专利名称：革兰氏阳性细菌用抗菌剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及革兰氏阳性细菌用抗菌剂，其含有基本上不含针对革兰氏阳性细菌的 抗菌活性成分的粒子作为有效成分。
背景技术：
近年来，很多抗生剂被不断地开发，使得如今抱有细菌感染症已经被克服的错觉， 然而，细菌一一掌握了针对多种抗生素的防御机理而幸存，并作为医院内感染的病原菌而 引发重大的事态。耐甲氧西林黄色葡萄球菌(MRSA)以及耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐万古 霉素黄色葡萄球菌(VRSA)、进而多药耐药性铜绿假单胞菌(MDRP)等多数耐药菌对现存的 几乎所有抗生剂有耐性，因而全世界都期待着尽快找到对策。抗生素的耐药机理是针对各抗生素的特异性机制，多药耐药菌是运用其多样构造 而由抗生素的多药联用疗法中幸存。为了应对该问题，开始了采用新抗生素的探索或结 构改变、药物传递方法的改进、从耐药菌的全基因组解析到蛋白质组学技术、多位点测序 (Multi-locus sequence typing)技术或常居菌干扰作用等各种各样的办法的多种研究。 它们的成效还不充分，还需要同时包含多种耐药机理的对策。为了通过药物释放系统(DDS)、缓释来提高药物的效果，药剂微粒化的研究不断发 展，例如使药剂与氰基丙烯酸酯聚合物粒子结合的DDS是公知的(专利文献1、2及非专利 文献1)。但是，在至今为止的任何研究中，目的都是药物的DDS和缓释，对于微粒单体的抗 菌作用完全未知。专利文献1 日本特表平11-503148号公报专利文献2 日本特表2002-504526号公报# 专禾Ij JC ^ 1 =Christine Vauthier et al. , Adv. Drug Deliv. Rev. ,55, 519-548(2003)
发明内容
发明要解决的课题因此，本发明的目的在于，提供超出耐药菌所掌握的多种抗生素耐药机理，可以对 多种多药耐药菌发挥抗菌作用的新手段。解决课题的手段本申请发明人等一直以来对抗菌药的利用丙烯酸系纳米微囊结合的药物传递方 法进行了研究，但此次，基于由该研究获得的技术诀窍(know how)，首次将不结合抗菌药的 粒子单体应用于细菌，结果发现粒子与细菌的细胞壁特异性粘附后的溶菌现象，从而完成 了本发明。S卩，本发明提供革兰氏阳性细菌用抗菌剂，其含有下述粒子作为有效成分，所述粒 子是粘附于革兰氏阳性细菌的细胞壁而不粘附于哺乳动物的细胞膜的、粒径为5μπι以下 的粒子，且基本上不含针对革兰氏阳性细菌的抗菌活性成分。另外，本发明还提供革兰氏阳
4性细菌的抗菌方法，其包括使有效量的粒子与要抗菌的革兰氏阳性细菌接触，所述粒子是 粘附于革兰氏阳性细菌的细胞壁而不粘附于哺乳动物的细胞膜的、粒径为5μπι以下的粒 子，且基本上不含针对革兰氏阳性细菌的抗菌活性成分。进而，本发明还提供粒子用于制造 革兰氏阳性细菌用抗菌剂的用途，所述粒子是粘附于革兰氏阳性细菌的细胞壁而不粘附于 哺乳动物的细胞膜的、粒径为5 μ m以下的粒子，且基本上不含针对革兰氏阳性细菌的抗菌 活性成分。发明效果通过本发明，可以提供利用与公知的抗生素完全不同的机理的新型抗菌手段。作 为不使用抗生素的杀菌剂，已有消毒药，但它们是外用药，由于其毒性而无法进行体内给 药，无法用于感染症治疗。本发明中使用的粒子由于可以使用已确认了对人体的安全性、正 被实际使用的原材料来制备，因此还可以用于感染症治疗。本发明的抗菌剂由于是超越了 细菌的耐药机理的抗菌剂，因此对于以MRSA、VRE为代表的显示多药耐药性的革兰氏阳性 细菌也能够适用，而且还可以避免新的多药耐药菌出现这一抗生素使用中的重大问题。通 过本发明，不仅拓宽了对多药耐药菌感染症的治疗途径，而且创造了抗菌药研发的全新领 域，可以期待在抗菌药研究中产生革命性的局面。
[图1]VSE及VRE菌体的SEM照片。[图2]万古霉素处理后的VRENCTC12201株的SEM照片。[图3]用制造例1中制备的0.01NHC1-Dex70+Glucose粒子处理过的、VRE NCTC12201株的SEM照片(粒子处理1小时后、3小时后及6小时后)。[图4]用制造例1中制备的0.01NHC1-Dex70+Glucose粒子处理过的、VRE NCTC12201株及GTC02000株的SEM照片(粒子处理1小时后)。[图5]用制造例1中制备的0. 01NHC1-Dex70+Glucose粒子处理过的、MRSA JCM8703菌株的SEM照片(粒子处理1小时后、3小时后及6小时后)。[图6]制造例3中制造的各粒子的粒径分布的曲线图。[图7]制造例3中制造的各粒子的ζ-电位分布的曲线图。
具体实施例方式本发明的革兰氏阳性细菌用抗菌剂含有下述粒子作为有效成分，所述粒子是粘附 于革兰氏阳性细菌的细胞壁而不粘附于哺乳动物的细胞膜的粒子，且基本上不含针对革兰 氏阳性细菌的抗菌活性成分。本发明中使用的粒子具有下述特征，即粘附于革兰氏阳性细菌的细胞壁而不粘附 于哺乳动物的细胞膜。如下地进行粒子是否粘附于细胞壁、细胞膜等细胞表面的判断。将 粒子在生理盐水或Mueller Hinton Broth等培养液中悬浊(6 μ g/ml)，使用市售的24孔细 胞培养板(通常，每1孔的容量为3. 29ml、底面培养表面积为1. 91cm2)，在每1孔IO5个 IO6个/Iml程度的革兰氏阳性细菌或哺乳动物细胞数中添加该悬浊液1ml。放置至少1小 时后，用微量移液管向每1孔加入Iml生理盐水，缓缓振荡板2 3次后，吸除上清洗涤液。 进而，将同样的洗涤操作重复2次。用电子显微镜对如此得到的细胞试样进行观察，在细胞表面发现粒子的情况判断为粘附，没有发现的情况判断为不粘附。需要说明的是，通过所述 处理粒子有时会侵入细胞内，但在粘附性评价中不考虑有无侵入细胞内。众所周知，哺乳动 物细胞表面没有细胞壁，而是被细胞膜覆盖，该细胞膜的结构由脂质双分子层构成，这种哺 乳动物细胞的表面结构无论是来源于任何动物种类或组织，基本上都是相同的。因此，对于 用于判断是否粘附于哺乳动物细胞膜的哺乳动物细胞的种类没有特别限定。另外，可以是 从生物体采集的组织细胞块或将其分离而制备得到的细胞，也可以是经株化的培养细胞。 例如，如下述实施例的记载，可以使用人培养细胞株即HeLa细胞或仓鼠CHO细胞等细胞，来 评价对哺乳动物细胞膜的粘附性。以下，本说明书中，有时将不粘附于哺乳动物细胞膜而粘 附于革兰氏阳性细菌细胞壁的该粒子的粘附性称为“特异性粘附”。另外，该粒子是基本上不含针对革兰氏阳性细菌的抗菌活性成分的粒子。所谓“抗 菌活性成分”，是指可以在生物化学上作用于革兰氏阳性细菌的代谢途径或生理机能而阻 止该细菌发育的化学物质成分，具体地，是指能够利用于革兰氏阳性细菌的抗菌中的抗生 素以外的化学物质成分。所谓“基本上不含”，意思是完全不含抗菌活性成分，或者即使含有 也只不过含有对革兰氏阳性细菌(对该抗菌活性成分为敏感性)无法进行抗菌程度的微量 的该抗菌活性成分。“无法进行抗菌程度的微量”的意思是，将每单位体积粒子所含的粒子 中的抗菌活性成分量定义为粒子中的含有浓度，将与该含有浓度相同浓度的抗菌活性成分 不与粒子结合而单独作用于敏感性革兰氏阳性细菌时，无法阻止该敏感性革兰氏阳性细菌 的发育的量。作为本发明中使用的粒子，优选完全不含抗生素等抗菌活性成分。本发明的抗菌剂不是利用抗生素的抗菌活性的物质，而是通过粒子对细胞壁 粘附的作用引起溶菌，阻止细菌发育的物质。虽然粒子的上述特异性粘附性引起溶菌 的详细原理不明，本发明的范围不拘于理论，但考虑如下。即，细胞壁合成基本是形 成UDP-MurNAc-五肽、以及接着与细胞膜的脂肪酸结合后，与GIuNAC结合得到的脂 质-MurNAc (GluNAc)-五肽，该MurNAc与合成中的肽聚糖的GluNAc结合而构建出多枝结构 的细胞壁。该细胞壁合成是在细胞壁的外侧进行的，因此，粒子通过粘附于细菌表面而阻碍 细胞壁合成，导致溶菌。本发明的抗菌剂的抗菌作用受上述粒子的粒径和ζ -电位影响(参照下述实施 例)。本发明中所用的粒子的粒径为5 μ m以下，优选为2 μ m以下，更优选为1 μ m以下。需 要说明的是，粒径的下限没有特别限定，例如在用如下述实施例中所记载的方法通过丙烯 酸酯系单体的聚合来制造丙烯酸酯系聚合物粒子时，粒子的粒径通常为7nm左右以上(图 6)。抗菌剂所含有的粒子全体的平均粒径优选为20nm 500nm，特别优选为20nm 300nm。 另外，ζ-电位表示粒子表面的电荷，因此是粒子的分散性的指标。本发明中使用的粒子粘 附于数百nm 数μ m程度的尺寸的细菌表面而起作用，因此优选具有不发生凝集的程度的 分散性，虽没有特别限定，但ζ-电位优选为_3mV -80mV。粒子尺寸及ζ-电位，如下述实 施例记载那样，通过使用了 He · Ne激光的市售装置(实施机种=Zetasizer Nano, Malvern Inst. UK社制)就可以容易地测定。通过该装置，可以得到如图6及图7所示的粒径分布 及电位分布的曲线图，可以算出平均粒径和电位。需要说明的是，通过该装置测定 平均粒径的原理是，通过由被粒子布朗运动散射的激光的强度变动求出粒径的光子相关法 (动态散射法)算出；另外，电位的测定原理是粒子的电泳。具有上述特异性粘附性的粒子优选为在重复单元中具有下述通式(I)
[化1]
权利要求
革兰氏阳性细菌用抗菌剂，其含有粒子作为有效成分，所述粒子是粘附于革兰氏阳性细菌的细胞壁而不粘附于哺乳动物的细胞膜的、粒径为5μm以下的粒子，且基本上不含针对革兰氏阳性细菌的抗菌活性成分。
2.根据权利要求1所述的抗菌剂，其中，所述粒子的粒径为Iym以下。
3.根据权利要求2所述的抗菌剂，其中，所述粒子的平均粒径为20nm 500nm。
4.根据权利要求3所述的抗菌剂，其中，所述粒子的平均粒径为20nm 300nm。
5.根据权利要求1 4中任一项所述的抗菌剂，其中，所述粒子的ζ-电位 为-3mV -80mV。
6.根据权利要求1 5中任一项所述的抗菌剂，其中，所述粒子为在重复单元中具有下 述通式(I)
7.根据权利要求6所述的抗菌剂，其中，所述通式(I)中，Z为氰基、氨基或亚氨基。
8.根据权利要求6或7所述的抗菌剂，其中，所述通式(I)所表示的结构是下述通式 (II)所表示的结构，
9.根据权利要求8所述的抗菌剂，其中，所述通式(II)中，R为羟基或碳原子数1 10的烷氧基。
10.根据权利要求9所述的抗菌剂，其中，所述通式(II)中，Z为氰基，R为正丁氧基。
11.根据权利要求6 10中任一项所述的抗菌剂，其中，所述聚合物粒子是通过在下述 通式(III)
12.根据权利要求11所述的抗菌剂，其中，所述通式(III)中，Z为氰基、氨基或亚氨 基，R为羟基或碳原子数1 10的烷氧基，X及Y合在一起表示亚甲基。
13.根据权利要求12所述的抗菌剂，其中，所述通式(III)所表示的单体为正丁 基-2-氰基丙烯酸酯。
14.根据权利要求11 13中任一项所述的抗菌剂，其中，所述糖类是选自由葡萄糖、核 糖、果糖、甘露糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖、蔗糖、甘露聚糖及平均分子量70，000以上的葡聚 糖组成的组中的至少1种。
15.根据权利要求14所述的抗菌剂，其中，所述糖类是选自由葡萄糖、核糖、乳糖、海藻 糖及平均分子量70，000以上的葡聚糖组成的组中的至少1种。
16.根据权利要求11 15中任一项所述的抗菌剂，其中，所述聚山梨醇酯是聚氧乙烯 失水山梨醇单月桂酸酯。
17.革兰氏阳性细菌的抗菌方法，其包括使有效量的粒子与要抗菌的革兰氏阳性细菌 接触，所述粒子是粘附于革兰氏阳性细菌的细胞壁而不粘附于哺乳动物的细胞膜的、粒径 为5 μ m以下的粒子，且基本上不含针对革兰氏阳性细菌的抗菌活性成分。
18.粒子用于制造革兰氏阳性细菌用抗菌剂的用途，所述粒子是粘附于革兰氏阳性细 菌的细胞壁而不粘附于哺乳动物的细胞膜的、粒径为5 μ m以下的粒子，且基本上不含针对 革兰氏阳性细菌的抗菌活性成分。
全文摘要
本发明公开了超越细菌的耐药性机制的新型革兰氏阳性细菌用抗菌剂。该抗菌剂含有下述粒子作为有效成分，所述粒子是粘附于革兰氏阳性细菌的细胞壁而不粘附于哺乳动物的细胞膜的、粒径为5μm以下的粒子，且基本上不含针对革兰氏阳性细菌的抗菌活性成分。通过本发明的抗菌剂，还能够对以MRSA、VRE为代表的显示多药耐药性的革兰氏阳性细菌进行抗菌，而且还可以避免新的多药耐药菌出现这一抗生素使用中的重大问题。
文档编号A61P31/04GK101959523SQ20088012762
公开日2011年1月26日 申请日期2008年12月22日 优先权日2007年12月27日
发明者城武升一 申请人:公立大学法人横浜市立大学