专利名称：一种中药活性组群的筛选方法
技术领域：
应用于中药活性组群筛选及提取分离过程。
背景技术：
中药学作为中医学不可分割的组成部分，几千年来，在中医整体观和辨证论治原 则的指导下，为人类的健康事业作出重要贡献。现代医学认为中药是以多途径、多靶点、多 受体形式发挥作用，也决定了药物作用成分的复杂性。相关参考文献如下
[1]汉斯莫利特、阿诺德*固本订著，杨光译.乳液，悬浮液，固本配合技术与应用。 化学工业出版社.北京化学工业出版社，2003年版267。 [2]匡海学主编.新世纪全国高等中医药院校规划教材 中药化学(供中药类专 业用)，北京中国中医药出版社，2003年版，2005年第5次印刷21。 溶剂提取法[2]作为中药传统提取方法之一，与药理学相结合，为活性成分的发 现与分离作出积极贡献；近年，高通量药物筛选技术的发展与应用，大大加快药物活性成分 的筛选速度，发现了一大批活性成分。但我们应看到，天然药物的提取技术在某种意义上 偏离了中医理论的指导和范畴，将中药成分"科学"的肢解为单味成分的简单加和。例如 生脉饮中五羟基糠醛认为是药物发挥作用的新产物，已超出原药成分的范畴；另外实验也 存在将已知成分活性和理化性质作为选择溶媒和提取方法的依据，忽略中药配伍及整体发 挥作用的科学内涵。高通量药物筛选在活性组分的筛选上，取得了长足的发展，但目前受 中药分离纯化技术、资金、技术普及等层面的影响，国内尚需要一段的发展历程。鉴于上述 因素，本专利参照黑箱理论，引入"溶解度参数法"筛选中药或复方药物有效部位群的提取 方法，将中药作为具有科学内涵但尚不知其内涵的统一体加以全面研究。"溶解度参数"是 Hildebrand J H等在20世纪中期提出的概念，它被定义为物质内聚能密度的平方根，是表 征简单液体分子间相互作用强度特征的重要参数。半个多世纪以来，溶解度参数概念得到 不断扩展与修正，以最初的Scatchard-Hildebrand正规溶液理论为依据，Hansen CM建立 了三维溶解度参数体系。1971年，Bag-ley E B等提出以液体的内压替代内聚能密度并建 立了相应的二维溶解度参数体系，在此基础上发展起来的理论使溶解度参数成为研究混合 物体系的重要部分。随着科学技术的不断发展，溶解度参数作为衡量物质之间相容性的重 要参数之一，在高分子及相关领域得到了广泛应用。本文则将溶解度参数发展并引入中药 提取领域，拓展其应用空间与范畴。
发明内容
本发明的目的是提供一种中药活性组群提取分离的实验方法，其特征在于 1)确定待查药物的药理学指标； 2)以溶解度参数梯度分布为依据，选择一组溶媒； 3)将上述待查药物溶入上述溶媒中，分别提取中药活性组份； 4)将上述中药活性组份分别进行药理学试验，获得相应的药理学参数；
5)将溶解度参数对药理学参数进行数据回归，以获得药理学最佳理论值及最佳的 溶解度参数，并以该溶解度参数为依据，获取最佳的溶媒； 6)将上述确定待查药物溶于上述最佳的溶媒中，提取中药活性组份，再进行药理 学评价，以验证该待查药物活性。 以溶媒溶解度参数梯度分布作为溶媒选择手段，所选定的溶媒溶解度参数依据现 有文献资料应尽可能涵盖全程，例如参照文献1确定溶解度参数范围为9. 9 47. 8，选择 较大范围溶解度参数溶媒对中药活性组分进行提取，以保证活性组群筛选的全面性，同时 随着溶剂种类的不断增加，这一溶解度参数范围也必将逐渐扩大。本试验过程选定的溶解 度参数范围为14. 9 47. 8 ;溶解度参数的选择即可为均度或近似均度梯度，也可为非均度 梯度，但最少不得少于5个梯度，以便于线性回归的准确性。 以各溶媒提取物所对应的药理学实验数据为考查指标，根据中医的证或病，可以 选择一个或几个指标进行考查，此实验可参考《中药新药研究指南》药理学、毒理学所确定 考查指标进行考查，但均应以量的形式体现，以定性的形式经权重后赋分所优化的参数不 会特别准确，但可看一般趋势。 以溶解度参数对药理学指标进行回归及理论值优化为数据处理手段，本方法所确 定的线性回归，可以是简单的线性回归，也可是多元的线性回归，处理的软件可以为SPSS、 SAS、Qbasic均匀设计软件，因其数据处理原理基本相同，本实验采用了 Qbasic均匀设计软 件，进行处理。 本法"经试验确证后提取中药活性组群的实验方法"，所确定的理论值必须经所确 定溶媒进行提取，经提取物药理学上述指标考查，并与优化实验组比对确定。另验证组不得 少于3组，便于确定提取工艺的优越性与实验的稳定性。 本法"经试验确证后提取中药活性组群"，应用范围广泛，可用于中药活性组分中 间体质量控制研究；用于中药活性组分组方配伍研究；用于中药活性组分物质基础研究； 用于中药活性组分制备工艺研究；用于中药活性组分药代学研究等，也可直接用于中药制 剂研究，直接产生经济利益。 故此，本实验方法拟解决的技术问题1.本发明拟体现出中医整体观与中药多组 分、多靶点、多途径发挥作用的科学内涵，为一种具有中医特色活性组群的提取分离的方 法，克服现有活性组群筛选、分离的片面性和高成本性，便于普及与应用，在中药组分提取 领域将得到较为广泛的应用。2.引入统计分析手段，避免传统提取工艺条件优化设计的主 观性与片面性，筛选结果更接近真正活性组群。 本发明拟解决技术问题所采用的技术方案中药主要来源于天然药及其加工品， 其中包括的中成药则是中药复方或单方使用的成品制剂。药物所含成分繁杂，药物配伍发 挥作用物质基础不明，作用机理不清。药效产生可能是药物中主流成分，如有机酸、黄酮类、 生物碱、皂苷等的直接作用；也可能是药物中的次要成分，在药物配伍中激发了某些药物反 应而体现出的治疗作用；也可能是药物配伍产生新的化合物发挥作用；也有可能是药物激 发人体受体而发挥的某些生化反应，等等。上述诸多都是一种科学的猜想，有些猜想证明 是正确的，但大家相信，药物发挥作用的机理绝不局限于人们的猜想。如果按照我们猜想 的途径进行研究，可能会产生一定的积极结果，有一定的提示作用，但提示往往不能说明全 部。为此我们设想，无论药物是以何种方式发挥作用，但相信药物的最原始物质基础总是与中药配伍或药材自身组成有关。这些药物成分性质各异，相互间作用复杂，我们为此引入了 "黑箱理论"，对药物整体进行提取筛选研究。 根据"相似相溶原理"，活性组分的提取与溶剂的性质有关，而溶剂与提取物之间 的作用，主要通过溶剂自身的氢键作用、极性作用、范德华力等形式发生，并以参数的形式 体现。上述各参数则以溶解度参数的形式表现出来，为此将此法命名为"溶解度参数法"或 "溶度系数法"。实验中所选定溶媒溶解度参数可通过查表或自己计算而得到，根据不同的 系数确定不同的提取水平，以不同溶解度参数提取物产生的药理活性为指标，进行多元回 归，确定各溶解度参数的最佳值，并以此为依据，选定最佳提取溶媒进行提取，获得活性物 质基础，作为中药发挥作用的部位群应用或进行进一步分析。 本发明的优点本发明克服了参照中药代表性成分性质及药理活性进行提取的束 缚，比较全面的梳理了组分与药效学之间的关系，通过多元回归更逼近了药物活性组群的 最佳提取方式；同时将不同提取物进行深入研究或简单合并，突出了中药多途径、多靶点、 多组分发挥作用的思想与中医的整体观。为此此方法的提出，是一项具有中医特色的提取 方法与手段。为此，突出中医特色，降低实验成本，便于方法普及，为中药活性组分分析提供 科学方法，会产生有益试验结果。方案如图1所示。
图1为中药活性组群的筛选流程图。
具体实施方式
实施例1 单味中药枳壳利胆活性组群筛选 (1)提取溶媒及溶解度参数的确定参照有关文献[1]，溶剂的溶解度参数范围选定 为14. 9 47. 8(4. 1868J/cm3)1/2(未修正)，实验分别选择提取溶媒为正己烷(14. 9) 、二乙 醚(15. 8)、乙酸乙酯(18. 1)、丙酮(20)、2-丁醇(22. 2)、甲醇(29. 6)、水(47. 8)，共7组，分 设7个水平安排实验。 (2)不同溶解度参数溶媒提取物对大鼠胆汁分泌的影响 分别取枳壳药材，粉成细粉(过60目筛)，加十倍量上述溶媒，冷浸24小时，超声 提取40分钟，滤过，并减压浓縮近干，加水及助溶剂溶解，稀释成10g生药/mL混悬溶液，备 用。取大鼠63只，体重283. 54± 32. 18g，随机分成7组，每组9只，分别为实验1 7组，实 验前16h禁食不禁水，实验时大鼠以10%乌拉坦lmL/100g ip麻醉，行胆管插管术后，按试 验设计要求十二指肠给药，(4. 89g生药/kg)给药1次，给药后收集、计算1. 5h时间内胆汁 流量，结果见表l. (3)均匀设计水平的确定及考查结果实验采用U7(76)表，设定溶解度参数组成各 参数为单一因素，分占均匀设计表第1、2、3列，安排实验，以大鼠胆汁排泄量为考查指标， 结果见表l。 表1.利胆作用考查结果
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实验号5d6p6t胆汁排泄量(S±S， n—沖L)
114.90014.91.18±0.38
214.52.95.115.81.30±0.44
315.85.37.218.10.46±0.14
415.510.470200.75±0.09
15.85.714.522.21.25±0.42
615.112.322.329.60.30±0.11
715.616.042.347.80.64±0.17 将上述试验结果代入Qbasic均匀设计软件，进行逐步回归，胆汁排泄量回归方程 为 Y = -22. 9940+4. 1416X「2. 2871X2_0. 1691X2「0. 0091X22+0. 1551XA， R2为0. 9648。 最佳理论值为1. 4981mL，优化结果为A(14. 5000) 、B(0. 0000) 、C(0. 0000)，通过查阅有关文 献[1]初步确定溶解度参数为14. 5的溶媒为正戊烷，分别以此为溶媒进行上述提取，并分 别取280±23大鼠36只进行验证试验，胆乐(0. 324g/kg)为阳性对照进行试验，结果分别 为1.32±0. 45 ;1.29士0. 57 ;1.38士0. 56，阳性对照为1.21±0. 57，结果显示筛选结果利胆 效果较佳，好于对照组，但没有显著性差别(p>0.05).最终确定枳壳的正戊烷提取部分为 利胆的活性组群，并作为中间体，展开中药活性组群物质基础研究。
实施例2 复方活血排石汤镇痛、利胆活性组群筛选
处方组成赤芍30g香附15g枳壳13g (1)提取溶媒及溶解度参数的确定参照有关文献[1]，溶剂的溶解度参数范围选定 为47. 8 15. 3(4. 1868J/cm3)1/2(未修正)，实验按照公比近似为0. 75梯度分别选择溶媒 为正庚烷(15. 3)、二氯甲烷(20. 3)、乙醇(26. 5)、甲酰胺(36. 6)、水(47. 8)，共5组，分设5 个水平安排实验。 (2)不同溶解度参数溶媒提取物的制备按照处方配伍比例分别取赤芍、香附、枳壳 3味，粉成细粉(过60目筛)，加十倍量上述溶媒，冷浸24小时，超声提取40分钟，滤过，并 减压浓縮近干，加水及助溶剂溶解，稀释成10g生药/mL混悬溶液，备用。
(3)对大鼠胆汁分泌的影响取大鼠50只，体重259. 33±43. 32g，随机分成5组，每 组10只，分别为实验1 5组，实验前16h禁食不禁水，实验时大鼠以10%乌拉坦lml/100g ip麻醉，行胆管插管术后，按试验设计要求十二指肠给药，(7. 89g生药/kg)给药l次，给药 后收集、计算1. 5h时间内胆汁流量(mL)，结果见表2. (4)不同剂量配比对小鼠化学致痛的影响取昆明种小鼠50只，早、$各半，体重 18 22g，随机分为5组，每组10只，分别为实验1 5组，按均匀设计表实验安排20m1/ kgig给药，给药45mi后，每只小鼠ipO. 6%醋酸0. lml/10g，观察20min内各组出现的扭体 反应次数。实验采用U7 (76)表，设定溶解度参数为单一因素，并分占均匀设计表第1、2、3列， 安排实验，以小鼠扭体数为考查指标，结果见表2。
表2. U7(76)均匀设计利胆、镇痛作用考察结果
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实验号5d5p8h5t胆汁排泄量(5士S,iFlO,mL)鹏数陶,iFlO,次)
115.30015.31.30±0.4412.91±6.82
218.26.36.120.31.28±0.3817.91±5.82
315.88.819.426.50.46±0.1413.39±4.34
417.226.219.036.60.95±0.0910.20±3.27
515.616.042.347.80.34*0.178.40±4.82 将上述胆汁排泄量结果代入Qbasic均匀设计软件，进行逐步回归，胆汁排泄量 回归方程为Y = 1. 4130-0. 0636X3+0. 0004X32+0. 0012X2X3， Q = 0. 0583， S = 0. 2414， R2为 0. 9633。最佳理论值为1. 4130mL，优化结果为A(15. 3000) 、B(0. 0000) 、C(0. 0000)，通过查 阅有关文献[1]初步确定溶解度参数为15. 3的溶媒为正庚烷。 将上述扭体次数结果代入Qbasic均匀设计软件，进行逐步回归，得回归方程为Y =1. 4102+0. 1494X3+0. 0487X/+0. 0167X2X3， Q = 0. 1046， S = 0. 3235， R2为0. 9990。最佳 理论值为0. 5878次，优化结果为A(15. 3000) 、 B(26. 2000) 、 C(42. 0000)，通过计算，确定溶 解度参数为52. 05，查阅有关文献[1]，水的溶解度参数较大为47. 8，与此接近，故选择水为 溶媒，进行提取。 通过上述实验筛选所确定的溶媒，进行3批验证，结果显示，胆汁排泄、扭体次数
优于上述实验组，统计学检测具有显著差别(P < 0. 05)。 分别将上述提取物合并，干燥，加敷料制粒，装胶囊备用，即得。
权利要求
一种中药活性组群的筛选方法，其特征在于1)确定待查药物的药理学指标；2)以溶解度参数梯度分布为依据，选择一组溶媒；3)将上述待查药物溶入上述溶媒中，分别提取中药活性组份；4)将上述中药活性组份分别进行药理学试验，获得相应的药理学参数；5)将溶解度参数对药理学参数进行数据回归，以获得药理学最佳理论值和最佳的溶解度参数，并以该溶解度参数为依据，获取最佳的溶媒；6)将上述确定待查药物溶于上述最佳的溶媒中，提取中药活性组份，再进行药理学评价，以验证该待查药物活性。
2. 按照权利要求l所述中药活性组群的筛选方法 均度或非均度梯度，且梯度数量^ 5。
3. 按照权利要求1所述中药活性组群的筛选方法 一指标或多个指标。
4. 按照权利要求l所述中药活性组群的筛选方法 性回归，为单元的或多元的。
5. 按照权利要求l所述中药活性组群的筛选方法 或复方。
6. 按照权利要求1所述中药活性组群的筛选方法 对药理学参数进行回归及数据分析软件为SPSS或SAS或Qbasic均匀设计软件。
7. 权利要求1所述中药活性组群的筛选方法，用于经实验确证后提取中药活性组群用 于中药活性组分中间体质量控制研究；用于中药活性组分组方配伍研究；用于中药活性组 分物质基础研究；用于中药活性组分制备工艺研究；用于中药活性组分药代学研究。，其特征在于溶解度参数的选择为 ，其特征在于采用药理学指标是单 ，其特征在于所用的数据回归为线 ，其特征在于所述待查中药是一味 ，其特征在于所述的以溶解度参数
全文摘要
一种中药活性组群的筛选方法，以溶媒溶解度参数梯度分布作为溶媒选择手段，以各溶媒提取物所对应的药理学实验数据为考查指标，以溶解度参数对药理学指标进行回归及理论值优化为数据处理手段，确定溶媒种类并提取，经试验确证后提取中药活性组群的实验方法。可以应用于经实验确证后提取中药活性组群用于中药活性组分中间体质量控制研究；用于中药活性组分组方配伍研究；用于中药活性组分物质基础研究；用于中药活性组分制备工艺研究；用于中药活性组分药代学研究。
文档编号A61K36/00GK101780112SQ200910010230
公开日2010年7月21日 申请日期2009年1月21日 优先权日2009年1月21日
发明者乔敏, 刘晶, 孟丽, 尤献民, 张会宗, 李国信, 项绍杰 申请人:辽宁省中医药研究院