专利名称：：抗肿瘤活性精制番荔枝总内酯及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种植物提取物，具体是涉及一种精制番荔枝总内酯和其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
：番荔枝内酯是一类从番荔枝科植物中提取分离得到的天然化合物，番荔枝内酯类化合物具有广泛的生物活性，最典型的是杀虫和抗肿瘤细胞活性，研究显示番荔枝内酯在体内外具有强大的肿瘤细胞毒性，而且对多种肿瘤细胞都显示较好的生物活性，研究表明番荔枝内酯抗肿瘤活性的作用机理是通过阻断线立体NADH氧化还原酶，从而阻止呼吸链电子的传递，抑制肿瘤细胞ATP的生成，使肿瘤细胞因饥饿而死亡,其作用机制独特,不同于一般抗肿瘤药物的作用机制，被喻为"明曰抗癌之星"。现有技术中国发明专利(CN1739586A)公开了番荔枝粗提取物，中国发明专利(CN1224016A)公开了番荔枝总内酯，但现有技术中存在成分复杂，成分组成不明确，低活性成分含量高，难以控制药物的质量和药效。本发明提供的精制番荔枝总内酯中主要成分史可莫辛(1)和番荔枝塔亭戊(2)的结构式分别如下所示
发明内容发明目的本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种成分清楚，质量可控，由史可莫辛和番荔枝塔亭戊为主要成份的精制番荔枝总内酯和其制备的方法，本发明还有一个目的是提供该精制番荔枝总内酯在制备抗肿瘤药物中的应用。技术方案本发明提供的精制番荔枝总内酯由番荔枝内酯史可莫辛和番荔枝塔亭戊为主要成份，其通过以下方法制得取番荔枝的根、叶、树皮或种子粉碎后用石油醚、氯仿、乙4酸乙酯其中之一或它们的混合溶剂渗漉，在低于6(TC减压回收得到浓縮液、静置、离心、取离心所得上层液，加入1至HO倍量的石油醚或石油醚和水的混合溶液，在50至85t:的水浴中加热溶解，吸取上层石油醚层，重复上面操作1到5次，合并石油醚溶液、浓縮、得浓縮物后，干燥，得到番荔枝总内酯，然后取番荔枝总内酯，进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯或氯仿-甲醇梯度洗脱，用薄层色谱跟踪，收集史可莫辛和番荔枝塔亭戊相应流分，浓縮干燥得到由史可莫辛和番荔枝塔亭戊为主要成份的精制番荔枝总内酯。本发明提供的精制番荔枝总内酯中史可莫辛和番荔枝塔亭戊的重量百分含量为50%到90%。'本发明提供的精制番荔枝总内酯的制备方法，其包括以下步骤①取番蔡枝植物的根、叶、树皮或种子去杂，粉碎后用石油醚、氯仿、乙酸乙酯其中之一或它们的混合溶剂渗漉后，在低于60'C减压回收得到浓縮液、静置、离心、得上层浓縮液；②取步骤①离心所得上层液加入1到10倍量的石油醚或石油醚和水的混合溶液，然后在50至85。C的水浴中加热溶解，吸取上层石油醚层，重复上面操作l-5次，合并石油醚溶液，浓縮，得浓縮物后，干燥，得到番荔枝总内酯；③取步骤②所得的番荔枝总内酯，进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯或氯仿-甲醇梯度洗脱，用薄层色谱跟踪，收集史可莫辛和番荔枝塔亭戊相应流分，浓縮干燥得到由史可莫辛和番荔枝塔亭戊为主要成份的精制番荔枝总内酯。以上制备方法中步骤③所用的柱层析硅胶为100到300目，番荔枝总内酯与柱层析所用硅胶的重量比为1:3到1:6,洗脱剂石油醚-乙酸乙酯或氯仿-甲醇梯度洗脱比例为50:1到2:1。上述硅胶薄层色谱跟踪所用的硅胶为硅胶G(CMC钠为粘合剂)，显色剂为碘蒸汽、碱性苦味酸试剂或kedde试剂即3，5-二硝基苯甲酸和氢氧化钠试剂，展开剂为石油醚-乙酸乙酯(9:2)。本发明制备精制番荔枝总内酯的另一种制备方法，其包括以下步骤①把番荔枝植物的根、叶、树皮或种子去杂，粉碎过20目后，用醇类(乙醇、甲醇、正丁醇、丙二醇或异丙醇)溶剂做夹带剂，采用超临界二氧化碳方法萃取，得到二氧化碳萃取液，在低于60'C减压回收得浓縮液；②取步骤①所得的浓縮液加入1到10倍量的石油醚或石油醚和水的混合溶液，然后在50至85'C的水浴中加热溶解，吸取上层石油醚层，重复上面操作l-5次，合并石油醚溶液，浓縮，得浓缩物后，干燥，得到番荔枝总内酯；③取步骤②所得的番荔枝总内酯，进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯或氯仿-甲醇梯度洗脱，用薄层色谱跟踪，收集史可莫辛和番荔枝塔亭戊相应流分，浓缩干燥得到由史可莫辛和番荔枝塔亭戊为主要成份的精制番荔枝总内酯。以上制备方法中步骤①所用的夹带剂(乙醇、甲醇、正丁醇、丙二醇或异丙醇)的用量5以毫升记为药材质量克的0%到50%，萃取温度为20'C到50°C，萃取压强为10Mpa到40Mpa，萃取时间为1到4小时。本发明超临界二氧化碳萃取方法，一个优选萃取条件为夹带剂为乙醇，其用量毫升为药粉的重量克的20%，萃取温度为35'C，萃取压强为25Mpa，萃取时间为2小时。本发明超临界二氧化碳萃取方法，另一个优选萃取条件为夹带剂为甲醇，其用量毫升为药粉的重量克的30%,萃取温度为35'C,萃取压强为30Mpa,萃取时间为3小时。上述硅胶薄层色谱所用的硅胶为硅胶G(CMC钠为粘合剂)，显色剂为碘蒸汽、碱性苦味酸试剂或kedde试剂即3，5-二硝基苯甲酸和氢氧化钠试剂，展开剂为石油醚-乙酸乙酯(9:2)。以上两种制备精制番蕩枝总内酯方法的步骤②中采用1到IO倍量的石油醚或石油醚和水的混合溶液，在50至85'C的水浴中加热溶解，番荔枝总内酯能很好的溶于上层石油醚层，可以快速有效的去除其它极性大的色素等杂质，经过重复上面操作1-5次，能得到高纯度的番荔枝总内酯。为了更好的控制本发明提供的精制番荔枝总内酯的质量，本发明采用比色法控制精制番荔枝总内酯中番荔枝总内酯的含量和采用高效液相色谱法控制精制番荔枝总内酯中史可莫辛和番荔枝塔亭戊的含量。比色法的条件为精密吸取标准品或样品适量加入lX碱性苦味酸溶液0.5ml(即1%苦味酸乙醇溶液与5%NaOH水溶液用前等体积混合)再用95%乙醇定容至10ml，于70'C水浴锅中水浴10min，冷却至室温后于470nm处测吸光度，用外标法计算精制番荔枝总内酯中番荔枝总内酯的含量。高效液相色谱条件和仪器参数为安捷伦1200系列，反相碳18柱(220cm，4.6mm,0.5拜)，检测波长为220nm，流速为1ml/min，柱温为3(TC，流动相是甲醇-水(85:15)，用峰面积积分，外标法计算精制番荔枝总内酯中史可莫辛和番荔枝塔亭戊的含量。它们的回归方程为番荔枝内酯回归方程相关系数r线性范围(pg/ml)最低检测限(ug/ml)1.番荔枝塔亭戊Y=6362.9x-777.380.99953.8~45.60.082.史可莫辛Y=3632.8X—423.930.99954.3—51.70.17为实现精制番荔枝总内酯在制备抗肿瘤药物中的应用，把番荔枝内酯和药学上可接受的载体制成片剂，胶囊剂，喷雾剂，注射剂，脂肪乳剂，栓剂，微囊，软膏剂或透皮控释贴剂，用于口服或外用。为实现精制番荔枝总内酯在制备抗肿瘤药物中的应用，做成片剂或胶囊剂时加入乳糖和淀粉，必要时加入润滑剂硬脂酸镁，整粒、干燥、压片成片剂或装胶囊成胶囊剂；做成栓剂时加入可可脂、蜂蜡或聚乙二醇,混匀，制成栓剂；做成注射剂时加入脂肪乳剂、花生油、卵6磷脂或甘油，过滤、灭菌制成注射剂；做成外用制剂时加入赋形剂凡士林、丙二醇或聚氧化乙烯。本发明与现有技术相比的优点有1.本发明所用的原材料可以是根叶、树皮或种子，原材料的来源丰富，价格低廉，易得。2.本发明提供的精制番荔枝总内酯含量高，成分清楚，活性强，不确定低活性成分少，药效好，质量安全可控。'3.本发明提供的由史可莫辛和番荔枝塔亭戊为主要组成的精制番荔枝总内酯，药理活性表明不是两者的简单的叠加，相互有协同作用。4.本发明提供的精制番荔枝总内酯的制备方法工艺简单、消耗低、得率高，能实现工业化大生产，特别是本发明提供的超临界二氧化碳萃取方法提取效率高，只需少量的乙醇，避免采用有毒有机试剂，且萃取的温度低，能更好的保证精制番荔枝总内酯结构稳定，保证药效。制备方法中采用溶剂萃取法精制番荔枝总内酯，即采用1到IO倍量的石油醚或石油醚和水的混合溶液，在50至85'C的水浴中加热溶解，吸取上层石油醚层，重复上面操作l-5次，合并石油醚溶液，浓縮，得浓縮物后，干燥得到精制番荔枝总内酯，该方法能快速的去除杂质，得到纯度高的精制番荔枝总内酯，工艺简单，成本低，效率高。5.本发明提供的精制番荔枝总内酯可以和不同的赋形剂制备成不同的药物剂型，能方便临床应用。图1为本发明精制番荔枝总内酯的制备工艺流程图。具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1:番荔枝总内酯的提取，取番荔枝干燥种子2千克，粉碎，种子粗粉用IO倍量的氯仿渗漉二次，用硅胶薄层色谱检测，番荔枝内酯近渗漉提取完全，在低于60'C减压回收得到浓縮液，静置24小时，离心，3000转每分钟，然后取离心所得上层浓縮液(88.7g),即得番荔枝总内酯粗提取物。取番荔枝总内酯粗提取物80g，加入l倍量的石油醚，置6(TC水浴中加热溶解，混匀，静置分层后，吸取上层石油醚层，浓縮，干燥，重复上面操作3次，得到番荔枝总内酯46g。取上述番荔枝总内酯46g，拌等量的硅胶后，研匀，上硅胶(400g，200到300目，青岛海洋化工厂)柱层析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，石油醚-乙酸乙酯(50:l)1到20流份，石油醚-乙酸乙酯(20:1)21到50流份，石油醚-乙酸乙酯(10:1)51到68流份，石油醚-乙酸乙酯(2:1)69到85流份每份接收lOOml。用硅胶薄层色谱跟踪，分别收集史可莫辛(17到31流份沐番荔枝塔亭戊42到59流份)，合并，在低于60'C减压回收，得到精制的由史可莫辛和番荔枝塔亭戊组成的番荔枝总内酯5.28。(批号Ol)实施例2:按实施例l的方法提取番荔枝总内酯粗提取物，从2千克番荔枝干燥种子中提取得到总内酯提取物86.6g，取上述番荔枝总内酯粗提取物82g，加入10倍量的石油醚-水(5:l)，置80°C水浴中加热溶解，混匀，静置分层后，吸取上层石油醚层，浓縮，干燥，重复上面操作3次，得到番荔枝总内酯47g。取上述番荔枝总内酯47g，拌等量的硅胶后，研匀，上硅胶(400g，200到300目，青岛海洋化工厂)柱层析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，石油醚-乙酸乙酯(50:1)1到21流份，石油醚-乙酸乙酯(20:1)22到55流份，石油醚-^酸乙酯、(10:1)56到70流份，石油醚-乙酸乙酯(2:1)71到88流份每份接收100ml用硅胶薄层色谱跟踪，分别收集史可莫辛(19到32流份)和番荔枝塔亭戊(40到55流份)，合并，在58'C减压回收，得到精制的由史可莫辛和番荔枝塔亭戊组成的番荔枝总内酯5.6g。实施例3:番荔枝总内酯的提取，取番荔枝干燥种子2千克，粉碎，种子粗粉用IO倍量的乙酸乙酯渗漉二次，用硅胶薄层色谱检测，番荔枝内酯近提取完全，在低于60'C减压回收得到浓縮液，静置24小时，离心，3000转每分钟，然后取离心所得上层浓缩液(76.8g)，即番荔枝总内酯粗提取物。取番荔枝总内酯粗提取物75g，加入5倍量的石油醚-水(l:l)，置50'C水浴中加热溶解，混匀，静置分层后，吸取上层石油醚层，浓缩，干燥，重复上面操作1次，得到番荔枝总内酯41g。取上述番荔枝总内酯40g，拌等量的硅胶后，研匀，上硅胶(400g，200到300目，青岛海洋化工厂)柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，氯仿-甲醇(50:1)1到18流份，氯仿-甲醇(20:l)19到30流份,氯仿-甲醇(10:1)31到58流份，氯仿-甲醇(2:1)59到80流份每份接收100ml。用硅胶薄层色谱跟踪，分别收集史可莫辛(14到28流份)和番荔枝塔亭戊36到50流份)，合并，在55°0减压回收，得到精制的由史可莫辛和番荔枝塔亭戊组成的番荔枝总内酯4.6g。实施例4:按实施例3的方法提取番荔枝总内酯粗提取物，从2千克番荔枝千燥种子中提取得到总内酯提取物77.2§，取上述番荔枝总内酯粗提取物75g，加入8倍量的石油醚-水(3:l)，置70°C水浴中加热溶解，混匀，静置分层后，吸取上层石油醚层，浓縮，干燥，重复上面操作3次，得到番荔枝总内酯38g。取上述番荔枝总内酯38g，拌等量的硅胶后，研匀，上硅胶(350g，200到300目，青岛海洋化工厂)柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，氯仿-甲醇(50:1)1到13流份，氯仿-甲醇(20:l)14到35流份，氯仿-甲醇(10:1)36到53流份，氯仿-甲醇(2:1)54到70流份每份接收100ml，用硅胶薄层色谱跟踪，分别收集史可莫辛(ll到26流份)和番荔枝塔亭戊(30到45流份)，合并，在5(TC减压回收，得到精制的由史可莫辛和番荔枝塔亭戊组成的番荔枝总内酯4.1g。(批号02)实施例5:番荔枝总内酯的提取，取番荔枝干燥种子1200g，粉碎过20目，在萃取温度35'C,萃取压25Mpa,萃取时间2小时和夹带剂乙醇的用量为240ml的条件下进行超临界二氧化碳萃取。得到萃取物，在低于6(TC减压回收得到浓縮液，干燥，得到番荔枝总内酯粗提物52g。取番荔枝总内酯粗提物50g，加入5倍量的石油醚-水(10:l)，置50'C水浴中加热溶解，混匀，静置分层后，吸取上层石油醚层，浓縮，干燥，重复上面操作3次，得到番荔枝总内酯26g。取上述番荔枝总内酯26g，拌等量的硅胶后，研匀，上硅胶(250g，200到300目，青岛海洋化工厂)柱层析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，石油醚-乙酸乙酯(50:1)1到20流份，石油醚-乙酸乙酯(20:1)21到40流份，石油醚-乙酸乙酯(10:1)41到58流份，石油醚-乙酸乙酯(2:1)59到75流份每份接收100ml。用硅胶薄层色谱跟踪，分别收集史可莫辛(17到31流份)和番蒸枝塔亭戊(35到48流份)，合并，在60'C减压回收，得到精制的由史可莫辛和番荔枝塔亭戊组成的番荔枝总内酯3.5g。(批号03)实施例6:按实施例5的方法提取番蔡枝总内酯粗提物，从1200g番蔡枝干燥种子中提取得到番荔枝总内酯粗提物53g，取上述番荔枝总内酯50g，加入6倍量的石油醚-水(3:l)，置85'C水浴中加热溶解，混匀，静置分层后，吸取上层石油醚层，浓縮，干燥，重复上面操作3次，得到番荔枝总内酯26.6g。取上述番蔡枝总内酯26g，拌等量的硅胶后，研匀，上硅胶(250g，200到300目，青岛海洋化工厂)柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，氯仿-甲醇(50:1)1到21流份，氯仿-甲醇(20:1)22到40流份，氯仿-甲醇(10:1)41到58流份，氯仿-甲醇(2:1)59到76流份每份接收100ml。用硅胶薄层色谱跟踪，分别收集史可莫辛(16到32流份)和番荔枝塔亭戊(36到46流份)，合并，在6(TC减压回收，得到精制的由史可莫辛和番荔枝塔亭戊组成的番荔枝总内酯3.6g。实施例7:番荔枝总内酯的提取，取番荔枝干燥种子1200g，粉碎过20目，在萃取温度35'C，萃取压30Mpa,萃取时间3小时和夹带剂甲醇的用量为360ml的条件下进行超临界二氧化碳萃取，得到萃取物，在低于6(TC减压回收得到浓縮液，干燥，得到番荔枝总内酯粗提物55g。取番荔枝总内酯粗提物55g，加入5倍量的石油醚-水(l:l)，置60'C水浴中加热溶解，混匀，静置分层后，吸取上层石油醚层，浓縮，干燥，重复上面操作5次，得到番荔枝总内酯28g。取上述番荔枝总内酯28g，拌等量的硅胶后，研匀，上硅胶(250g，200到300目，青岛海洋化工厂)柱层析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，石油醚-乙酸乙酯(50:1)1到21流份，石油醚-乙酸乙酯(20:1)22到40流份，石油醚-乙酸乙酯(10:1)41到58流份，石油醚-乙酸乙酯(2:1)59到76流份每份接收100ml。用硅胶薄层色谱跟踪，分别收集史可莫辛(16到32流份)和番荔枝塔亭戊(36到46流份)，合并，在60'C减压回收，得到精制的由史可莫辛和番荔枝塔亭戊组成的番荔枝总内酯3.8g。(批号04)实施例8:按实施例7的方法提取和富集番荔枝总内酯有效部位，从1200g番荔枝干燥种子中提取得到番荔枝总内酯粗提取物58g，取上述番荔枝总内酯粗提取物55g，加入7倍量的石油醚-水(6:1)，置6(TC水浴中加热溶解，混匀，静置分层后，吸取上层石油醚层，浓縮，干燥，重复上面操作4次，得到番荔枝总内酯30g。取上述番荔枝总内酯28g，拌等量的硅胶后，研匀，上硅胶(300g，200到300目，青岛海洋化工厂)柱层析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，石油醚-乙酸乙酯(50:1)1到23流份，石油醚-乙酸乙酯(20:1)24到42流份，石油醚-乙酸乙酯(10:1)43到55流份，石油醚-乙酸乙酯(2:1)56到75流份每份接收100ml。用硅胶薄层色谱跟踪，分别收集史可莫辛(18到35流份)和番荔枝塔亭戊(38到49流份)，合并，在6(TC减压回收，得到由史可莫辛和番荔枝塔亭戊组成的精制番荔枝总内酯5.2g。实施例9:采用比色法(碱性苦味酸法)测定精制番荔枝总内酯中总内酯的含量，其方法为精密吸取标准品或样品适量,加1%碱性苦味酸溶液0.5ml(1%苦味酸乙醇溶液与5%NaOH水溶液用前等体积混合)95X乙醇定容至10ml，于7CTC水浴锅中水浴10min，冷却至室温后于470nm处测吸光度。含量测定结果如表1所示。表1精制番荔枝总内酯中总内酯的含量精致番蔡枝总内酯含量(g)总内酯的百分含量(％)批号01:5.280.76批号02:4.1卯.24批号03:3.591.42批号04:3.892.11采用高效液相色谱法，以色谱条件:反相碳18柱(220cm,4.6mm，0.5nm)，检测波长220nm,流速lml/min，柱温30'C，流动相是甲醇-水(85:15)，用峰面积积分，外标法计算精制番蔡枝总内酯中史可莫辛和番荔枝塔亭戊的含量，含量测定结果如表2所示。表2番荔枝总内酯中史可莫辛和番荔枝塔亭戊的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>实施例10:精制番荔枝总内酯的急性毒性实验。按Bliss法计算小鼠半数致死量LD50值，测定结果如下腹腔注射ipxlLD50=0.318±0.06mg/kg静脉注射ivxlLD50=0.186±0.08mg/kg口月艮poxlLD50=0.896±0.10mg/kg由实验所得LD50值说明精制番荔枝总内酯的急性毒性较低，三种给药途径中口服给药的毒性反映最小，静脉注射由于药物迅速达到各器管，呈现较敏感的量-效(死亡)关系，在高剂量时给药后8小时出项死亡，中剂量在24小时有小鼠死亡，低剂量未见小鼠死亡.实施例ll:精制番荔枝总内酯体外对人肿瘤细胞的抑制作用。以人肺癌(MCF-7),乳腺癌(A-5408)，人肝癌(SMMC-7451)，人宫颈癌(Hela)和人胃癌(SGC-7901)5种瘤株，采用噻唑蓝还原法(MTT)进行体外抗肿瘤实验，精制番荔枝总内酯，史可莫辛和番荔枝塔亭戊单体各设5个浓度，以紫衫醇为阳性对照组，以样品的溶剂即二甲亚砜为阴性对照组。所用小鼠为清洁级昆明小鼠。由表3的实验结果可以看出精制番荔枝总内酯对5株人肿瘤细胞的显示不同的抑制作用，特别其中对人宫颈癌(Hela)的IC5o为4.16xl(T3，人肺癌(MCF-7)的ICw为2.46xl(T3，显示了比史可莫辛，番荔枝塔亭戊单体和紫衫醇更强大的细胞选择抑制活性，精制番荔枝总内酯对人乳腺癌(A-5408池显示较强的抑制活性，其ICso为2.36xl(T2。上述体外抗肿瘤实验表明本发明提供的主要由史可莫辛，番荔枝塔亭戊组成的精制番荔枝总内酯显示了比史可莫辛，番荔枝塔亭戊单体和紫衫醇更强的细胞选择抑制活性。同是说明本发明提供的由史可莫辛和番荔枝塔亭戊为主要组成的精制番荔枝总内酯不是两者简单的组分叠加。表3精制精制番荔枝总内酯和紫衫醇对5株肿瘤细胞的抑制作用(ICso半数抑制率)肿瘤细胞株精制番荔枝总内酯IC50(—1)史可莫辛番荔枝塔亭戊阳性药TaxolIC50Oig/ml)MCF-72.46x10-33.86xl(T31.31x10-21.02x10-2A-54082.36xl(T22.76x10-28.72x10-22.08x10-2SMMC-74517.04x10"7.96x10"9.87x10"3.79x10-2Hela4.16x10-36.86xl(T31.16xIO'26.3lx10-3SGC-7卯11.39x10-13.39x10"8.79x10"1.36x10-2实施例12:精制番荔枝总内酯体内对移植性肿瘤生产的抑制作用。以小鼠移植性肝瘤Heps和小鼠肉瘤S180进行小鼠体内肿瘤生产的抑制实验，精制番荔枝总内酯，史可莫辛和番荔枝塔亭戊各设3个剂量组，即高、中、低3组，以紫衫醇为阳性对照组，以样品的溶剂即大豆油为阴性对照组，每组各设10只小鼠，每天每组小鼠腹腔注射0.2ml,连续7天，于第8天处死小鼠，取肿瘤，称重，计算抑瘤率.结果见表4和表5。表4精制番荔枝总内酯腹腔给药对小鼠肝癌HepS的抑制实验结果组别动物数始/终剂量(jjg/mg，7天)瘤重(;士SD,mg)抑瘤率(％)P值阴性组10/10*1.132±0.146紫衫醇Taxol画o20.426±0.10862.9<0.001史可莫辛高浓度10/1030.442±0.02660.9<0扁史可莫辛中浓度10/101.50.583±0.04749.5<0扁史可莫辛低浓度10/100.750.813±0.02628.2<0.01番荔枝塔亭戊高浓度10/1030.468±0.03258.7<0細番荔枝塔亭戊中浓度10/101.50.607±0.01746.4<0細番荔枝塔亭戊低浓度10/100.750.962±0.02615.1>0.1番荔枝总内酯髙浓度10/1030.410±0.11063.8<0.001番荔枝总内酯中浓度10/101.50.526±0.12053.6<0.001番荔枝总内酯低浓度10/100.750.796±0.10329.7<0.01抑瘤率(％)=(1-药物组瘤重/阴性组瘤重>100%*给与相同量溶解样品的溶液，下同。12表5精制番荔枝总内酯腹腔给药对小鼠肉癌S180的抑制实验结果组别动物数始/终剂量(pg/mg,7天)瘤重(^士SD，mg)抑瘤率(％)P值阴性组10/100.872±0.146紫衫醇Taxol10/1020.383±0駕56.1<0.001史可莫辛高浓度磨30.342±0.02660.8<0.001史可莫辛中浓度10/101.50.399±0.04754.3<0.001史可莫辛低浓度10/100.750.713±0.02618.3>0,1番荔枝塔亭戊高浓度10/1030.368±0.03257.8<0.001番荔枝塔亭戊中浓度10/101.50.407±0.01753.4<0.001番荔枝塔亭戊低浓度10/100.750.732土0.02616.1>0.1番荔枝总内酯高浓度10/930.333±0.06361.9<0.001番荔枝总内酯中浓度10/101.50.386±0.10455.8<0.001番荔枝总内酯低浓度10/100.750.646±0.10325.9<0.5由实验结果表4得出精制番荔枝总内酯对小鼠肝瘤Heps生长显示强大的抑制活性，相对于阴性组高、中、低3个浓度都具有统计学意义，高浓度组对小鼠肝瘤Heps抑制率为63.8%比相应浓度的史可莫辛，番荔枝塔亭戊和阳性药紫衫醇具有更好的抑瘤活性。由实验结果表5得出精制番荔枝总内酯对小鼠肝肉瘤S③也显示较强的抑制活性，相对于阴性组高,中浓度组都具有统计学意义，高浓度组对小鼠肉瘤Su!o抑制率为61.9%，也显示比紫衫醇具有更好的抑瘤活性。通过比较看出精制的番荔枝总内酯的高，中，低浓度显示了比史可莫辛，番荔枝塔亭戊单体相应浓度更好的抑瘤效果。以上体内抗肿瘤实验进一步说明本发明提供的由史可莫辛和番荔枝塔亭戊为主要组成的精制番荔枝总内酯不是两者简单的组分叠加，具有一定的协同作用。且除高浓度组有l只小鼠死亡外，其他浓度组未见小鼠死亡，说明在实验所设的浓度范围内，精制番荔枝总内酯具有高抗肿瘤活性，低毒副作用，进一步证明了本发明所提供的精制番荔枝总内酯的质量安全，有效的优点。1权利要求1、一种精制番荔枝总内酯，其特征在于由番荔枝内酯史可莫辛和番荔枝塔亭戊为主要成分，其通过以下方法制得取番荔枝的根、叶、树皮或种子粉碎后用石油醚、氯仿、乙酸乙酯其中之一或它们的混合溶剂渗漉，在低于60℃减压回收得到浓缩液、静置、离心、取离心所得上层液，加入1到10倍量的石油醚或石油醚-水混合溶液，在50至85℃的水浴中加热溶解，吸取上层石油醚层，重复上面操作1到5次，合并石油醚溶液、浓缩、得浓缩物后，干燥，得到番荔枝总内酯，然后取番荔枝总内酯，进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯或氯仿-甲醇梯度洗脱，用薄层色谱跟踪，收集史可莫辛和番荔枝塔亭戊相应流分，浓缩干燥得到由史可莫辛和番荔枝塔亭戊为主要成份的精致番荔枝总内酯。2、根据权利要求l所述的精制番荔枝总内酯，其特征在于精制番荔枝总内酯中史可莫辛和番荔枝塔亭戊的重量百分含量为50%到90%。3、权利要求l所述的精制番荔枝总内酯的制备方法，其特征包括以下步骤①取番荔枝植物的根、叶、树皮或种子去杂，粉碎后用石油醚、氯仿、乙酸乙酯其中之一或它们的混合溶剂滲漉后，在低于60'C减压回收得到浓縮液、静置、离心、得上层浓縮液；②取步骤①离心所得上层液加入1到IO倍量的石油醚或体积比为1:1到10:1的石油醚和水的混合溶液在50至85'C的水浴中加热溶解，吸取上层石油醚层，重复上面操作l-5次，合并石油醚溶液，浓縮，得浓縮物后，干燥，得到番荔枝总内酯；③取步骤②所得的番荔枝总内酯，进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯或氯仿-甲醇梯度洗脱，用薄层色谱跟踪，收集史可莫辛和番荔枝塔亭戊相应流分，浓縮干燥得到由史可莫辛和番荔枝塔亭戊为主要成份的精制番荔枝总内酯。4、根据权利要求3所述的精制番荔枝总内酯的制备方法，其特征在于步骤③所用的柱层析硅胶为100到300目，番荔枝总内酯与柱层析所用硅胶的重量比为1:3到1:6，洗脱剂石油醚-乙酸乙酯或氯仿-甲醇梯度洗脱的比例为50:1到2:1。5、权利要求l所述的精制番荔枝总内酯的制备方法，其特征包括以下步骤①把番荔枝植物的根、叶、树皮或种子去杂，粉碎过20目后，用醇类(乙醇、甲醇、正丁醇、丙二醇或异丙醇)溶剂做夹带剂，采用超临界二氧化碳方法萃取，得到二氧化碳萃取液，在低于6(TC减压回收得浓縮液；②取步骤①所得的浓縮液加入1到IO倍量的石油醚或体积比为1:1到10:1的石油醚和水的混合溶液在50至85"C的水浴中加热溶解，吸取上层石油醚层，重复上面操作1-5次，合并石油醚溶液，浓縮，得浓缩物后，干燥，得到番荔枝总内酯；③取步骤②所得的番荔枝总内酯，进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯或氯仿-甲醇梯度洗脱，用薄层色谱跟踪，收集史可莫辛和番荔枝塔亭戊相应流分，浓縮干燥得到由史可莫辛和番荔枝塔亭戊为主要成份的精制番荔枝总内酯。6、根据权利要求5所述的超临界二氧化碳萃取方法，其特征在于萃取条件为夹带剂乙醇、甲醇、正丁醇、丙二醇或异丙醇的用量以毫升记为药材质量克的0%到50%，萃取温度为20'C到50。C，萃取压强为10Mpa到40Mpa,萃取时间为1到4小时。7、根据权利要求6所述的超临界二氧化碳萃取方法，其特征在于萃取条件为夹带剂乙醇用量以毫升记为药材质量克的20%，萃取温度为35'C，萃取压强为25Mpa，萃取时间为2小时。8、根据权利要求6所述的超临界二氧化碳萃取方法，其特征在于萃取条件为夹带剂甲醇用量以毫升记为药材'质量克的30%，萃取温度为35'C，萃取压强为30Mpa，萃取时间为3小时。9、权利要求1或2所述的精制番荔枝总内酯在制备治疗肺癌、乳腺癌、肝癌、宫颈癌或胃癌药物中的应用。10、根据权利要求9所述的应用，其特征在于把精制番荔枝内酯和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、喷雾剂、注射剂、脂肪乳剂、栓剂、微囊、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。全文摘要本发明涉及一种抗癌精制番荔枝总内酯及其制备的方法，采用番荔枝根、叶、树皮或种子为原材料，经石油醚、氯仿、乙酸乙酯或它们混合溶液渗漉提取，或者用超临界二氧化碳萃取后，用溶剂法，即用石油醚加热溶解去杂得到番荔枝总内酯，再用硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯或氯仿-甲醇梯度洗脱，分离精制得到由史可莫辛和番荔枝塔亭戊为主要组成的番荔枝总内酯。由本发明所用原材料的来源丰富，价格低廉，易得，得到的精制番荔枝总内酯含量高，成分清楚，质量可控，其制备方法工艺简单，消耗低，得率高，能实现工业化大生产。文档编号A61K36/185GK101485700SQ200910024959公开日2009年7月22日申请日期2009年3月3日优先权日2009年3月3日发明者祥李,杨海军,陈建伟申请人:南京中医药大学