表达神经营养因子家族相关基因的间充质干细胞及其应用的制作方法

专利名称：表达神经营养因子家族相关基因的间充质干细胞及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种间充质干细胞及其制备方法，具体涉及骨髓、脐带或脐血间充质 干细胞的分离、培养和干细胞纯化及外源性基因如神经生长因子基因转移入间充质干细胞 的方法及其在细胞移植、干细胞培养、定向分化中的应用。
背景技术：
干细胞是正常人体内存在的细胞群体，具有高度自我复制和高度的分化能力。近 年来随着干细胞研究的深入，人们发现利用干细胞可再生各种组织器官，如肝脏、胰腺、神 经组织、骨骼、肌腱等。因来源和分离的原因，现阶段临床应用的干细胞主要有成人骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)禾口造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)、人外周血干细胞、人胚胎来源的干细胞和脐带血造血干细胞及胎盘或脐带间 充质干细胞。按HSCs来源分为骨髓移植(BMT)、外周血造血干细胞移植(PBSCT)、脐带血 干细胞移植、纯化的CD34+细胞移植、胎肝HSCT。按免疫遗传学分为异基因干细胞移植、 同基因干细胞移植、自体干细胞移植。研究表明，BMSCs (骨髓基质来源干细胞)可以分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪 细胞、肌细胞、神经细胞和腱细胞等，是一种具有多向分化潜能干细胞，在体外易分离和扩 增，且便于细胞移植。此外，BMSCs独特的增殖分裂模式使外源基因易于导入和表达，因此， BMSCs在组织工程、细胞治疗和基因治疗中具有广阔的应用前景。干细胞领域研究最多和最清楚的仍是HSCs，它在基础与临床应用研究处干细胞的 最前沿，并不断为其它干细胞研究提供理论和实践的指导和依据。干细胞可分为长期亚群和短期亚群，长期亚群具有无限的自我更新能力，在个体 中持续终生，短期亚群自我更新能力有限，如短期HSCs的自我更新能力仅维持8周左右；根 据分化功能不同，干细胞分为全能性干细胞、多能性干细胞和单能性干细胞，个体形成中最 早的干细胞为全能性干细胞，包括受精卵及胚泡的内细胞团。全能性干细胞进一步形成原 始的生殖干细胞及体干/祖细胞，并最终分化形成各种组织细胞。人类诸多疾病采用常规手段难以达到治疗效果，基因治疗是将人的正常基因或有 治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷和发挥治疗作用，从而达 到治疗疾病目的。基因治疗与常规治疗方法不同，其针对的是疾病的根源_异常的基因本 身。基因治疗分体细胞基因治疗、生殖细胞基因治疗和干细胞基因治疗。自从1990年美国 国立卫生研究院(NIH)和其下属重组DNA顾问委员会(RAC)批准了美国第一例临床基因治 疗申请以来，基因治疗已从单基因遗传病扩展到多个病种范围，主要有恶性肿瘤，心血管 疾病，遗传病，AIDS，类风湿等。理想的载体应具组织专一性，甚至细胞专一性，使其用常规方法注射到体内后即 可自动抵达目的细胞，并把要移植的基因整合到染色体上。由于用基因移植治疗的细胞，必 须先从病人体内取出进行人工培养后，再移植到病人体内，因而基因治疗难度很大，目前只有皮肤细胞和骨髓细胞可接受该处理，而且能做到的治疗只是引入外源基因使其表达，以 补充缺失的或失去正常功能的酶，而不能做到用正常基因去替换突变基因。干细胞转基因治疗是继基因治疗的概念提出后，用于遗传病治疗的新手段。主要 通过自体细胞核移植得到的胚胎来获取干细胞，然后进行基因纠正和定向分化，有望在遗 传病的治疗上获得突破，并解决移植排斥问题。脑细胞源性神经营养因子(BDNF)是由脑细胞产生、分泌的一种有着重要生物功 能的神经细胞营养因子。BDNF对中枢和外周的多种神经细胞具有较为广泛的神经营养作 用，如促进某些神经群的生存和分化，调控神经突轴的轫力，并与海马的学习、记忆以及脊 髓疼痛机制有关等。BDNF除了其神经生长作用之外，还有促进内皮细胞生成和缺血组织新 生血管的生成，促进累及早老性痴呆的主要神经元的功能恢复和成活。BDNF对多巴胺神经元的生存和生长也有重要作用。它具有阻止凋亡细胞的死亡， 增加酪氨酸水解酶阳性神经元的生存和神经元纤维的生长。研究证明数种中枢神经系统疾 病与此BDNF支持减少相关连。因此，BDNF作为一种强效神经保护因子，被认为是治疗某些 中枢神经系统疾病的一个好的候选因子。胶质细胞系来源的神经营养因子(⑶NF)具有促进多巴胺能神经元和运动神经元 存活的作用，能减少脑缺血时迟发性神经元的死亡和减轻脑缺血损伤后脑水肿和缩小梗死 体积。自从GDNF被克隆后，其对神经损伤的保护作用已被众多的研究所证实，外源性的 GDNF转基因治疗可改善脑缺血的症状和病理改变。

发明内容
本发明的目的在于提供了一种可表达外源的神经营养因子家族基因的间充质干 细胞(MSCs)及其制备方法，并提供了将该MSCs用于干细胞的体外培养、扩增和定向分化的 用途。发明人在研究中发现，年龄大(60周以上)的大鼠骨髓干细胞和老年人(大于 50岁以上)的骨髓干细胞，在体外扩增时，尽管有白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)、内皮生长因子(epithelial growth factor, EGF)和神经生长因子(nerve growth factor, NGF)存在的条件下，MSCs仍不能有效和活跃的扩增。因此，本发明用年轻 的胎大鼠MSCs作为MSCs培养的饲养层细胞扩增大龄鼠的MSCs，取得了较满意的结果。继 而本发明提出了 MSCs和转基因MSCs用于骨髓干细胞培养、扩增与分化的研究思路，旨在促 进大龄动物或老年人或体外难扩增的MSCs的体外扩增和定向分化。本发明从骨髓、脐带和脐血中提取培养MSCs。为了使干细胞能表达外源基因，采用 重组腺相关病毒(recombinant Adeno-Associated Virus,rAAV)为载体将治疗用基因-脑 细胞源性神经营养因子(BDNF)基因(人大脑来源)转移入MSCs，从而实现MSCs和基因治 疗相结合。本发明所述的一种表达神经营养因子家族相关基因的MSCs，是按以下步骤制备 的A)从骨髓、脐带和脐血中提取、培养干细胞；因它们均具有MSCs的生物学特征， 在形态上呈均质性，高表达⑶166、⑶54、⑶29，低表达⑶13、⑶34、⑶45，因此以下均称为 MSCs ；
B)采用腺相关病毒(Adeno-Associated Virus, AAV)为载体，将神经营养因子家 族相关基因重组到AAV载体上；C)制备表达神经营养因子家族相关基因的AAV ；D)将上述表达神经营养因子家族相关基因的AAV颗粒感染分离、纯化的干细胞， 得到表达神经营养因子家族相关基因的MSCs。所述步骤C中，所述的所述神经营养因子家族相关基因包括胶质细胞源性神经营 养因子即⑶NF和脑细胞源性神经营养因子即BDNF。所述步骤A中，采用离心法分离骨髓干细胞和脐血干细胞，用免疫磁珠法纯化 ⑶34+细胞。具体方法如下1、按临床常规骨髓穿刺操作每次取得红骨髓200ml或取自脐带血库的脐血 100ml。2、将骨髓血或脐血加入到磷酸盐缓冲液(PBS)中轻勻，常温离心机中以1500r/ min进行离心15分钟，弃上清，将沉淀物用磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻悬浮，细胞悬液按2 1 比例缓慢加入到比重为1. 089的干细胞分离液和淋巴细胞分离液中，20°C以2500r/min离 心10分钟。3、离心管中液体分为四层，小心吸取富含有核细胞的中间细胞层，以PBS洗涤， 800r/min常温离心4分钟。细胞计数。胎盘蓝染色，活细胞计数。瑞氏染色和有核细胞分 析。4、获得单个核细胞悬液后进行CD34+细胞纯化(MACS磁性分离试剂盒，购自 Miltenyi Biotech 公司，德国)。5、纯化后的细胞悬液取样计数，以PE标记的鼠抗人⑶34单克隆抗体(购自 Becton Dickinson公司，美国)标记细胞，流式细胞术测定⑶34+细胞纯度。6、将纯化后的⑶34阳性细胞用含10%小牛血清的DMEM/F12(Hyclone公司)培 养，内含LIF 1.0IU/ml,CSF 1. 0ng/ml,bFGF 2ng/ml。培养24小时后进行转基因技术操作。所述步骤A中，采用胶原酶和胰酶消化法分离脐带MSCs，具体方法如下1、将产后脐带立即浸入4 °C罕氏平衡盐溶液(Hanks ‘ Balanced Salt Solution(HBSS)(Gibco，14185-052，USA)中；2、75%乙醇消毒30秒，清除脐带血管，间质(Wharton' s胶)于试管中切成 0. 5cm3 大小；3、250g离心5分钟，去上清，沉淀用0. 1M/L的PBS洗三次；4、250g离心5分钟，沉淀用0. 1 %的胶原酶37°C消化18小时；5、洗涤，再用2. 5 %的胰酶37°C消化30分钟；6、收集消化后游离的MSCs，用含10%小牛血清的DMEM/F12(Hycl0ne公司)培养， 内含LIF 1.0IU/ml, CSF 1. 0ng/ml, bFGF 2ng/ml。培养24小时后进行转基因技术操作。所述步骤B中，包括以下步骤a)人神经营养因子家族相关基因克隆及其N未端的构建；b)含神经营养因子家族相关基因表达盒的AAV载体的构建。上述步骤a中，所述神经营养因子家族相关基因包括胶质细胞源性神经营养因子 即GDNF和/或脑细胞源性神经营养因子即BDNF。
5
本发明经动物脑内移植实验证实骨髓或脐血MSCs在体内能分化形成神经元或神 经胶质细胞，并且能稳定表达⑶NF。本发明从人骨髓中提取纯化骨髓MSCs的方法并不限于以上典型方法，也可用如 下方法物理方法如穿剌、引流等从骨髓中获取骨髓血细胞。分离骨髓或脐血MSCs的方法可包括1、贴壁分离法。该法主要利用干细胞具有在塑料培养瓶中贴壁生长的特性将干细 胞与其它细胞相分离。2、流式细胞分选法。该法是根据干细胞体积小、相对缺少颗粒和独特的表面标志 等特性对其加以分离。3、免疫磁珠法。该法是根据免疫学原理，利用包备有抗体的磁珠与干细胞表面的 一些特殊标志如CD34特异结合，通过一定强度磁场时被滞留而分选。4、密度梯度离心法。该法是根据干细胞与其它细胞的密度不同，实验证明间质 干细胞位于低密度细胞层。所采用的常用梯度分离液有Percoll和Ficoll，Ficoll法或 Peroll法可有效地将造血干细胞从骨髓或脐血中分离出来，且纯度较高，细胞存活好。本发明将外源基因转入人骨髓或脐血MSCs的方法并不限于以上典型的AAV载体 的方法，也可用如下的方法1、电穿孔法；2、脂质体法；3、钙磷法；4、病毒载体法如疱疹病毒载体、巨细胞病毒 载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体(ADV)、腺相关病毒载体(AAV)等；5、非病 毒载体法如转座子法(Transposon systems)、原核/真核表达载体等。本发明所转入外源基因是与疾病发生、预防和治疗相关的基因，例如生长因子基 因(表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板来源生长因子(PDGF)、脑源性 神经因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)等)，营养不良蛋白(dystrophin)与假性肥大性肌 营养不良基因，囊性纤维化与人CFTR基因，粘多糖病与0 -葡糖苷酸酶基因，镰状细胞性贫 血与血红蛋白S基因，侏儒症与生长激素基因和苯丙酮尿症与苯丙氨酸羟化酶基因，白介 素IL1-28，干扰素和细胞趋化因子等基因，转入病症相关外源基因的骨髓或脐血MSCs可用 于转入基因相关疾病的诊断和治疗。本发明将人源正常目的基因转入骨髓或脐血MSCs，在骨髓或脐血MSCs内表达、分 泌有治疗功效目的基因产物蛋白质，而构成的一种结合基因治疗、达到对治疗相关疾病治 疗更有针对性、疗效更显著的骨髓或脐血MSCs。本发明将转入神经营养因子(如BDNF和⑶NF)基因的MSCs，用做饲养层细胞用于 某些特定个体(如老年动物、老年人、患萎缩性疾病(再障、肿瘤化疗后和脑萎缩等)和体 质差的患者)的骨髓干细胞或神经干细胞培养扩增和维持未分化状态。本发明将转入神经营养因子(如BDNF和⑶NF)基因的MSCs，同骨髓干细胞或神经 干细胞共培养，以促进骨髓干细胞向神经细胞方向定向分化，而神经干细胞又可定向分化 成特定的神经细胞如多巴胺能神经元等。


图1 用干细胞分离液分离和免疫磁珠法纯化的的CD34+骨髓干细胞，干细胞特征 显示为细胞小，核染色深，胞质很少。
图2 培养中的骨髓MSCs 经过数代培养后，骨髓MSCs扩增明显。图3 绿色荧光蛋白基因转染的人骨髓MSCs及其表达应用基因转染技术，将脂质 体包被绿色荧光蛋白基因表达质粒转染人骨髓MSCs，48小时后，用荧光倒置显微镜观察绿 色荧光蛋白基因在人骨髓MSCs的表达，结果如箭头所示人骨髓MSCs表达绿色荧光蛋白基 因，表达荧光强度达中度，转染率达20%以上。图4 人神经营养因子(BDNF)基因cDNA片段(RT-PCR)产物.第一泳道为DNA分 子量标准；第二和第三泳道为该基因反向转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)产物。箭头所指 为该基因cDNA片段在琼脂糖电泳上的位置。图5 重组人神经营养因子(BDNF)的表达。此图为转化细菌后的表达产物在 SDS-PAGE胶经卡马氏亮兰染色后的结果。从左向右起，第一泳道为标准蛋白质分子量标记 物；第二泳道为未诱导的细菌产物；第三和第四泳道为诱导的产物。箭头所示为表达产物。图6 该基因BDNF在表达产物的Western Blot分析结果。第一泳道为标准蛋白 质分子量标记物；第二泳道为末诱导细菌产物；第三、第四和第五泳道分别为不同诱导时 间的产物。显示表达产物为符合预期的BDNF基因产物。图7 转基因MSCs的上清能诱导PC12细胞的神经元样分化，细胞轴突生长明显， 其末端膨大，并可与周围神经细胞形成连接。图8 未转基因的MSC细胞上清共培养的细胞也有小量的神经突起形成，而对照组 的PC12细胞仍为单个园型或多角型细胞呈集落生长。图9 共表达人源⑶NF和BDNF基因表达盒结构图从左到右，分别是pCMV启动子、 3 -珠蛋白内含子、人⑶NF、IRES、人BDNF和人生长激素多聚腺嘌呤组成。图10 含共表达人源⑶NF和人源BDNF基因表达盒的重组AAV基因组结构图从 左到右，分别为反转末端重复子(ITR)、共表达人源⑶NF和BDNF基因的表达盒和反转末端 重复子(ITR)。图11 转BDNF基因的脐血MSCs与骨髓MSCs共培养，细胞呈现梭形、多角形、锥形 或星形，与神经细胞类似，相互交织成网。
具体实施例方式实施例一骨髓MSCs分离培养和绿色荧光蛋白基因转染人骨髓MSCs绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因是目前发现的唯一能在细 胞内表达，且不需要其他外源底物参与的全新报告基因。本研究利用CMV-GFP基因转染人 骨髓干细胞，观察GFP在人骨髓干细胞内的表达情况。一、材料1、设备超净工作台，水平离心机，倒置显微镜和普通显微镜。离心管和平衡天 平，骨髓穿剌针和采血袋。流式细胞仪，干燥箱，手套和手术衣。比重计(1.000-1. 100、 1. 100-1. 200)2、试剂泛影葡胺(Sigma公司)，羟甲基纤维素(Sigma公司)，氯化铯(Sigma公 司)，聚蔗糖(Ficoll-400，Phamacia公司)，磷酸二氢钾、氢氧化钠(均为广州化学试剂 厂)。3、细胞培养基含10%小牛血清的高糖DMEM培养基(Gibco公司)。
4、淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)。5、CD34免疫磁珠试剂，购自premega公司。6、BD Procount progenitor Cell Enumeration Kit(BD公司，干细胞计数试剂盒， 批号N0. 340498)7、pGFP10II :3192kb，为含有野生型 GFP 基因 cDNA EcoR I 片段(包括 0RF 禾口 3' 端非编码区)的PBS质粒(invitrogen公司)。二、方法1、干细胞分离液的制备称取泛影葡胺3g、羟甲基纤维素2g、氯化铯0. 2g、聚蔗糖3g。将上述组分依次加 入100ml的量筒中，加O.Olmol/L磷酸盐缓冲液至100ml，即得干细胞分离液的浓缩液。用 比重计测得其比重为1. 123g/ml。使用时，将上述干细胞分离液的浓缩液用0. Olmol/L磷酸 盐缓冲液稀释至所需的比重，即为工作液。2、采集临床志愿者髂骨内骨髓按临床常规骨髓穿刺操作每次取得红骨髓200ml。将20ml骨髓加入到磷酸盐缓冲 液(PBS)中轻勻，常温离心机中以1500r/min进行离心15分钟，弃上清，将沉淀物用磷酸盐 缓冲液(PBS)轻轻悬浮，细胞悬液按2 1比例缓慢加入到比重为1.089的干细胞分离液 和淋巴细胞分离液中，20°C以2500r/min离心10分钟。离心管中液体分为四层，小心吸取 富含有核细胞的中间细胞层，以PBS洗涤，800r/min常温离心4分钟。细胞计数。胎盘蓝染 色，活细胞计数。瑞氏染色和有核细胞分析。3、用免疫磁珠法纯化人骨髓干细胞CD34+造血干/祖细胞分离采用免疫磁珠法，从骨髓血中分离的单个核细胞，以 DMEM调整细胞浓度至107ml，洗涤后加磁珠标记的单抗，于10°C，孵育15min，过Mini MACS 细胞分离柱，脱离磁场，加压洗脱结合的CD34阳性细胞即为纯化的骨髓干细胞。4、免疫细胞化学和流式细胞检测。试剂盒操作详见说明书。将新鲜分离的细胞加入EppendofT管(106细胞/管)， 以1500rpm转速离心5min，PBS洗1次，加入冷丙酮lml，4°C固定8min ；离心弃上清后加入 一抗(CD34、CD45)，混勻后37°C反应45min，1500rpm转速离心lOmin，PBS洗3次，离心弃上 清后加入带二抗标记的IgG，混勻后37°C反应30min，PBS洗涤两次，离心后的沉淀物视量加 入PBS制备成细胞悬液，流式细胞仪进行检测。5、人骨髓干细胞的培养与扩增取2 X 106ml-lCD34+细胞种入培养瓶中，加DMEM培养液含20 % FCS和LIF (lU/ml， GIBC0)、SCF(50ng/ml, GLBC0)、IL-3 (200U/ml，GLBC0)、GM-CSF (200U/ml，GIBC0) 37°C >5% C0240小时后半量换液，再培养48小时后分瓶培养扩增。以下所用细胞均为培养扩增的人 骨髓MSCs。6、进行pEGFP-Nl质粒细胞转染，用Lipofectamine2000脂质体转染法。三、结果1、各种分离液所得细胞经胎盘蓝染色显示，细胞存活率均达90%以上，均未显示 对骨髓细胞有毒性作用。2、用瑞氏染色法鉴定，用干细胞分离液分离所得细胞主要为干细胞，细胞小，如红细胞大小，核染色深，胞质很少(图1)。3、干细胞标志试剂盒和流式细胞仪鉴定骨髓干细胞干细胞标志试剂盒主要用于 鉴定骨髓造血干细胞，其中⑶34用于标志造血干细胞，⑶45用于标志淋巴细胞，PI主要用 于标志有核细胞。经流式细胞仪测定，干细胞分离液所得细胞悬液中CD34、CD45和有核细 胞比例见表1。结果提示用1. 086比重的干细胞分离液所得的⑶34阳性细胞数比淋巴细 胞分离液所得的CD34+细胞数多12倍。表1，不同比重干细胞分离液分离猪骨髓细胞各种标志的细胞比例 4、用免疫磁珠法纯化人骨髓干细胞，⑶34阳性细胞占96. 4%。5、分离的骨髓MSCs经4-5代转代后，细胞扩增明显，大部分细胞呈梭型，同心园状 分布，少量细胞呈小圆型(图2)。6、用pEGFP-m质粒进行骨髓MSCs转染，转染细胞荧光强度为中度以上，绿色荧光 信号主要从胞体中发出(图3)，转染效果达20%以上。实施例二 人⑶NF和BDNF基因克隆及其N未端的构建1、人⑶NF基因克隆及其N未端的构建以人脑组织信息核糖核苷酸(mRNA)为模板，用Poly(T)引物在反向转录酶作用 下，合成人脑组织的互补脱氧核糖核苷酸(cDNA)，然后以人脑组织cDNA作为模板，用人工 合成的，含有编码人白细胞介素_2分泌先导多肽核苷酸和人成熟GDNF基因N-末端序列核 苷酸的正向引物和人GDNF基因C-末端序列核苷酸的反向引物进行PCR扩增，进行人GDNF 基因克隆及其N未端的改建，并在其N-末端引入内切酶Nhel和Ndel位点，在其C_末端 引入内切酶BamHI和Hindlll位点。弓丨物1C-末端部份序列与引物2N-末端部份序列相同 (见下划线)；引物3C-末端含GDNF的C-末端序列。由于人白细胞介素_2分泌先导多肽核苷酸较长，故采用分步克隆法。即以人脑组 织cDNA作为模板，先用引物2和引物3进行第一次PCR反应，再以此PCR产物为模板，用引 物1和引物3进行第二次PCR反应。PCR引物设计如下引物 l(61mer):5，~gt |gctagccatatg| tacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgt-3，引物 2(52mer)5' —actaagtcttgcacttgtcacaaacagttctgagaagaagcgccggggatca—lj，引物3(34mer)5， -tcaagcttggatcctcagatacatccacaccttt-3'
PCR扩增产物经加尾(tailing)加上腺嘌呤后，连接至T-easy载体，转化细菌后， 扩增、抽提、纯化，经DNA测序确定。测序正确后，构建含人⑶NF基因原核细胞表达质粒，进行表达和 westernblotting 检测。2、人BDNF基因克隆及其N未端的构建以人脑组织信息核糖核苷酸(mRNA)为模板，用Poly(T)引物在反向转录酶作用 下，合成人脑组织的互补脱氧核糖核苷酸(cDNA)。然后以人脑组织cDNA作为模板，用人工 合成的，含有编码人白细胞介素_2分泌先导多肽核苷酸和人BDNF基因N-末端序列核苷酸 的正向引物和人BDNF基因C-末端序列核苷酸的反向引物进行PCR扩增，进行人BDNF基因 克隆及其N未端的改建。并在其N-末端引入内切酶Ncol和Smal位点，在其C-末端引入 内切酶Xbal和Hindlll位点。引物4C-末端部份序列与引物5N-末端部份序列相同(见 下划线)；引物6C-末端含GDNF的N-末端序列。由于人白细胞介素-2分泌先导多肽核苷酸较长，故采用分步克隆法。即以人脑组 织cDNA作为模板，先用引物5和引物6进行第一次PCR反应，再以此PCR产物为模板，用引 物4和引物6进行第二次PCR反应。PCR引物设计如下弓丨物 4(63mer)5' —gtccatggcccgggatgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgt一3，弓丨物 5(55mer)5，_actaagtcttggcacttgtcacaaacagtcactctgaccctgcccgccgaggggag_3，弓丨物 6(41mer)5' -gcctctagaaagcttctatcttccccttttaatggtcaatg-3'PCR扩增产物经加尾(tailing)加上腺嘌呤后，连接至T-easy载体，转化细菌后， 扩增、抽提、纯化，经DNA测序确定。测序正确后，构建含人BDNF基因原核细胞表达质粒，进行表达检测。实施例三、共表达⑶NF和BDNF表达盒pAAV_MCS载体的构建共表达⑶NF和BDNF表达盒pAAV_MCS载体的构建方法(图9，10)包括以下步骤1)应用AAV helper-free表达系统中pAAV-MCS载体的多克隆位点，将⑶NF基 因以内切酶BamHI和Xball核苷酸片段、经纯化、并与BamHI和Xball酶切消化、纯化的 pAAV-MCS载体进行连接反应后，转化感受态细菌，进行扩增，并涂布在含适当抗生素的培养 皿上，37 °C培养箱过夜生长；2)筛选多个克隆菌落于含适当抗生素的培养液中，37°C震荡培养过夜，于第二天 抽取、纯化pAAV-MCS质粒DNA，并用BamHI和Xball酶切消化，以确定含有BamHI和Xball 的GDNF基因片段的pAAV-MCS载体的质粒DNA和克隆菌株；3)确定含有⑶NF基因片段的pAAV-MCS之后，以内切酶Hindlll和Bglll完全消 化含有⑶NF基因的pAAV-MCS质粒DNA，1 %琼脂糖分离、纯化备用；4)为获得IRES片段，用内切酶Hindlll和Small完全消化pIRESneo3载体DNA， 琼脂糖分离、纯化IRES片段备用；5)用内切酶Small和Bglll完全消化含有BDNF基因片段的T-easy载体DNA，1%
10琼脂糖分离、纯化BDNF基因片段备用；6)将上述内切酶HindHI和Small消化的IRES片段和内切酶Small和Bglll消 化的BDNF基因片段经连结酶反应，拼接到上述内切酶Hindlll和Bglll完全消化的含⑶NF 基因的pAAV-MCS载体质粒DNA上，转化感受态细菌，370C培养扩增，并涂布在含适当抗生素 的培养皿上，37°C培养箱过夜生长；7)筛选多个克隆菌落于含适当抗生素的培养液中，37°C震荡培养过夜，于第二天 抽取、纯化pAAV-MCS质粒DNA，并用上述内切酶消化pAAV-MCS质粒DNA，确定含⑶NF基因、 IRES片段和BDNF因的pAAV-⑶NF/IRES/BDNF质粒；将此pAAV-⑶NF/IRES/BDNF表达质粒 用脂质体导入真核细胞，应用蛋白质印迹法，观察由CMV启动子驱动共表达⑶NF和BDNF的 状况。实施例四、⑶NF-AAV的表达⑶NF-AAV的表达，包括以下步骤1、在转染前48小时，在加入10ml DMEM生长培养液的100毫米培养皿中接种约3 百万个AAV-293细胞，2天后细胞密度应为70-80% ；2、解冻含上述表达盒的 pAAV-MCS、pAAV-RCH 和 pHelper 质粒 DNA，用 pH 7. 5 的 TE 缓冲液调整每种质粒DNA为lmg/ml ；3、在15毫升培养管中从上述3种质粒溶液中各取10微升DNA溶液，再加入1毫 升0.4M CaCl2，轻轻混勻；4、在另一支15毫升培养管中加入1毫升2x HBS溶液，再将上述3)中的1.03毫 升的DNA/CaCl2滴入1毫升2x HBS溶液中，倒转培养管多次，混勻；5、立即将DNA/CaCl2/HBS混悬液滴入AAV-293细胞培养皿中，并使其均勻分布在 培养液中；6、将AAV-293细胞培养皿放入37°C培养箱中6小时，随后去除AAV-293细胞培养 皿中的培养液，加入10毫升新鲜DMEM生长培养液，在37°C培养箱中培养72小时；7、3天后观察，如观察到培养液颜色变化、或看到有细胞形态变园，脱离板面或漂 浮在培养液中，则表明有重组AAV病毒颗粒产生；8、此时收集细胞培养液、并收集细胞，通过4次冻/融法，裂解细胞，使其胞内重组 AAV病毒释放出来，最后在室温下以10，OOOXg离心10分钟，将上清液转移至另一新管中，贮 存于_80°C冰箱保存。此即为表达人源GAD65和⑶NF基因的重组AAV母液，下一步可进行 病毒扩增、病毒滴定度检测及GDNF基因表达产物的检测。为了使骨髓或脐血MSCs能表达外源基因，发明人采用AAV为载体，以CMV为启动 子，将⑶NF基因转移入骨髓或脐血MSCs。rAAV载体由AAV-293细胞哺育生产，AAV载体病 毒的纯化采用两次氯化铯离心法。1X106细胞/ml的浓度加入培养瓶中进行培养6-12小时后，换新的培养液。⑶NF 在培养上清中的表达用抗GDNF单克隆抗体进行ELASA测定。实施例五、脑细胞源性神经营养因子(BDNF)转基因骨髓MSCs的制备1、材料1. 1 主要试剂:Trizol Reagent, LipofectamineTM2000 (美国 Invitrogen 公司)。 逆转录酶DNA合成试剂盒(美国Fermentas公司)。T4DNA连接酶(美国MBI公司)。PCR
11Kit(Qiagen公司)；BamHI和Xho I限制性内切酶(Promega公司)；引物合成、核苷酸序列 测定(Qiagen公司)；Endofree Plasmid Maxi Kit (Qiagen公司)；原位-半乳糖苷酶染色 试剂盒(Stratagene公司)，DMEM培养基(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青公司)；喜 树碱(Sigma公司)。1. 2病毒载体、细胞株及菌种pAAV系列质粒及AAV-293、AAV-HT1080细胞 (Stratagene公司)，DH5宿主菌由本室制备保存。2、方法2. lpAAV-BDNF重组AAV载体的构建从胎脑组织中提取总RNA，利用M-MLV逆转录酶及01igo_dT引物合成第一条cDNA 链，然后在PCR管中加入ExTaqTM;利用PCR法扩增BDNF目的基因，上游引物为5’ -GCTCTAGAGCCACCATGACCATCCTTTTCCTTACTATG-3’，其中TCTAGA为Xbal I识别位点，下游引物为5，-GCGGTACCCTATCTTCCCCTTTTAATGGTCAAT-3，。上、下游引物经5’端修饰分别引入限制性内切酶BamHI和Xhol位点。扩增产物 经BamHI和Xhol酶切后定向克隆入pAAV_MCS载体多克隆位点。重组质粒pAAV_BDNF经双 酶切鉴定正确后，进行DNA测序。2. 2 重组 AAV (AAV-BDNF)的包装采用Qiagen试剂盒大量提取超纯质粒pAAV-BDNF、pHelper和pAAV-RC质粒，分别 测定0D值，并用TE溶液调整质粒浓度为lg/L。DMEM高糖培养基培养AAV-293，细胞融合至 70% 80%时，用磷酸钙转染法将pAAV-BDNF质粒与AAV包装质粒pAAV_RC、AAV辅助质粒 pHelper三质粒共转染AAV-293细胞，构建带有BDNF全长0RF的重组AAV-BDNF。pAAV-LacZ 作为报告基因同pAAV-BDNF —样共转染AAV-293细胞。转染后于培养箱中培养6h后换新 鲜培养基，再培养66 72h后回收病毒。显微镜下观察细胞形态变化。2. 3病毒颗粒的收集用细胞刮子将细胞悬浮，收集细胞悬液，进行4轮冷冻(液氮)_复温(37°C水浴) 循环，每次冷冻、复温均lOmin。10, OOOr/min离心lOmin收集上清液-初级病毒液，于_80°C保存。2. 4重组pAAV-BDNF病毒滴度检测培养AAV-HT1080细胞，以每孔3X 105个接种12孔培养板，培养过夜，使细胞达到 80%融合。每孔加入0. 2mL AAV容纳培养基(使培养基中喜树碱终浓度达0. 8 y mol/L)，混 勻后培养4h。吸出培养基，病毒原液稀释100倍后，再进行体积为2. 5mL的5倍系列稀释， 稀释度从2 X 10_3到8X 10_5。取0. 5mL分别加入3个培养孔，同时以无病毒原液作为阴性 滴度对照。培养2h，每孔再加入0. 5mLDMEM,培养48h，弃上清，使用Stratagene公司的原 位日-半乳糖苷酶染色试剂盒对细胞进行固定和染色，在细胞密度适当的培养孔中计数蓝 染的细胞，计算每mL贮存物中病毒颗粒(染色细胞数)。2. 5BDNF基因重组的pAAV的纯化及其体外表达目的基因的检测用病毒接种于大约10瓶75cm2培养瓶的HT1080细胞，待出现细胞病变时如上收 集病毒，用CsCl密度梯度离心法纯化pAAV，_70°C保存备用。将纯化的pAAV的转染HT1080 细胞，取其培养基配制电泳样品，用未接种的同时传代的HT1080细胞培养基配制样品做为阴性对照，分别取第1天，第2天，第3天的培养基用于样品制备，蛋白电泳及Western blot 法检测BDNF基因在HT1080细胞中的表达，其中在We stern blot过程中使用羊抗大BDNF多 克隆抗体(1 1000)与PVDF(聚偏氟乙稀)膜上的BDNF蛋白质进行结合。2. 6BDNF-pAAV 转染大鼠骨髓MSCs和体外细胞培养活性测定大鼠骨髓基质细胞(MSCs)的分离、原代和传代培养在无菌条件下取出大鼠股骨 和胫骨。剪掉骨头两端，露出骨髓腔，用无血清的DMEM培养液冲洗骨髓腔，反复2次或3次， 以lOOOr/min离心5min。离心后弃上清，用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞， 接种于培养瓶中。培养24h后换液，后每3d全量换液1次，细胞基本铺满瓶壁后，以胰酶消 化传代。在MSCs培养基中加入适量病毒液。37°C CO2孵箱中孵育，培养3，10天，取培养上 清，进行BDNF的Western blot检测和对PC12细胞(源于大鼠肾上腺髓质瘤/嗜铬细胞瘤， 是一种单胺能细胞株)的神经营养活性测定。以未转染BDNF-pAAV的MSCs培养上清做阴 性对照。3、结果3. 1 重组 pAAV-BDNF 的鉴定体积分数1. 5%琼脂糖凝胶电泳显示约860bp处有扩增条带，片段大小与预期值 一致(图4)。重组质粒pAAV-BDNF经双酶切后，电泳显示出现大小为4. 6kb和861bp的载 体片段和目的基因片段，结果与预期相符(图4)。重组质粒pAAV-BDNF测序亦证实插入片 段BDNF与Genbank序列完全一致，全长编码区无碱基突变。3. 2三种载体共转染AAV-293细胞及病毒粗提物的制备3种载体共转染AAV-293细胞6h后，显微镜下观察到培养基底部出现无数小黑色 颗粒，细胞无明显变化。24h后观察到AAV-293细胞部分变圆，随着病毒增殖，细胞成串浮 起，出现细胞病理效应；48h后细胞逐渐从壁上脱落；而阴性对照组细胞则贴壁完整，无明 显形态变化。3. 3病毒滴度测定不同稀释度的AAV-LacZ病毒感染AAV-HT1080细胞后，细胞经固定及X_gal染色 后，在显微镜下可明显观察到蓝染的细胞。在蓝染细胞密度合适的细胞孔中记数全部的蓝 染细胞数，计算重组病毒的滴度约为l.OXliTpfu。3. 4蛋白电泳及Western blot检测结果(图5，6)对照组3、10dMSCs培养基均未见明显特异性条带，而实验组，转染后3、10d取其培 养基进行检测，可见BDNF的表达逐渐增强，并较对照组有显著性增强，图中的黑色条带即 为检测到的BDNF蛋白(图5，6)。3. 5对PC12细胞的神经营养活性转基因MSCs的上清能诱导PC12细胞的神经元样分化，细胞轴突生长明显，其末端 膨大，并可与周围神经细胞形成连接(图7)。未转基因的MSC细胞上清共培养的细胞也有 小量的神经突起形成，而对照组的PC12细胞仍为单个园型或多角型细胞呈集落生长(图 8)。实施例六、脑细胞源性神经营养因子(BDNF)转基因骨髓MSCs对脑缺血性动物模 型的脑损伤保护作用
一、材料与方法1、BDNF转基因骨髓MSCs按实施例二所述方法由本室自制。2、实验动物与分组健康Wistar大鼠80只(购自中山医科大学实验动物中心)，体重180g 220g。大鼠脑缺血再灌流模型的建立，根据Honma等(Honma T,Honmou 0，Iihoshi S, et al. Intravenous infusion of immortalized human mesenchymal stem cells protects against injury in a cerebral ischemia model in adult rat. Exp Neurol, 2006，199 =56-66.)的方法，大鼠麻醉后取颈正中切口，结扎颈总动脉、颈外动脉，于颈总动 脉分叉下方剪一切口，将一末端用酒精灯烧成圆头的尼龙线插入颈内动脉17-18mm，结扎颈 内动脉。2小时后拔线，实现再灌注。脑缺血再灌注后1天进行神经缺损评分，方法为6级 评分法0级，无功能障碍；1级，不能伸展左侧前肢；2级，向左侧旋转；3级，向左侧倾倒；4 级，无自主活动伴意识障碍；5级，死亡。评分2 3级者为模型制备成功，进入本实验。假 手术组除不插尼龙线外，其余步骤同手术组。实验分4组假手术组(8只)、缺血对照组(8只)、MSCs组(8只)、转基因MSCs 组(8只)。3、大鼠骨髓MSCs的分离、原代和传代培养在无菌条件下取出大鼠股骨和胫 骨。剪掉骨头两端，露出骨髓腔，用无血清的DMEM培养液冲洗骨髓腔，反复2次或3次，以 1000r/min离心5min。离心后弃上清，用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，接 种于培养瓶中。24h后换液，后每3d全量换液1次，细胞基本铺满瓶壁后，以胰酶消化传代。4、大鼠MSCs转基因在MSCs细胞培养基中加入适量病毒液。37°C CO2孵箱中孵 育10天，经Western blot检测能表达BDNF。5、尾静脉注射MSCs 脑缺血再灌注24小时后，将ImL转基因MSCs (1 X IO6个细胞 /ml)经尾静脉注射入转基因MSCs组大鼠体内，将未进行转基因MSCs (1 X IO6个细胞/ml) 经尾静脉注入MSCs组大鼠体内，缺血对照组和假手术组大鼠体内分别注入ImL生理盐水。6、功能评估大鼠模型制备前后每3天均采用Combs和D' Alecy(Combs DJ, D' Alecy L G. Motor performance in rat s exposed to severe forebrain ischemia effect of fasting and 1，3-butanediol. Stroke，1987，18 :503_511.)的方法进行网屏测 验、平衡木测验、抓握牵引测验，观察大鼠在行为学方面的差异。每项试验进行两次，取较高 的分数值作为大鼠的该项得分。7、各组大鼠于MSCs治疗后28天以4%多聚甲醛灌注取脑。取脑组织冠状面均勻 切2mm厚脑片，2% TTC染色，数码相机拍照，以图像处理软件测量梗死面积，计算梗死面积 与损伤侧脑半球的面积比。8、统计学处理采用SPSS 13. O统计软件，各组数据均以均数士标准差(χ士s)表 示。采用方差分析或t检验进行组间比较，P < 0. 05为差异有统计学意义。二、结果1、神经功能评分MSCs组大鼠神经功能恢复较缺血对照组明显提前，MSCs治疗后 第4天即出现明显的神经功能改善，MSCs治疗21天以后与缺血对照组比较无显著差异。 而转基因MSCs组在治疗后第4天大鼠神经功能评分即与MSCs组、对照组比较均有显著 差异(ρ <0.01)，至治疗后21天效果更加明显(ρ <0.001)，到28天时仍有显著差异(ρ < 0. 01)。
2、脑梗死面积比较MSCs治疗后28天，脑组织TTC染色显示，梗死区与损伤侧脑 半球面积比值与缺血对照组比较无显著差异(p>0. 05)，而转基因MSCs组脑梗死区面积明 显缩小，梗死区与损伤侧脑半球面积比值与缺血对照组比较有显著差异(P < 0. 05)。三、结论 转BDNF基因MSCs对大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤有明显的治疗作用，效果优 于单用MSCs。实施例七、共表达神经营养因子⑶NF和BDNF基因的自体骨髓MSCs的构建构建 本发明的共表达神经营养因子⑶NF和BDNF的转基因骨髓MSCs，首先克隆人⑶NF和BDNF 基因，构建共表达人⑶NF和BDNF基因的重组AAV ；用此重组AAV转染人自体骨髓MSCs， 完成共表达GDNF和BDNF的转基因修饰自体骨髓MSCs的构建。本发明采用的AAV系统为 Stratagene 公司的 AAV helper-free 系统。1、人⑶NF和人BDNF基因克隆及其N未端的构建(见实施例二 )；2、含共表达⑶NF和BDNF表达盒的pAAV_MCS载体的构建(见实施例三)；3、共表达⑶NF和BDNF的AAV的制备，具体操作过程如下1)在转染前48小时，在加入IOml DMEM生长培养液的100毫米培养皿中接种约3 百万个AAV-293细胞，2天后细胞密度应为70-80% ；2)解冻含上述表达盒的 pAAV-MCS、pAAV-RCH 和 pHelper 质粒 DNA，用 pH 7.5 的 TE 缓冲液调整每种质粒DNA为lmg/ml ；3)在15毫升培养管中从上述3种质粒溶液中各取10微升DNA溶液，再加入1毫 升0.4M CaCl2，轻轻混勻；4)在另一支15毫升培养管中加入1毫升2x HBS溶液，再将上述3)中的1.03毫 升的DNA/CaCl2滴入1毫升2x HBS溶液中，倒转培养管多次，混勻；5)立即将DNA/CaCl2/HBS混悬液滴入AAV-293细胞培养皿中，并使其均勻分布在 培养液中；6)将AAV-293细胞培养皿放入37°C培养箱中6小时，随后去除AAV-293细胞培养 皿中的培养液，加入10毫升新鲜DMEM生长培养液，在37°C培养箱中培养72小时；7)3天后观察，如观察到培养液颜色变化、或看到有细胞形态变园，脱离板面或漂 浮在培养液中，则表明有重组AAV病毒颗粒产生；8)此时收集细胞培养液、并收集细胞，通过4次冻/融法，裂解细胞，使其胞内重组 AAV病毒释放出来，最后在室温下以10，OOOg离心10分钟，将上清液转移至另一新管中，贮 存于_80°C冰箱保存。此即为表达人源GAD65、BDNF和⑶NF基因的重组AAV母液，下一步 可进行病毒扩增、病毒滴定度检测及GDNF和BDNF基因表达产物的检测。4、骨髓MSCs的分离和培养(参见实施例一)；5、转基因骨髓MSCs的构建在75cm2的培养瓶中培养约3 5百万个MSCs，将4毫升含约5百万个pAAV_GDNF/ BDNF重组AAV颗粒转染骨髓MSCs约4小时，然后加入适量的骨髓MSCs培养液，置37°C二 氧化碳培养箱过夜。6、共表达⑶NF和BDNF的转基因骨髓MSCs的鉴定待转基因骨髓MSCs培养24 48小时后，收集部分培养的转基因骨髓MSCs和培养上清液，进行PT-PCR反应和western blotting反应，确定转基因的骨髓MSCs是否共表 达GDNF和BDNF及其表达水平。7、共表达⑶NF和BDNF的转基因骨髓MSCs的应用应用外科神经核定位技术及微管输送系统，将共表达⑶NF和BDNF的转基因骨髓 干细胞定点移植至中枢神经系统相关部位，观察对中枢神经系统相关疾病，如脑血管疾病、 脑缺氧和脑外伤导致的脑功能损伤以及早老性痴呆疾病；以及移植至中枢神经核如绞状 体、豆状核和黑质等，观察对中枢神经系统退行性疾病帕金森氏病的治疗效应。实施例八、转BDNF基因脐血MSCs对体外培养人骨髓MSCs增殖的影响。一、材料与方法
1、主要试剂见实施例一和实施例五。2、脐血间充质干细胞(umbilical cord blood-derived MSCs, UBMSCs)的分离培 养(参见实施例一)，细胞培养扩增至3 X IO6左右进行冻存，共三管，每管1 X IO6左右。3、转 BDNF 基因的 UBMSCs (transgene UBMSCs, TUBMSCs)的制备在 UMSCs 细胞培 养基中加入适量转BDNF基因的AAV病毒液，37°C 5% CO2中孵育2天，经Western blot检 测能表达BDNF。细胞培养扩增至3 X IO6左右进行冻存，共三管，每管IXlO6左右。4、人骨髓单个核细胞的制备53岁成人，参照实施例一的方法制备骨髓单个核细 胞，细胞总数为2. BXlO805、UBMSCs和TUBMSCs作为饲养层细胞的制备收集第3代的UBMSCs和TUBMSCs，分 别加入丝裂霉素C (浙江海正药业，国药准字H33020786，100 μ g/ml，用DMEM培养基配制) 处理lh，用DMEM培养液洗涤4次，用骨髓MSCs培养基稀释成0. 5 X 105/ml细胞浓度待用。6、分组试验1)对照组成人骨髓单个核细胞，用骨髓MSCs培养基稀释成IX 106/ml加入24孔 板中，每孔0. 5ml，每组4孔。2)UBMSCs饲养层细胞对照组(对照U)丝裂霉素处理后的UBMSCs，0. 25X 105/ml 细胞浓度加入以24孔板内，每孔0. 5ml，每组4孔。3) TUBMSCs饲养层细胞对照组(对照T)丝裂霉素处理后的TUBMSCs，0. 25 X IO5/ ml细胞浓度加入以24孔板内，每孔0. 5ml，每组4孔。4) UBMSCs饲养层细胞+成人骨髓单个核细胞培养实验组(实验U)用骨髓MSCs 培养基调整细胞终浓度为丝裂霉素处理后的UMSCs，0. 25XlOVml细胞浓度；骨髓小单核 细胞，1 X106/ml细胞浓度；加入24孔板中，每孔0. 5ml，每组4孔。5) TUBMSCs饲养层细胞+成人骨髓单个核细胞培养实验组(实验T)用骨髓MSCs 培养基调整细胞终浓度为丝裂霉素处理后的TUBMSCs，0. 25XlOVml细胞浓度；骨髓小单 核细胞，1 XlO6Ail细胞浓度；加入24孔板中，每孔0. 5ml，每组4孔。7、上述细胞于培养后第三天第一次全部换液，以后每二天换液一半，维持二周，其 间在倒置显微镜下观察细胞生长情况，待有细胞生长到融合时用胰酶消化和进行细胞计 数。8、统计学处理采用t检验和分组方差分析，ρ <0.01显示有显著性差异。二、结果1、形态学观察
对照组第一次细胞培养换液后，可见少量细胞贴壁生长，细胞形态呈多样性，可 见少量梭形细胞生长。培养二周后梭形细胞呈增多趋势。对照U组和对照T组细胞形态相似，第一次细胞换液后，细胞呈梭形，排列有一定 方向性，细胞生长密度约为30%，10天后细胞密度未见明显增加。实验U组在第一次换液后细胞呈梭形生长，至第8天细胞多呈长梭形，排列有方 向性，呈螺旋状生长，至第10天细胞密度已达约70-80%。实验T组在第一次换液后细胞呈梭形生长，至第8天细胞多呈长梭形，排列有方 向性，呈螺旋状生长，至第10天细胞密度已达约90-95%。2、细胞计数，各组细胞计数结果见表2。表2，各组细胞培养至第10天时的计数结果(X士SD，η = 4) 结果提示用脐血MSCs做饲养层细胞，可使细胞扩增数量增加约6倍((实验U组 细胞数_饲养层细胞数)/对照细胞数=5. 6)；而用转基因脐血MSCs做饲养层细胞，可使 细胞扩增数增加10倍((实验T组细胞数-饲养层细胞数)/对照细胞数=10. 0)。三、结论用脐血MSCs做饲养细胞，可明显促进老年人骨髓MSCs的生长和扩增；而用转 BDNF基因的脐血MSCs做饲养细胞，骨髓MSCs扩增更明显。实施例九转BDNF基因脐血MSCs对体外培养人骨髓MSCs增殖和定向分化的影 响。发明人在利用转BDNF基因脐血MSCs促进体外培养人骨髓MSCs增殖时研究发现， 部分骨髓MSCs出现多突起的改变，状似神经细胞。为此，发明人进行了转BDNF基因脐血 MSCs促进体外培养人骨髓MSCs向神经细胞分化的实验研究。一、材料和方法1、转BDNF基因的UMSCs (transgene UMSCs, TUMSCs)和人骨髓单个核细胞的制备 见实施例五。2,TUMSCs和人骨髓单个核细胞共培养。取终浓度TUMSCs细胞，0. 25X 105/ml ；骨 髓小单核细胞，IX 106/ml细胞浓度，25cm2的培养瓶，用骨髓MSCs培养基(见实施例一)每 瓶5ml进行培养。
3、每3-4天换液1次。待贴壁细胞达80% -90%融合时，以0. 125%胰酶消化，按1 3比例传代。
4、待细胞出现明显的多突起时，以1 X IOVcm2接种于预铺有盖玻片的6孔培养板 中制备细胞爬片，以人MSCs为分化对照，同时制备细胞爬片。每孔加入含10% FBS的DMEM 培养液2ml，达80%融合时终止培养。5、以免疫细胞化学方法检测神经细胞表面标志物NSE的表达。人MSCs和混合培养 MSCs细胞爬片，用4%多聚甲醛室温下固定30min，0. 2% TritonX-IOOPBS渗透细胞5min， 0. 3%过氧化氢室温下封闭30min，羊血清封闭30min。加NSE多克隆抗体(1 400稀释 度)，4°C孵育12h过夜。加入生物素标记的二抗，室温下孵育30min，加入链酶亲和素-过 氧化物酶复合物(SABC)，37°C孵育60min。DAB显色，中性树脂封固，光学显微镜观察。二、结果1、细胞接种36h后可见少量细胞贴壁，呈梭形，类似成纤维细胞，成集落样生长， 以后逐渐增多。培养1周左右，细胞形态开始变化，可见较多指状突起细胞。培养至12天 时，细胞融合成片。将混合细胞传代培养于载玻片上，五天后部分细胞呈现梭形、多角形、锥 形或星形，似神经细胞，相互接成网(见图11)。2、细胞表面标志物的变化载玻片上混合培养的MSCs与单纯骨髓MSCs比较，细胞 NSE染色明显增强。三、结论骨髓MSCs具有向神经细胞分化的能力，转BDNF基因的脐血MSCs能促进MSCs向 神经细胞方向定向分化。实施例十、转⑶NF基因脐带MSCs对体外培养人骨髓MSCs增殖的影响。MTT比色法(噻唑蓝法)主要用于检测细胞内琥珀酸脱氢酶的活力，它可反映细 胞的增殖活力和细胞数量。本实验用MTT法检测转GDNF基因脐带MSCs对体外培养人骨髓 MSCs增殖的影响。一、材料与方法1、主要试剂见实施例一和实施例五。2、脐带间充质干细胞(umbilical cord MSCs, UMSCs)的分离培养(参见实施例 一)，细胞培养扩增至3 X IO6左右进行冻存，共三管，每管1 X IO6左右。3、转 GDNF 基因的 UMSCs(transgene UMSCs, TUMSCs)的制备在 UMSCs 细胞培养基 中加入适量转⑶NF基因的AAV病毒液，37°C 5% CO2中孵育2天，经Western blot检测能 表达⑶NF。细胞培养扩增至3-4X106左右进行冻存，共三管，每管IXlO6左右。4、人骨髓单个核细胞的制备53岁成人，参照实施例一的方法制备骨髓单个核细 胞，细胞总数为2. BXlO805、UMSCs和TUMSCs作为饲养层细胞的制备收集第3代的UMSCs和TUMSCs，分别 加入丝裂霉素C (浙江海正药业，国药准字H33020786，100 μ g/ml，用DMEM培养基配制)处 理lh，用DMEM培养液洗涤4次，用骨髓MSCs培养基稀释成0. 5 X 105/ml细胞浓度待用。6、分组试验1)对照组成人骨髓单个核细胞，用骨髓MSCs培养基稀释成1 X 106/ml加入96孔 板中，每孔0. 1ml，每组8孔。2)UMSCs饲养层细胞对照组(对照U)丝裂霉素处理后的UMSCs，0. 25X 105/ml细胞浓度加入以96孔板内，每孔0. lml，每组8孔。3) TUMSCs饲养层细胞对照组(对照T)丝裂霉素处理后的TUMSCs，0. 25X 105/ml 细胞浓度加入以96孔板内，每孔0. 1ml，每组8孔。4) UMSCs饲养层细胞+成人骨髓单个核细胞培养实验组(实验U)用骨髓MSCs培 养 基调整细胞终浓度为丝裂霉素处理后的UMSCs，0. 25 XlOVml细胞浓度；骨髓小单核细 胞，1 X106/ml细胞浓度；加入96孔板中，每孔0. 1ml，每组8孔。5) TUMSCs饲养层细胞+成人骨髓单个核细胞培养实验组(实验T)用骨髓MSCs 培养基调整细胞终浓度为丝裂霉素处理后的TUMSCs，0. 25XlOVml细胞浓度；骨髓小单 核细胞，1 XlO6Ail细胞浓度；加入96孔板中，每孔0. 1ml，每组8孔。7、上述细胞于培养后第三天第一次全部换液，以后隔天换液一半，第三次 换液后 48 小时，每孔加入 5mg/ml 噻唑蓝(3-(4，5)-dimethylthiahiazo (_z-yl)-3， 5-di-phenytetrazoliumromide, MTT)PBS 液 20ulo继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加lOOOulDMSO，振荡 10分钟，使结晶物充分融解。MK3型酶标仪(Thermo公司，美国)测定570nm波长附近的吸光度，计算光密度值 (OD)。8、统计学处理采用t检验和分组方差分析，ρ <0.01显示有显著性差异。二、结果各组细胞光密度值测量结果见表3。表3.转⑶NF基因UMSCs对人MSCs生长的影响(0D值，X士 sd，η = 8) *，同对照组比较，ρ < 0. 05 ；#，同对照组比较，ρ < 0.01 ；+，同实验U组比较，ρ < 0. 01 ；三、结论用脐带MSCs做饲养细胞，可明显促进老年人骨髓MSCs的生长；而用转⑶NF基因 的脐带MSCs做饲养细胞，骨髓MSCs生长更明显。序列表(SEQUENCELISTING)<110>广州和竺生物科技有限公司<120>表达神经营养因子家族相关基因的间充质干细胞及其应用<130><160>6
<170>PatentIn version 3. 4
<210>1<211 >61<212>DNA<213>人工合成<400>1gtgctagcca tatgtacagg atgcaactcc tgtcttgcat tgcactaagt cttgcacttg 60t61<210>2<211>52<212>DNA<213>人工合成<400>2actaagtctt gcacttgtca caaacagttc tgagaagaag cgccggggat ca52<210>3<211>34<212>DNA<213>人工合成<400>3tcaagcttgg atcctcagat acatccacac cttt34<210>4<211>64<212>DNA<213>人工合成<400>4gtccatggcc cgggatgtac aggatgcaac tcctgtcttg cattgcacta agtcttgcac 60ttgt64<210>5<211>55<212>DNA<213>人工合成<400>5actaagtctt gcacttgtca caaacagtca ctctgaccct gcccgccgag gggag55<210>6<211>41<212>DNA<213>人工合成<400>6gcctctagaa agcttctatc ttcccctttt aatggtcaat g4权利要求
一种能表达神经营养因子家族相关基因的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞是按以下步骤制备的A)从骨髓、脐带或脐血中提取干细胞；B)采用腺相关病毒或者其它病毒载体或非病毒载体为载体，将神经营养因子家族相关基因重组到AAV载体上；C)制备表达神经营养因子家族相关基因的AAV；D)将上述AAV颗粒感染分离、纯化的间充质干细胞，得到表达神经营养因子家族相关基因的间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞，其特征在于所述间充质干细胞的提取分离 方法采用密度递度离心法、免疫吸附法、流式细胞分筛法和细胞贴壁生长法。
3.根据权利要求1所述的间充质干细胞，其特征在于所述步骤B中，所述的其它病毒 载体或非病毒载体包括腺病毒载体、疱疹病毒、慢病毒、逆转录病毒等现行常用病毒载体 或非病毒载体如转座子、原核或真核表达载体。
4.根据权利要求1所述的间充质干细胞，其特征在于所述步骤C中，所述的所述神经 营养因子家族相关基因包括胶质细胞源性神经营养因子即GDNF和脑细胞源性神经营养因 子即BDNF。
5.根据权利要求1所述的间充质干细胞，其特征在于所述步骤B中，包括以下步骤a)神经营养因子家族相关基因的克隆及其N未端的构建；b)含神经营养因子家族相关基因表达盒的AAV载体的构建。
6.根据权利要求4所述的间充质干细胞，其特征在于所述步骤a中，所述神经营养因 子家族相关基因包括胶质细胞源性神经营养因子即GDNF和/或脑细胞源性神经营养因子 即 BDNF。
7.根据权利要求4所述的间充质干细胞，其特征在于所述步骤b中，所述神经营养 因子家族相关基因包括胶质细胞源性神经营养因子即GDNF和脑细胞源性神经营养因子即 BDNF,所构建的AAV载体为pAAV-MCS载体。
8.如权利要求1所述的间充质干细胞用于促进骨髓干细胞或神经干细胞的培养扩增 的饲养层细胞的用途。
9.如权利要求1所述的间充质干细胞用于促进骨髓干细胞或神经干细胞的定向分化 的饲养层细胞的用途。
10.如权利要求1所述的间充质干细胞用于制备治疗神经系统疾病如脑血管疾病、运 动神经元病和脊髓损伤等的药物制剂的用途。
全文摘要
本发明涉及一种骨髓、脐带或脐血间充质干细胞及其在细胞移植、干细胞培养、扩增与定向分化领域的用途。本发明所述的表达神经营养因子家族相关基因的间充质干细胞，该间充质干细胞是按以下步骤制备的从骨髓、脐带或脐血中提取间充质干细胞；采用腺相关病毒(AAV)为载体，将神经营养因子家族相关基因重组到AAV载体上；制备表达神经营养因子家族相关基因的AAV；将上述AAV颗粒感染分离、纯化的间充质干细胞，得到表达神经营养因子家族相关基因的间充质干细胞。本发明将其作为饲养层细胞为干细胞培养、扩增和定向分化提供人工可控的微环境，促进干细胞增殖和定向分化，以达到为人类疾病提供一种新的治疗手段。
文档编号A61K35/28GK101857854SQ20091003858
公开日2010年10月13日 申请日期2009年4月13日 优先权日2009年4月13日
发明者李远友, 王尚武, 邹清雁, 陈文明 申请人:广州和竺生物科技有限公司