果如图2所示，参考例1中显示了在瘢痕疙瘩病变部位弹性纤维结构无法确认。 本试验中，以弹性纤维的主要成分-弹性蛋白为代表，原纤蛋白-1等弹性纤维构成成分的 mRNA在瘢痕疙瘩组织中也以与正常组织同等水平表达。这显示瘢痕疙瘩组织中弹性纤维结 构的缺失不是由于弹性蛋白、原纤蛋白-1等的产生减少。[参考例3]瘢痕疙瘩组织中弹性蛋白与原纤蛋白-1蛋白的表达参考例2中显示了瘢痕疙瘩组织中的正常水平的弹性蛋白、原纤蛋白-1的mRNA 的表达。接着，通过免疫组织化学染色研究弹性蛋白、原纤蛋白-1的蛋白质水平的表达和 在胞外基质中的局部存在。顺序如下。弹性蛋白染色切断人瘢痕疙瘩组织，使用4%多聚甲醛在4°C下固定24小时。然 后石蜡包埋，制备6μπι的切片。脱石蜡后通过LSAB/HRP试剂盒(歹二 八 >株式会社 制备)进行免疫组织化学染色。使用抗弹性蛋白抗体(1 100，二 ν、午、y方u ￥ ) ”公 司制备，PR533)作为一次抗体。
原纤蛋白-ι染色切断人瘢痕疙瘩组织，立即包埋在OCT冰冻切片包埋剂 (0. C. T. Compound)中进行冷冻。制备10 μ m冷冻切片，用Block Ace进行封闭，然后用抗 原纤蛋白-1抗体(1 200，才、才一力一公司制备)与其反应。二次抗体使用了 Alexa Fluor 546山羊抗兔IgG抗体(1 800，毛l· # 二，一 /口一 y公司制备)。用烟酸己可碱 (Hoechst) ( ν 7 ι公司制备)进行细胞核染色。结果如图2B所示。通过烟酸己可碱染色被染色的部分显示在细胞核的局部存在， 即细胞的局部存在，细胞的间隙存在胞外基质。弹性蛋白染色中，可以确认细胞内的弹性蛋 白的表达(箭头)，但在胞外基质中未见纤维状的染色图像(以“*”举例给出了胞外基质的 一个部位)。在原纤蛋白-1染色中，与正常皮肤同样，在胞外基质中可见纤维状的染色图
像。 这些显示，在瘢痕疙瘩患者病变部位的细胞中，同时产生了弹性蛋白和原纤蛋 白-1，但是在胞外基质中未见弹性蛋白在原纤蛋白-1上的沉积，弹性纤维结构缺失。产生 的弹性蛋白分泌在胞外基质中，但是未作为弹性纤维与原纤蛋白-1缔合·沉积，因此可认 为从瘢痕疙瘩组织中代谢·消失。[参考例4]蓄积在瘢痕疙瘩组织中的CS的分析对瘢痕疙瘩组织和正常皮肤的CS蓄积量进行了比较。对蓄积在瘢痕疙瘩组织中 的CS的种类也进行了研究。方法是与参考例3同样，将所得的瘢痕疙瘩组织切片(6μπι)和正常皮肤组织切片 (6 μ m)脱石蜡，然后未处置或进行了各种CSase处理，然后进行了爱茜蓝染色(pH 2. 5)。爱 茜蓝是对组织中的GAG进行染色的色素。将CSase-ABC(来自普通杆菌，生化学工业株式会 社制备)XSase-B (来自肝素黄杆菌，生化学工业株式会社制备)、CSase-AC (来自肝素黄杆 菌，生化学工业株式会社制备)分别用0. Imol Tris-HCl缓冲液溶解，使浓度为lmU/Ιμ 1， 在37°C下对组织切片进行了 2小时处理，然后用爱茜蓝液(pH 2. 5)进行了染色。结果如图3所示。左侧的两张图是CSase未处置的瘢痕疙瘩组织切片(下图)和 正常皮肤组织切片(上图)的爱茜蓝染色照片。与正常皮肤组织相比，可知瘢痕疙瘩组织 的染色性强，在瘢痕疙瘩病变部位的胞外基质中蓄积GAG。而右侧的三张照片是将瘢痕疙瘩 组织切片进行CSase-ABC、CSase-B, CSase-AC处理后进行了爱茜蓝染色的照片。三种酶处 理后均比右侧下图的瘢痕疙瘩组织(未进行酶处理)的爱茜蓝染色性低，但在CSase-ABC 处理中，可确认到染色性降低至与正常皮肤同等的水平。[参考例5]CS对于弹性纤维再生的影响由参考例4的结果显示通过过量蓄积的CS，发生瘢痕疙瘩组织中的弹性纤维形 成的缺失(抑制弹性蛋白在原纤蛋白上的沉积)。因此，在体外培养系统(工，7卜^工才、 * ；^ 7 *七^ )中，人为地将CS-A、CS-B或CS-C单独以及各种CS组合得到的CS对来自患 者的瘢痕疙瘩细胞进行处理，研究了最能引起弹性纤维结构缺失(抑制胞外基质中的弹性 蛋白的沉积)的CS的组合。在24孔细胞培养板中插入直径13mm的培养板(4 株式会社制备)，以 IXio4/孔在该板上接种用explant法由人瘢痕疙瘩组织中采集的瘢痕疙瘩细胞，用DMEM 培养基(年二公司制备)培养。CS添加组是设定CS-A、CS-B和CS-C单独以及各种CS 组合的添加组。培养基中每隔2天分别将400 μ g/ml上述3种CS单独或者将它们组合，添加1ml。对照是不添加任何成分进行培养(未添加组)。第9天取出培养板，用100%甲醇 固定，用2% BSA固定，然后用抗弹性蛋白抗体(1 100，工，7 f 口夕。々7公司制备， PR533)、抗原纤蛋白-1抗体(1 200，二巧卞午、y m 9· >7 V公司制备，PR217)作为一次 抗体，与其进行反应。二次抗体是使用Alexa Flure 546山羊抗兔IgG抗体(1 200，^ l· 、” 一"口一 7公司制备)，用烟酸己可碱(〉7 7公司制备)进行了细胞核染色。然后 通过共焦激光显微镜系统(株式会社二二 >制备，Digital Eclipse Clsi)观察，获得图像。 然后使用图像分析软件(Image pro)进行了弹性蛋白染色的图像分析。进行图像的灰阶校 正、图像反转，与核染色图像比对，同时设定范围，可以提取不含有核染色区域的染色范围， 测定弹性蛋白染色部分的面积。所得的值以相对于CS未添加组的相对百分比表示(％)， 其中CS未添加组为100%。图4表示CS未添加组的弹性蛋白染色和原纤蛋白-1染色照片。染色为椭圆形 的部分表示为烟酸己可碱染色的细胞核的部位、即细胞的局部存在，细胞间隙表示胞外基 质的部分。CS未添加组中确认到胞外基质中的弹性蛋白的沉积(右图白箭头)、原纤蛋 白-ι(左图白箭头)的纤维结构。通过图像分析软件分析各种CS添加组的结果，将该结 果用图表表示(图5和表2)。在CS-A、CS-B和CS-C单独，或将CS_A、CS_B和CS-C的两种 组合得到的CS中，与CS未添加组相比，可见抑制了胞外基质中若干纤维性弹性蛋白沉积， 在同时添加CS-A、CS-B和CS-C三种的组中，可见最强的对纤维性弹性蛋白沉积的抑制作 用。即，使三种CS共存时，显示出起 到了最高的弹性纤维素形成抑制作用。[表2]添加各种CS时弹性蛋白在胞外基质中的沉积量(％ )
CS-A
CS-A CS-A CS-B 未添加 CS-A CS-B CS-CCS-B
CS-B CS-C CS-C
CS-C
相对于未添加
10087.0 95.9 86.7 66.3 67.4 91.0 37.6
的百分比(％ )[实施例l]CSase-ABC对于移植瘢痕疙瘩病变组织中弹性纤维形成(再生)的影 响由参考例4的结果显示，CSase-ABC可最良好地分解蓄积在瘢痕疙瘩组织中的CS。 由参考例5的结果显示，CS-A、CS-B和CS-C同时共存时引发最强的弹性纤维形成抑制。因 此，选择可以分解全部三种CS的CSase-ABC，研究该酶的体内(移植瘢痕疙瘩病变组织)的 治疗效果、即研究对弹性纤维形成(再生)和瘢痕疙瘩组织尺寸的影响。图6A表示在移植中使用的瘢痕疙瘩患者(临床症状严重)的组织片的病理组织 照片。右图是左图中的用圆圈圈起来的部分的放大图。大型的明亮的成纤维细胞是瘢痕疙 瘩细胞数，其数目多(白箭头)，显著可见交联的透明化的胶原纤维束(黑箭头)。弹性纤维缺失。图中未见正常皮肤。将5mm的方形瘢痕疙瘩组织由图6A的病变组织移植到免疫 功能不全小鼠(c57balb nu/nu 6周，雄性，日本工义工瓜* 一公司制备)背部2处位置，确 认附着后，在移植8天后、18天后在移植组织片的一处(右侧的移植部分)注射ΙΟμΙ溶 解于0. IM Tris缓冲液的50mU/10y 1的软骨素酶ABC(来自普通变形菌，生化学工业株式 会社制备)。在另一处的移植组织片(左侧的移植部分)局部注射10 μ 1作为对照的0. IM Tris缓冲液。移植35天后目视观察组织片的尺寸，并拍摄照片。与上述同样，将由相同病变组织得到的5mm的方形瘢痕疙瘩组织移植到免疫功 能不全小鼠背部，确认附着后，在移植7天后、14天后、21天后，在移植组织片的一处注射 10 μ 1溶解于0. IM Tris缓冲液的50mU/10 μ 1软骨素酶ABC。在另一处的移植组织片局部 注射10 μ 1作为对照的0. IM Tris缓冲液。移植35天后(实验开始6周后)取出移植组 织片，进行组织学分析。用4%多聚甲醛在4°C下固定24小时后，制备石蜡块。制作3μπι 的切片，脱石蜡后通过弹性van Gieson(EVG)染色进行标本制作，然后使用显微镜观察移植 部位的皮肤组织。在图6B 表示在免疫功能不全的小鼠中刚移植瘢痕疙瘩组织片后和移植4周后的 照片。左侧的照片是刚移植了瘢痕疙瘩组织片后的样子，右侧的照片是移植后35天后 的照片。右侧照片的左侧移植部分是注射缓冲液(对照)的瘢痕疙瘩组织片，右侧的移植 部分是注射CSase-ABC的瘢痕疙瘩组织片。可知通过注射CSase-ABC，右侧的瘢痕疙瘩组织 片与注射缓冲液的移植片相比极端缩小。图6C表示实施了缓冲液注射或CSase-ABC注射的瘢痕疙瘩组织片在移植后35天 后的组织(EVG染色)观察结果的照片。其结果，在缓冲液注射组的组织中，完全未见弹性纤维形成，绝大部分透明化，但 在CSase-ABC注射组的组织中，可在广范围内确认染色为黑色的弹性纤维形成(黑箭头)， 确认到引起了弹性纤维结构的再生。并且染色为红色的胶原纤维束(白箭头)的状态为与 正常皮肤类似的状态，透明化消失。由以上的结果，通过注射CSase-ABC，可以确认弹性纤维的再生、交联胶原纤维 束和透明化的消失、以及诱导瘢痕疙瘩组织体积的显著缩小，可以证实本发明人的注射 CSase-ABC可成为以弹性纤维再生为机理的瘢痕疙瘩的根治治疗药的构想。[实施例 2] CSase-ABC、CSase-B, CSase-AC 的治疗效果的比较按照与实施例1同样的方法进行CSase-ABC、CSase-B, CSase-AC的治疗效果的比 较。将CSase-ABC、CSase-B和CSase-AC分别溶解于0. Imol Tris-HCl缓冲液中，使浓度 为50mU/10y 1，分别在移植组织片注射10 μ 1。图7Α表示采集了移植片的瘢痕疙瘩患者 (临床症状中等)病变部位的病理组织照片。右图是左图中的用圆圈圈起来的部分的放大 图。瘢痕疙瘩细胞数目(白箭头)多，但胶原的透明化程度比实施例1(图6Α)少。弹性纤 维缺失，图中未见正常部位。图7Β的照片从左到右是在背部一侧移植来自患者的瘢痕疙 瘩组织片，附着后每隔1周进行1次、共计3次的缓冲液给予、CSase-ABC注射、CSase-B注 射、CSase-AC注射，在移植后第35天拍摄的小鼠背部的照片。通过CSase-ABC注射，瘢痕 疙瘩组织片可见显著的移植组织片尺寸的缩小，其程度达到了无法与小鼠皮肤区分程度的 平坦。在CSase-B注射中，可见移植组织片尺寸有一些缩小，而在CSase-AC注射中，几乎未见移植组织切片的缩小。为了确认CSase-ABC注射后的移植组织是否达到与正常组织同样的组织图像、 艮口，达到弹性纤维的再生、交联胶原束和透明化消失，进行了与实施例1同样的组织学研 究。作为比较，对于缓冲液注射、CSase-B注射、CSase-AC注射个体也进行了同样的组织学 研究(图8)。上部分是用线圈起残留瘢痕疙瘩组织，表示残留面积。为了计算CSase-B注 射、CSase-AC注射、CSase-ABC注射例与缓冲液注射例中的残留人瘢痕疙瘩组织面积的相 对值，是使用Image-Pro Express J5. 1测量残留瘢痕疙瘩组织面积(用线圈起的面积)。与 缓冲液注射液中的残留人瘢痕疙瘩组织面积相比，CSase-B注射中面积有些缩小，CSase-AC 注射中有约一半的面积缩小，CSase-ABC注射中可见显著的缩小，与图7B的目视结果一致。 图8的中间部分是为了表示弹性纤维的再生程度和透明化的状态而将上部分的分别用圆 圈圈起的部分放大的组织照片。在缓冲液注射、CSase-B注射、CSase-AC注射个体中，可见很多透明化和胶原纤维 的交联(黑箭头)，而在CSase-ABC注射个体中，完全未见透明化和胶原纤维的交联，可见明 确的弹性纤维的再生(白箭头)。与实施例1中的CSase-ABC注射个体的结果相比，组织全 体中未见弹性纤维再生，这可以认为是由于瘢痕疙瘩组织形成正常组织，而开始与裸小鼠 的组织同化。以往已知裸小鼠的皮肤中没有弹性纤维形成。CSase-B注射、CSase-AC注射 个体中未见明确的弹性纤维结构。CSase-B注射个体的中间部分的照片中央部的较浓的结 构不是弹性纤维，而是交联的胶原束(染色为红色)。下部分表示是进一步放大的瘢痕疙瘩 细胞的图像(HE染色)。与正常的人成纤维细胞相比，细胞较大、核也较大，可明显染色，这 是瘢痕疙瘩细胞(箭头)。在缓冲液注射、CSase-B注射、CSase-AC注射中可见很多瘢痕疙 瘩细胞，但在CSase-ABC注射中，瘢痕疙瘩细胞消失(全部为正常成纤维细胞)。3次计数 一个视野中的瘢痕疙瘩细胞数目，计算平均值。以缓冲液例为100时，分别用％表示各自的 相对数。上述结果汇总示于表3中。[表 3]
权利要求
弹性纤维形成促进剂，该弹性纤维形成促进剂含有分解硫酸软骨素A、硫酸软骨素B和硫酸软骨素C的酶。
2.权利要求1所述的弹性纤维形成促进剂，其中，上述酶是来自普通变形菌的软骨素 酶 ABC。
3.瘢痕疙瘩和/或增生性瘢痕的根治治疗药，该根治治疗药含有分解硫酸软骨素A、硫 酸软骨素B和硫酸软骨素C的酶。
4.权利要求3所述的根治治疗药，其特征在于该根治治疗药促进弹性蛋白与原纤蛋 白的缔合。
全文摘要
本发明提供瘢痕疙瘩和/或增生性瘢痕的有效治疗药。具体来说，提供含有来自普通变形菌(proteus vulgaris)的软骨素酶ABC的弹性纤维再生剂、以及含有该再生剂作为有效成分的瘢痕疙瘩和/或增生性瘢痕的治疗药。
文档编号A61K38/51GK101969986SQ200880120686
公开日2011年2月9日 申请日期2008年12月8日 优先权日2007年12月7日
发明者内藤素子, 池田实香, 铃木茂彦 申请人:生化学工业株式会社;铃木茂彦