一种用于组织修复的纳米仿生材料及其制备方法

专利名称：一种用于组织修复的纳米仿生材料及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于组织修复的纳米仿生材料及其制备方法，属于生物医学技术领域。
背景技术：
目前各种医用人工材料不少。人体在受到外界不利因素(如火灾、车祸、撞击)或由于自体原因(如肿瘤侵蚀、 先天性疾病)，都可造成种种组织或器官的缺失和损伤，例如硬脑膜缺损、关节缺损、皮肤 创伤、心脏瓣膜封闭不全。因此人体组织器官基本都具有一定的自我修复能力尽管人体不同的组织器官都有一定的修复能力，但其修复能力各不相同，例如皮 肤再生能力较强，但关节软骨几乎不能自身修复；可是一旦损伤超过了必要的限度和范围， 自我则不能修复。但若人体组织不能及时修复，则会造成不良后果，引发种种病痛，严重者 可危害生命。例如硬脑膜缺损导致脑脊液外溢、脑的膨出，还能引发颅内感染、脑粘连、皮 下积液，造成癫痛、头痛、脑功能障碍等疾病；而关节软骨则表现为不可逆转的关节疼痛，影 响关节功能；临床开创皮肤移植前，皮肤大面积烧伤者的存活率仅在20%以下。因此，一旦损伤超过了自我修复所能达到的限度和范围，通常需要进行相应的器 官移植，以治疗创伤、修复器官、恢复原有的生理功能、提高生活质量，挽救生命。例如在软 骨受损严重时必须用软骨修复、大面积皮肤创伤时的临床皮肤移植。一般来说，目前的移植材料可以划分为以下几种。自体移植材料、异体移植材料、 异种移植材料及合成材料。自体材料又分为用相同组织器官材料和不同组织器官材料。前者是指用相同的器 官组织的移植物，如自体皮肤移植、自体软骨移植的马赛克移植、自体软骨细胞移植。此类 移植物有以下优点修复效果佳，没有免疫反应。后者指用不同的器官组织的移植物，如 用自身筋膜重建的硬脑膜、自体软骨膜/骨膜移植重建的软骨，同样不会产生免疫反应，但 通常移植效果略差于前者。两者共同的缺点在于自体材料来源有限，在临床应用上经常缓 不济急；供体部位常发生继发性病变；以伤治伤，需要二次手术，造成供区新的创伤缺陷； 手术的过程相对复杂；易产生并发症和术后疤痕；可导致供区不愈或功能障碍；且自体移 植通常费用昂贵。同种异体材料通常取自尸体。此类移植物有以下优点修复效果较佳，可保存贮存 并及时提供给临床应用，免疫反应较弱。但同种异体来源也相对有限；无法完全避免免疫排 斥，残留的抗原会导致不同程度的炎症反应，造成纤维变性和粘连，产生免疫消融现象，也 易产生瘫痕，刺激；此外无法完全杜绝病原体传播的危险。异种材料通常取自牛、猪等动物，例如用于心脏瓣膜移植的牛心包膜、用于皮肤 移植的猪皮真质等。此类移植物的最大优点是来源广泛，可及时供应；而缺点则在于临床 修复效果一般不及自体或同种异体材料；异体来源导致无法彻底消除免疫原性；此外还可 能携带病毒、传播疾病，引起种间疾病传播，例如疯牛病就导致了对牛源性生物材料的极大担忧。 合成材料可划分为以下几种仅有支架材料；含有细胞和/或细胞外基质和支架 材料的复合物。 支架材料分为不可吸收/部分吸收和可吸收材料。不可吸收材料/部分吸收如硅 胶人工脑膜、金属一超高分子量聚乙烯对磨关节假体、硅橡胶、聚氨酷关节软垫材料等。优 点是来源广泛；易于保存运输；可及时供应临床所需。但这些移植物虽然在一定程度上能 起到替代缺损组织器官生理功能的作用，但其效果还有待进一步提高，临床修复效果不及 自体或异体异种材料移植物；不可吸收材料/部分吸收材料的不可吸收部分对受体永远是 异物，可能导致慢性炎症反应、术区感染、延期出血，引起其它并发症。可吸收材料有人工材料和天然材料。与不可吸收材料一样， 优点是来源广泛；易 于保存运输；可及时供应临床所需；其降解产生是人体生理代谢物，可完全被吸收，不会导 致免疫反应或极轻微的免疫反应。但这些移植物虽然在一定程度上能起到替代缺损组织器 官生理功能的作用，但其效果还有待进一步提高；且由于没有细胞作用，临床修复效果不及 自体或异体异种材料移植物。含有细胞和/或细胞外基质和支架材料的复合物可分为以下两种含有细胞外基 质和支架材料的复合物和含有细胞、细胞外基质和支架材料的复合物(组织工程)。含有细胞、细胞外基质和支架材料的复合物主要原理是使用人体细胞种植在合适 的生物支架材料上，以模拟人体组织器官的结构及功能。含有细胞外基质和支架材料的复合物主要原理是使用细胞因子定位于合适的生 物支架材料上，植入人体以吸引人体干细胞迁移、分化、生长增殖和表达，以模拟人体组织 器官的结构及功能，代替原来缺损器官。如前所述，当前在组织工程中开发为细胞培养支架的生物材料主要分为人工合成 的材料和天然生物材料两类。人工合成支架的机械性能、物化性质等各方面都在影响细胞 的迁移、分化、生长、增殖和表达。另一方面，细胞生长的基质非常复杂，单一材料较难适应细胞培养的要求，通过共 混调整不同材料之间的比例，可以使共混材料具有更适合细胞培养的力学性能、降解性和 生物学性质等。除支架材料外，细胞外基质对细胞的生长有很大的影响。如细胞因子辅助治疗软 骨损伤法中细胞因子本身对软骨生长的促进作用很好，皮肤生长因子对皮肤有再生作用， 碱性成纤维细胞因子对硬膜化过程有促进作用。但要将因子固定于组织工程支架材料并能 缓释释放，目前还没有相关专利和产品。最后人体的组织细胞培养亦相当重要。细胞的增殖性及存活密度是限制细胞培养 及体外大量扩增的因素之一。例如表皮细胞有较强的分化再生能力，而软骨细胞体外培养 分化能力相对弱。这与细胞周围培养环境、细胞因子、细胞本身在支架上的定位密切相关。总结以上已有技术的不足自体和异体材料虽然修复效果较好，但来源相当有限，在临床应用上经常缓不济 急；供体部位常发生继发性病变；以伤治伤，需要二次手术，造成供区新的创伤缺陷；手术 的过程相对复杂；易产生并发症；可导致供区不愈或功能障碍；且自体移植通常费用昂贵。异体材料来源广泛。但异种和异体材料无法完全避免免疫排斥，残留的抗原会导致不同程度的炎症反应，造成纤维变性和粘连，产生免疫消融现象，也易产生瘫痕，刺激；此 外无法完全杜绝病原体传播的危险；且引起免疫排斥反应，非目前通用的免疫抑制剂可以 控制仅采用支架的合成材料，因为没有采用细胞，不能充分发挥细胞再生增殖能力和 其在修复中的作用；采用了细胞的合成材料，由于现有加工技术的缺陷，多限于单种细胞黏 附在材料表面，或是细胞与材料的简单结合，无法将多种特定细胞，按照所需特定浓度，精 确结合在支架材料中的特定位置，难以模拟人体组织天然结构，致使修复效果有限。这是这 类材料共同缺点，也是其最大的缺点。且多数人工材料结构与天然结构差异较大，缺乏合适 孔径和合理分布的释控的生长因子，不能有效诱导干细胞和/或细胞长入，也不能诱导其 合理分化。修复的效果有限。生物打印技术是近年来出现的新技术。生物打印能按预定计划精确定位，这和传统打印技术的特点是一致的。生物打印的理论研究来源于一般的纸质打印，生物打印的纸 片理论上设计为一种在体内可降解的生物纸片；生物打印的墨水理论上设计为特制的细胞 溶液或有生物活性的细胞因子溶液，即“生物墨水”。将这种特制溶液喷射到可生物降解的 生物纸片上。打印后再将纸片按一定顺序的堆叠。由于使用了打印技术，可以将细胞或/ 和细胞因子(“生物墨水”)精确的结合到预定部位；而按特定的堆叠方式的生物纸片则会 形成三维结构。理论上如果所用的生物墨水是细胞溶液，则形成三维的组织结构和器官，最 后生物纸片降解，细胞保留下来，形成立体结构，例如，活的三维组织、血管和器官。采用生 物打印技术这种制备方法制备得到一种纳米仿生材料有望解决上述现有材料的不足。但是生物打印技术仍处于基础研究的阶段，生物纸片具体是一种什么样的物质、 细胞或/和细胞因子生物墨水具体是怎样的组成、如何实现所述的堆叠都是理论上的一些 探讨和设想，还没有出现具体的可直接利用细胞通过生物打印成功制备的纳米仿生材料， 也没有见到相关技术报道。

发明内容
本发明的目的在于克服已有技术的不足，提供一种能够精确结合药物和/或细胞 因子和/或细胞、可被完全吸收、降解速度可调、具有良好的生物组织相容性、力学性能合 乎要求、成本较低、生产周期很短、保存、运输容易、无病毒或相对安全、无免疫排斥或免疫 排斥作用极低的、应用范围广泛的用于组织修复的纳米仿生材料。本发明的另一个目的是提供上述纳米仿生材料的制备方法，具体地说，本发明以 电纺丝技术制作的纳米支架材料作为生物纸，以细胞和/或细胞因子和/或药物作为墨水， 利用生物打印技术成功制备得到纳米仿生材料，所述方法简单易行、可适应大规模生产、成 本低，同时拓宽了生物打印技术应用范围的，还具体定义了生物打印技术的应用。本发明通过以下技术方案实现上述目的一种用于组织修复的纳米仿生材料，包括纳米仿生支架和附着于其上的水溶胶， 所述水溶胶内包覆有一种或几种细胞因子和/或一种或几种细胞。本发明还可以在所述水溶胶内还可以包覆有一种或几种药物。所述细胞因子是对细胞的归巢、趋化、生长、分化、增殖、表达起作用的因子；所述 药物选自化学药物、生物药和/或天然药物(所述药物可以根据具体情形混用或单用)；所述细胞选包括通常采用缺损组织器官细胞，也可以用人体干细胞和/或饲养细胞。所述对细胞的归巢、趋化、生长、分化、增殖、表达起作用的因子选自细胞定向迁移 因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、白介素IL-3、血管生成素结合因子、转化生长因 子-α、血小板衍生的生长因子、胰岛素生长因子、骨形态发生蛋白、骨形态发生蛋白_2、血 管内皮生长因子、结缔组织生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、骨桥蛋白和/或生长激素 类因子，也可以是其他能具体应用到本发明方案中的细胞因子。所述纳米仿生支架是采用支架材料通过静电纺丝技术制备得到，所述支架 材料包 括聚乳酸、聚已内酯、聚乙交酯、聚氨酯、聚乙二醇、聚对苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸 甲酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚羟基丁酸己酸酯、聚磷酸酯、聚氨基甲酸酣、聚L-乳酸、聚酯酰 胺、聚乙烯醇、聚丙交酯、聚氧乙烷、聚对二恶酮、丙交酯、乙交酯、丁内酯、戊内酯、己内酯、 环氧乙烷、环氧丙烷、聚氨酯类、聚碳酸酯、胶原蛋白、明胶、壳聚糖、改性壳聚糖、淀粉、纤维 素、改性纤维素、明胶、纤维蛋白、丝蛋白、弹力蛋白拟态的肽聚合物、海藻酸、硫酸软骨素， 肝素，琼脂，葡聚糖、褐藻酸。将上述材料溶于一定的溶剂，形成电纺液，就可以通过静电纺 丝技术得到纳米仿生支架。这些溶剂可以为甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基 乙酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、六氟异丙醇、三氟乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、氯 仿、二噁烷、三氟乙烷、三氟乙酸、水或它们任意比例的混合物。上述的高分子材料和溶剂用 于静电纺丝的相关技术，例如材料与溶剂的重量比例等参照现有技术。用所述一种或两种以上混合材料通过静电纺丝技术，可以按照具体需要做出合适 孔径和直径及理化性能的纳米材料。此项工艺在本发明制备方法一节有详细叙述，操作简 单，所得到的纤维是纳米级的，比传统的方法得到的无纺布直径小几个数量级，其直径分布 是几个纳米到几个微米，并可通过工艺参数调整得到不同直径，做到和人体组织高度相似， 形成的网状结构的孔径大小和其分布也可调整，以利于不同类型的细胞迁入，又或为了达 到防粘连的目的，可以做到孔径小于细胞直径，以防止细胞迁入。如50士20微米的孔径有 利于血管内皮细胞长入；而神经纤维则需要30 100微米的孔径；此外，人体细胞直径平 均在10-20μΜ，平均孔径在3μ M以下，已经可以有效的防止细胞迁入和粘连的产生。静电 纺纤维得到的孔隙大小分布很大程度上依赖于纤维直径，已知纤维直径减小时，孔径也在 同时减小。据已发表的文献，纤维直径在4-10 μ M时，孔径从20-45 μ M ；据文献报道，静电纺 再生丝素纤维非织造织物的平均孔径可达到2 μ Μ。根据所选择的材料亲疏水性能的不同， 还可以通过静电纺将其亲水性纳米支架层或疏水性纳米支架层。例如亲水性的硫酸软骨 素、淀粉、纤维素、明胶、胶原蛋白、壳聚糖、聚乙二醇可纺为亲水性纳米支架层；疏水性的聚 氨酯、聚乳酸、聚对苯二甲酸乙二酯可纺为疏水性纳米支架层。由于目前高分子材料改性研 究在不断发展，原本亲水性材料改性为疏水或疏水材料改性为亲水都越来越常见，范围也 越来越广。所述水溶胶可以是以下聚合物制成的水溶胶多糖类聚合物，如淀粉、纤维素、海 藻酸、透明质酸或壳聚糖；多肽类聚合物，如胶原、聚L-赖氨酸或聚L-谷胺酸；合成的亲水 高分子聚合物，如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺或聚N-聚代丙烯酰胺。上述聚合物 制备的水溶胶通过改变温度、酸碱度、经紫外线照射或者加入交联剂(固化液)等方法，可 由液态转变为固态。所述细胞包括通常采用缺损组织器官细胞，也可以用人体干细胞，例如软骨缺损修复中采用的软骨细胞，血管修复中采用的内皮细胞和肌细胞；也可用具有相应分化功能的干细胞，例如皮肤修复中采用的表皮干细胞、软骨修复采用的间充质干细胞等，所述细胞 常规培养后，用相应的液体培养基将其最后用于生物打印的浓度调整为l-8X106/ml为优 选方案。所述细胞还包括饲养细胞，所述饲养细胞是指其与干细胞共培养时，能促进干细胞 增殖和抑制其分化的特定细胞。例如雪旺氏细胞对神经干细胞的生长和增殖有促进作用。 常用的饲养层细胞有小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse Embryo Fibroblast，MEF)，SIM小鼠成纤 维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系(STO细胞)，子宫上皮细胞(UE)等。饲养细胞对干细 胞的作用是因为饲养细胞能产生抑制干细胞自主分化和促进干细胞增殖的因子，故能够有 效的促进干细胞增殖，并维持其未分化状态。所述细胞因子是对干细胞的归巢或趋化、分化、生长、增殖、表达，和/或对细胞的 粘附、迁移、增殖、分化、表达起作用的因子。这些因子可选自细胞定向迁移因子(SDF-I)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生 长因子(FGF)、白介素IL-3、血管生成素结合因子(ECM)、转化生长因子-α (TGF-α)、血小 板衍生的生长因子(PDGF)或细胞定向迁移因子、胰岛素样生长因子、骨形态发生蛋白、骨 形态发生蛋白_2、血管内皮生长因子、结缔组织生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、骨桥 蛋白、生长激素类(如促生长素)、转化生长因子β (TGF-β)等细胞吸引及粘附因子。本 发明也可用于其它对干细胞归巢/趋化和分化起作用的其它因子。据已有的文献报道和 证实，EGF具有在体促进骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的作用，在体内还可介导上皮生 长，促进血管形成，加快皮肤创面愈合速度和提高愈合质量的作用；FGF对表皮细胞增殖、 分化和皮肤附件发生有诱导作用；白介素IL-3可刺激皮肤上皮细胞增殖；ECM支持内皮或 成纤维细胞的粘附和移动；TGF-α可促进成纤维细胞和上皮的生长，刺激体内的血管生成 因子；血小板衍生的生长因子(PDGF)可促进皮肤成纤维细胞增殖；一定剂量的生长激素可 促进皮肤胶原蛋白特别是I型胶原蛋白的合成，使皮肤明显增厚。SDF-I是目前明确的对 干细胞趋化归巢起最重要作用的分子，可趋使干细胞定向迁移，应激、损伤、缺氧及G-CSF 等均可诱导损伤局部干细胞定向迁移因子SDF-I大量表达，从而捕获干细胞定向迁移于损 伤局部，进而增殖分化为各种功能细胞。CXCR4是SDF-I的唯一受体，且在CD34+干细胞表 面都有广泛表达。SDF-I因子不仅能通过SDF-1-CXCR4结合来捕获迁移中干细胞，同时能 通过CXCR4介导的细胞反应(如上调黏附分子的表达)来激活干细胞穿越内皮细胞层的迁 移运动。目前现有技术已经证实⑶34+干细胞可依据SDF-I的浓度梯度迁移，并且SDF-I 在诱导干细胞趋化和转移动员的同时，也具有刺激活性，增加干细胞的增殖分化的作用。 SDF-1-CXCR4是目前明确的对造血干细胞趋化定向迁移起最重要作用的分子。碱性成纤维 细胞生长因子可促进硬膜化过程。TGF-β能促进干细胞分化为软骨细胞，并促进软骨细胞 增殖和基质合成代谢。刺激原如地塞米松和II型胶原。如地塞米松能提高软骨细胞外基 质基因的表达；II型胶原能诱导并维持间充质干细胞向软骨细胞分化。所述药物可以依据具体情况选择化学药和生物药及天然药物，如抗感染药、止血 药、抗凝血药、消炎药、抗肿瘤药或防粘连药物。抗感染药如抗生素可用苄氨西林，螺旋霉 素，磺胺，喹诺酮类抗生素等；止血药如止血因子；防粘连药物，如曲尼斯特、Btt嗜司特；抗 凝血药，如双香豆素、肝素钠、水蛭素等；消炎药，如异丙嗪、地塞米松、氢化可的松、泼尼松 龙、布洛芬、羟基保泰松等；细胞生长抑制剂，如氟尿嘧啶；抗肿瘤药物，如放线菌素D等等。
本发明同时提供了上述用于组织修复的纳米仿生材料的制备方法，包括以下步 骤(1)制备电纺溶液、含有细胞因子和/或细胞的水溶胶溶液；(2)用静电纺丝制得纳米仿生支架；(3)用喷墨打印机将含有细胞因子和/或细胞的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生 支架上，水溶胶固化后即得。上述步骤(1)中所述电纺溶液所用的溶剂为甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酞胺、二甲基乙酞胺、四氢呋喃、二甲基亚飒、六氟异丙醇、三氟乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲 醇、乙醇、氯仿、二噁烷、三氟乙烷、三氟乙酸、水或它们的任意混合物。所述水溶胶溶液中还可根据最后制备的产品有针对性地加入药物。上述步骤(2)和(3)重复若干次，以得到不同厚度的纳米仿生材料。上述步骤中“制备含有细胞/细胞因子和/或细胞的水溶胶溶液”也可以步骤(2) 和步骤⑶之间进行。步骤(1)所述含有细胞因子的水溶胶溶液可以是含有干细胞定向迁移因子和干 细胞分化因子的水溶胶缓冲液；所述干细胞定向迁移因子和干细胞分化因子所占质量百分 比总数不高于10%。所述细胞是在三维纳米仿生支架上种植人体细胞，常规培养人体细胞，用液体培 养基重悬浮，用于最后打印时细胞密度l_8X106/ml。所述药物可为化学药和生物药及天然药物及提取物，天然提取物例如胶原对软骨 生长有促进作用。步骤(1)的优选方案之一是所述水溶胶缓冲溶液为藻酸盐或藻酸盐与其它物质 的混合溶液，交联剂溶液为氯化钙溶液；或所述水溶胶缓冲溶液为纤维蛋白原溶液，交联剂 溶液为凝血酶溶液；或所述水溶胶缓冲溶液为透明质酸碳酸氢钠溶液，交联剂溶液为酰胼 或碳化二亚胺；或所述水溶胶缓冲溶液为胶原-聚阴离子溶液，交联剂为碳化二亚胺。步骤(2)所述静电纺丝的优选参数为注射泵推进速度为0. 1 20ml/h，纺丝 针头为10、12、14、16、18或20号针头，施加电压为5 50KV，调节接收装置的接收距离为 5. 0-50厘米，接收喷丝的细胞培养皿中装有交联剂溶液。生物打印的纸片为电纺制得的纳 米仿生支架。所述喷墨打印机优选改装的惠普550C喷墨打印机，改装方法参考美国专利US 7051654。经清洗、灭菌、包装后贮存。本发明的纳米仿生材料可以用于制备成各种人工材料，如创面覆盖物(人工皮 肤)、人工软骨、人工神经导管、人工硬脑膜、人工血管、心脏瓣膜等，具体请见实施例。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果本发明结合了电纺丝技术及生物打印技术，将特定的药物和/或细胞因子和/或 细胞结合在纳米支架内和/或纳米支架表面，大大增强了纳米仿生材料对组织修复、组织 再生的效果，有广阔的应用前景具体来说(1)采用了组织工程技术，采用细胞、细胞因子及适宜的细胞外基质，细胞种植于纳米支架上并按设计要求进行分化，达到器官移植同等的修复效果；(2)本发明利用生物打印技术，将细胞和细胞因子等生物物质按设计要求与纳米支架精确结合，细胞因子和刺激原在体内环境条件下可控释放，形成诱导与体内相似的微 环境，诱导细胞在体外自组装为具有生理功能的人工器官。达到器官移植修复效果。(3)本发明所使用纳米支架材料是目前已经证实对人体无毒无害的安全生物材 料，是人工材料，即不会带来免疫排斥、病毒传播、疾病传染的诸多风险，也不会带来其它毒 害作用。(4)本发明的纳米仿生材料根据创面修复过程自动安全降解，在降解过程的同时 缺损部位得到了完全修复，这使得再生过程与正常分化过程一致，达到良好的修复效果。材 料在新生组织生成后被完全吸收的，避免了免疫组织反应；(5)本发明的应用范围较任何一种现有技术的产品都更为广泛。(6)同时利用生物打印技术和静电纺丝技术制作的纳米仿生材料，细胞因子和 药物可以做到有效按浓度和位置要求分布，细胞因子能加速损伤部位的修复，吸引损伤部 位原位干细胞的迁移和分化；加入的药物的量可以按需要调节，比如急性感染期浓度更高 (支架表面)，慢性感染期(支架内)浓度低，这不仅减轻了药物的用量，更重要的是，降低 药物用量之后，减少了随之而来的药物不良反应。(7)同时利用生物打印技术打印细胞，不同类型的细胞可以做到按浓度和位置要 求有效分布，极大促进组织修复及再生效果。(8)本发明材料可以根据需要调节支架结构，如亲疏水性、防粘连性能、耐磨性。


图1为本发明创面覆盖物的结构示意图；图2为实施例2中创面覆盖物移植到家兔皮肤创伤部位6小时后的结果示意图；图3为实施例2中创面覆盖物移植到家兔皮肤创伤部位7天后的结果示意图；图4为实施例2中创面覆盖物移植到家兔皮肤创伤部位14天的结果示意图；图5为实施例3制得的纳米仿生人工关节软骨的结构示意图，图中1为静电纺丝 形成的生物纸片。2、3为打印的细胞因子。4为软骨细胞；图6为实施例6生物打印和电纺制备的人工脑膜结构示意图，1为细胞支架层，2 为碱性成纤维细胞因子，3为防粘连层，4为抗生素，5为止血和防粘连药物。
具体实施例方式实施例1制备纳米仿生创面覆盖物(1)制备电纺溶液、含有药物的水溶胶溶液和交联剂溶液电纺液选择疏水性的L-聚乳酸和ε-己内酯，两者比值为50 50，作为共聚高分 子材料，数均分子量是260000，溶于六氟异丙醇。交联剂溶液选用0. IM氯化钙溶液。含有细胞因子的水溶胶溶液采用止血因子藻酸盐溶液，所述细胞因子藻酸盐溶液 中止血因子的质量百分比浓度为lOppm。
将配置好的0. IM氯化钙溶液放入直径150mm的细胞培养皿中，置于静电纺丝装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进行改装，参照 美国专利US 7051654公开的方法，固定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方，用作止血因子 定位打印；将配好的细胞因子藻酸盐溶液装入喷墨打印墨盒中；本实施例采用的墨盒型号 为 HP51626A。(2)用所述交联剂溶液接收静电纺丝制得纳米仿生支架将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为5毫升/小时， 调节高压发生器的电压为30KV，调节接收装置的接收距离为20厘米，用并将纤维接收为膜 状结构。静电纺丝20分钟，关闭静电纺丝。(3)用喷墨打印机将含有细胞因子的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上，水 溶胶固化后即得。2、制备细胞支架层制备电纺溶液、含有药物的水溶胶溶液和交联剂溶液；采用亲水性材料，聚乙二醇与硫酸软骨素质量比为70 30，纺丝液质量分数为 9%，交联剂溶液选用0. IM氯化钙溶液。含有细胞因子的水溶胶溶液采用碱性成纤维细胞因子的藻酸盐溶液，所述细胞因 子藻酸盐溶液中碱性成纤维因子的质量百分比浓度为lOOppm。(1)将配置好的0. IM氯化钙溶液放入直径150mm的细胞培养皿中，置于静电纺丝 装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进行改装， 例如可参照美国专利US 7051654公开的方法，固定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方，用 作止血因子定位打印。将配好的细胞因子藻酸盐溶液装入喷墨打印墨盒中。本实施例采用 的墨盒型号为HP51626A。(2)用所述交联剂溶液接收静电纺丝制得纳米仿生支架；将上述溶液加入静电 纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为0. 8毫升/小时，调节高压发生器的电压为 20KV，调节接收装置的接收距离为11厘米，用并将纤维接收为膜状结构。静电纺丝20分钟， 关闭静电纺丝。(3)用喷墨打印机将含有碱性成纤维细胞因子的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生 支架上，水溶胶固化后即得。3、清洗，灭菌，包装。实施例2本发明实施例1的纳米材料——纳米彷生创面覆盖物(人工皮肤)，见附图1所 示，附图1中显示了在纳米仿生支架结构中，分布不同浓度、不同类型的细胞因子，其中1为 细胞趋化因子，2为纳米纤维，3是细胞分化因子。本实施例提供所述人工皮肤在修复家兔(菜兔)皮肤创伤中的实验以腹部人为造成全层皮肤缺损(3X3cm2)的成年家兔作为实验动物模型。创伤后 2小时，将实施例1制备的纳米材料人工皮肤(3X3cm2)移植到创伤部位。移植进行6小 时后，可见干细胞开始定向迁移进入人工皮肤；移植物与正常皮肤组织融合良好，且与创面 贴合紧密，见图2，受到趋化因子作用，干细胞迁入、贴附，同时形态发生变化，图2中4表示 干细胞迁入分化为皮肤细胞；5表示干细胞正迁入；6表示干细胞。移植7天后镜下可见有毛细血管从周围正常组织向移植物内长入，且长入移植物基质内的新生毛细管数量逐渐增 多。移植的人工皮肤与其周围正常皮肤颜色十分接近，表皮层清晰可见层次分明的基底层、 棘细胞层、颗粒层和角质层，并可见表层有角质化细胞层剥离脱落，同时可见真皮层细胞数 量及细胞外基质显著增加，并且纳米支架已开始被吸收并被这些增殖的细胞及其所分泌的 细胞外基质所取代，参见图3，由附图3可见干细胞分化为皮肤细胞的同时，人工皮肤的纤 维开始分解并吸收，同时血管和神经开始形成，图中7表示分化为上皮细胞，8表示降解的 纳米纤维，9表示尚未完全分化的细胞，10表示诱导的神经，11表示诱导的血管。术后14 天，经过本发明创面覆盖物治疗的皮肤，创面覆盖物完全降解后，所达到的皮肤修复效果见 图4，由图4大体可见创面已基本愈合，修复区皮肤颜色正常，并且无残留的瘫痕，图中12表 示腺体，13表示血管，14表示神经。实施例3所述电纺溶液优选数均分子量为26000的聚-DL-乳酸和聚己内酯的二氯甲烷溶液；所述聚-DL-乳酸和聚己内酯所占的重量百分比分别为50%和50%，溶液总的质量百分 比浓度为10%。交联剂溶液选用100mg/ml水溶性碳化二亚胺溶液；含有细胞因子的水溶胶溶液采用细胞因子的胶原与聚阴离子溶液，其中胶原浓 度为1%，聚阴离子采用聚谷氨酸，浓度50mg/ml，所述细胞因子包括细胞定向迁移因子 SDF-I、表皮生长因子、转化生长因子β、BMP，总的质量百分比浓度为0. 5%。具体操作是将配置好的碳化二亚胺溶液放入直径150mm的细胞培养皿中，至于静 电纺丝装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进 行改装，例如可参照美国专利US 7051654公开的方法，固定在电纺丝装置箱内电纺针头正 下方，用作细胞因子定位打印。将配好的细胞因子溶液装入喷墨打印墨盒中，本实施例采用 的墨盒型号为HP51626A。将电纺溶液装入注射泵开始纺丝，设定注射泵推进速度为0. 2ml/h，选用12号针 头，施加电压为20KV，用装有碳化二亚胺溶液的细胞培养皿接收喷丝。喷丝30分钟后，停止 静电纺丝，开启喷墨打印机，按照设定的位置，将细胞因子的透明质酸碳酸氢钠溶液(细胞 因子质量百分比浓度0. 1% )打印在培养皿的电纺层上，透明质酸溶液接触电纺层上的碳 化二亚胺后迅速固化，形成透明质酸水溶胶，将细胞因子包裹并固定。重复打印15遍后，关闭打印机，重新静电纺丝35分钟，然后再关闭静电纺丝，打印 15遍，重新静电纺丝35分钟，然后再关闭静电纺丝。反复9次，形成厚度约4. Omm的纳米人 工关节软骨。图5为制得的纳米仿生人工关节软骨的结构示意图，图中1为静电纺丝形成 的生物纸片。2、3为打印的细胞因子。4为软骨细胞。实施例4用实施例1制备的人工软骨进行动物实验选择新西兰兔并进行肌肉注射麻醉。确定兔子完全麻醉以后，剃光两条腿的膝关 节，用橡皮膏固定，并保持仰卧姿势。确认膝关节没有病变现象以后，用锐利的手钻在大腿 骨关节面位置处打一个中心螺旋状的凹孔，然后用钻子在其中心位置打一个直径4rnrn、深 3mm的洞，人为建立了一个全厚的软骨缺陷。按照上述方法建立软骨损伤以后，继续观察损 伤区域4个月。确定关节软骨损伤区域没有自己愈合。
再次进行肌肉注射麻醉，打开上次手术部位。移植本发明制备的人工关节软骨。分层缝合伤口 .进行软骨修复12周后进行核磁共振检测。从核磁共振图上可见，修复处表面平 滑，表明修复处未有塌陷。未见明显免疫炎症反应。进行软骨修复4个月后，处死实验动物，取手术部位组织观察。肉眼观察可见，在 移植物处形成新生的透明软骨，新生软骨与关节表面融合良好。组织切片检测，可见人工关 节软骨己完全被新生的透明软骨所替代，修复处未出现塌陷，与正常软骨的交界处紧密接 合，界线模糊。未见巨噬细胞等炎症细胞浸润，未见明显免疫炎症反应。实施例51、制备防粘连层(1)制备电纺溶液、含有药物的水溶胶溶液和交联剂溶液电纺液选择疏水性的L-聚乳酸和ε-己内酯，两者比值为50 50，作为共聚高分 子材料，数均分子量是260000，溶于六氟异丙醇。交联剂溶液选用0. IM氯化钙溶液。含有细胞因子的水溶胶溶液采用止血因子藻酸盐溶液，所述细胞因子藻酸盐溶液 中止血因子的质量百分比浓度为lOppm。将配置好的0. IM氯化钙溶液放入直径150mm的细胞培养皿中，置于静电纺丝装置 及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进行改装，参照 美国专利US 7051654公开的方法，固定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方，用作止血因子 定位打印；将配好的细胞因子藻酸盐溶液装入喷墨打印墨盒中；本实施例采用的墨盒型号 为 HP51626A。(2)用所述交联剂溶液接收静电纺丝制得纳米仿生支架将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为5毫升/小时， 调节高压发生器的电压为30KV，调节接收装置的接收距离为20厘米，用并将纤维接收为膜 状结构。静电纺丝20分钟，关闭静电纺丝。纺丝和打印重复若干次。(3)用喷墨打印机将含有细胞因子的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上，水 溶胶固化后即得。2、制备过渡层(1)制备电纺溶液、含有药物的水溶胶溶液和交联剂溶液电纺液选择以下方案聚氨酯与透明质酸的质量比为70 30，纺丝液质量分数为 10%。混合氨苄西林，浓度为3%。得到均一溶液。。交联剂溶液选用0. IM氯化钙溶液。含有细胞因子的水溶胶溶液采用止血因子藻酸盐溶液，所述细胞因子藻酸盐溶液 中止血因子的质量百分比浓度为lOppm。将配置好的0. IM氯化钙溶液放入直径150mm的细胞培养皿中，置于静电纺丝装置 及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进行改装，参照 美国专利US 7051654公开的方法，固定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方，用作止血因子 定位打印；将配好的细胞因子藻酸盐溶液装入喷墨打印墨盒中；本实施例采用的墨盒型号 为 HP51626A。
(2)用所述交联剂溶液接收静电纺丝制得纳米仿生支架将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为4毫升/小时， 调节高压发生器的电压为20KV，调节接收装置的接收距离为11厘米，用并将纤维接收为膜 状结构。静电纺丝20分钟，关闭静电纺丝。纺丝和打印重复若干次。(3)用喷墨打印机将含有细胞因子的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上，水 溶胶固化后即得。3、制备细胞支架层制备电纺溶液、含有药物的水溶胶溶液和交联剂溶液；采用亲水性材料，聚乙二醇与硫酸软骨素质量比为70 30，纺丝液质量分数为 9%，交联剂溶液选用0. IM氯化钙溶液。含有细胞因子的水溶胶溶液采用碱性成纤维细胞因子的藻酸盐溶液，所述细胞因 子藻酸盐溶液中碱性成纤维因子的质量百分比浓度为lOOppm。(1)将配置好的0. IM氯化钙溶液放入直径150mm的细胞培养皿中，置于静电纺丝 装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进行改装， 例如可参照美国专利US 7051654公开的方法，固定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方，用 作止血因子定位打印。将配好的细胞因子藻酸盐溶液装入喷墨打印墨盒中。本实施例采用 的墨盒型号为HP51626A。(2)用所述交联剂溶液接收静电纺丝制得纳米仿生支架；将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为0. 8毫升/小 时，调节高压发生器的电压为20KV，调节接收装置的接收距离为11厘米，用并将纤维接收 为膜状结构。静电纺丝20分钟，关闭静电纺丝。(3)用喷墨打印机将含有碱性成纤维细胞因子的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生 支架上，水溶胶固化后即得。见图6，生物打印和电纺制备的人工脑膜结构示意图，1为细胞 支架层，2为碱性成纤维细胞因子，3为防粘连层，4为抗生素，5为止血和防粘连药物。3、清洗，灭菌，包装。实施例6犬动物实验实验犬体重15 20KG，年龄1. 5-2岁，雌雄不拘，共5只。以氯胺酮肌肉注射全 麻，麻醉剃毛后，将动物置于专用手术台上，腹卧位。用2%碘酒和75%酒精消毒。动物头 顶正中，纵向切开。用剥离器分离骨膜，暴露双顶部颅骨板，用高速磨钻磨开颅骨，双顶部形 成骨窗。用小剪刀剪掉双侧顶部3cmX3cm大小的矩形硬脑膜，制造出顶部的硬脑膜缺损。 在暴露的脑表面电灼，造成6个ImmXlmm大小的损伤点。将用本发明专方法所制备的人工 脑膜修剪成相应形状及尺寸的修补材料，防粘连层向脑表面，用4/0无损伤丝线间断缝合， 针距4mm，修补于犬顶部的缺损。用圆针4号丝线缝合肌肉。术后对动物进行常规的喂养及 观察。术后动物恢复良好，切口愈合良好，无脑脊液漏，无癫痫发生。术后进食进水正常，动 物的户外活动正常，没有发现运动障碍，存活至预定期限。术后12个月，动物以手术部位为中心，在大于手术部位Icm范围切取标本，使其包 括人工脑膜及周边硬脑膜及内面的脑组织。切取出标本后，可见人工脑膜与硬脑膜的连接 处对合平整，无分界，已完全愈合，仅见缝合的丝线。原生硬脑膜之间未见明显充血，出血等排异反应 。
权利要求
一种用于组织修复的纳米仿生材料，包括纳米仿生支架和附着于其上的水溶胶，所述水溶胶内包覆有一种或几种细胞因子和/或一种或几种细胞。
2.如权利要求1所述的纳米仿生材料，其特征在于所述水溶胶内还包覆有一种或几种 药物。
3.如权利要求1或2所述的纳米仿生材料，其特征在于所述细胞因子是对细胞的归巢、 趋化、生长、分化、增殖、表达起作用的因子；所述药物选自化学药物、生物药物或天然药物。所述细胞选自人体待修复组织的相关细胞、人体干细胞和/或饲养细胞。
4.如权利要求3所述的纳米仿生材料，其特征在于所述对细胞的归巢、趋化、生长、分 化、增殖、表达起作用的因子选自细胞定向迁移因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、 白介素IL-3、血管生成素结合因子、转化生长因子-a、血小板衍生的生长因子、胰岛素生 长因子、骨形态发生蛋白、骨形态发生蛋白-2、血管内皮生长因子、结缔组织生长因子、碱性 成纤维细胞生长因子、骨桥蛋白和/或生长激素类因子；
5.如权利要求1或2所述的纳米仿生材料，其特征在于所述纳米仿生支架是采用支架 材料通过静电纺丝技术制备得到，所述支架材料为聚乳酸、聚已内酯、聚乙交酯、聚氨酯、聚 乙二醇、聚对苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚羟基丁酸己酸酯、 聚磷酸酯、聚氨基甲酸酣、聚L-乳酸、聚酯酰胺、聚乙烯醇、聚丙交酯、聚氧乙烷、聚对二恶 酮、丙交酯、乙交酯、丁内酯、戊内酯、己内酯、环氧乙烷、环氧丙烷、聚氨酯类、聚碳酸酯、胶 原蛋白、明胶、壳聚糖、改性壳聚糖、淀粉、纤维素、改性纤维素、明胶、纤维蛋白、丝蛋白、弹 力蛋白拟态的肽聚合物、海藻酸、硫酸软骨素，肝素，琼脂，葡聚糖或褐藻酸的任意一种或两 种以上材料的混合物；所述水溶胶是选自以下聚合物制成的水溶胶淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸、壳聚 糖、胶原、聚L-赖氨酸、聚L-谷胺酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺或聚N-聚代丙 烯酰胺。
6.一种权利要求1所述纳米仿生材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)制备电纺溶液、含有细胞因子和/或细胞的水溶胶溶液；(2)用静电纺丝制得纳米仿生支架；(3)用喷墨打印机将含有细胞因子和/或细胞的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架 上，水溶胶固化后即得。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述电纺溶液所用的溶剂为 甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酞胺、二甲基乙酞胺、四氢呋喃、二甲基亚飒、六氟异丙醇、 三氟乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、氯仿、二噁烷、三氟乙烷、三氟乙酸、水或它们的 任意混合物。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述水溶胶溶液中加入了药物。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述水溶胶溶液的制备在步 骤⑵和步骤(3)之间进行。
10.如权利要求6 9所述的任一种制备方法，其特征在于步骤(2)和(3)重复若干次。
全文摘要
本发明提供了一种用于组织修复的纳米仿生材料及其制备方法，所述纳米仿生材料包括纳米仿生支架和附着于其上的水溶胶，所述水溶胶内包覆有一种或几种细胞因子和/或细胞。本发明提供的所述纳米仿生材料的制备方法包括制备电纺溶液和含有细胞因子和/或细胞的水溶胶溶液；用静电纺丝制得纳米仿生支架；用喷墨打印机将含有细胞因子和/或细胞的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上等步骤，电纺和打印可以重复，以得到不同厚度的纳米仿生材料。本发明结合了电纺丝技术及生物打印技术，将特定的药物和/或细胞因子和/或细胞结合在纳米支架内和/或纳米支架表面，大大增强了纳米仿生材料对组织修复、组织再生的效果，有广阔的应用前景。
文档编号A61L27/18GK101829361SQ200910037740
公开日2010年9月15日 申请日期2009年3月10日 优先权日2009年3月10日
发明者徐弢, 袁玉宇 申请人:广州迈普再生医学科技有限公司