专利名称：：盐酸博安霉素脂质体及其制备方法
技术领域：
：本发明属于药物制剂领域，具体涉及盐酸博安霉素脂质体及其制备方法。
背景技术：
：盐酸博安霉素(boanmycinhydrochloride,BAM)系中国医学科学院医药生物技术研究所开发的国产一类抗癌新药。其化学结构与国外报道的博来霉素A6(bleomycina6)完全一致。实验研究显示，该药具有抗癌谱广、疗效高、毒性低、给药途径多(肌肉或静脉注射、动脉插管)、无明显骨髓抑制等特点。对盐酸博安霉素所进行的I期临床研究结果表明，其主要毒副作用有轻至中度发热、轻度消化道反应、注射局部硬结和肺纤维化等。脂质体(Liposome)最初是由英国学者Bangham和Standish将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现的。磷脂分散在水中自然形成多层囊泡，每层均为脂质的双分子层囊泡中央和各层之间被水相隔开，双分子层厚度约为4纳米。后来，将这种具有类似生物膜结构的双分子层小囊称为脂质体。脂质体可分为多室脂质体和单室脂质体.单室脂质体又分为小单室脂质体和大单室脂质体。Bangham和Standish最初发观的就是多室脂质体，它们较易制备。小单室脂质体为球形，尺寸一般20—50nm为佳；大单室脂质体的尺寸为微米数量级。2003年，国内开发申报的注射用紫杉醇脂质体和注射用两性霉素B脂质体获准上巿，据统计，目前国内开发申报的脂质体药物共有io余个，分别处在临床研究阶段或技术审评阶段。pH梯度法的发明，源于对生理现象的观察。在20世纪70年代，有学者发现有机胺可以以较高的浓度被富集到线粒体的内膜中。推测可能与线粒体的内外pH梯度有关。1985年加拿大的学者发表文章，证明K"的扩散电位可以诱使阿霉素、长春碱等生物碱向大单室脂质体内聚集。pH梯度法的发明，是脂质体领域一个里程碑式的工作，在目前上巿的3个抗生素制剂中，有2个产品使用了pH梯度法载药技术。该方法的操作程序如下首先根据药物的性质选择内相缓冲液和外相缓冲液。如果药物为生物碱，则内相缓冲液应为酸性缓冲液，外相缓冲液的pH值应接近生理pH值。筛选合适的内外相缓冲液的组合是非常重要的，因为它直接决定了穿透磷脂双分子层。确定内外相缓冲液后，下一步就可以制备空白脂质体。将制备的空白脂质体经过进一步处理使其粒度降低到所需要的范围。脂质体粒度的控制也是一个非常重要的问题。最终产品的粒度会显著影响其体内行为，进而影响被包封药物的治疗效果和毒性。最终产品的粒度控制在什么范围，与产品的治疗效果有关，如将脂质体用作药物储库，发挥其缓控释作用，可以将脂质体粒度控制在微米级。通过临床前的药理学和毒理学研究，可以选择出最佳的粒度范围。为了使最终产品的粒度在需要的范围内，必须使用合适的制备工艺和制备设备。如冷冻干燥、乙醇注入、高压挤出和微射流等。药物的装载也是一个非常重要的问题。必须选择合适的制备方法和处方，以便获得较高包封率和载药量。必须根据药物的性质和期望的治疗目的，使用合适的载药手段。目前，国内已有药厂开发出盐酸博安霉素粉针制剂，并在临床中发现它对头颈部鳞癌、食管癌、鼻咽癌、恶性淋巴瘤、乳腺癌、绒癌有一定疗效。同时研究表明，盐酸博安霉素对肝癌细胞的DNA和RNA以及蛋白质合成有很强的抑制作用。临床试验表明其对肝癌的有效率29.4%。基于以上考虑，本发明将盐酸博安霉素制备成脂质体制剂，一方面可以利用脂质体的被动靶向效应，增大其在肝脏部位的聚集；同时可以减小给药剂量，降低药物对人体其它器官的毒副作用。
发明内容本发明的目的在于提供一种盐酸博安霉素脂质体及其制备方法。本发明是通过如下方案实现的本发明选择天然或合成磷脂，釆用高压微射流法直接一步将磷脂和胆固醇制备成脂质体，并采用梯度法装载药物，制备出盐酸博安霉素脂质体制剂，粒径控制在200nm以下，从而实现静脉注射靶向给药目的；同时为了提高脂质体贮存过程中的稳定性，在脂质体溶液中加入适当的支持剂，经冷冻干燥或喷雾千燥，将其制成脂质体冻干粉。本发明的博安霉素脂质体包括盐酸博安霉素、磷脂、胆固醇、柠檬酸、柠檬酸钠、梯度调节剂，其质量百分比分别为0.5-3.0%,3-30%,1-10%，0.5-3%,0.5-3%,1-5%。所说的磷脂选自蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、双硬脂酸卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱中的一种或几种；梯度调节剂选自碳酸钙、无水碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾或氢氧化钠中的一种或几种；每单位制剂剂量优选2-3ml，还可进一步冷冻干燥成脂质体冻千制剂。制成的冻干制剂在使用前分散在生理盐水、葡萄糖注射液或5%甘露醇注射液中。其制备方法如下(c、d可选择)a称取处方量的磷脂、胆固醇分散到适量pH4.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，在30-7(TC条件下搅拌至分散均匀「b将上述溶液加入到高压微射流中，在100-800大气压下，反复操作5-30次，得半透明状溶液；c在上述溶液中加入适量支持剂，进一步釆用下列两种方法制备脂质体冻干粉。l)冷冻干燥法于上述脂质体溶液中加入支持剂(如蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇等)，进行冷冻干燥，即得。2)喷雾干燥法于上述脂质体溶液中加入支持剂(如蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇等)，其用量为10-30%,进行喷雾干燥，即得。d将脂质体冻干粉以注射用2-3ml生理盐水、葡萄糖注射液或5%甘露醇注射液重新水化，能够分散成，粒度形态与原液无显著差别。并使用pH调节剂(碳酸钙、无水碳酸钠、碳酸氢钠或氢氧化钠中的一种或几种)调节溶液pH值至8.0-11.0;e在上述溶液中加入处方量的盐酸博安霉素，置于59-6rC水洛中保温60min即得。上述方法中每次配制的溶液优选经微孔滤膜过滤，微孔滤膜规格优选0.2nm。包封率测定取脂质体溶液5ml，使用超滤杯分离出游离药物溶液，测定其中药物含量，并根据下面的公式计算包封率EN(%)=(l-M游离/M总)*100%其中EN代表包封率；M、M《分别代表游离盐酸博安霉素质量和脂质体溶液中盐酸博安霉素总质量。本发明的博安霉素脂质体制剂质量稳定，粒径在200nm以下者不小于90%，包封率在60°/。以上。所述的脂质体可以经静脉、肌肉等途径给药。由于脂质体的被动靶向性，同巿售的粉针剂相比较，剂量降低，因此生产成本降低，尤其是在制成冻干制剂时，同样的剂量每单位制剂只需灌注2-3ml，冻干成本降低，生产过程简单，临床使用更方便，符合临床使用习惯，且制备的脂质体包封率高并能平稳血浆浓度，降低毒副作用。具体实施例实施例l:盐酸博安霉素脂质体制剂的制备盐酸博安霉素4.0g蛋黄卵磷脂24.2g胆固醇8.2g维生素EO.lg杼檬酸4.5g柠檬酸钠4.8g氢氧化钠8.5g其余为注射用水_共細g制备工艺称取处方量的磷脂、胆固醇分散到适量pri4.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，在3(TC条件下搅拌至分散均匀；将上述溶液加入到高压微射流中,在200大气压下，反复操作10次，得半透明状溶液；取2ml脂质体溶液,并使用碳酸钙溶液调节溶液pH值至9.0;在上述溶液中加入4.0g的盐酸博安霉素，置于59-6rC水浴中保温60min即得另取博安霉素脂质体溶液lml，加入75y。乙醇2ml，震荡后用生理盐水定容。分别取上述样品各20^tl，测定包封率。结果包封率70.5%。实施例2:盐酸博安霉素脂质体冻干制剂的制备盐酸博安霉素8.3g大豆卵磷脂120.2g胆固醇40.5g维生素E0.2g柠檬酸12.5g柠檬酸钠12.8g乳糖160.6g碳酸氢钠24.2g其佘为注射用水_制备工艺称取处方量的磷脂、胆固醇分散到适量pH4.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，在5(TC条件下搅拌至分散均勻；将上述溶液加入到高压微射流中，在400大气压下，反复操作25次，得半透明状溶液；在2ml上述溶液中加入乳糖，冷冻千燥，即得白色冻干粉末。将脂质体冻干粉以注射用2ml生理盐水重新水化，并使用碳酸钙溶液调节溶液pH值至10.0;在上述溶液中加入8.3g的盐酸博安霉素，置于59-61。C水浴中保温60min即得另取博安霉素脂质体溶液lml,加入75%乙醇2ml，震荡后用生理盐水定容。分别取上述样品各20pl，测定包封率。结果包封率73.8%。实施例3:盐酸博安霉素脂质体冻干制剂的制备盐酸博安霉素24.6g二硬脂酰磷脂酰胆碱240.2g胆固醇80.2g维生素E0.2g海藻糖120.6g乳糖120.5g柠檬酸24.2g柠檬酸钠24.1g无水碳酸钠40.8g其佘为注射用水_制备工艺称取处方量的磷脂、胆固醇分散到适量pH4.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，在70。C条件下搅拌至分散均匀；将上述溶液加入到高压微射流中，在800大气压下，反复操作30次，得半透明状溶液；在2ml上述溶液中共訓g共800g加入乳糖和海藻糖，喷雾干燥，即得白色冻干粉末。将脂质体冻干粉以注射用2ml生理盐水重新水化，并使用碳酸锦溶液调节溶液pH值至11.0;在上述溶液中加入24.6g购盐酸博安霉素，置于59-61。C水浴中保温60min即得另取博安霉素脂质体溶液lml,加入75。/。乙醇2ml，震荡后用生理盐水定容。另取博安霉素脂质体溶液lml,加入75。/。乙醇2ml，震荡后用生理盐水定容。分别取上述样品各20]Li1,测定包封率。结果包封率64.6%。实施例4:盐酸博安霉素脂质体制剂的制备盐酸博安霉素12.3g二掠榈酰磷脂酰胆碱144.0g胆固醇48.8g维生素E0.24g柠檬酸14.1g柠檬酸钠16.5g无水碳酸钠32.0g其余为注射用/K_共800g制备工艺称取处方量的磷脂、胆固醇分散到适量pH4.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，在68。C条件下搅拌至分散均匀；将上述溶液加入到高压微射流中，在600大气压下，反复操作25次，得半透明状溶液；在2ml上述溶液中加入蔗糖和甘露醇，冷冻干燥，即得白色冻干粉末。将脂质体冻干粉以注射用2ml生理盐水重新水化，并使用碳酸钙溶液调节溶液pH值至9.0;在上述溶液中加入12.3g的盐酸博安霉素，置于59-61。C水洛中保温60min即得另取博安霉素脂质体溶液lml，加入75M乙醇2ml，震荡后用生理盐水定容。另取博安霉素脂质体溶液lml，加入75。/。乙醇2m1,震荡后用生理盐水定容。分别取上述样品各2(^1,测定包封率。结果包封率75.5%。实施例5:体内药动学和组织分布研究选择健康的体重在1822g小鼠96只(雌雄各半)，随即分成6组，前3组尾注射盐酸博安霉素粉针，后3组尾静脉注射盐酸博安霉素脂质尾静脉注射给药于给药后O,1，2,5,10，15,20,25,30，40,50,60,120,240,480min取血，心，肝，脾，肺，肾，将血液置肝素试管中，离心10min(4000r.p.m),分离血浆置试管中，与其余各组织于-2(TC冰箱中避光冷冻待测。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表l、3组受试动物尾静脉注射盐酸博安霉素粉针、脂质体后药动学参数按照公式靶向指数Te-AUCo，(靶向)/ZAUC。—①(非靶向)计算盐酸博安霉素分针和脂质体对小鼠心肝脾肺肾各器官的靶向指数见下表。(其中AUCo—^釆用梯形法计算)靶向指数粉针AUC0—oo脂质体AUCo一oo粉针脂质体心8.4319.450.1780.037肝16.17378.10.4072.182脾5.2517.260.1040.032肺12.5343.130.2890.085.肾13.4893.410.3180.325表2、靶向指数的计算盐酸博安霉素水溶性极好，使用常规方法载药方法很难获得较高的药物包封率，由于其结构与已上巿的阿霉素类似，所以我们采用pH梯度法载药并获得了较高的包封率(75%);获得如下药物动力学参数。粉针制剂t/2=0.28±0.05hr;AUC0.t=360.57±120.14(imol.min.L-l;AUCo.^6.11士1.97^imol.hr'L-l;MRT=0.50±0.17hr;CL=4.71±0,72L'hr".kg"。脂质体制剂t1/2=2.27±0.01hr;AUC0.t=931.58±201.24jimol.min.L-1;AUC0.oo=17.38±3.46pmol'hrL-1;MRT=1.70士0.26hr;CL=1.58±0.35L'hr"'kg—';将盐酸博安霉素制成脂质体制剂后，由于其粒径在100-150nm之间，主要被体内网状内皮系统吞噬，在肝脏和脾脏中粉针和脂质体制剂在尾静脉注射40min后，血药浓度趋于平稳，波动较小；以靶向指数为衡量指标将药物制成脂质体其肝靶向指数由0.41增至2.18，肝靶向指数大于1说明盐酸博安霉素脂质体具有明显的肝靶向型，同时其他各组织的靶向指数不同程度下降，减小了对其他各组织的副作用。权利要求1、盐酸博安霉素脂质体，其特征在于包括盐酸博安霉素、磷脂、胆固醇、柠檬酸、柠檬酸钠、梯度调节剂、id="icf0001"file="A2009100108280002C1.tif"wi="1"he="2"top="39"left="116"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>其质量百分比分别为0.5-3.0％，3-30％，1-10％，0.5-3％，0.5-3％，1-5％。2、根据权利要求l所述的盐酸博安霉素脂质体，其特征在于所说的磷脂选自蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、双硬脂酸卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱中的一种或几种；梯度调节剂选自碳酸钙、无水碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾或氢氧化钠中的一种或几种。3、根据权利要求l所述的盐酸博安霉素脂质体，其特征在于使用高压微射流制备空白脂质体，并釆用pH梯度法载入盐酸博安霉素。4、一种如权利要求l所述的盐酸博安霉素脂质体的制备方法，其特征在于其制备步骤如下a称取处方量的磷脂、胆固醇分散到适量pH4.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，在30-7(TC条件下搅拌至分散均勻；b将上述溶液加入到高压微射流中，在100-800大气压下，反复操作5-30次，得半透明状溶液；c在上述溶液中加入处方量的盐酸博安霉素，置于60。C水浴中保温60min即得。5、根据权利要求4所述的盐酸博安霉素脂质体的制备方法，其特征在于步骤c中水洛温度是60。C,配制的溶液均经微孔滤膜过滤。6、根据权利要求l所述的盐酸博安霉素脂质体，其特征在于所述的盐酸博安霉素脂质体可以加入支持剂，进一步制备成盐酸博安霉素脂质体冻干粉。7、根据权利要求6所述的盐酸博安霉素脂质体，其特征在于釆用冷冻干燥法或喷雾干燥法制成盐酸博安霉素脂质体冻干制剂。8、根据权利要求6所述的盐酸博安霉素脂质体，其特征在于所说的支持剂为蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇中的一种或两种，其用量为10-30%。9、根据权利要求6所述的盐酸博安霉素脂质体，其特征在于所述的脂质体冻干制剂每单位制剂的剂量为2-3ml。10、根据权利要求9所述的盐酸博安霉素脂质体其特征在于所述的脂质体冻干制剂以注射用2-3ml生理盐水、葡萄糖注射液或5%甘露醇注射液重新水化，能够分散，粒度形态与原液无显著差别。全文摘要本发明涉及药物制剂领域，具体涉及盐酸博安霉素脂质体及其制备方法，包括盐酸博安霉素、磷脂、胆固醇、柠檬酸、柠檬酸钠、梯度调节剂，其质量百分比分别为0.5-3.0％，3-30％，1-10％，0.5-3％，0.5-3％，1-5％。所说的磷脂为卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱等。本发明采用PH梯度法制备。本发明与现有技术相比，可以降低药物用量，减少对人体的毒副作用，降低生产成本，对某些特定器官具有靶向性等优点。本发明还可以制成注射液或加入支持剂，进一步制备成盐酸博安霉素脂质体冻干粉。文档编号A61K47/24GK101513390SQ200910010828公开日2009年8月26日申请日期2009年3月24日优先权日2009年3月24日发明者宇刘,亮方,李铁福,鑫金申请人:沈阳药科大学