专利名称：兽用狂犬疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药生物制品领域，具体涉及一种兽用狂犬疫苗及其制备方法。
背景技术：
狂犬病又称恐水症，是由狂犬病病毒引起的一种人畜共患的中枢神经系统急性传 染病，狂犬病病毒属核糖核酸型弹状病毒，通过唾液传播，多见于狗，狼，猫等食肉动物，人 一旦被携带狂犬病毒的此类动物咬伤，就会感染发病，其病死率为100 %，近年来，我国狂犬 病疫情持续上升，疫情波及的地区也在迅速扩大，年报告发病人数连续突破3000例，高居 世界第2位，死亡人数高居37种法定传染病报告病死数之首。有效预防和控制狂犬病的关 键在于加强疫源性动物的全面免疫。现行的用于动物狂犬病预防的疫苗包括弱毒苗和灭活 苗，目前国内动物免疫中广泛使用的是狂犬病弱毒活疫苗，这类疫苗制备简单，但在易感动 物体内存在返祖的潜在可能和免疫原性差的缺陷，欧美发达国家早已停止使用此类疫苗， 而都普遍使用灭活苗，灭活苗在制成前需要进行浓缩，成本很高，由于生产技术障碍和成本 上的考虑，目前国内兽用狂犬病灭活疫苗完全依赖进口，且价格昂贵，因此，必须突破技术 和成本上的难关，加快我国兽用狂犬病灭活疫苗的研制和生产。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术上的缺陷和条件不足，提供一种生产成本 低廉，且高效安全的兽用灭活狂犬疫苗的制备方法。本发明通过以下技术方案实现一种细胞培养的灭活疫苗，制备该疫苗所用基质细胞为幼仓鼠肾传代细胞 (BHK-21)经单细胞克隆法制得的BSR细胞，该细胞于2009年03月05日保藏在中国普通微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究 所，保藏编号=CGMCC NO. 2910 ；所用种毒为狂犬病病毒SAD株，于2009年03月23日保藏在 中国典型培养物保藏中心，武汉，武汉大学，保藏编号CCTCC N0.V200906。制备上述兽用灭活狂犬疫苗的步骤包括1)从工作细胞库中复苏BSR细胞，进行细胞的传代扩增，细胞采用转瓶培养，培养 液为含8% 10%新生小牛血清的DMEM培养液，培养温度为35 37°C。2)取狂犬病病毒SAD株毒种接种于经转瓶培养生长良好的BSR细胞，经吸附后于 33°C 35°C温度条件下培养至病毒增殖高峰期，病毒培养液为含2% 3%新生小牛血清 的DMEM培养液，每间隔2 4天收获一次病毒液，其间每收获一次更换新的病毒培养液。3)收获病毒液，加入甲醛溶液，置于33°C 35°C温度下经24 26小时灭活病毒。4)将灭活后的病毒液加入佐剂至终浓度达400 700ug/ml，充分混勻吸附，定量 分装得到兽用狂犬病灭活疫苗。上述第3)步中灭活病毒采用终浓度为1 4000的甲醛。上述第4)步中采用的佐剂为氢氧化铝。
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与现有公开技术相比，本发明具有如下优点1、本发明制得产品免疫原性高，机体抗体产生时间快、抗体水平高、保护期长，病 毒完全灭活不存在返祖的安全性问题。经过免疫的动物保护率达90%以上，注射1周后动 物即会产生中和抗体，并在14 30天左右达到2. 0国际单位以上，2 3月达到峰值，平均 值为6. 0国际单位以上，免疫1年后中和抗体水平仍在0. 5个国际单位以上，高于世界卫生 组织公认的0. 5个国际单位的保护抗体水平。对三月龄犬及妊娠母犬做安全性试验，均未 出现体温异常变化、全身或局部反应，精神状态也正常，尤其对妊娠母犬无不良反应，分娩 仔犬均健活，未出现流产、死胎等现象，说明本疫苗对妊娠母犬和一般的犬均非常安全，SAD 病毒完全灭活不存在返祖的安全性问题。2、本发明采用的细胞易于规模化培养、病毒产量高，可实现大批量生产。采用 的BSR细胞为传代细胞，生长旺盛，易于大规模培养，可以大分种比例进行传代培养，培养 36 48小时细胞可生长为致密单层，利用BSR细胞培养SAD病毒，病毒产量可达到107。 0FFU/ML以上，远高于采用VERO细胞和其它细胞系培养Flurry LEP株、PV株和其它病毒株
的病毒产量。3、生产过程主要原材料均可采用国产产品，疫苗制造直接成本远低于进口疫苗， 且生产过程无需经过病毒液浓缩纯化等工艺，只需病毒液灭活后加佐剂吸附即可制成，因 此可大大节约设备等方面的成本，流程简单。4、采用终浓度为1 4000的甲醛灭活病毒，不但灭活效率高，而且简单易行，节约 成本。5、采用氢氧化铝佐剂来吸附，避免了以往采用油乳佐剂成本高、副作用大的缺点， 并能取得良好效果。因此，本发明具有良好的经济效益和社会效益。
图1为本发明制备方法的流程图
具体实施例方式下面结合附图和实施例来进一步说明本发明方法的
具体实施例方式1、自工作种子细胞库中取出第82代3支冻存的BSR细胞，分别接种到3个T25细 胞瓶中，每瓶加入12 15ml含10%牛血清的DMEM培养液，PH7. 2 7. 5，于37°C、5% C02 环境中培养2 3天至长成良好单层(约为3-5X IO6个细胞)后用0. 25%胰酶消化，以适 当比例分种，自T25——T75——T125-—K氏瓶-—3L转瓶-—15L转瓶共扩大培养22天， 获得第89代30个15L瓶处于对数生长期形态良好的细胞。2、弃去营养液，按0. 1/0. 01M0I (单细胞感染量)的比例将狂犬病毒SAD株接种至 细胞瓶，吸附4 6小时后每瓶加入含2%小牛血清，谷氨酰胺，0庆大霉素的维持 液2000 2500ml，以7. 5%碳酸氢钠调节PH值至7. 4 7. 6，置33°C 35°C环境、10转/ h培养。于培养后第4，7，10天收获病毒液并更换新鲜维持液，共获得病毒原液198000ml。 取样用 FITT 法检测病毒滴度分别为 107_5FFU/ml、108_5FFU/ml、107_°FFU/ml。3、收获的病毒液按终浓度1/4000加入甲醛溶液，于33°C 35°C灭活26小时并取
4样做灭活试验。合并灭活试验合格、滴度> 106 5FFU/ml的病毒原液共198000ml，加入氢氧 化铝佐剂充分混勻吸附终至浓度为450ug/ml，定量分装得兽用狂犬病灭活疫苗。按以上实施例方法生产5批兽用狂犬病灭活疫苗，每批随机抽检成品检定结果如 下 各项指标均符合质量要求。
权利要求
一种兽用狂犬病疫苗，其特征在于所述疫苗为细胞培养的灭活疫苗，制备该疫苗所用基质细胞为幼仓鼠肾传代细胞(BHK 21)经单细胞克隆法制得的BSR细胞，保藏在CGMCC，保藏编号NO.2910；所用种毒为狂犬病病毒SAD株，保藏在CCTCC，保藏编号NO.V200906。
2.一种制备上述兽用狂犬病疫苗的方法，其特征在于其制备步骤为1)从工作细胞库中复苏BSR细胞，进行细胞的传代扩增，细胞采用转瓶培养，培养液为 含8% 10%新生小牛血清的DMEM培养液，培养温度为35 37°C。2)取狂犬病病毒SAD株毒种接种于经转瓶培养生长良好的BSR细胞，经吸附后于 33°C 35°C温度条件下培养至病毒增殖高峰期，病毒培养液为含2% 3%新生小牛血清 的DMEM培养液，每间隔2 4天收获一次病毒液，其间每收获一次更换新的病毒培养液。3)收获病毒液，加入甲醛溶液，置于33°C 35°C温度下经24 26小时灭活病毒。4)将灭活后的病毒液加入佐剂至终浓度达400 700ug/ml，充分混勻吸附，定量分装 得到兽用狂犬病灭活疫苗。
3.根据权利要求2所述的制备兽用狂犬疫苗的方法，其特征在于所述第3)步中灭活 病毒采用终浓度为1 4000的甲醛。
4.根据权利要求2所述的制备兽用狂犬疫苗的方法，其特征在于所述第4)步中采用 的佐剂为氢氧化铝。
全文摘要
本发明公开了一种兽用灭活狂犬疫苗的制备方法，该方法将狂犬病病毒SAD株毒种接种于BSR细胞进行转瓶培养，经过细胞传代扩增、病毒接种、病毒液收获、病毒灭活、吸附等步骤，制得兽用灭活狂犬疫苗SAD株。本发明制得产品免疫原性高，机体抗体产生时间快、抗体水平高、保护期长，病毒完全灭活不存在返祖的安全性问题，是动物狂犬病防治的新型疫苗。本发明采用的细胞易于规模化培养、病毒产量高，且生产过程无需经过病毒液浓缩纯化等工艺，显著节约成本，适合大批量推广应用。
文档编号A61P31/14GK101920013SQ20091003292
公开日2010年12月22日 申请日期2009年6月9日 优先权日2009年6月9日
发明者傅振芳, 韦建平 申请人:常州同泰生物药业科技有限公司