专利名称：：二氢杨梅素在制备防治肿瘤放化疗不良反应的药物的应用的制作方法
技术领域：
：本发明是涉及二氢杨梅素医药新用途，特别是涉及作为防治肿瘤放化疗的不良反应和毒副作用、预防肿瘤发生与肿瘤转移、防治肿瘤治疗中的并发性感染疾病等药物。
背景技术：
：二氢杨梅素(dihydromyricetin)，又称蛇葡萄素，学名为3，5，7，3',4'，5'—六羟基黄酮。二氢杨梅素是一种已知的化合物，文献WalterKarrarr，BirkhauserVerlagundStuttgart(1958),P.652，NO:1640公布了其结构式为:申请号03123879公开了含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物在制备广谱抗病毒药物和制备提高免疫力药物中的用途；申请号200410052153公开了蛇葡萄素在制备血管生成抑制剂的药物中的应用；申请号200410062289公开了蛇葡萄素在制备与醛糖还原酶相关疾病的药物中的用途；申请号03114133公开了蛇葡萄素在制备防治艾滋病药物中的应用；申请号00117225蛇葡萄素在制备抗白血病和抗鼻咽癌药物中的应用。但上述专利申请未公丌二氢杨梅素在抑制和清除自由基的化学损伤而防治机体的化学毒害、预防突变和继发性肿瘤发生与肿瘤转移，也未公开二氢杨梅素防治肿瘤放化疗治疗的不良反应、预防肿瘤治疗并发性感染等疾病的药物及保健食品中的应用。国内外抗肿瘤的临床药物中，主要包括细胞毒类药物、激素类药物和生物靶向治疗药，其中的细胞毒类化疗药物包括作用与DNA化学结构的药物(如丝裂霉素、环磷酰胺、顺铂等)、影响核酸合成的药物(如阿糖胞苷、氟尿嘧啶、巯嘌呤等)、作用于核酸转运的药物(如放线菌素D、平阳霉素等)、拓扑异构酶I抑制药(如羟喜树碱、拓扑替康等)、作用于微管蛋白的药物(长春新碱、紫杉醇等)等，这些化疗药物往往对肿瘤患者产生诸多严重不良反应，包括骨髓抑制、白细胞降低、心肌毒性、肝功能损伤、免疫力低下、抵抗力降低易引发细菌和病毒性感染、细胞突变和继发性肿瘤、肿瘤转移等。在肿瘤的放疗治疗中，由于辐射对机体产生显著伤害，也引发了肿瘤患者的多方面的不良反应。化疗药物和3放疗可以抗肿瘤，但本身都或多或少产生一些不良反应，也难以控制和消除不良反应，尤其是机体突变和继发性肿瘤等。放化疗治疗中，化疗药物在体内引发自由基，或本身能转化为自由基形式的化学结构，攻击细胞膜脂质、蛋白质和核酸分子，破坏这些大分子的构象和结构稳定性，致使大分子的功能被损害或逐渐失活；由于大分子蛋白的功能失活、核酸(DNA和脂A)的线性结构断裂，导致基因突变发生，细胞修复功能严重下降，基因突变的累积将引发新的继发性肿瘤；器官应急反应机能和细胞逆境修复能力降低、化学毒副作用的累积将导致组织和器官伤害如骨髓抑制与白细胞低下导致免疫力下降而并发性感染难以控制、毛囊和真皮层损伤而导致脱发或皮疹，消化道和消化器官往往更易受到细胞毒类化疗药物的毒性作用，引发厌食、呕吐、恶心、体力严重下降等。肿瘤患者一般免疫力低下，对外源化学物质的应急反应和毒性作用的修复的能力也很低，因此肿瘤临床治疗中迫切需要既能预防肿瘤发生、控制肿瘤进展和肿瘤转移，又能控制、减轻或防治肿瘤药物治疗的不良反应，本身却很少产生药物不良反应或毒副作用的新型防治肿瘤药物。而本发明中提供的二氢杨梅素作为防治肿瘤放化疗不良反应的药物，又能抗肿瘤、预防细胞突变和继发性肿瘤与肿瘤转移、感染、或骨髓抑制。-
发明内容本发明的目的是提供二氢杨梅素在制备防治肿瘤放化疗不良反应的药物的应用。其化疗优选为细胞毒类药物化疗。所述细胞毒类化疗药物优选为作用于DNA化学结构的药物、作用于核酸转运的药物、拓扑异构酶I抑制药或作用于微管蛋白的药物。所述作用于核酸合成的药物为氟尿嘧啶。所述作用于微管蛋白的药物为长春新碱或紫杉醇。所述作用于DNA化学结构的药物为环磷酰胺、丝裂霉素或顺铂。所述防治肿瘤放化疗不良反应为骨髓抑制、血细胞降低、细胞突变、脱发或继发性肿瘤。所述肿瘤放化疗不良反应为乳腺癌、宫颈癌或肠癌放化疗不良反应，二氢杨梅素与化疗药物联合用药提高肿瘤治疗疗效。所述二氢杨梅素与化疗药物联合用药是指用药学上可接受的辅料制备的贴剂、软膏剂、凝胶剂、软胶囊剂或栓剂。所述药物为用药学上可接受的辅料制备的口服固体制剂、口服液体制剂、注射液、冻干粉针剂或大输液剂型。本发明创造性发现二氢杨梅素清除自由基、抑制自由基反应链，从而预防、控制或消除化学药物和辐射对组织细胞和器官的伤害或毒害，也发现二氢杨梅素抗突变和抑制肿瘤基因表达和引发肿瘤细胞凋亡而防治肿瘤发生、防治继发性肿瘤及转移，还发现二氢杨梅4素抑制病毒转染而防治感染。因此，二氢杨梅素作为防治肿瘤放化疗不良反应的药物，抑制和减轻化学伤害、防治致突变剂的损害而预防基因突变或继发性肿瘤，将与放化疗联合用药而实现防治肿瘤放化疗不良反应和预防肿瘤发生。绝大多数肿瘤患者死亡的直接原因并非肿瘤本身，而是肿瘤放化疗的不良反应及并发性感染等。因此，肿瘤临床治疗的目标是，结合切除手术，通过药物治疗，有效控制和消除肿瘤，降低放化疗治疗中的不良反应，消除肿瘤治疗中的并发症，提高患者的生存质量和远期疗效。二氢杨梅素集多种药理与药效作用于一身的多功能的特点是目前肿瘤临床治疗中单一药物所不具备的，将使得它在肿瘤治疗中得到广泛应用。图1为二氢杨梅素对正常血红蛋白的保护以及对TBHP引起的高铁血红蛋白生成的抑制作用图。图2a为用DMPO(0.1mol/L)捕集的Fenton反应体系产生的羟基自由基的ESR波谱。图2b为体系中加入二氢杨梅素对该体系产生的羟基自由基的ESR波谱。图3a为用DMPO捕集的光照核黄素/EDTA)体系产生的0—2自由基的ESR特征波谱。图3b为体系中加入二氢杨梅素对该体系产生的0—2自由基的ESR特征波谱。具体实施例方式为了更好地理解本发明的实质，通过下面的实施例详细说明本发明，但是应该理解这些实施例只是说明本发明，而不是在任何方面限制本发明的范围。实施例l:从显齿蛇葡萄植物中提取与纯化制备二氢杨梅素将显齿蛇葡萄植物的幼嫩叶、或嫩芽、或幼嫩叶和嫩芽混合物l公斤，按l:81:12的重量比(原料水)加入水，浸泡30分钟-4小时后，加热至沸腾，保温提取3060分钟，趁热过滤或离心分离，收集提取液；再次按l:51:8的重量比(原料水)加入水，加热至沸腾，保温提取2040分钟，趁热过滤或离心分离，合并收集提取液；浓缩提取液至原体积的20%50%，加入食用酒精至乙醇浓度为40%75%，加热至沸腾后保温1060分钟，稍微冷却后，过滤或离心除去沉淀，回收乙醇或直接将滤液冷却静置12天，收集沉淀(干燥沉淀物即得显齿蛇葡萄植物总黄酮提取物，或二氢杨梅素的粗提取物)。将沉淀以l:510的重量比水加热溶解，冷却静置12天获得二氢杨梅素的结晶物，分离纯化二氢杨梅素；再对结晶物加适量水热溶，冷却静置12天获得二氢杨梅素的重结晶物；经24次重结晶即可纯化制备含量超过99%以上的二氢杨梅素。实施例2:二氢杨梅素的结构确证实施例1制备的二氢杨梅素。(1)核磁共振分析核磁共振检测仪器为IN0VA500超导脉冲傅里叶变换核磁共振谱仪。经过核磁共振氢谱、碳谱、DEPT谱、gCOSY谱、gHMQC谱、gHMBC谱检测分析，确定其与3，5,7'3，,4，，5，-六羟基2，3双氢黄酮醇的结构相符。①氢谱、gCOSY谱谱宽6711.4Hz(13ppm)gC0SYi普:i普宽4598.2X4598.2Hz;数据点2048X256。表l、1H核磁共振谱数据及分析谱峰序号化学位移S(ppm)裂分峰数耦合常数质子数COSY相关峰4.40dd10.5，614.90，5.69bcd4.905.695.855.90dddd10.562211114.404.405.905.85f6.40s2gh8.118.81ss12i10.74brs1j11.86s1②碳谱、DEPT谱、gHMQC谱、gHMBC谱i普宽:30911.9Hz(240卯m)gCOSY谱:i普宽4598.2X4598.2Hz;数据点2048X256表2、13C核磁共振谱数据及分析备注3位CH2位CH3位CH8位CH6—位CH2—/6—位CH4'位0H375'位OH7位0H5位OH谱峰序号ABCDEFGHI化学位移5(ppirO71.5583.1594.8595.84100.38106.85127.02133.36145.60性J162.40K163.23166.69M197.40(DEPT)ddddsdsssssss碳原子数备注11111211211113位CH2位CH8位CH6位CHl(T位C2'(6')位CHr位cf位c3、(5、)位C9位C5位C7位C4、位C二0(2)二氢杨梅素的质谱分析检测仪器为VGZAB-HS色质联用仪。二氢杨梅素的测定分子量为321M/Z，与理论分子量及相关碎片峰相一致-(3)紫外光谱分析二氢杨梅素在甲醇中的紫外吸收峰为Al=292ran，X2=208nm。实施例3:二氢杨梅素对过氧化特丁垸(T朋P)引起的高铁血红蛋白生成的抑制作用1、实验方法将压积红细胞加入双蒸水，制成1%红细胞的完全溶血液，分别加入各样品组分37。C温孵30min,加入TBHP使其终浓度达到250uM，继续温孵30min，测定OD咖检测高铁血红蛋白含量的相对变化。高铁蛋白生成抑制率的计算生成抑制率二(氧化损伤组OD柳,-样品组0D6:W)/(氧化损伤组0D6:,-对照组ODJ。2、实验结果TBHP在水相中逐渐释放出HA，HA被游离的或血红素中结合的铁催化，通过Fenton反应产生超氧阴离子和羟基自由基。正常红细胞血红蛋白的a、e肽链的最大光吸收值分别在540、577nm，当红细胞受到TBHP的氧化攻击后，部分氧合血红蛋白迅速转换成高铁血红蛋白，在630nm附近有最高吸收峰。如图1所示，在TBHP的作用下，氧合血红蛋白(其最大吸收峰在540nm和575nm处)被破坏，部分被转化为高铁血红蛋白(其最大吸收峰在630nm处)。而二氢杨梅素加入到红细胞的完全溶血液中后，TBHP对氧合血红蛋白的破坏和高铁血红蛋白的促进生成都受到了抑制作用，氧合血红蛋白的吸收峰升高，而高铁血红蛋白的吸收峰降低。如表3所示，二氢杨梅素的添加量与其对高铁血红蛋白生成的抑制作用呈正相关且量效关系明显。表3、二氢杨梅素对TBHP引起的高铁血红蛋白生成的影响二氢杨梅素(lig/ml)高铁血红蛋白生成抑制率(％)109.12017.34030.78036.2实施例4、ESR技术检测二氢杨梅素对自由基的清除作用ESR技术是研究自由基和抗氧化剂最直接最有效的方法。为了检测和辨认短寿命自由基，需将一不饱和的抗磁性物质一自由基捕集剂，加入反应体系，捕捉瞬时自由基，从而可以得到能用ESR波谱仪在常温下检测到的寿命较长的自由基。1.材料和方法材料DMP0(5，5-imethyl-1-pyrroline-l-oxide)在使用前用活性炭提纯，提纯后无杂质ESR信号。丙酮、乙酸乙酯、核黄素、二苯基苦基苯肼(DPPH)等试剂均为分析纯。二氢杨梅素为分离纯化制备。ESR测试使用Brucker200型ESR波谱仪，测试条件为X波段，微波功率20譜，调制100kHz，调幅O.lmT，扫宽20mT，中心磁场324.5mT,室温下检测。利用Fenton反应产生0H自由基，用DMPO捕集0H自由基反应体系共50yL，pH=7.4，其中含有O.04MDMPO、0.01%H202、0.025mMFeS04、样品溶液或PBS(磷酸盐缓冲7液PH=7.4)5uL，迅速混匀，吸入石英毛细管中，记录一分钟时的ESR波谱。光照核黄素产生02—自由基,DMPO捕集CV自由基。反应体系共30uL，pH二7.4，其中含有0.08MDMPO、0.3M核黄素、5mMEDTA钠盐、2mMDETAPAC、样品或PBS5uL，迅速混匀，吸入石英毛细管中，光照90秒后，进行测试。2.结果由Fenton反应产生的羟基自由基的ESR波谱(图2a)是由4条谱线组成高度比为1:2:2:1的典型图谱(g-2.0045，aN=aH=l.49mT)。加入二氢杨梅素对波谱信号的超精细分裂常数和g值没有影响，随着二氢杨梅素浓度的增加，其ESR信号强度递减(图2b)。故用波谱信号第二峰的峰对峰高度h(mm)表示ESR信号的相对强度。在Fenton反应体系中，加入不同浓度的二氢杨梅素对该体系产生的羟基自由基进行了清除，清除后的ESR波谱如图所示。加入不同浓度的二氢杨梅素后,ESR信号强度明显减小，而且具有明显的剂量依赖效应(表4)。图3a、图3b所示，用DMPO捕集光照核黄素/EDTA体系产生的0—z自由基的ESR波谱是由12条谱线组成的典型图谱(aN-1.42mT，aBH=l.12mT，aCH=0.13mT)。加或不加二氢杨梅素对波谱信号的超精细分裂常数没有影响，仅信号强度不同。加入不同浓度的二氢杨梅素后，其中(b)(c)(d)的波谱峰高显著降低，随着样品浓度的增加，清除0—2自由基的效果也越来越明显。在样品浓度为100ug/mL时，己将产生的(T自由基100%清除。表4、ESR法检测二氢杨梅素对自由基的清除能力<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注清除率可以用某样品浓度的峰高除以对照的峰高计算。峰高的计算方法羟基自由基取第二峰的高度，超氧自由基取第一峰，DPra取第3峰。二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基是一种稳定的以氮为中心的自由基。二氢杨梅素能够清除超氧自由基、羟基自由基和含氮自由基，是由于他本身的分子结构，不仅可螯合消除金属离子作为自由基链反应的引发剂，阻止和抑制自由基的产生，而且可以清除、捕集自由基使其反应链中断，在机体中的细胞及其生化代谢反应中发挥抗氧化作用，以此广泛地参与、介导和调节机体，发挥其药理与药效作用。自由基是许多化学物质和辐射对机体细胞产生伤害或毒害的主要原因。自由基对细胞膜产生损伤、对脂质、蛋白质和核酸的分子构象实施非特异性氢抽提和化学加成而形成高分子自由基，这些高分子自由基将和其他的蛋白质高分子形成高分子聚合物或导致核酸线性分子断裂，从而破坏高分子的结构及功能。实施例5、二氢杨梅素对H202诱导的细胞氧化损伤的抑制作用Hela细胞以含10%灭活的新生牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素以及含2mmol/ml谷氨酸盐的DMEM培养基，在5%C02、37°C、相对湿度95%条件下培养。培养细胞单层生长、当瓶底细胞的覆盖度达90%时，以0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。每两天换液一次，仅指数生长期的细胞用于实验研究。指数生长期的细胞以0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，用含10%新生牛血清的DMEM培养基稀释，调整细胞密度至2XlOVml，以每孔100ul接种于96孔培养板，37°C、5%0)2条件培养24小时。加入二氢杨梅素使其终浓度分别为5ug/ml、10ug/ral和15ug/ml。温育30分钟后Hela细胞中加入不同剂量的HA作为氧化损伤剂；在各个不同的H2(V浓度下，H202都能显著降低Hela细胞的活力。当^02的浓度等于或低于1.2mM时，二氢杨梅素处理组相对于不加二氢杨梅素组，Hela细胞活力大多得到显著增高且增高程度与二氢杨梅素的终浓度呈正相关(表5)。表5、二氢杨梅素对HA诱导的Hela细胞氧化损伤的影响H202(慮)不同浓度的二氢杨梅素(ug/ml)的细胞相对活力010150100±1.:32101.35±4.3799.29±1.3097.74±3.660.281.84±2,.6794.42±4.7995.21土1.57'95.62±2.15'0.458.09±1,.8177.32±2.18'83.47±1.39'90.37±3.14'0.636.77±2,.2058.23±4.31'60.44±4.14'71.38±1.63'1.220.01±2,■4221.81±1.3736.39±3.19'40.97±2.65'2.417.81±1.■0518.03±4.9118.35±2.8418.12±3.76实施例6、二氢杨梅素对骨髓抑制小鼠模型的药效试验1、材料和方法环磷酰胺；二氢杨梅素。昆明鼠，1822g，30只，812周龄。雌雄不拘，由中山大学实验动物中心提供。造模方法环磷酰胺175mg/kg腹腔注射小鼠，0.2ml/次，每日一次，连续三次。动物分组与处理10只/组，①造模组环磷酰胺175mg/kg腹腔注射小鼠，每日一次，连续三次。②正常对照组在其它组注射环磷酰胺时注射生理盐水0.2nil/次。③二氢杨梅素组环磷酰胺175mg/kg腹腔注射小鼠，每闩一次，连续三次。按照二氢杨梅素120mg/kg每天灌胃一次，连续10天。观察体征变化。9在最后一次二氢杨梅素后的次日处理动物进行观察。采用尾静脉采血，进行血细胞计数。小鼠处死后，取出股骨，剔除肌肉和结缔组织，剪开股骨两头，用6号针头以RPMI1640液冲出骨髓细胞，检测骨髓有核细胞数。2、实验结果二氢杨梅素对环磷酰胺的骨髓抑制有显著的保护作用(表6),环磷酰胺组的骨髓有核细胞数目与对照组相比明显减少，而二氢杨梅素加速损伤骨髓造血功能的恢复。表6、各组外周血象与体征变化组别wbc(xio7l)rbc(x10'2/L)plt(xio'7U有核细胞数(x106/L)体重抑制(%)皮毛脱落正常对照组5.4±0.94.6±0.77.35±0.1132.08±0.14—极少造模组2.7±0.63.0±0.62.45±0.1011.2±0.37.2多，易脱落二氢杨梅素组4.3土0，4.68±0.123*1.85±0.14*1.5极少实施例7、二氢杨梅素的抗突变作用1、实验方法环磷酞胺(Cyclophosphamide简称CP)、丝裂霉素C(Mitomyein简称MMC)，N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N'-nltro-N-nitrosogua-nidine简称MNNG)，秋水仙碱。(1)小白鼠骨髓pce微核试验将nih小白鼠随机分成5组，即一个阴性对照组，3个二氢杨梅素试验组和1个阳性对照组。阴性对照组小鼠每日每只ig0.3ml生理盐水，3个二氢杨梅素给药组分别以20、40和60mg/kg的二氢杨梅素剂量ig小鼠给药，给药至第7天的同时腹腔注射100mg/kg剂量的CP，24h后再以相同剂量的CP腹腔注射小鼠，6h后处死小鼠。阳性对照组小鼠仅ig生理盐水，腹腔注射CP的时间、剂量既处理与给药组一致。制备小鼠骨髓细胞微核玻片标本，在光学显微镜下计数嗜多染红细胞(PCE)总数和含微核的PCE数，当1个PCE中出现2个以上微核均按1个细胞计，并按下列公式计算各组微核细胞率(mncf):腦cf-(含微核的pce数/观察到的pce总数)x1000%。(2)小鼠骨髓细胞染色体崎变(ca)试验动物分组及二氢杨梅素剂量均与"小鼠骨髓细胞pce微核试验"相同，所不同的是在给药第7天的同时给药组和阳性对照组小鼠均腹腔注射1次2mg/kg剂量的MMC，在处死小鼠前3h再腹腔注射4mg/kg剂量的秋水仙碱溶液进行预处理，按常规法制备骨髓细胞染色体玻片标本。每一实验组镜检观察500-1000个中期细胞分裂相，记录染色体畸变细胞数和畸变类型，主要观察染色单体断裂，无着丝粒染色体断片和环状染色体等，然后计算各组的畸变细胞率^含CA的细胞数/观察的分裂中期细胞数。2、实验结果10(1)二氢杨梅素对由CP诱发小鼠骨髓细胞微核的抑制作用二氢杨梅素对由CP诱发的小鼠骨髓PCE微核的抑制效应实验表明，高、中和低3个剂量的二氢杨梅素抗突变试验组CP诱发的小鼠骨髓细胞MNCF显著低于阳性对照组，二氢杨梅素试验组对由CP诱发的MNCF的抑制率分别为68.5%，61.0%和42.6%(抑制率=[(阳性对照组的顧CT一试验组的MNCF)/阳性对照组的薩CF]X100%)，在所测的剂量范围内表现出一定的量效关系。(2)二氢杨梅素对由醒c诱发的小鼠骨髓细胞cA的抑制作用二氢杨梅素试验组的CA细胞率(CAF)与應C阳性对照组的CAF比较，均达显著性差异(P<0.05)，低、中和高3个剂量的二氢杨梅素抗突变试验组对由應C诱发的CAF的抑制率分别为65.1%，56.8%和49.1%，低剂量二氢杨梅素试验组对CA的抑制效应略高于高剂量组，剂量与效应关系呈负相关性。二氢杨梅素的抗突变作用表明其具有抑制致癌物的作用，即具有抗致癌和抗致突变作用，从而预防机体细胞发生突变和癌变。目前肿瘤的发生大多为致突变化学物质造成机体损伤、或诱导细胞突变和癌变，因此，二氢杨梅素具有预防肿瘤发生、预防癌症患者在长期化疗中的继发性肿瘤、控制和减少高致癌条件下的癌变形成等药效作用。实施例8、二氢杨梅素对荷瘤小鼠辐射损伤的保护作用1、实验方法NIH小白鼠；二氢杨梅素。(1)二氢杨梅素对NIH小白鼠辐照的影响NIH小白鼠6-7周龄，每组10只，，雌雄兼用，分组包括①正常对照组饮服生理盐水；②照射组60CoY射线照射；③照前饮服O.1%二氢杨梅素生理盐水溶液，照后不服二氢杨梅素；④照后灌胃(ig)100mg/kg;⑤照后ig200mg/(bwd)生血宝。照射前7d均自由饮服。照射前7d均自由饮服，照射后7d每天ig.100tng/kg，第10天股动脉取血，计数冊C和RBC，再将各组鼠处死后计数胸腺和脾脏指数。照射:60Co源由华南农大辐照中心提供，Y射线一次性照射，总吸收剂量为4.5Gy,吸收剂量率为0.97Gy/min。(2)二氢杨梅素对荷瘤小鼠辐照的影响18周龄的小鼠，体重2224g，随机分成6组，每组10只，A组:CK;B组:荷瘤；C组荷瘤+二氢杨梅素+照射；D组荷瘤+照射+二氢杨梅素；E组荷瘤+照射；F组荷瘤+二氢杨梅素。饲养7d后，除A组外其余按移植性肿瘤研究法接种。5ml—次性注射器抽取S180腹水癌小鼠腹水，生理盐水稀释5倍后，每只小鼠注射0.3ml(A组除外)。第2天开始，C组和F组小鼠每天ig.二氢杨梅素，剂量为100/kg。15d后，C、D和E组进行60CoY射线照射，吸收剂量为100cGy。照射后对D组小鼠ig二氢杨梅素(剂量同上)，C组则停止ig.二氢杨梅素。再经15d后，脱颈处死，解剖，按前述方法检测红11细胞、白细胞、免疫器官指数。2、实验结果(1)二氢杨梅素对免疫器官辐射损伤影响Y射线照射后，小鼠胸腺和脾脏严重损伤。小鼠在受照前或后二氢杨梅素ig胸腺指数和脾脏指数均显著高于对照组。(2)二氢杨梅素对小鼠造血功能的影响辐照前ig.二氢杨梅素组和辐照后ig.二氢杨梅素组小鼠的红细胞、白细胞均明显高于照射组(表7)。表明二氢杨梅素对辐照所致的血象损伤具有明显的防护效应。表7、二氢杨梅素对辐照小鼠血象的作用处理组红细胞(Xl(f7L)白细胞(xio7l)①9.53±0.857.35±0.59②4.45±0.75#1.89±0.53#③5.68±0.45*4.35±0.52*④7.51±0.57**5.10±0.85**7.95±0.55**6.16±0.55**注与照射组比较*P<0.05,**p<0.01;与对照组比较#卩<0.01(3)二氢杨梅素对荷瘤小鼠照射的影响小鼠血象和体重增重的实验结果见表8。与A组比较，荷瘤小鼠的3种生理指标均低于生理盐水对照组，受照射各组的指标达到显著性水平，说明小鼠荷瘤后，体质下降,受照后下降更明显。F组3种生理指标均高于B组,说明二氢杨梅素对荷瘤小鼠的生活质量具有一定的保障。C、D、F组的白细胞水平都高于E组,且达到显著水平,说明二氢杨梅素对小鼠白细胞的照射损伤具有显著的保护作用。二氢杨梅素也促进了小鼠的体重的恢复。表8、二氢杨梅素对辐照小鼠血象的作用处理组红细胞(x白细胞(X107L)体重平均增重(g)10'2/l)A5.53±0.40众5.45±1.25众5.90±0.82众#B2.45±1.25*tt2.89±1.13*#1.51±0.95众#▲C3.68±1.15众*4.35±0.52众#3.45±0.82众#▲D3.01±0.78*4.10±0.85众#2.12±0.87*众E3.55±0.55众3.46±0.85#▲2.45±1.32*AF3.98±0.55众4.60±0.55众2.89±1.51*众12与B组比较众p<0.01;与E组比较ttp〈0.01;与C组比较Ap〈0.01荷瘤小鼠免疫器官实验结果(表9)表明，B组小鼠荷瘤后每克脾脏、胸腺的细胞数和脾脏指数、胸腺指数显著低于A组空白对照。C、D和F组荷瘤小鼠的4种指标均高于B组荷瘤小鼠，且差异显著。说明二氢杨梅素能够维持荷瘤小鼠的免疫细胞的增殖生长,并且接近正常水平。C、D的4种指标均高于E组，除D的每克胸腺细胞数外,其他都达到显著水平，表明二氢杨梅素在肿瘤的辐射治疗中保持机体免疫功能具有显著药效作用。表9、二氢杨梅素对辐照小鼠血象的作用处理器官指数(mg/10g体重)免疫器官细胞数(Xl(f个/g)组,脾胸腺脾胸腺A4.53±0.40☆2.65±0.20☆1.73±0.20众#1.71±0.19众B2.41±0.75*1.72±0.53*0.73±0.35*0.80±0.41*C4.08±0.55☆*2.96±0.42☆1.56±0.33众#2.15±0.582众#D4.59±0.88☆*2.31±0.55☆1.49±0.39众#1.47±0.47*众E2.65±0.55*▲2.49±0.75☆0.87±0.1.25±0.72众AF4.38±0.75众#4.60±0.55☆1.86±0.15众#2.02±0.51众#注与对照组比较*p<0.05，与B组比较众p<0.01;与E组比较弁p〈o.oi;与c组比较ikix:o.oi本试验研究表明二氢杨梅素具有抑制辐射对免疫细胞和免疫器官的损伤与毒害作用，这对于肿瘤放疗治疗的机体保护、减轻和控制化疗中的不良反应与骨髓抑制、提高机体免疫力的药效作用。实施例9、二氢杨梅素对人宫颈癌HeLa细胞及移植瘤的抑制和凋亡作用1、实验方法人宫颈癌HeLa细胞；BALB/c-nu裸鼠。二氢杨梅素。RPMI-1640培养基和胰酶(EDTA)美国Gibco公司产品。新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司,噻唑蓝(MTT)染液为北京中山公司产品。AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒为BenderMedsystem公司产品。(1)二氢杨梅素对宫颈癌HeLa细胞的抑制与凋亡作用宫颈癌HeLa细胞培养于含10%新生小牛血清和双抗的RPMI-1640培养基中，置于135%C02、37°C、95%饱和湿度的恒温密闭孵箱中进行常规培养，每日观察细胞的生长情况。3d传代1次。在0—80ng/ml二氢杨梅素浓度递增时，多孔板培养HeLa细胞，3个复孔，MTT法检测细胞活力，流式细胞仪观察细胞凋亡作用。(2)二氢杨梅素对宫颈癌HeLa细胞移植瘤的抑制作用BALB/c-nu裸鼠，4-6周龄，18-22g，雌性，取对数生长期的人宫颈癌Hela细胞(1X107ml)，在无菌条件下于裸鼠背侧近右后肢处皮下接种，0.2ml/只。接种后第14天可见肿瘤生长，肿瘤呈菜花状，色红，质硬，可活动，肿瘤长至约50-80mm3，时开始抑瘤实验。裸鼠皮下接种肿瘤6d后，32只小鼠皮下移植处均成瘤，将小鼠随机分成4组。对照组，生理盐水O.5ml/只；二氢杨梅素组，60mg/kg,1次/天，ipO.5ml;5-Fu组，30mg/kg，ip，1次/4d，共6次；二氢杨梅素-5-Fu组，30mg/kg，1次/天，ipO.5ml，5-Fu，30mg/kg，ip，l次/4d，共6次。腹腔注射给药，连续用药24d，每只小鼠注射液体量相等,均为0.4mL，第26天处死全部小鼠进行指标检测。抑瘤率测定按体质量变化调整给药;接种后每2天测量1次小鼠皮下肿瘤最长径(a)和最短径(b)，计算肿瘤体积[V-(aXb2)/2]，绘制肿瘤生长曲线。接种后第26天脱颈椎处死小鼠，完整剥离肿瘤称重,.计算抑瘤率，抑瘤率=(1-干预组平均瘤质量/对照组平均瘤质量)X100°/。。2、实验结果(1)二氢杨梅素对宫颈癌HeLa细胞的抑制与凋亡作用二氢杨梅素对人宫颈癌HeLa细胞的增殖具有极显著的抑制作用(表10)。表IO、二氢杨梅素对宫颈癌HeLa细胞活性的抑制作用一仏始泰^,，、细胞活力的抑制率-氢杨梅素(lig/ml)(%)00—109.91一2016.2—4041.660肌0以AnnexinV-PI双标染色流式细胞仪分析二氢杨梅素对宫颈癌HeLa细胞凋亡表明，不同浓度的二氢杨梅素作用宫颈癌HeLa细胞24、48、72h后，细胞凋亡发生率明显增高，随二氢杨梅素浓度加大和作用时间延长，凋亡率明显增高，与对照组相比具有极显著差异性。二氢杨梅素诱导人宫颈癌HeLa细胞具有明显的药物浓度依赖性，在同一时间段，随药物浓度的增加细胞凋亡率增加，两者呈正相关(PO.Ol)。同一浓度不同时间段(24,48，72h)细胞的凋亡率逐渐增加，80tig/ml浓度二氢杨梅素作用72h后的凋亡率最高，已经超过70%。(2)二氢杨梅素对宫颈癌HeLa细胞移植瘤的抑制作用接种宫颈癌HeLa瘤细胞后，成瘤率为100%。各组皮下移植瘤的体积逐渐增大，肿瘤成局部结节状生长，接种后的第1~6天，移植瘤生长速度基本相同，但随后对照组移植瘤生长明显快于其他给药组。26d后，二氢杨梅素处理组肿瘤体积及肿瘤质量均低于对照组(PO.Ol)，而与治疗对照组比较无显著性差异(PX).05)，表明二氢杨梅素对宫颈癌具有显著抗肿瘤作用(表ll)。表ll、二氢杨梅素对宫颈癌增殖的抑制作用处理组动物数瘤体重(g)抑制率(％)体征变化阴性对照81.351±0.373/皮毛脱落少二氢杨梅素80,492±0.112*63.5*皮毛脱落少5-Fu80.417逸121*69.1*皮毛脱落较多二氢杨梅素-5-Fu组80.345±0.113*74.5*皮毛脱落少*P<0.01，相对于阴性对照组。实施例10、二氢杨梅素对人乳腺癌裸鼠移植瘤细胞增殖和凋亡作用1、实验方法材料健康雌性纯种裸鼠BALB/c(nu/nu)，4~6周龄，重1320g，购自中山大学实验动物中心。5-氟尿嘧啶(5-Fu);Ki67、BcI-2抗体及相关试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。原位凋亡检测试剂inSituCellDeathDetection(Podkit),购自Roche公司。人乳腺癌细胞株MDA-MB-231;二氢杨梅素。人乳腺癌细胞裸鼠移植瘤的建立人乳腺癌细胞株MDA-MB-231在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中培养，传代扩增，收集对数生长期细胞制备悬液，活细胞浓度为lX107/ml。SPF环境下进行实验操作，在每只裸鼠右胸乳腺脂垫内接种细胞悬液0.2ml/只(含细胞数2乂106个)，4周左右形成明显可见的移植瘤，32只荷瘤鼠随机分组用药。动物分组及用药①对照组8只，丙二醇0.1ml/只，ip,共15d;0.9%NS，0.1ml/只，ip，共5d。②二氢杨梅素组8只，二氢杨梅素60mg/(kg'd),溶于0.1ml丙二醇中，ip，共15d;0.9%NSO.lml/只，ip，共5d。③5-Fu组8只，5-Fu30mg/(kgd)，溶于0.9%NS0.1ml，ip，共5d;丙二醇O.Iml/只，ip，共15d。④二氢杨梅素+5-Fu组8只，二氢杨梅素60mg/(kgd)，溶于0.1ml丙二醇中，ip，共]5d;5-Fu30mg/(kgd)溶于0.9%NS0.1ml中，ip，共5d。抑瘤率观察每隔2d用游标卡尺测量肿瘤最大长径(a)、横径(b)，计算肿瘤体积，平均瘤体积气aXb2)/2，并绘制移植瘤生长曲线；实验结束后，完整剥取肿瘤，称量瘤重。按以下公式计算药物的抑瘤率抑瘤率气l-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)X100%。Ki67、Bcl-2表达的检测Ki67抗原采用SP法免疫组化染色，阳性细胞胞核染成棕黄色。按，下述计算Ki67指数(Ki67-LI):低倍下(X100倍)确定有代表性的Ki67染色阳性5个视野，高倍下(X400倍)每个视野数200个肿瘤细胞，其中阳性细胞所占百分比即为Ki67-LI。Bcl-2采用SP法免疫组化染色，阳性细胞胞浆染成棕黄色。按下述进行结果判定:观测100个肿瘤细胞中阳性细胞的百分比，其阳性率<10%为(-)，阳性率10%25%15为(十)，阳性率25%50%为(+十)，阳性率>50%为(+++)。阴性对照均用PBS代替第一抗体。2、实验结果MDA-MB-231乳腺癌细胞接种于裸鼠乳腺脂墊，4周左右形成明显可见移植瘤，呈分叶状或结节状生长。用药期间，裸鼠无死亡。二氢杨梅素组、5-Fu组、二氢杨梅素+5-Fu组抑瘤率分别为41.5%、44.6%、50.3%，以联合用药组肿瘤生长受抑制最明显(表12)。表12、二氢杨梅素对人乳腺瘤的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>二氢杨梅素对移植瘤细胞增殖的影响在光镜下观察肿瘤组织，对照组移植瘤细胞仍保持培养状态下癌细胞原有的异型性，形状不规则，核大深染，核异型，可见异常核分裂相。二氢杨梅素用药组肿瘤细胞呈现不同程度退行性变，部分肿瘤组织出现明显坏死。Ki67免疫组化显示Ki67抗原表达于乳腺癌细胞核内，阳性细胞呈棕褐色染色。对照组Ki67-LI高于二氢杨梅素组、5-Fu组、二氢杨梅素+5-Fu组,有显著性差异(PO.01)(表13)，表明二氢杨梅素用药组肿瘤细胞增殖受到明显抑制,结合光镜分析，二氢杨梅素对肿瘤细胞也有一定直接细胞毒性作用。表13、药物对肿瘤细胞增殖、凋亡的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>*P<0.01，相对于阴性对照组；AP<0.05，5-Fu和二氢杨梅素处理组间。二氢杨梅素对移植瘤细胞凋亡的影响Timd法检测，在荧光显微镜下见凋亡细胞呈黄绿色荧光细胞,细胞体积縮小皱縮,治疗组较对照组凋亡细胞明显增多。光镜下见凋亡细胞核染成棕黄色。结果表明二氢杨梅素组、5-Fu组、二氢杨梅素+5-Fu组凋亡指数明显高于对照组(PO.Ol)，二氢杨梅素+5-Fu组明显高于二氢杨梅素组、5-Fu组(P0.05)。二氢杨梅素可诱导乳腺癌细胞发生凋亡，而联合用药，诱导肿瘤细胞凋亡作用增强。乳腺癌组织中Bcl-2免疫组化检测结果Bcl-2蛋白表达于乳腺癌细胞浆，二氢杨梅素组、5-Fu组、二氢杨梅素+5-Fu组明显低于对照组(P0.05)，表明二氢杨梅素可抑制bci-2基因的蛋白表达(表13)。_表13、各组乳腺癌组织Bcl-2蛋白表达Bcl-2表达阴性对二氢杨梅素5-Fu二氢杨梅素照十5隱Fu一1+3767++412+++1实施例11、二氢杨梅素对亲骨转移乳腺癌细胞肿瘤转移基因骨涎蛋白表达的抑制作用丄、实验材料与方法MDA-MB-231-B0细胞MEM培养液干粉，Gibco公司，胎牛血清。设置对照组和二氢杨梅素处理组；对照组为含10%胎牛血清培养液培养MDA-MB-231-B0细胞，二氢杨梅素处理组是在对照组的基础上加入20mg/L的二氢杨梅素。其余操作相同。免疫组化法检测乳腺癌肿瘤细胞骨涎蛋白(BSP)蛋白的表达。制备MDA-MB-231-B0细胞爬片，釆用常规免疫组化SP法检测BSP的表达。待细胞在载玻片上的融合度达到7590%，用0.01mol/L的PBS冲洗玻片3次，1W。甲醛固定30min。0.01mol/L的PBS洗涤，3%的H202甲醇溶液室温下孵育10min，0.01mol/L的PBS洗涤，在蜡笔所画的范围内滴一滴试剂B(正常非免疫动物血清)，室温孵育lOrnin，加经1:200稀释的50yl—抗(鼠抗hBSP)，室温放置6090min，对照组仅加抗体稀释液，0.01mol/L的PBS洗涤，滴加生物素标记的第二抗体(羊抗鼠IgG)，室温孵育lOmin，O.01mol/L的PBS洗涤，滴加1滴试剂D(链霉菌抗生素-过氧化物酶溶液)，室温孵育10min，O.Olmol/L的PBS洗涤，DAB显色，自来水冲洗，苏木精复染，自来水冲洗，乙醇梯度脱水，透明剂处理2X10min，树胶封片。显微镜下观察，细胞胞质中出现棕黄色颗粒为BSP表达阳性。2、实验结果与讨论通过免疫组化法检测BSP蛋白的表达，亲骨转移乳腺癌细胞MM-MB-231-BO胞质内有棕色颗粒，表明MDA-MB-23卜BO细胞表达BSP。而二氢杨梅素处理的细胞胞质中均无棕色颗粒，提示细胞BSP表达呈阴性。骨涎蛋白(bonesialoprotein，BSP)是细胞外基质中的一种酸性糖蛋白，主要分布在矿质化的组织中，由成骨细胞、破骨细胞以及软骨细胞表达和分泌。已有研究报道乳腺癌细胞中增加BSP的表达促进乳腺癌细胞骨转移的发生。BSP阳性癌细胞脱离血循环进入骨髓腔，黏附定位于骨矿质化基质的表面，BSP的RGD序列与aVP3结合，导致乳腺癌细胞和骨小梁的黏附，活化破骨细胞产生溶骨性骨吸收，促进乳腺癌细胞的骨转移进程。实验结果提示二氢杨梅素可抑制乳腺癌肿瘤的转移。实施例12、二氢杨梅素对人肠癌细胞及裸鼠移植瘤增殖抑制作用1、实验方法人结肠腺癌细胞系l(WO细胞；二氢杨梅素。细胞培养lovo细胞以含10%灭活的新生牛血清、双抗的1640培养基，在5%C02、1737°C、相对湿度95%条件下培养。培养细胞单层生长、当瓶底细胞的覆盖度达90%时，以0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。以指数生长期的细胞用于实验研究。在0—120ixg/ml二氢杨梅素浓度递增时，多孔板培养lovo细胞，3个复孔，MTT法检测细胞活力，观察二氢杨梅素对肿瘤细胞增殖抑制作用。人结肠腺癌细胞裸鼠移植瘤的建立人结肠腺癌细胞株kwo在含10%新生牛血清的RPMI1640培养液中培养，传代扩增，收集对数生长期细胞制备悬液。SPF环境下进行实验操作，腹背侧部皮下注射含5xl()S癌细胞的悬液0.5ml，成瘤后用组织块套管针法皮下移植为实体瘤。将人结肠癌皮下移植的裸鼠随机分为3组，每组8只，雌雄各半。(1)模型组(阴性对照)，生理盐水0.5ml/只灌胃；(2)二氢杨梅素组，以80mg/kg灌胃；(3)5-Fu组(阳性对照)，以5-Fu30mg/kg腹腔注射；(4)二氢杨梅素-5-Fu组，以二氢杨梅素40mg/kg灌胃、并以5-Fu30mg/kg腹腔注射。在移植后第6天开始给药，5-Fu组给药1次/d，共用6天后停药，二氢杨梅素组给药1次/d,共6周，对照组给予生理盐水。停药后24h处死，剥离肿瘤块称重，观察抗肿瘤作用。2、实验结果(O二氢杨梅素对肠癌细胞的抑制和凋亡作用lovo细胞在二氢杨梅素终浓度为20、40、60、80ug/ml时，细胞活力明显下降且各浓度下细胞活力与阴性对照组比较差异极显著(P〈0.01)(表14)。AnnexinV-PI双标染色流式细胞仪分析二氢杨梅素对lovo细胞凋亡的影响不同浓度的二氢杨梅素作用k)vo细胞72h后，细胞凋亡发生率明显增高，随二氢杨梅素浓度加大和作用时间延长，凋亡率明显增高，与对照组相比具有显著差异性。表14、二氢杨梅素对肠癌Iovo细胞凋亡的影响(-x士s)二氢杨梅素(ug/ml)细胞抑制率(％)细胞凋亡率(％)101.8±0.3l.O土O.1204.4±0.51.7±0.34017.0±1.27.7±0.38047.5±0.528.7±0,8，87.5±1.548.7±0.8二氢杨梅素诱导人肠癌lovo细胞具有明显的药物浓度依赖性，在同一时间段，随药物浓度的增加细胞凋亡率增加,两者呈正相关(PO.Ol)。同一浓度不同时间段细胞的凋亡率逐渐增加。120ug/m浓度二氢杨梅素作用72h后的凋亡率达到了48.7%。(2)二氢杨梅素对肠癌细胞裸鼠移植瘤增殖抑制作用在光镜下观察肿瘤组织，对照组移植瘤细胞仍保持培养状态下癌细胞原有的异型性，形状不规则，可见异常核分裂相。二氢杨梅素给药组肿瘤细胞呈现不同程度退行性变，部分肿瘤组织出现明显坏死，表明二氢杨梅素对肠癌肿瘤细胞增殖显著的抑制作用(表15)。18表15、二氢杨梅素对肠癌肿瘤增殖的抑制作用处理组动物数瘤体重(g)抑制率(％)阴性对照80.951±0.473/二氢杨梅素80.312±0.151*67.3*5-Fu80.277±0.142*70.8*二氢杨梅素-5-Fu组80.205±0.122*77.8*P<0.01，相对于阴性对照组。实施例13、二氢杨梅素的抑菌作用观察1、材料供试细菌枯草芽孢杆菌(Ssci77〃s5〃M77i5)金黄色葡萄球菌(5Y邵力y/。c。ce〃,sa"re〃5)沙门氏菌(&^/3<9/7￡>7(k;力力月市炎双球菌(尸"e咖ocoeci/50大肠杆菌(&c/erj.c/u'<3co7i)绿脓杆菌(/^e〃ctawo朋s3er柳'"。幼)普通培养基牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，自来水(或蒸馏水)1000ml，调Ph7.2-7.4(固体培养基另加2%的琼脂)。用于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌的培养。加富培养基在普通培养基的无菌液体培养基中加5%的无菌小牛血清。用于培养肺炎双球菌。2、对几种细菌最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定取20ml三角瓶分别编组编号，除第1瓶外，每一瓶加入3ml培养液；第1瓶内加入含有二氢杨梅素培养液6ml，吸取3ml加到第2瓶内，充分混匀后，吸出3ml到第3管，依次递增稀释到第6瓶，第6管充分混匀后吸出3ml混合液弃去。每一瓶内分别加入菌悬液50iU(菌液浓度为106-107个/)111)，摇匀后置37'C摇床培养24h，取出观察结果。阳性对照和阴性对照设置一瓶培养。从细菌生长少(培养不浑浊)各瓶，继续培养一天后，取培养菌液涂布琼脂平板培养基，经37'C培养后观察有无生长加以判断。以能抑制细菌生长的二氢杨梅素最高稀释度为最低抑菌浓度(MIC)，以仍没有菌生长的二氢杨梅素最大稀释度为最低杀菌浓度(MBC)3、测定结果二氢杨梅素对几种细菌均有抗菌作用(表16),最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定结果表明二氢杨梅素对这些细菌均有杀菌能力。表16、二氢杨梅素对几种细菌均有抗菌作用细菌MIC(mg/ml)MBC(mg/ml)枯草芽孢杆菌1.01.019金黄色葡萄球菌0.500.50沙门氏菌1.02.0大肠杆菌0.501.0绿脓杆菌0.500.50肺炎双球菌0.501.0实施例14、二氢杨梅素对小鼠CC14慢性损伤肝炎的治疗作用1、材料和方法动物18-22g雌性BALB/C小鼠，随机分组。禁食6小时后，按0.5ml/kg体重腹腔注射CCL(10%石蜡油溶液)，每周二次，共八次。实验分为三组，二氢杨梅素组按120呢/kg体重每闩灌胃，正常对照组及损伤对照组给与相应的生理盐水。最后一次给药第三天杀鼠，取血测定丙氨酸转氨酶(ALT)和血清白蛋白(g/L)。同时取肝大叶相同部位的一小块肝组织，用10%福尔马林固定后，做病理切片检查。2、实验结果CC14染毒组，肝小叶周围炎性细胞浸润明显，可见纤维组织增生，小叶中心大部肝细胞坏死明显，部分肝细胞脂肪变，空泡样变明显二氢杨梅素治疗组的肝组织学改变与CC14染毒组有明显不同，多数视野未见肝纤维组织增生和明显肝细胞坏死，炎性细胞浸润及脂肪样变性较轻。血清酶学及血清白蛋白检查结果(表17)，表明二氢杨梅素对CCl4慢性损伤小鼠有显著的保护作用。表17、二氢杨梅素对CCV優性损伤小鼠血清转氨酶和血清白蛋白的影响(Xts,n=10)ALT(U/100ml)血清白蛋白(g/L)处理正常对照组29.7土2.0348.53土6.33CCl4组105.95土8.3633.22土4.31CCL+二氢杨梅素40.64土7.26**41.54土6.18****P<0.01与CCL,组比较。CCl4进入体内后，经肝脏细胞色素P450激活，声称三氯甲基自由基(CC1:，')，通过氢的吸附而攻击内质网膜上的磷脂分子，引起膜的脂质过氧化，CC1"继而与膜脂质和蛋白质大分子进行共价结合，引起膜结构和功能完整性的破坏，CCl.,还可抑制细胞膜和微粒体膜上钙离子泵的活性，使钙离子内流增加，从而引起细胞屮毒死亡。二氢杨梅素可以改善慢性肝损害肝组织空泡样变性、肝脂肪化和纤维化的形态学改变，明显降低血清中肝转氨酶和提升血清中白蛋白的含量，保护肝功能。实施例15、二氢杨梅素片剂的制备片剂配方二氢杨梅素30-80%,药用淀粉2—10%，乳糖10%—60%，阿斯巴甜0.2-1%、硬脂酸镁0.5-1%将100目过筛的二氢杨梅素lOOOg和乳糖lOOOg干粉混合，过80目筛2-3次；加适量的蒸馏水，将药用淀粉60g加热糊化后、喷洒入混合干粉中，并不断搅拌均匀，制粒，过16目筛后烘干；按照干粒重量加入100目过筛的阿斯巴甜0.5%和硬脂酸镁0.5%,混匀，压片。片硬度为0.9-1.2kg，片重为0.5-1.0g/片。实施例16、二氢杨梅素胶囊的制备胶囊剂配方二氢杨梅素30-80%，药用淀粉5—30%，乳糖0%—60%,硬脂酸镁0.5-1%。将二氢杨梅素1000g、药用淀粉100g、乳糖200g的干粉混合，过80目筛2-3次；加适量的蒸馏水，将适量药用淀粉加热糊化后、喷洒入混合干粉中，搅拌均匀，制粒，过16-24目筛后烘干；按照干粒重量加入硬脂酸镁0.5%，混匀。填充胶囊，粒重0.25-0.75g/粒。实施例n、二氢杨梅素贴剂的制备将生橡胶100g切成条状，用压胶机压成网状胶片，去静电、放冷，浸入汽油中约24小时，使其充分溶胀，再移入配料锅内搅拌约3小时，依次加入松香80g、氧化锌80g、羊毛脂15g、凡士林15g、液体石蜡10g，混匀，加入二氢杨梅素100g，搅匀，经80目铜丝筛网滤过，进行涂膏，切段，盖衬，切块，制成1000贴，即得二氢杨梅素贴剂。2权利要求1、二氢杨梅素在制备防治肿瘤放化疗不良反应的药物的应用。2、根据权利要求1所述的二氢杨梅素在制备防治放化疗药物不良反应药物的应用，其特征在于所述化疗为细胞毒类药物化疗。3、根据权利要求2所述的二氢杨梅素在制备防治放化疗药物不良反应药物的应用，其特征在于所述细胞毒类化疗药物为作用于DNA化学结构的药物、作用于核酸转运的药物、拓扑异构酶I抑制药或作用于微管蛋白的药物。4、根据权利要求2所述的二氢杨梅素在制备防治放化疗药物不良反应药物的应用，其特征在于所述作用于核酸合成的药物为氟尿嘧啶。5、根据权利要求2所述的二氢杨梅素在制备防治放化疗药物不良反应药物的应用，其特征在于所述作用于微管蛋白的药物为长春新碱或紫杉醇。6、根据权利要求2所述的二氢杨梅素在制备防治放化疗药物不良反应药物的应用，其特征在于所述作用于DNA化学结构的药物为环磷酰胺、丝裂霉素或顺铀。7、根据权利要求1所述的二氢杨梅素在制备防治放化疗药物不良反应药物的应用，其特征在于所述防治肿瘤放化疗不良反应为骨髓抑制、血细胞降低、细胞突变、脱发或继发性肿瘤。8、根据权利要求1所述的二氢杨梅素在制备防治放化疗药物不良反应药物的应用，其特征在于所述肿瘤放化疗不良反应为乳腺癌、宫颈癌或肠癌放化疗不良反应，二氢杨梅素与化疗药物联合用药提高肿瘤治疗疗效。9、根据权利要求8所述的二氢杨梅素在制备防治放化疗药物不良反应药物的应用，其特征在于所述二氢杨梅素与化疗药物联合用药是指用药学上可接受的辅料制备的贴剂、软膏剂、凝胶剂、软胶囊剂或栓剂。10、根据权利要求1所述的二氢杨梅素在制备防治放化疗药物不良反应药物的应用，其特征在于所述药物为用药学上可接受的辅料制备的口服固体制剂、口服液体制剂、注射液、冻干粉针剂或大输液剂型。全文摘要本发明公开二氢杨梅素在制备防治肿瘤放化疗不良反应的药物的应用。该应用具体用于制备防治肿瘤放疗与化疗中的不良反应、防治骨髓抑制、脱发、抗突变与防治继发性肿瘤的发生和防治肿瘤转移，作为防治乳腺癌、宫颈癌和肠癌等药物。本发明创造性发现二氢杨梅素清除自由基、抑制自由基反应链、二氢杨梅素抗突变和抑制肿瘤基因表达和引发肿瘤细胞凋亡而防治肿瘤发生、防治继发性肿瘤及转移以及防治感染。因此，二氢杨梅素作为防治肿瘤放化疗不良反应的药物，抑制和减轻化学伤害、防治致突变剂的损害而预防基因突变或继发性肿瘤，将与放化疗联合用药而实现防治肿瘤放化疗不良反应和预防肿瘤发生。文档编号A61K31/352GK101485655SQ20091003715公开日2009年7月22日申请日期2009年2月12日优先权日2009年2月12日发明者张晓元,勇郭申请人:华南理工大学