一种对上皮细胞间通透性无影响的靶向Claudin-4显像剂的制作方法

专利名称：一种对上皮细胞间通透性无影响的靶向Claudin-4显像剂的制作方法
技术领域：
本发明属医学影像技术领域，尤其涉及一种适于正电子发射计算机断层扫描的显像 剂即一种对上皮细胞间通透性无影响的耙向Claudin-4显像剂，及其制备方法。
背景技术：
正电子发射计算机断层扫描(Positron Emission Computed Tomography, PET)是一
种较先进的医学影像技术，且PET技术是目前唯一的用解剖形态方式进行功能、代谢和 受体显像的技术，具有无创伤性的特点，是目前临床上用以诊断和指导治疗肿瘤最佳手
段之一。
目前用于肿瘤PET检测的显像剂种类包括肿瘤血流量显像剂(如150水)、肿瘤代 谢显像剂(如糖代谢显像剂18FDG;氨基酸代谢显像剂11C-蛋氨酸；磷脂代谢显像 剂llC-choline胆碱，18F-胆碱；核酸代谢显像剂18FLT胸腺嘧啶)、受体显像剂(如 18F-雌二醇)、乏氧显像剂(如18F-硝基咪唑)、抗体和多肽显像剂(如F-18标记的RGD)、 骨显像剂(如简单F-18离子)、细胞凋亡显像剂(如llC-A皿exinV)以及基因显像剂(如 18F标记的5—F尿嘧啶)。其中以代谢类显像剂应用最为广泛，如18FDG占PET肿瘤检测显 像剂临床应用的951然而上述显像剂均不是基于分子水平的细胞组织结构改变而定位 的，此，难以反映肿瘤的生物学行为(如肿瘤的的分化、侵袭与转移潜能)及评估预 后。这些指标是肿瘤临床诊断与治疗的重要依据。
细胞紧密连接(tight junction, TJ)是建立与维持上皮细胞正常功能的结构基础。 紧密连接作为上皮细胞连接的关键组分，起着维持上皮细胞的极性、选择性的物质通透 调节等重要生理作用。而上皮性肿瘤的一个重要特征即是细胞极性的消失、物质通透调 节的改变以及基底膜的降解与破坏。这种结构性的改变在肿瘤发生与发展的细胞分子生 物学层面上发挥了重要的作用，例如，可解除对表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)及其类似活性分子与EGFR结合的限制作用，致使EGFR异常过度激活；改变上 皮细胞基底膜的代谢，以及细胞的分化等重要的肿瘤生物学行为。这些改变在肿瘤的生 物学功能上可表现为肿瘤的生长与增殖能力的增强，并且Claudin-4在肿瘤发生过程中 的异常过表达可促进基质金属蛋白酶(MMP)的活性，破坏基底膜，破坏正常组织及其 周围解剖结构(微环境)增强肿瘤的浸润与转移。研究已证实肺上皮细胞由于紧密连接 破坏造成的细胞间通透性改变，可导致的肺癌的发生。
Claudin是细胞间紧密连接(tightjunction)的重要组成分子，Claudin分子的分布与 表达可反映出TJ的结构与功能改变。Claudin-4作为Claudin家族的成员之一，主要分 布在肺、乳腺、卵巢、胰腺以及大肠等组织器官，并在这些组织器官的癌变细胞中相应 表达。细胞紧密连接在肿瘤发生发展过程中的功能的异常，可通过Claudin-4的分布与 表达而得以显示。近年来，人们发现梭状芽胞杆菌属中的产气荚膜杆菌肠毒素 (Clostridium perfringens enteroxin， Cpe)是Claudin-4的配体。而Cpe羧基端的30个 氨基酸残基组成的多肽序列虽失去Cpe的毒性，却仍保持以Claudin-4为受体并与其特 异性结合的特性，即使此序列的氨基酸残基减少到16个(氨基端减少到12个，羧基端 减少到2个)，仍可特异性地与Claudin-4结合，且对上皮细胞间通透性无影响。这一特性为肿瘤的功能影像学诊断以及放疗靶区的构建和相应的诊断试剂开发提供了条件。
近年来随着对肿瘤诊断技术进步的要求，如正电子发射计算机断层显像，功能影像 学检测已成为当代肿瘤影像学诊断的研究方向，而功能显像剂的研发更成为肿瘤功能影 像学诊断的关键与限制因素。
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种适于正电子发射计算机断层 扫描的显像剂即一种对上皮细胞间通透性无影响的耙向Claudin-4显像剂，及其制备方 法。
本发明所述的对上皮细胞间通透性无影响的耙向Claudin-4显像剂，为18F标记的 由16个氨基酸残基组成的多肽，其特征在于所述18F标记的多肽是如下通式的化合物，
其中式中多肽是指H-Ala-Asn-Ser-Ser-Tyr-Ser-Gly-Asn-Tyr-Pro-Tyr-Ser-Ile-Leu-Phe-Gln-OH所示的氨基酸序列；
式中，Ala:丙氨酸；Asn:天冬酰胺；Ser:丝氨酸；Tyr:酪氨酸；Gly:甘氨酸；
Pro:脯氨酸；He:异亮氨酸；Leu:亮氨酸；Phe:苯丙氨酸；Gin:谷氨酰胺。
上述式中的氨基酸序列多肽具有Claudin-4的配体功能，可与Claudin-4特异性结合。 上述18F标记部分由ISF标记化合物W-琥珀酰亚胺-4-["F]氟苯甲酸酯 (7V-succinimidyl4-[18F]fluorobenzoate， 18F-SFB)与式中多肽反应生成，1SF标记化合物 的化学结构式如下式所示，
本发明所述适于正电子发射计算机断层扫描的显像剂即对上皮细胞间通透性无影 响的靶向Claudin-4显像剂的制备方法 1、多肽的合成
本发明采用固相Fmoc保护策略进行多肽合成。步骤为先将2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂放入反应管中，加入DMF溶剂进行树脂溶涨。通过縮合试剂DIEA，将a-氨 基经Fmoc保护的第一个氨基酸Fmoc-L-Gln-OH接到树脂上。在脱保护试剂——哌啶的 作用下，脱去Fmoc保护基团。茚三酮检测脱保护作用，深蓝色为阳性反应。经DMF 与甲醇洗涤后，进行縮合反应。可采用两种方法a)保护氨基酸三倍过量，HBTU縮合
发明内容试剂三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入NMM十倍过量.反应 30mia。 b)保护氨基酸三倍过量，HOBt三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应 管，立刻加入DIC三倍过量.反应30min.。再经DMF与甲醇洗涤。重复上述哌啶脱保 护至DMF与甲醇再洗漆的操作步骤，从右到左依次连接结构式序列中的氨基酸。在最 后一个氨基酸连接后，并用DMF、甲醇及DCM洗涤树脂。用10ml/g (树脂胶量)，TFE 80%; DCM20%，从树脂上切割全保护肽。切割时间120分钟。将切割下来的全保护肽 段脱保护用乙醚洗六次，然后常温挥干。将溶液用氮气尽量吹干，用HPLC纯化多肽， 并将纯化后的溶液冻干。通过MS的分子量鉴定，和HPLC分析的纯度鉴定后，将白色 粉末状的多肽，密封包装，-20度保存，备用。
2、合成4-甲酸基-N，N,N-三甲基胺苯甲醛三氟甲基磺酸盐(4-formyl-N,N,N-trimethyl
用4-二甲氨基苯甲酸与二氯甲烷及三氟代甲磺酸甲酯反应过夜。再用二乙醚与反应 浓缩液强力搅拌及洗涤。最后用二氯甲烷与产物一起研碎来进行固形产物的进一步纯 化。
3、 18F-SFB的生成
用GE Medical System PETtrace回旋加速器和碳酸钾(30 u 1, 1 M in water)、重氧水 (H2180)、碳酸钾(30 u 1， 1 M in water)和Kryptofix 2.2.2 (120 P 1, 0.5 M in acetonitrile)产生 18氟核素(["F]fluoride )，并用乙腈(acetonitrile)通过共沸蒸发(azeotropic evaporation)去除
水。由4-甲酸基-N,N,N-三甲基胺苯甲醛三氟甲基磺酸盐中的三甲基季铵基团 (trimethylammonium group)与已生成的18氟核素([18F]fluoride )进行亲核取代反应产
生4-氟苯甲醛(4-[18F]fluorobenzaldehyde )。通过碱性高锰酸盐的氧化生成中间产物
4-[18巧氟苯甲酸(4-[18F]fluorobenzoic acid)。再经与N， N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯 (N，N-disuccinimidyl carbonate)作用将4-[，]氟苯甲酸转化为iV-琥珀酰亚胺-4-["F]氟
苯甲酸酯(W-succinimidyl 4-[lsF]fluorobenzoate， l8F-SFB)。
4、 'SF标记多肽的生成
将[，]-SFB/CH3CN (乙腈)溶液加入多肽水溶液(l mg/ml)及硼酸盐缓冲液(0.5 M, pH 7.5)，室温下放置50分钟。反应用盐酸(l M)终止。反应混合物用TRACERlab FXC HPLC unit and reversephase HPLC (Waters Spherisorb ODS2; 5 H m; 4.6x250 mm)按4步 梯度纯化H20:CH3CN:TFA, 80:20:0.1 (v/v/v) 5分钟，75:25:0.1 5分钟，70:30:0.1 5分 沐最后65:35:0.1 5分钟。流速1 ml/min。将溶液用氮气尽量吹干。
5、 用脱保护液TFA94.5。/。；水2%; EDT2.5%; TIS 1°/。脱去多肽侧链保护基团。用乙醚 洗六次，将溶液用氮气尽量吹干，用HPLC纯化多肽，得适于正电子发射计算机断层扫 描的显像剂即以Claudin-4为受体的18氟(1SF)标记多肽——对上皮细胞间通透性无影 响的靶向Claudin-4显像剂，备用。
上述显像剂的制备方法以反应式形式表示如下<formula>formula see original document page 5</formula>本发明方法制得的以Claudin-4为靶向分子的功能分子影像显像剂不仅可反映肿瘤 细胞自身的生物学功能状态，更能够反映出肿瘤组织的病理结构的功能性改变。
Claudin-4受体I8F标记多肽正电子发射计算机断层显像剂的用途是通过正电子发射 计算机断层显像(positron emission tomography, PET)检测肿瘤(如肺癌、乳腺癌、卵 巢癌、胰腺癌以及大肠癌等)组织的Claudin-4分布与表达，从而对检测肿瘤进行功能 影响学诊断。
本发明的正电子发射计算机断层扫描显像剂即对上皮细胞间通透性无影响的耙向 Claudin-4显像剂是基于Cpe设计的16个氨基酸残基的核素(18氟)标记多肽，其以 Claudin-4为受体并可与其特异性地结合，通过PET实现对肿瘤细胞极性的改变、基底 膜的降解与破坏、肿瘤病变与累及范围以及分化程度等临床病理学指标的检测，为肿瘤 的功能影响学诊断以及放疗靶区的构建提供诊断依据。除上述功能外，本发明所涉及的 多肽显像剂因其肽链的縮短，而具有不影响细胞间的通透性、增加其对基底膜的透过性 以及减少抗原性等重要生物学特性。这些特性使得该显像剂可在肿瘤组织微环境(如血 运、氧合、生物活性分子分布、酸碱度、细胞凋亡体清除等等)不改变的情况下，对肿 瘤病变进行检测，同时降低重复使用可能诱导的阻断抗体干扰。总之，本发明的有益效 果是弥补了既有显像剂在反映肿瘤的生物学行为方面的不足，作为新的功能显像剂能 够为肿瘤临床提供更重要的诊断与治疗依据，如肿瘤的的分化、侵袭与转移潜能以及预 后的评估。
具体实施例方式
实施例1 1、多肽的合成 合成原料及相关试剂
1) 保护氨基酸原料
Fmoc-L-Ala-OH， Fmoc-L-Asn(Trt)-OH, Fmoc-L隱Ser (tBu)-OH， Fmoc-L-Tyr (tBu)-OH， Fmoc-L-Gly-OH, Fmoc-L-Pro-OH， Fmoc-L-Ile-OH， Fmoc-L-Leu-OH ， Fmoc陽L-Phe隱OH，
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH(苏州天马医药集团精细化学品有限公司)，其中縮写表示Fmoc: 9-
芴基甲氧羰基；BOC:叔丁氧羰基；Trt:三苯甲基；tBU:叔丁基。
2) 縮合试剂
HBTU (苯并三氮唑-N,N，N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，苏州天马医药集团精细化学品有 限公司)，HOBT(l-羟基苯并三唑，苏州天马医药集团精细化学品有限公司)，D正A(二 异丙基乙胺，国药集团上海化学试剂公司)，NMM(N-甲基吗啉，苏州天马医药集团精 细化学品有限公司)，DIC(二异丙基碳二亚胺，苏州天马医药集团精细化学品有限公司)
3) 溶剂
DMF (二甲基甲酰胺，Dikma)， DCM (二氯甲烷，Dikma)， ACN (乙腈，Fisher)
4) 树脂
2-ChlorotrityI Chloride Resin (天津市南开合成科技有限公司)(2-氯三苯甲基氯树脂)
5) 脱保护试剂
哌啶(国药集团上海化学试剂公司)
6) 切割试剂TFA (三氟乙酸J.T.Baker)， TIS (三异丙基硅烷，ALDRICH)， EDT (乙二硫醇， ALDRICH) ， TFE (三氟代乙醇，ALDRICH)
7) 氮气(上海比欧气体工业公司)
8) 无水乙醚(上海试一化学试剂有限公司)
9) 精密电子天平(北京赛多利斯天平有限公司) 仪器设备
1) SYMPHONY型12通道多肽合成仪(型号SYMPHONY,软件Version.201厂家 Protein Technologies.Inc)
2) SHIMADZU高效液相色谱仪(型号制备型，分析型，软件Class-VP. Sevial System, 厂商SHIMADZU)
3) LABCONCO冻干机(型号Freezone. Plus. 6，厂商LABCONCO，
4) 离心机(上海安亭科学仪器厂型号TDL-40B)
合成过程
1) 树脂溶涨
将2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂放入反应管中，力B DMF麥/i(15ml/g)，振荡 30min.
2) 接第一个氨基酸
通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Gly-OH氨基酸，再加入10倍 摩尔过量的DIEA —^^^f,iZ，最后加入DMF溶解，振荡30min。
3) 脱保护
去掉DMF，力n20。/。哌啶脱保护试剂DMF溶液(15ml/g)， 5min，去掉再加20%哌 啶DMF溶液(15ml/g)， 15min.
4) 检测
抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN(硫氰酸钾)， 苯酚溶液各一滴，105"C — 11(TC加热5min,变深蓝色为阳性反应。
5) 洗
DMF(10m/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次
6) 缩合
方法a:保护氨基酸三倍过量，HBTU^^^"^B倍过量，均用尽量少DMF溶解， 加入反应管，立刻加入NMM十倍过量.反应30min.
方法b:保护氨基酸三倍过量，HOBt三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反 应管，立刻加入DIC(二异丙基碳二亚胺)三倍过量.反应30min.
7) 洗
DMF(10ml/g)—次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次
8) 重复二至六步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸。
9) 最后一个氨基酸连接后，按照下列方法洗树脂。
DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次， 抽干10min。
10) 从树脂上切割多肽
从树脂上切割全保护肽段方法10ml/g (树脂胶量)，TFE (trifluoroethanaol，三氟乙醇)80%; DCM20%,切割时间120分钟，得到侧链保护的全保护肽段。
11) 吹干洗涤
将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干，
12) 用HPLC纯化多肽
将粗肽用纯水或者加少量乙腈溶解，按照下列条件纯化
泵A : 0. 1%三氟乙酸水溶液
泵B : 0. 1%三氟乙酸乙腈溶液
流速1.0ml/min
进样体积30til
检测波长220咖
梯度 吋间 A B
05.00 90% 10%
30.00 20% 80%
30.10 终止
<检测器A〉
柱子Venusi MRC-ODS C184. 5X250mm
13) 最后将纯化后的溶液冻干，即得到成品。
15) 鉴定
分别取少量的成品多肽，做MS的分子量鉴定，和HPLC分析的纯度鉴定。
16) 将白色粉末状的多肽，密封包装，-20度保存，备用。
2、合成4-甲酸基-N, N, N-三甲基胺苯甲醛三氟甲基磺酸盐
1 )取一个100-ml带有橡胶隔膜的圆底烧瓶，放入一枚磁力搅拌棒(25.4 mm长X7.9 mm
直径)。插入一个氩气进气口和一个通气口(一次性注射针头)。打开磁力搅拌器。
2) 随着氩气流的开通，用热风枪加热烧瓶3分钟。使烧瓶温度达到室温。
3) 把氩气流量减至最小。
4) 称取0.75g(5.0mmol)的4-二甲氨基苯甲醛加入烧瓶，重新用带有橡胶隔膜、氩气进 气口和通气口一次性注射针头的盖好烧瓶。
5) 用50ml配有20号皮下注射针头的玻璃注射器，分两次将总量80ml二氯甲烷移入烧瓶。
6) 用1 m配有一次性注射针头的聚丙烯注射器，滴加0.61 ml三氟代甲磺酸甲酯至步骤5
强力搅拌的溶液。
7) 移去氩气进气口和通气口，用石蜡封口膜将烧瓶口和橡胶隔膜包缠避免湿气进入。 在室温下(20 。C)搅拌橙黄色反映混合物过夜。
8) 用磁力搅拌棒取回器将磁力搅拌棒移去，用旋转蒸发器在环境温度(20 。C)下将溶液 浓缩至约20-30 ml。
9) 将上述浓缩的溶液用巴斯德吸管逐渐加入250-ml在冰浴中冷却的、装有200 ml二乙
醚并且强力搅拌的锥形烧瓶。
10) 用一个玻璃质漏斗过滤固形物，并用二乙醚对固形物进行三次洗涤，每次用二乙醚 50 ml并用一个真空泵干燥(d mm Hg)。
11) 产物的进一歩纯化可通过将产物与二氯甲烷一起研碎来实现。具体步骤用放入一个小磁力搅拌棒(8mm长x 1.5 mm直径)的1打兰(1-dram )反应瓶取100 mg固形
物，加入2ml二氯甲烷。搅拌此混合物5分钟，使固形物沉下。弃上清，再重复此过程 两次。用缓和的氩气流蒸发固形物中残留的二氯甲烷，最后用真空泵(<1 mm Hg)干燥
固形物。
3、 18F-SFB的生成
1) 在通风良好活性炭过滤罩的环境下加热油浴至100°(:。
2) 用5ml反应瓶秤取1-2mg4-甲酸基-N，N，N-三甲基胺苯甲醛三氟甲基磺酸盐，盖以密封盖。
3) 用10ml水和10ml DMSO-水混合液(1: 9， vol/vol)活化C18 S印-Pak固相萃取柱
(色谱柱)。
步骤是将C18Sep-Pak安装于10-ml注射器，注射器针筒注入10ml水，用针栓将水推过 柱子。重复此步骤用DMSO-水混合液过柱。
4) 用10ml二氯甲垸过柱活化S印-Pak硅柱。
5) 准备一支2.5cm长、狭窄处填塞玻璃绒的3-A。分子筛。在步骤21之前用1ml醋酸乙酯冲洗。
6) 将50mg高锰酸钾溶于1 ml (1 N)的氢氧化钠制备5。X) (wt/vol)高锰酸钾溶液。
7) 用干燥的乙腈中配制0.1 M的"f 二琥珀酰亚胺基碳酸酯和吡啶溶液，并在氩气 环境下储存至使用。
制备18氟核素
8) 用GE Medical System PETtrace回旋加速器和碳酸钾(30 n 1， 1 M in water)、重氧水 (H2180)禾Q Kryptofix 2.2.2 (120 u 1, 0.5 M in acetonitrile)产生18氟核素(。8F〗fluoride )，并 用乙腈(acetonitrile)通过共沸蒸发(azeotropic evaporation)去除水。 按以下歩骤准备Kryptofix 222和碳酸钾溶液用1-dram样品瓶制备10 mg ml"的 Kryptofix 222乙腈溶液；用0.5-dram样品瓶制备1 mg/5 ml的碳酸钾水溶液；用具有顶 盖隔膜的5-ml反应瓶将1 ml Kryptofix 222溶液和5 ml碳酸钾溶液混合。
9) 用1-ml配有针头的一次性注射器将含有所需「F]核素剂量的["0]水转移至上述 Kryptofix 222和碳酸钾混合溶液。
10) 通过反应瓶隔膜插入一个氩/氮进气管和排气管(一次性注射针头)，将该反应瓶浸于 油浴(步骤1所述)。通过混合物上面的缓和氩/氮气流蒸发溶剂。
11) 一经溶剂蒸发，立即用带有一次性针头的1-ml注射器加入1 ml乙腈。再次挥发溶剂， 此歩骤重复两次。
合成4-[18门氟苯甲醛
12) 增加油浴温度至120-140。C。
13) 用带有一次性针头的1-m胜射器加入0.1 mlDMSO至反应瓶，温和混旋。用另一支 带有一次性针头的1-ml注射器抽出溶于DMSO的「F]氟化物溶液，并再次重复此过程。
14) 在120-140。C的油浴中加热反应混合物5-8分钟。在冰浴中冷却反应瓶3分钟。
15) 力B5 ml水至反应混合物并将稀释的反应混合液移至装好已活化的C18 Sep-Pak柱子 的注射器针筒。将反应混合物推过C18Sep-Pak柱，收集洗提液于一次性试管。移去 Sep-Pak柱子，分离针筒和针闩。另用5ml水冲洗反应瓶，将洗出液移入该装好C18 Sep-Pak柱子的注射器针筒，将洗出液推过Sep-Pak柱子。没有反应的氟化物不被滞留在S印-Pak柱子，被洗脱于洗出液。用氩/氮气灌流1-2分钟干燥C18 S印-Pak柱。
16) 用2ml二氯甲垸按上述方法洗脱C18S印-Pak柱，分离4-[18门氟苯甲醛并收集于一 个一次性试管。加无水硫酸钠( 1-2g)至二氯甲垸溶液，温和混旋。
17) 将4-，氟苯甲醛的二氯甲垸溶液过已活化的硅S印-Pak柱，并用每次1-ml二氯甲 烷冲洗S印-Pak柱两次。
合成4-[18F]-苯甲酸
18) 在上述4-[1￥氟苯甲醛的二氯甲烷溶液中加入5% (wt/vol)高锰酸钾的氢氧化钠溶液 (1 N NaOH)0.25ml和磁力搅拌棒(12.7mm长X 7.9 mm直径)一支，并强力搅拌。
19) 将装有以上混合液的试管插入120。C的油浴约3分钟。
20) 在残留水溶液中加入100-200mg亚硫酸氢钠，随之加入0.1-0.2 ml浓盐酸。再加 入1ml醋酸乙酯，盖好试管，强力搅拌。使液体分层，小心用巴斯德吸管抽出含4-[18门 氟苯甲酸的上层醋酸乙酯，移入另一试管。再加1 ml醋酸乙酯到原试管，混旋并将醋酸 乙酯层吸至第二支试管。再重复一次该步骤。
21) 加无水硫酸钠卜1-2g)至汇集的醋酸乙酯溶液，温和混旋。为保证干燥，将4-[18円 氟苯甲酸的醋酸乙酯溶液过分子筛柱，并收集于25-ml耐热玻璃锥形瓶。为保证质量， 可通过HPLC分析一份额(3-5 MBq)的样品。
22) 将锥形瓶装于微型旋转蒸发器，浓缩溶液至小体积(0.1-0.2 ml) 合成^F-SFB
23) 将放射性活性物质转移至1 ml反应瓶。用少量醋酸乙酯(三次冲洗<0.1 ml)冲洗 锥形瓶并将冲洗液移至反应瓶。在每次转移后于20 。C用温和的氩气流蒸发醋酸乙酯。 在完成最后一次转移后，蒸发到接近干燥状态(1-5 ul)。
24) 与此同时，升高油浴温度到150。C。
25) 用1-ml注射器加0.1 ml乙腈，随后用微量移液器加入0.1 M的A;f 二琥珀酰亚胺 基碳酸酯(DSC)和吡啶溶液各30 yl。盖好瓶盖，于150。C加热3分钟。
26) 用温和的嵐/氮气流蒸发掉反应瓶中残留的热乙腈。在50 nl醋酸乙酯重构放射活 性物质并抽至250-ulHPLC注射器。用50 ul醋酸乙酯冲洗反应瓶并抽至同一注射 器。将所有注射器内容物注入正相HPLC柱，用己烷:醋酸乙酯:醋酸70:30:2 (vol/vol/vol) 的混合液以1 ml min—1的流速洗脱。
27) 收集HPLC含有[^F]SFB(/R^4-15min)的洗脱液于一试管。用温和氩/氮气流于 20。C蒸发溶剂，并加入0.5ml乙腈。
4、 ，标记多肽的生成
将["F]-SFB/CH3CN (乙腈)溶液(40iU)加入多肽水溶液(IOO tU ， 1 mg/ml)及 硼酸盐缓冲液(IO y 1， 0.5 M, pH 7.5)，室温下放置50分钟。反应用盐酸(O.l tnl,l M)终止。 反应混合物用TRACERlab FXFN HPLC (C18 Sep-Pak柱)按4步梯度纯化 H20:CH3CN:TFA, 80:20:0.1 (v/v/v) 5分钟，75:25:0.1 5分钟，70:30:0.1 5分钟，最后 65:35:0.1 5分钟。流速1 ml/min,收集分离液["F]-(Ala)-多肽。
5、 脱侧链保护
用脱保护液TFA94.5^/。；水2%; EDT2.5°/。； TIS 1%脱去多肽侧链保护基团，脱保 护时间120分钟。用乙醚洗六次，再用乙醇洗三次，经制备型HPLC (C18 Sep-Pak柱) 纯化，无菌滤膜过滤，用生理盐水稀释至乙醇含量<10%，即得到"F标记多肽显像剂。上述"F标记多肽显像剂的化学通式如下
<formula>formula see original document page 11</formula>
其中式中多肽是指-Ala-Asn-Ser-Ser-Tyr-Ser-Gly-Asn-Tyr-Pro-Tyr-Ser-Ile-Leu-Phe-Gln-OH所示的氨基酸序列。
6、 "F标记多肽显像剂使用剂量为静脉注射，0.15-0.2毫居里(ma)/Kg体重。
权利要求
1.一种对上皮细胞间通透性无影响的靶向Claudin-4显像剂，为18F标记的由16个氨基酸残基组成的多肽，其特征在于所述18F标记的多肽是如下通式的化合物，其中式中多肽是指H-Ala-Asn-Ser-Ser-Tyr-Ser-Gly-Asn-Tyr-Pro-Tyr-Ser-Ile-Leu-Phe-Gln-OH所示的氨基酸序列；式中18F标记部分由18F标记化合物N-琥珀酰亚胺-4-[18F]氟苯甲酸酯与式中多肽反应生成，18F标记化合物化学结构式如下式所示
全文摘要
本发明公开了一种对上皮细胞间通透性无影响的适于正电子发射计算机断层扫描的靶向Claudin-4显像剂，为¹⁸F标记的由16个氨基酸残基组成的多肽。本发明所涉及的多肽显像剂因其肽链的缩短，而具有不影响细胞间的通透性、增加其对基底膜的透过性以及减少抗原性等重要生物学特性。这些特性使得该显像剂可在肿瘤组织微环境(如血运、氧合、生物活性分子分布、酸碱度、细胞凋亡体清除等等)不改变的情况下，对肿瘤病变进行检测，同时可降低重复使用可能诱导的阻断抗体干扰。
文档编号A61K51/02GK101574532SQ20091001618
公开日2009年11月11日 申请日期2009年6月15日 优先权日2009年6月15日
发明者于金明, 正 付, 前 国, 廖湘鲁, 徐峥浦, 敏 李, 王兴武, 阳 程, 纪春绍, 赵书强, 陈鲁生 申请人:山东省肿瘤医院