专利名称：：陈皮提取物在制备治疗肺纤维化药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及陈皮提取物在制备治疗肺纤维化药物中的应用。
背景技术：
：特发性肺纤维化(ldiopathicPulmonaryFibrosis,IPF)是一种原因不明、以进行性呼吸困难为突出临床表现的局限于肺部的一种特殊类型的慢性间质性肺炎，其病理改变为普通型间质性肺炎，以肺泡上皮损伤、成纤维细胞(Fibroblasts)增殖，并形成成纤维细胞灶(FibroblastFoci)为特征。胸部影像学表现为弥漫性网状、网结节阴影或蜂窝样改变，以中下肺野周边胸膜下为重，而磨玻璃样改变较少。肺功能呈限制性通气功能障碍和/或弥散功能受损，导致低氧血症。近年来，随着对肺间质性疾病研究的逐步深入，肺纤维化的发现率有明显上升趋势。IPF发病机制未完全阐明，至今也仍然没有有效的药物能逆转IPF的自然过程及其终末结局。目前治疗药物仍以糖皮质激素和免疫抑制剂/细胞毒药物为主，但疗效均不理想，对人体具有明显的毒副作用。如糖皮质激素，有效率仅10%~30%，甚至有报道无效，长期使用可引起严重的副作用。肺移植可以作为肺纤维化终末阶段，即蜂窝肺阶段的唯一有效治疗方法，但是由于适当的供体的缺乏、昂贵的医疗费用及免疫排斥等副作用，使它的开展受到限制。IPF预后甚差，确诊后平均存活24年，5年生存率为30%~50%，严重危害病人的健康和生存。因此，积极寻找能有效阻断胶原沉积，延缓纤维化进程，并具有毒副作用小、长期服用安全可靠等特点的治疗方药，具有十分重要的理论和现实意义。陈皮为芸香科植物橘(C&mr幼'cw/afeBlanco)及其栽培变种的干燥成熟果皮。陈皮气香，味辛、苦，性温，入脾、肺经。陈皮为常用传统中药，采用汤剂入药方式，具有理气健脾、燥湿化痰之功效，主要用于治疗呼吸系统和消化系统疾病。研究表明陈皮提取液具有抗过敏、抗氧化、清除氧自由基、抗肿瘤的作用及免疫调节作用，陈皮提取物能抑制人增生性瘢痕成纤维细胞增殖，促进其凋亡及I型胶原分解。在陈皮及其有效成份对肺的药理学研究中，目前仅发现陈皮挥发油有刺激性祛痰作用，陈皮水提取物及挥发油对离体豚鼠支气管平滑肌具有舒张作用，尚无陈皮对肺纤维化及肺成纤维细胞作用的研究报道。
发明内容本发明提供陈皮提取物在制备治疔肺纤维化药物中的应用，可以有效减少胶原沉积，延缓纤维化进程。所述陈皮提取物为陈皮加溶媒加热回流后得到的提取物或陈皮经水蒸汽蒸馏得到的挥发油。所述溶媒一般为水、乙醇或异丙醇。其中乙醇优选为质量百分比浓度为50%-100%的乙醇，更优选为质量百分比浓度为75%的乙醇。所述陈皮提取物按下述方法制得(1)将干燥陈皮粉碎成粉状，加溶媒，浸过陈皮表面l2cm，加热，回流1小时，趁热过滤；(2)在药渣中按(1)中的方法再加溶媒加热回流，趁热过滤；(3)合并滤液，将滤液减压浓縮，干燥得到陈皮水提物干粉。其中所述干燥可以为公知的各种方式，如风干、60度以下烘干或冷冻干燥。作为本发明的改进，所述挥发油为用水蒸汽蒸馏后用有机溶剂萃取，使有机溶剂挥发后得到的挥发油。所述有机溶剂为乙醚或石油醚。本发明中利用水、乙醇等溶媒提取，减压浓縮除去提取液中的溶媒，或利用水蒸气蒸馏法得到挥发油，成功地得到了陈皮提取物，将之作为治疗肺纤维化的药物进行实验研究，结果表明可以降低与纤维化紧密相关的生物指标血清及肺中羟脯氨酸含量、肺组织中转化生长因子(31蛋白及信使核糖核酸(mRNA)表达水平，有效抑制人胚肺成纤维细胞(HELF)增殖，延缓肺泡炎的产生和肺纤维化进程。同时陈皮为常用传统中药，毒副作用小、长期服用安全可靠。具体实施例方式实施例1:陈皮提取物制备具体制备方法如下①将干燥陈皮粉碎成粗粉，加适量的蒸馏水，浸过药材表面约l2cm，加热，回流1小时，趁热过滤。在药渣中再加适量蒸馏水同法加热回流，趁热过滤，合并滤液。②滤液减压浓縮，冷冻干燥得到陈皮提取物干粉，以下简称水提物。实施例2:陈皮提取物制备具体制备方法如下①将干燥陈皮粉碎成粗粉，加适量的75%乙醇，浸过药材表面约12cm，加热，回流1小时，趁热过滤。在药渣中再加适量75%乙醇同法煎煮，合并滤液。②滤液减压浓縮，冷冻干燥得到陈皮提取物干粉，以下简称醇提物。实施例3:陈皮提取物制备具体制备方法如下干燥陈皮粉碎成粗粉，用水蒸气蒸馏法提取挥发油反复多次，合并蒸馏液并用乙醚萃取，收集乙醚液，挥干，得到陈皮提取物，以下简称挥发油。实施例4:陈皮水提物、醇提物和挥发油对人胚肺成纤维细胞(HELF)增殖抑制作用实验在DEME培养液(美国HyClone公司)中加入10%小牛血清和1%青霉素G钾和链霉素制成培养液，取2-3代汇合度80%的HELF细胞，0.25%胰蛋白酶消化，用上述培养液制成浓度为5xl044(个/毫升)细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，每孔接种100微升，置于37'C，5%C02饱和湿度条件下培养，培养12小时。待细胞完全贴壁，形态延展良好后加入含有不同浓度的待测药的DMEM培养液，培养24小时，其中，药物浓度为药物与全体细胞培养液的质量体积比，阳性对照药泼尼松为目前的临床使用的肺纤维化治疗药，其加入量为l微摩尔。利用MTT法(波长570nm)测定吸光值，计算抑制率[g卩(对照组吸光值一药物组吸光值)/对照组吸光值]，结果如下-抑制率(％)待测药300毫克/毫升150毫克/毫升15毫克/毫升毫克/毫升0.5毫克/毫升0毫克/毫升1微摩尔对照_—一一_0.0±10.7—泼尼松_—————19.8士2.3*水提物—290,7±7.1**—104.0士22.2"一0.9士5.218.6±4.1*16.6±4.6*——醇提物15.9±7.529.2±2.5*51.0±3.7*49.7±2.1*37.5±4.3*——挥发油46.6±1,1*49.7±5.8*54.5±0.5*44.2±2.7*41.7±6.7*——"一"表示对人胚肺成纤维细胞(HELF)增殖具有促进作用。*尸<0.05，**P<0.01。从上表可以看出陈皮水提物、醇提物和挥发油对人胚肺成纤维细胞(HELF)增殖均有抑制作用，以乙醇提取物和挥发油作用为强。实施例5:陈皮醇提物对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化的防治作用实验将35只SD大鼠编号、称重后，随机分为A、B、C、D、E五组，每组7只。A组正常组。B组对照组。C组泼尼松组，建模后次日起每天用泼尼松5毫克/公斤，灌胃。D组陈皮醇提物组，建模后次日起每天用陈皮乙醇提物100毫克/公斤，灌胃。E组陈皮醇提物组，建模后次日起每天用陈皮乙醇提物200毫克/公斤，灌胃。其中，B-E组按照下列方法建模，步骤如下用苯巴比妥腹腔注射将大鼠麻醉后仰卧于实验台上，固定大鼠头部和四肢，轻轻拉出舌，压迫舌腹，在额镜直视下，窥见声门，趁大鼠吸气瞬间，迅速将与注射器相连的顶端磨钝的9号腰穿针(药液预先装在注射器内)插入约达气管分叉处，缓缓注入博莱霉素溶液，用量为0.2毫升/100克。注药完毕将动物直立、旋转数分钟，尽量使药物在肺内分布均匀。A组按上述步骤一次性气管内注射生理盐水0.2毫升/100克，作为正常组。大鼠清醒后常规分笼饲养。各组大鼠均于实验第28天，灌胃给药2小时后麻醉，腹主动脉取血后处死，制备血清，并行肺组织取样，进行下列项目的检测l)一般情况观察分别观察各组大鼠造模前后及给药干预前后的-一般状态，包括体重情况、体毛情况、精神状态、活动情况、呼吸及死亡情况等。结果见下表(大鼠体重，单位为克)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*尸<0.05，**尸<0.01。由于气管内注入博莱霉素造成大鼠机体呼吸功能障碍，继发引起机体营养物质的消化、吸收出现严重障碍，体内分解代谢大于合成代谢，而使机体出现生长缓慢。大鼠早期出现体重下降(第一、第二周)。泼尼松为目前临床使用抗肺纤维化治疗药，该药虽能提高食欲，但因其有促进蛋白质分解、抑制其合成及抑制免疫而导致生长缓慢、肌肉消瘦等副作用，故泼尼松组大鼠体重下降尤为明显。结果表明第7天时对照组、泼尼松组的体重显著低于正常组(尸<0.01);而醇提取物100和200毫克/公斤/天剂量组体重与对照组比较有显著性增加(J°<0.05)，陈皮乙醇提取物200毫克/公斤/天组在第二周还可以显著增加大鼠的体重(P<0.05)。与泼尼松相比，陈皮乙醇提取物没有泼尼松的副作用，可以显著改善由博莱霉素造成的大鼠体重下降。2)血清和肺组织羟脯氨酸含量血清和肺组织羟脯氨酸含量用样本碱水解法及紫外分光光度计检测。结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*P<0.05，尸<0.01。肺纤维化的特点是肺中胶原蛋白合成的速度大于降解的速度，胶原纤维显著增多，最终导致胶原的逐渐积累。羟脯氨酸是组成机体胶原蛋白的一种特有的氨基酸，除弹性蛋白含少量羟脯氨酸(约1%)外，几乎所有羟脯氨酸都存在于胶原中，故组织中羟脯氨酸含量能反映器官纤维化的程度。结果表明陈皮乙醇提取物200毫克/公斤/天组(E)血清及肺中羟脯氨酸含量显著低于对照组，陈皮乙醇提取物100毫克/公斤/天组(D)血清羟脯氨酸含量与对照组比较无显著性差异，但肺组织羟脯氨酸含量与对照组比较有显著性差异。显示了陈皮乙醇提取物具有降低羟脯氨酸含量的作用，从而降低纤维化的程度。3)肺组织病理学观察右肺常规固定后，用PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.4)冲洗、乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡定向包埋，制成蜡块，4微米连续切片，行HE(苏木精-伊红)及VanGieson(VG)染色，观察肺组织病理学变化，奥林巴斯光学显微镜观察并照像，确定肺泡炎和肺纤维化的程度，并将肺泡炎和肺纤维化分级及计算积分，进行病理半定量分析。结果见下表。组别肺泡炎纤维化-+卄4+f积分-+卄积分正常组A2000.3±0,5**1100.4±0.8**对照组B00432.4±0.500162.9±0.4泼尼松组C0401.4±0.5**0221.9±0.9*醇提物组D011.7±0.8*02411.9±0.7*醇提物组E23201.0±0.8"13301.3±0.8***尸<0.05，**P<0.01。肺部病理形态的改变是最为直观的疗效衡量标准。本实验结果显示对照组肺泡间隔明显增厚，大量炎性细胞浸润，重度纤维组织增生，可见大量成纤维细胞增殖和胶原纤维，胸膜下肺泡结构破坏紊乱，肺泡隔变薄或断裂，且对照组病理积分较正常组高，存在显著性差异。结果表明陈皮乙醇提取物100毫克/公斤/天组(D)及200毫克/公斤/天组(E)肺泡炎积分和肺纤维化积分显著低于对照组，对肺纤维化具有防治作用。4)肺组织中转化生长因子pi(TGF-PO蛋白及信使核糖核酸(mRNA)的表达水平组别蛋白TGF-^信使核糖核酸面积(平方微米)积分光密度面积(平方微米)积分光密度正常组A359.79±20.73**56.55±6.76"209.72±28.23*59.10±6.31*对照组B567.88±88.8075.05±7.41367.34±46.5577.24±1.92泼尼松组c472.73±39.83*65.44±8.42*279.77±26.95*71.55±2.00*醇提物组D461.19±72.00*64.54±2.00*283.58±26.35*72.32±3.47*醇提物组E368.07±63.72*62.08士2.92*267.75±21.54*69.26±6.01***户<0.05，**P<0.01。转化生长因子(31是已知作用很强的致纤维化细胞因子，在肺纤维化发生的细胞因子网络中占据着重要地位，对肺纤维化的发生发展至关重要；该因子在肺纤维化发生发展过程中持续上调，它可以趋化并促进成纤维细胞的增殖，刺激成纤维细胞分泌前胶原。结果表明陈皮乙醇提取物100毫克/公斤/天(D)及200毫克/公斤/天组(E)可以显著降低肺组织中转化生长因子P1蛋白及信使核糖核酸(mRNA)表达水平。本结果说明陈皮乙醇提取物可以通过降低转化生长因子(31蛋白及信使核糖核酸两个方面的表达发挥抑制肺纤维化的功效。权利要求1.陈皮提取物在制备治疗肺纤维化药物中的应用。2.如权利要求1所述的陈皮提取物在制备治疗肺纤维化药物中的应用，其特征在于所述陈皮提取物为陈皮加溶媒加热回流后得到的提取物或陈皮经水蒸汽蒸馏得到的挥发油。3.如权利要求2所述的陈皮提取物在制备治疗肺纤维化药物中的应用，其特征在于所述溶媒为水、乙醇或异丙醇。4.如权利要求3所述的陈皮提取物在制备治疗肺纤维化药物中的应用，其特征在于所述乙醇为质量百分比浓度50%-100%的乙醇。5.如权利要求4所述的陈皮提取物在制备治疗肺纤维化药物中的应用，其特征在于所述乙醇为质量百分比浓度为75%的乙醇。6.如权利要求2-5中任一项所述的陈皮提取物在制备治疗肺纤维化药物中的应用，其特征在于所述陈皮提取物按下述方法制得(1)将下燥陈皮粉碎成粉状，加溶媒，浸过陈皮表面12cm，加热，回流1小时，趁热过滤；(2)在药渣中按(1)中的方法再加溶媒加热回流，趁热过滤；(3)合并滤液，将滤液减压浓縮，干燥得到陈皮提取物干粉。7.如权利要求6所述的陈皮提取物在制备治疗肺纤维化药物中的应用，其特征在于所述干燥为风十、60度以下烘干或冷冻干燥。8.如权利要求2所述的陈皮提取物在制备治疗肺纤维化药物中的应用，其特征在于挥发油为用水蒸汽蒸馏后用有机溶剂萃取，使有机溶剂挥发后得到的挥发油。9.如权利要求8所述的陈皮提取物在制备治疗肺纤维化药物中的应用，其特征在于所述有机溶剂为乙醚或石油醚。全文摘要本发明提供陈皮提取物在制备治疗肺纤维化药物中的应用，可以有效减少胶原沉积，延缓纤维化进程。所述陈皮提取物为陈皮加溶媒加热回流后得到的提取物或陈皮经水蒸气蒸馏得到的挥发油。所述陈皮提取物按下述方法制得(1)将干燥陈皮粉碎成粉状，加溶媒，浸过陈皮表面1～2cm，加热，回流1小时，趁热过滤；(2)在药渣中按(1)中的方法再加溶媒加热回流，趁热过滤；(3)合并滤液，将滤液减压浓缩，干燥得到陈皮提取物干粉。本发明可以降低与纤维化紧密相关的生物指标血清及肺中羟脯氨酸含量、肺组织中转化生长因子β1蛋白及信使核糖核酸(mRNA)表达水平，有效抑制人胚肺成纤维细胞(HELF)增殖，延缓肺泡炎的产生和肺纤维化进程。文档编号A61K36/752GK101554422SQ20091002793公开日2009年10月14日申请日期2009年5月13日优先权日2009年5月13日发明者周贤梅申请人:江苏省中医院