专利名称：一种基因工程疫苗及其制备方法和在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种基因工程疫苗及其制备方法和在制药中的应 用，具体涉及采用分子佐剂B淋巴细胞刺激因子增强的基因工程疫苗HSP70-MAGE-1(161_169) 及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
基因工程疫苗包括基因重组疫苗、重组亚单位疫苗和基因疫苗等。基因疫苗又称 DNA疫苗，是将编码某种目的抗原蛋白的基因克隆到哺乳动物真核表达载体置于真核表达 元件的控制之下，并将其直接导入动物机体内，通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，从 而诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗肿瘤的目的。其与传统疫苗 的相比具有的优点有没有感染的危险，可诱发针对天然蛋白表位的抗体和特异性的细胞 毒性T细胞免疫反应，可维持长期持续的免疫反应，便于构建多价疫苗，稳定性不受温度影 响，可快速筛选具有免疫保护效果的基因以及具备预防和免疫治疗的双重功能。但是国内 外研究表明，DNA疫苗也存在着明显的不足，即现有各种核酸疫苗诱导的免疫应答效应往往 比常规疫苗接种引起的免疫反应弱，需采取措施强化免疫应答，因此我们就需要疫苗佐剂 来克服这个缺点。DNA疫苗的分子佐剂主要是指将某些分子的基因，与DNA疫苗所编码的抗原基因 共同应用于机体后，这些分子基因的表达产物(与抗原融合或非融合两种形式)，可通过募 集和活化淋巴细胞，促进疫苗编码抗原的摄取、加工和提呈，刺激协同刺激分子表达和细胞 因子分泌等作用，调节疫苗编码抗原所诱导的免疫应答的强弱和方向，提高疫苗的效力。热休克蛋白(HSPs)是一种高度保守的蛋白分子，在细胞受到热、葡萄糖缺乏等应 激条件下出现高效表达，在正常生理条件下，HSPs也有表达，参与细胞内一些重要的生理功 能，如蛋白质的转位、折叠与装配，因此HSPs被成为“分子伴侣”，HSPs在免疫系统中也发挥 多方面重要的作用。部分HSP70家族蛋白基因与MHC分子基因类似，而且HSP70的蛋白结 合基序与MHC-I类分子的构槽样结构非常相似。有研究构建了结核杆菌HSP70与HPV-16E7 融合基因，通过核酸疫苗方式进行动物实验，发现能够产生明显的E7特异性的T细胞介导 的免疫反应，对表达E7抗原的转移肿瘤具有明显作用。MAGE基因在黑色素瘤细胞系中发现，大量的研究已证明MAGE基因家族不仅仅是 黑色素瘤细胞的特异性基因。MAGE-I基因在多种肿瘤和正常睾丸组织中表达。在对一些肿 瘤组织标本和肿瘤细胞系的研究表明，MAGE-I在非小细胞肺癌、乳腺癌和肝癌等均有较高 表达。目前的研究表明MAGE-I是一种胞浆蛋白，尽管其具体作用还不清楚，但很多研究表 明MAGE-I可作为一种重要的肿瘤免疫治疗的靶物质之一。以MAGE-I为基础的免疫治疗结 果已经证实MAGE-I抗原可诱导产生特异性的细胞毒性T细胞，这种CTL能够识别和杀伤表 达MAGE-I基因的黑色素瘤与其他肿瘤细胞。B淋巴细胞刺激因子(BLyS)是肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员，可通过诱导凋亡 抑制一些肿瘤细胞系的生长，具有剂量依赖性，但作用较TNF弱。作为B细胞的共刺激因子，无论在体内、体外，对B细胞有强烈的促增殖和刺激分泌免疫球蛋白的作用，且参与T细胞 介导的免疫功能，可显著提高机体的细胞免疫、体液免疫功能，是一种新的免疫调节因子。 目前针对于BlyS的研究主要集中在应用BLyS蛋白治疗自身免疫缺陷性疾病和用于治疗自 身免疫性疾病的BlyS抗体(anti-BLyS)这两个方面。目前还没有将B淋巴细胞刺激因子 应用于肿瘤基因工程疫苗分子佐剂的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用B淋巴细胞刺激因子为分子佐剂增强的基因工程疫苗。本发明的另一个目的是提供上述基因工程疫苗的制备方法。本发明还有一个目的是提供B淋巴细胞刺激因子在制备肿瘤基因工程疫苗分子 佐剂中的应用。本发明的目的是通过下列技术方案实现的一种基因工程疫苗，该疫苗为采用B淋巴细胞刺激因子为分子佐剂增强的基因工 程疫苗 HSP7O-MAGE-I (161_169)。所述的基因工程疫苗，其中B淋巴细胞刺激因子分子佐剂的形式为BlyS真核表达 载体和/或BlyS融合蛋白。所述的基因工程疫苗，其中BlyS真核表达载体为pcDNA3. I-BlyS0所述基因工程疫苗的制备方法，该方法包括下列步骤a.采用MAGE-I (161_169)作为肿瘤特异性抗原，通过建立MAGE_1(161_169)与人HSP70的 融合基因，构建HSP70-MAGE-1(161_169)的真核表达载体；b.采用人BLyS基因构建BlyS的真核表达载体；或者将人BLyS基因克隆到融合 蛋白原核表达载体中，构建重组BLyS原核表达载体，用此重组BLyS原核表达载体转化大肠 杆菌，诱导大肠杆菌表达BlyS融合蛋白；c.将HSP70-MAGE-1(161_169)的真核表达载体与BlyS的真核表达载体或BlyS融合 蛋白合用即构成BlyS增强的基因工程疫苗HSP70-MAGE-1(161_169)。所述基因工程疫苗的制备方法，其中HSP70-MAGE-1 (161_169)的真核表达载体为 pcDNA3. 1-HSP70-MAGE-1(161_169) ；BlyS 的真核表达载体为 pcDNA3. I-BlyS ；重组 BLyS 原核表 达载体为 pET-28a-BlyS。所述的基因工程疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。B淋巴细胞刺激因子在制备肿瘤基因工程疫苗分子佐剂中的应用。本发明有益效果本发明采用MAGE-1(161_169)(其氨基酸序列为EADPTGHSY，SEQ ID NO. 9)作为肿 瘤特异性抗原，通过建立MAGE-1(161_169)与人HSP70的融合基因，成功构建了真核表达载 体pcDNA3. 1-HSP70-MAGE-1 (161_169)，即肿瘤DNA疫苗。同时采用BlyS作为基因工程疫苗 分子佐剂，构建了其真核表达载体pcDNA3. I-BlyS,或者将人BLyS基因克隆到融合蛋白原 核表达载体pET-28a中，构建重组质粒pET-28a-BLyS，用此重组质粒转化大肠杆菌BL21， 诱导大肠杆菌表达BlyS融合蛋白，并证实无论是pcDNA3. I-BlyS还是BlyS融合蛋白 与pcDNA3. 1-HSP70-MAGE-1(161_169)合用同时免疫C57BL/6小鼠，均能增强基因工程疫苗pcDNA3. 1-HSP70-MAGE-1(161_169)抗 B16F10 黑色素瘤的活性。
图1 :C57BL/6小鼠免疫方案示意图。肌肉注射免疫pcDNA3. 1-HSP70-MAGE-1DNA 疫苗(100 μ g/100 μ 1 PBS)三次(-37 天，-25 天，-13 天)，用佐剂 pcDNA3. I-BlyS DNA 或 BlyS原核表达蛋白加强免疫两次。在第0天，各组老鼠均皮下接种2X IO5Bie黑色素瘤细 胞，观测各组小鼠的抗肿瘤情况。图2.双酶切验证构建的质粒pcDNA3. 1-HSP70琼脂糖凝胶电泳。1 :DNA marker ；
2:HSP70 的 PCR 产物；3 :pcDNA3. 1-HSP70 经 BamH I 和 Hind III双酶切。图3. PCR验证构建的质粒pcDNA3. 1-HSP70-MAGE-1 (161-169)琼脂糖凝胶电泳。1 DNAmarker ；2 =PCR 产物(P3、P4 为引物)。图4.双酶切验证构建的质粒pcDNA3. I-BlyS琼脂糖凝胶电泳。1 =DNAmarker ；2 pcDNA3. I-BlyS 经 BamH I 和 Hind III双酶切。图5.双酶切验证构建的质粒pET-28a-BlyS琼脂糖凝胶电泳。1 :DNA marker ；2 pET-BlyS 经 BamH I 和 Hind III双酶切。图6.大规模制备质粒pcDNA3. 1-HSP70的琼脂糖凝胶电泳分析。1 =DNAmarker ；2 pcDNA3. 1-HSP70 经 BamH I 和 Hind III双酶切；3 :pcDNA3. 1 质粒。图7.大规模制备质粒pcDNA3. 1-HSP70-MAGE-1 (161-169)的琼脂糖凝胶电泳分 析.1，2 大规模制备质粒 pcDNA3. 1-HSP70-MAGE-1 (161-169)经 BamH I 和 Hind III双酶切； 3,4 构建质粒 pcDNA3. 1-HSP70-MAGE-1 (161-169)经 BamH I 和 Hind III双酶切。图8.大规模制备质粒pcDNA3. I-BlyS的琼脂糖凝胶电泳分析。1 =DNAmarker ；2，
3大规模制备质粒pcDNA3. I-BlyS的琼脂糖凝胶经BamH I和Hind III双酶切。图9. BlyS蛋白制备与纯化。1 蛋白marker ；2 :E. coll BL21菌总蛋白；3 纯化的 BlyS蛋白。图 10.质粒 pcDNA3. I-BlyS 转染 MCF-7 细胞 48h 后经 western-blot 检测 BlyS 蛋 白的表达。1 转染pcDNA3. I-BlyS细胞.2 转染pcDNA3. 1空载体细胞。图 11.质粒 pcDNA3. I-BlyS 转染 MCF-7 细胞 48h 后 BlyS mRNA 的表达。1 DNAmarker. 2 :HL_60 细胞；3 转染 pcDNA3. I-BlyS 细胞；4 转染 pcDNA3. 1 空载体细胞。图12.特异性抗MAGE-I抗体检测。每周收集各组小鼠血清，运用ELISA检测其特 异性抗MAGE-I抗体水平。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例1材料1菌种和质粒E. coli DH-5a (上海生工生物工程技术服务有限公司)，载体质粒pET_28a， pcDNA3. 1 (Invitrogen，美国)。2细胞和动物
小鼠黑色素瘤(B16F10)、人早幼粒细胞性白血病(HL-60)、宫颈癌细胞HeLa均购 自中科院上海细胞所；6周龄雄性C57BL/6小鼠购自中国医学科学院实验动物研究所。3酶和试剂Pfu DNA 聚合酶(Takara,中国)；DNA 限制性内切酶 BamH I，Nco I，Hind III， Xba I (MBI，美国)；DEAE-52 (Whatman,英国)；羊抗小鼠 IgG-HRP 和 IFN- y ELISA 试剂盒 (武汉博士德生物技术有限公司，中国)；Wizard质粒DNA纯化系统(Promega，美国)；DMEM 培养基、胎牛血清(Gibcol，美国)；Protein G亲和层析柱(Pharmacia，美国)；BAFF单克 隆抗体(anti-BAFF，R&D，美国)；淋巴细胞分离液Ficoll (南京生兴生物技术有限公司，中 国)；脂质体转染试剂Lipofectamine 2000 (Invitrogen，美国)；MAGE-1九肽(上海生工生 物工程技术服务有限公司，中国)。4实验仪器高速冷冻离心机(Sigma，德国)；PTC-200PCR仪、Gel 2000凝胶成像摄像分析系统 (BI0-RAD，美国)；C02细胞培养箱(Thermo，美国)；Model 680酶标定量测定仪(BIO-RAD, 美国)；37°C恒温细菌培养箱、37°C恒温摇床(上海福玛实验设备有限公司，中国)；低温高 速离心机(Sigma，美国)；X71倒置显微镜(Olympus，日本)；。方法1真核表达质粒pcDNA3. 1-HSP70构建以从宫颈癌细胞HeLa中抽提的mRNA为模板，设计引物Pl :5 ‘ -TAAAA GCTTGGCACCGGCATGGCCAAAGC-3 ‘ (SEQ ID NO.1) ；P2 5 ‘ -TTGGGATCCCTAGCTAGC ATCTACCTCCTCAATGGTG-3 ‘ (SEQ ID N0. 2)。用 Pl，P2 为引物进行 PCR 扩增，得到全长的 HSP70基因。所得目的片段经限制性内切酶BamH I、Hind III双酶切后，再与pcDNA3. 1真 核表达载体经BamH I , Hind III双酶切后切胶回收的大片段连接。连接产物转化E.coli DH5a菌，挑选阳性克隆，双酶切鉴定。2 真核表达质粒 pcDNA3. 1-HSP70-MAGE_1(161_169)构建以 pcDNA3. 1-HSP70 为模板，设计引物，P3 :5' -GCCATGACGAAAGACAACAATCTG-3 ‘( SEQ ID N0. 3) ；P4 5' -GGTCTGCTTCGCTACTGCCATCTACC-TCCTCAATGG-3‘ (SEQ ID N0. 4)， 再以此对引物的PCR产物为模板，设计引物P5 5 ‘ -CACCACCTACTCCGACAACC-3 ‘ (SEQ IDN0. 5) ；P6 5 ‘ -ATGGATCCTAATAGGAGTGGCCGGTGGGGT-CTGCTTCGCTACTG-3 ‘ (SEQ ID N0. 6)，以引物P5，P6经PCR得到目的片段，目的片段与T-easy载体连接，连接产物转化 E.coli DH5a宿主菌。筛选出测序正确的质粒后用限制性内切酶Bsu 151和Cla 1双酶切 后，与pcDNA3. 1-HSP70真核表达载体经Bsu 151和Cla 1双酶切后，切胶回收的大片段连 接，连接产物转化E.coli DH5a宿主菌，挑选阳性克隆，双酶切鉴定。 3真核表达质粒pcDNA3. I-BlyS构建以从人早幼粒细胞性白血病(HL-60)中抽提的mRNA为模板，设计引物P7 -TG GMGCTTCTCACGGTGGTGTCTTTCTAC-3 ‘ (SEQ ID N0. 7) ；P8 5' -TCAGGATCCTGGTGTAAGTAGGTC ACAGC-3' (SEQ ID N0. 8)；用P7，P8为引物进行PCR扩增，得到全长的BlyS基因。所得目 的片段经限制性内切酶BamH I、Hind III双酶切后，再与pcDNA3. 1真核表达载体经BamH I、 Hind III双酶切后切胶回收的大片段连接。连接产物转化E.coli DH5a宿主菌。4原核表达质粒pET-BLyS构建
将真核表达质粒pcDNA3. I-BlyS经限制性内切酶Xba I、Hind III双酶切后，切胶 回收小片段，与原核表达质粒PET-28a经限制性内切酶Xba I ,Hind III双酶切后，切胶回收 大片段连接，连接产物转化E. coli DH5a宿主菌。5真核表达质粒的纯化将含有pcDNA3. l-HSP70-MAGE-l(161_169)、pcDNA3. l_BlyS、pcDNA3. 1-HSP70 的 DH5 a 工程菌接种在LB培养基中发酵培养。收集菌体后先按一般大量抽提质粒的方法粗提，质粒 粗品彻底消化RNA后，再经DEAE-Cellulose柱层析进一步纯化，即在TE (pH 8. 0)缓冲条件 下，先用0. 3mol/L NaCl溶液洗脱除去杂质，再用0.6mol/L NaCl溶液将质粒DNA洗脱收集， 收集液用2倍体积的乙醇沉淀，离心20min，所得沉淀即为纯化质粒，经BamH I、Hind III双 酶切图谱验证质粒。并测定样品吸光度的比值(A260nm/A280nm)，且结合琼脂糖凝胶电泳估 计核酸的纯度。6BlyS原核蛋白的表达纯化将含有重组质粒pET-28a-BlyS的BL21工程菌，接种于含50 μ g/ml的硫酸卡那 霉素的LB培养基中，37°C 280rpm振荡培养10h。然后再将培养物按2% ν/ν接种于同样 含50 μ g/ml的硫酸卡那霉素的LB培养基，37°C 280rpm振荡培养4h后，再加入终浓度为 5mmol/L的诱导物IPTG去诱导BlyS表达。再继续培养6h后收集细菌BL21。用溶菌酶和 Dnase I裂解BL21细胞，离心取上清后用20-35%的饱和(MM)2SO4沉淀，再用25mmol/L Tris-HCKpH 7.6)溶解。透析后将此溶液转移入用25mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)平衡的 DEAE纤维素柱中，0-0. 4mol/L NaCl梯度洗脱，收集峰值时融合蛋白，通过超滤浓缩后，再过 经 20mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)平衡的 S印hadex G-100 柱，20mmol/L Tris-HCl (pH 7.6) 洗涤后收集融合蛋白，用水透析得到纯化的融合蛋白BlyS。低压冻干后储存于-20°C。7pcDNA3. I-BlyS 体外表达检测采用Wizard质粒DNA纯化系统制备转染实验使用的超纯质粒。按 Lipofectamine2000脂质体转染试剂盒操作瞬时转染MCF-7细胞，培养2天后，提取mRNA和 蛋白，分别用于PCR和western blot检测，以确定其能否体外表达。8免疫方案(图1)及肿瘤模型建立选用6 周龄 C57BL/6 雄性小鼠，设 PBS 空白对照组、pcDNA3. 1-HSP70-MAGE_1(161_169) 给药组(I )、pcDNA3. I-BlyS 阴性对照组(II )、pcDNA3. 1-HSP70-MAGE_1(161_169)加 pcDNA3. I-BlyS 佐剂组(III )、pcDNA3. 1-HSP70-MAGE_1(161_169)加 BlyS 原核表达蛋白组 (IV)0各组pcDNA3. 1-HSP70-MAGE-1(161_169)质粒均以100 μ g/只肌肉注射免疫小鼠3次， 时间分别为-37,-25,-13天。pcDNA3. I-BlyS (100 μ g/只，肌肉注射)和BlyS原核表达蛋 白(IOyg/只，腹腔注射)在第1次、第2次质粒免疫后一周给药。PBS对照组同时给予相 同体积的PBS。免疫后每周取血，ELISA测定抗MAGE-I抗体。3次免疫后的第2周，将收获 的对数生长期的肿瘤细胞用生理盐水洗3次，计数并调整细胞浓度为5X IO6个/mL。实验 组和对照组小鼠均皮下接种200 μ L B16F10肿瘤细胞悬液。接种后第2周处死小鼠，剥取 实体瘤并称重，比较各组抑瘤差异。9免疫小鼠血清抗MAGE-IIgG类抗体的检测MAGE-I九肽包被96孔酶标板，以HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体(1 20000稀释) 作为第二抗体，检测免疫小鼠血清(1 100稀释)中抗MAGE-IIgG类抗体。采用TMB显色，酶标仪测得吸光度值(A450nm)显示抗体水平。结果1真核表达质粒pcDNA3. 1-HSP70构建以限制性内切酶BamH I、Hind III双酶切，筛选阳性转化子(图2)，测序正确证明 已成功构建了真核表达质粒pcDNA3. 1-HSP70。2 真核表达质粒 pcDNA3. 1-HSP70-MAGE_1(161_169)构建以P3、P4为筛选引物，PCR筛选验证阳性转化子(图3)，测序正确证明已成功构建 了 真核表达载体 pcDNA3. 1-HSP70-MAGE-1(161_169)。3真核表达质粒pcDNA3. I-BlyS构建以限制性内切酶BamH I、Hind III双酶切，筛选阳性转化子(图4)，测序正确证明 已成功构建了真核表达质粒pcDNA3. I-BlyS04原核表达质粒pET-BLyS构建以限制性内切酶Xba I ,Hind III双酶切，筛选阳性转化子，测序正确证明已成功构 建了原核表达质粒pET-BlyS(图5)。5真核表达质粒pcDNA3. 1-HSP70的纯化琼脂糖凝胶电泳(图6)表明大规模制备质粒无明显的RNA条带，加样孔无亮带。 说明此工艺大规模提取的质粒DNA无RNA和杂蛋白的污染。纯化后的质粒DNA的A260nm/ A280nm的值为1. 86，符合一般认为纯DNA样品的比值。6 真核表达质粒 pcDNA3. 1-HSP70-MAGE_1(161_169)的纯化琼脂糖凝胶电泳(图7)表明大规模制备质粒无明显的RNA条带，加样孔无亮带。 说明此工艺大规模提取的质粒DNA无RNA和杂蛋白的污染。纯化后的质粒DNA的A260nm/ A280nm的值为1. 80，符合一般认为纯DNA样品的比值。7真核表达质粒pcDNA3. I-BlyS的纯化琼脂糖凝胶电泳(图8)表明大规模制备质粒无明显的RNA条带，加样孔无亮带。 说明此工艺大规模提取的质粒DNA无RNA和杂蛋白的污染。纯化后的质粒DNA的A260nm/ A280nm的值为1. 84，符合一般认为纯DNA样品的比值。8BlyS原核蛋白的表达纯化SDS-PAGE电泳(图9)表明我们成功将质粒pET-BlyS在E. coli BL21中表达，并 通过DEAE-纤维素离子交换柱和Si^phadex G-100柱处理得到了纯化的可用于动物给药的 融合蛋白BlyS。9pcDNA3. I-BlyS 体外表达检测Western blot (图10)和琼脂糖凝胶电泳(图11)显示转染了 pcDNA3. I-BlyS的 MCF-7细胞较转染pcDNA3. 1空载体的细胞无论是在BlyS蛋白水平还是在mRNA水平均显著 升高。表明我们构建的真核表达质粒pcDNA3. I-BlyS能够在真核细胞中表达BlyS蛋白。10疫苗的抑瘤效果选择B16F10黑色素瘤对各免疫组抑瘤情况进行比较(表1)。 pcDNA3. 1-HSP70-MAGE-1DNA疫苗对B16F10黑色素瘤有明显的抑瘤作用，而空载体质粒 pcDNA3. I-BlyS免疫组与PBS对照组没有明显区别。添加pcDNA3. 1-BlyS或者是BlyS融合 蛋白后，明显提高了 DNA疫苗的抑瘤效果。
表1 :DNA疫苗对B16F10黑色素瘤作用 11免疫小鼠血清抗MAGE-IIgG类抗体的检测对pcDNA3. 1-HSP70-MAGE-1 组和 pcDNA3. 1-HSP70-MAGE-1 加 BlyS 佐剂组的免疫 血清中抗MAGE-I-IgG类抗体进行了检测和比较(图12)。从ELISA的测定结果可以得出两 个结论pcDNA3. 1-HSP70-MAGE-1DNA疫苗可以打破机体对自身肽的免疫耐受，激发较强的 体液免疫；细胞因子BlyS可以作为基因工程疫苗的佐剂，明显提高基因免疫的抗体水平。序列表<110>中国药科大学<120> 一种基因工程疫苗及其制备方法和在制药中的应用<160>9<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>上游引物<400>1taaaagcttg gcaccggcat ggccaaagc 29<210>2<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>下游引物<400>2ttgggatccc tagctagcat ctacctcctc aatggtg 37<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>上游引物
<400>3
gccatgacga aagacaacaatctg 24
<210>4
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>下游引物
<400>4
ggtctgcttc gctactgccatctacctcctcaatgg 36
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>上游引物
<400>5
caccacctac tccgacaacc20
<210>6
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>下游引物
<400>6
atggatccta ataggagtggCCggtggggtctgcttcgct actg 44
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>上游引物
<400>7
tggaagcttc tcacggtggtgtctttctac30
<210>8
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>下游引物<400>8tcaggatcct ggtgtaagta ggtcacagc 39<210>9<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223〉<400>9Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr1权利要求
一种基因工程疫苗，其特征在于该疫苗为采用B淋巴细胞刺激因子为分子佐剂增强的基因工程疫苗HSP70-MAGE-1(161-169)。
2.根据权利要求1所述的基因工程疫苗，其特征在于B淋巴细胞刺激因子分子佐剂的 形式为BlyS真核表达载体和/或BlyS融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的基因工程疫苗，其特征在于BlyS真核表达载体为 pcDNA3. I-BlyS0
4.如权利要求1所述基因工程疫苗的制备方法，该方法包括下列步骤a.采用MAGE-I(161_169)作为肿瘤特异性抗原，通过建立MAGE_1(161_169)与人HSP70的融合 基因，构建HSP70-MAGE-1(161_169)的真核表达载体；b.采用人BLyS基因构建BlyS的真核表达载体；或者将人BLyS基因克隆到融合蛋白原 核表达载体中，构建重组BLyS原核表达载体，用此重组BLyS原核表达载体转化大肠杆菌， 诱导大肠杆菌表达BlyS融合蛋白；c.将HSP70-MAGE-1(161_169)的真核表达载体与BlyS的真核表达载体或BlyS融合蛋白 合用即构成BlyS增强的基因工程疫苗HSP70-MAGE-1(161_169)。
5.根据权利要求4所述基因工程疫苗的制备方法，其特征在于HSP70-MAGE-1(161_169)的 真核表达载体为 pcDNA3. 1-HSP70-MAGE-1(161_169) ；BlyS 的真核表达载体为 pcDNA3. I-BlyS ； 重组BLyS原核表达载体为pET-28a-BlyS。
6.权利要求1所述的基因工程疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.B淋巴细胞刺激因子在制备肿瘤基因工程疫苗分子佐剂中的应用。全文摘要
本发明属于基因工程领域，公开了一种基因工程疫苗及其制备方法和在制药中的应用。该基因工程疫苗为采用B淋巴细胞刺激因子为分子佐剂增强的基因工程疫苗HSP70-MAGE-1(161-169)。该疫苗能增强抗B16F10黑色素瘤的活性，可用于制备抗肿瘤药物，B淋巴细胞刺激因子可作为肿瘤基因工程疫苗分子佐剂。
文档编号A61P35/00GK101879316SQ20091002678
公开日2010年11月10日 申请日期2009年5月6日 优先权日2009年5月6日
发明者商明红, 孙立, 张彦凯, 张陆勇, 林森森, 袁胜涛 申请人:中国药科大学