一种用于治疗乳腺癌的融合蛋白及其应用的制作方法

专利名称：一种用于治疗乳腺癌的融合蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合蛋白及其应用，特别涉及一种用于治疗乳腺癌的融合 蛋白及其应用。
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率已跃居女性恶性肿瘤第一 位，为女性的"第一杀手"。虽然，很多患者切除了原发肺瘤，并于手术后进行了 综合性的治疗，但是许多患者最终因转移而导致治疗的失败。不同的乳腺癌可 能有不同的基因表型，而这些基因表型往往表现为对治疗的反应有很大差异。
Her2就是乳腺癌的典型的恶性表型基因之一，在乳腺癌中的过度表达与癌 细胞的增殖、转移和化疗耐药呈正相关。约20-30 %的乳腺癌病人的癌组织细胞 表达这种表皮细胞生长因子受体一Her2基因。虽然Her2在乳腺癌的表达率不算 高，但是阳性的乳腺癌病例在临床上往往表现预后差、发展快。这主要由于Her2 作为表皮生长因子受体，具有促癌细胞生长，扩散和肿瘤血管增生等功能，因 此，Her2蛋白是乳腺癌恶化的分子标记。
目前通过阻断Her2受体来治疗乳腺癌的途径主要有以下几类 1.抗Her2单克隆抗体Herceptin单抗治疗能使Her2阳性的晚期乳腺癌病 例进入临床緩解期，并维持18个月之久。但是由于乳腺癌细胞Her2受体是在 基因水平过量表达，而Herceptin只是通过阻断受体蛋白起作用，新的Her2蛋 白仍在源源不断地合成并输送到细胞膜，补充丧失的受体。而且鉴于心脏毒性 和过敏反应，单抗的用量不可能无限制地加大。另一方面，Herceptin只作用于 Her2跨膜蛋白的细胞外部分，其胞内部分的酪氨酸激酶仍可被邻近未被阻断的 表皮生长因子受体激活来传导增殖信号。2. 酪氨酸激酶抑制剂酪氨酸激酶抑制剂往往只针对级联网络系统的某一 环节，而Her2信号还可以通过旁路途径传导。此外，酪氨酸激酶抑制剂不能直 接抑制过量表达的Her2基因，更不能彻底地阻断Her2蛋白的合成。更重要的 是，酪氨酸激酶也是正常细胞所必需，使用其抑制剂干扰了很多正常组织细胞 的信号传导途径，引起多种毒副作用。因此，要进一步扩展抗Her2治疗乳腺癌 的临床成果，有必要发展毒性低，又能彻底抑制整个Her2跨膜蛋白表达的有效 方法。
3. 传统的反义基因方法包括特异性的反义寡核苷酸和核糖酶(ribozyme) 均曾用于抑制乳腺癌细胞Her2基因表达的实验研究。但是由于这些传统的反义 基因方法抑制基因表达的效果较弱，因此不能满足临床应用的需求。
由此可见，上述方法不能阻止新的HER-2蛋白的生成，而且还有严重的毒 副反应，临床应用受到很大限制。因此，开发新的高效低毒的靶向HER-2治疗 方法已成为当务之急。
PLK1基因也是一个典型的肿瘤恶性表型基因，在Her2阳性肿瘤中也呈较 高表达，在正常组织细胞中表达甚少，其与癌细胞的增殖、转移和化疗耐药呈 正相关。PLKl基因与Her2虽然没有比较直接的联系，但都同属恶性表型基因， 在Her2阳性乳腺肿瘤中呈高表达。目前针对PLK1基因的主要方法是通过siRNA 下调该基因的表达，从而产生抑制增殖和逆转化疗耐药的效应。
与传统的抑制基因表达工具反义寡核芬酸和核糖酶比较，siRNA沉,f植因 表达的效应要强大数十倍至数百倍，其抑制致病基因治疗疾病的潜力也远远大 于传统的逆基因工具。SiRNA在疾病中的应用范围很广，其主要适应症是恶性 肺瘤和病毒感染性疾病。与其它抑制基因表达的方法比较，siRNA技术应用于 治疗恶性肿瘤的优点在于特异性高、普遍性、高效性、稳定性好、渗透性好、 安全性、简便性，且siRNA的合成相对简单，价钱低廉，适合于大量使用。
目前用来携带基因物质导入细胞的载体分为非病毒和病毒类，病毒载体由 于其免疫源性引起剧烈的免疫反应和随机插入基因组导致细胞癌变，都会导致 严重的后果。近几年在美国FDA应用病毒载体携带基因物质的临床试验中曾发生过严重事件，故暂时未能推广应用暂不适合于临床应用。非病毒栽体主要包 括多肽物质和脂质体，前者主要包括鱼精蛋白多肽等，后者如脂质体樣史球囊等
(liposomes),常用的基因转染媒介，也主要是由各种脂质体组成。但是，这些 物质都不能选择性地把基因物质靶向导入乳腺癌细胞内。
Her2配基虽然能与其受体结合，但是结合后它激活受体，传导增殖信号， 刺激癌细胞分裂转移，故不是理想的靶向载体。抗Her2的单克隆抗体则不会激 活受体，但它属于大分子蛋白，很难与抗癌药物或基因物质复合，而且具有很 强的免疫原性，引起针对抗体本身的免疫反应，影响治疗效果，故也不宜用作 生物导弹。
单链片段抗体是指通过基因重组技术，人工表达保留了与抗原特异性结合 的免疫球蛋白Fab片段中的筒要部分，由一段重链和一段轻链组成，两链之间 通过短多肽铰链连接。ScFv既保留了抗原识别和结合的特性，又去除了普通抗 体中免疫原性最强的Fc段，同时其分子小，可以与其他脂质体或多肽重组成融 合蛋白，便于携带基因物质。
开发siRNA为小分子药物的主要障碍在于如何把小分子药物通过细胞膜传 递到胞浆发挥降解靶基因mRNA的作用。许许多多的生物障碍的存在限制了 siRNA分子往细胞质的运输，从而限制了 siRNA的治疗效果。譬如，由于siRNA 分子较小，很快便经由尿道排泄出体外；酶的作用导致siRNA分子降解或在血 清中不稳定等都影响了 siRNA的效果。现在应用比^/"泛的转染试剂和高压注 射等方法虽然可以导入siRNA并发挥效应，但存在损伤细胞膜和影响细胞内环 境的副作用。目前，对siRNA进行化学修饰提高其体内稳定性和应用合成(纳 米颗粒聚合体和脂质体)和非合成(病毒/DNA)载体来进行运输等方法在一定 程度上改善了 siRNA的效果。但是，限制siRNA运输的诸多难题并没有得到比 较彻底的解决。siRNA能发挥良好效应的最关键的是在把siRNA运到靶组织之 前要保护好分子并保证其活性，让siRNA分子直接结合到靶组织和有效的 siRNA分子释放到耙组织细胞的细胞质。

发明内容
为克服上述技术缺陷，本发明的主要目的在于提供一种用于治疗乳腺癌的
融合蛋白，所述融合蛋白为Her2单链片段抗体-多肽的融合蛋白，所述Her2 单链片段抗体能靶向乳腺癌细胞表面的Her2受体，所述多肽能携带siRNA。 所述的多肽包括鱼精蛋白多肽。
所述的用于治疗乳腺癌的融合蛋白为Her2单链片段抗体-鱼精蛋白多肽的 融合蛋白，其编码核苷酸序列如SEQIDNO.l所示，具体如下
3tggCCC3ggtgcagctggtgcagtctggga紛agcccggggagtctctg60
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所述siRNA包括PLKl-siRNA，所述PLKl-siRNA能抑制肺瘤恶性表型基 因的表达。
本发明还提供了用于治疗乳腺癌的融合蛋白在治疗乳腺癌中的应用。 本发明的用于治疗乳腺癌的融合蛋白能携带PLK1 -siRNA，并特异的靶向导 入Her2阳性乳腺癌细胞，Her2受体与配基或抗体结合后，可通过细胞内吞作用 循环到细胞内。Her2受体/抗体复合物被吞入细胞后，复合体会被分离，如果 复合体同时结合了化疗药物或基因物质，这些物质将会被吸收并释放到胞浆中。 因此，Her2抗体或配基携带的抗癌药物只攻击Her2高表达的癌细胞，并能顺利 把药物带入细胞内。治疗乳腺癌可产生强大的抑制乳^^癌生长和转移的效应， 有望突破以往反义寡核香酸和核糖酶不尽人意的基因抑制效果，成为抗Her2治疗乳腺癌的新型基因药物。
在本发明的实施例里所述的体外细胞培养实验中，应用抗Her2-ScFv (F5 ) 与经删节的(加ncated)鱼精蛋白片段融合蛋白携带报告基因，能大大提高报告 基因在Her2阳性的乳腺癌细胞中的表达。与同源的Her2阴性细胞比较，报告 基因表达能提高8到10倍。构建抗F5与多肽的融合蛋白，包括Her2单链片段 抗体-鱼精蛋白多肽的融合蛋白，其中，鱼精蛋白多肽带正电荷，能与带负电
荷的DNA质粒载体结合，并可浓缩这些DNA和siRNA分子，经与癌细胞Her2 受体介导进入细胞内。siRNA与DNA都是携带大量负电荷的分子，也能被荷正 电的多肽浓缩。在本发明的实施例中，仅列举Her2单链片段抗体-鱼精蛋白多 肽的融合蛋白的用于治疗乳腺癌的实验，Her2单链片段抗体-鱼精蛋白多肽的 融合蛋白只是一个优选实施例而已，当然不能将本发明的融合蛋白局限于此。


图1是pAcGP67B-Her2-ScFv-protamine质粒的简图； 图2是Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽(F5-P)融合蛋白的Western blot 鉴定结果图3是F5-P融合蛋白靶向输送PLK1 -siRNA治疗对乳腺癌肿瘤生长的影响； 图4是F5-P融合蛋白靶向输送PLKl-siRNA治疗乳腺癌后治疗终点切除肿 瘤称重的结果图5是F5-P融合蛋白靶向输送PLK1 -siRNA治疗对棵鼠肿瘤形成率的影响； 图6是将经过实验处理的各组BT 474肿瘤组织进行实时定量PCR检测把基
因PLK1 mRNA的表达水平实验结果图7是F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA治疗乳腺癌后肿瘤细胞的增殖指标变
化实验结杲图8是F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA治疗乳腺癌后肿瘤细胞的凋亡指标变 化实验结果图9是F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA治疗乳腺癌后肿瘤细胞的PLK1基因表达的变化实验结果图10是F5-P融合蛋白靶向输送PLKl-siRNA治疗对荷瘤鼠生存率的影响 实验结果图U是F5-P融合蛋白靶向输送PLK1-siRNA治疗对棵鼠肺重量的影响的实 验结果图12是F5-P融合蛋白靶向输送PLKl-siRNA治疗抑制乳腺癌转移情况的 实验结果图13是F5-P融合蛋白靶向输送PLKl-siRNA治疗棵鼠后肺HPRT表达的 影响的实验结果图14是F5-P融合蛋白靶向输送PLKl-siRNA治疗棵鼠后肝HPRT的表达 影响的实验结果图。
具体实施例方式
为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。 实施例1: Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白的制备 从基因文库中查到Her2单链片段抗体的全长序列后，用引物软件设计相关 引物。
设计的Her2-ScFv引物 正引物Ncol为内切酶
5 ，-GGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGGGGCAGAG-3' 反引物Notl为内切酶
5 ，-TTGCGGCCGCTCCGGAATTCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC-3' 设计的鱼精多肽引物 正引物Notl为内切酶
5 ，-CCGGAGCGGCCGCAATGGCCAGGTAC AGATGCTG誦3' 反引物PpuMI作为内切酶，终止密码子和6个组氨酸 5，-GCCGGGTCCCAGGAAAGGATCAGATCTGCATTAATGGTGGTGGTGATGATGAGATCTGTGTCTTCTACATCTCGGTCTG-3'
通过PCR克隆相关目的片段，Her2-ScFv的PCR反应体系1: 50ul体系 ddH20 37ul dNTP 5 ul 正引物 lul 反引物 lul 10xPCR緩冲液 5ul Easy pfii 1 ul 鱼精多肽的PCR反应体系2: 50ul体系 ddH20 37ul dNTP 5 ul 正引物 lul 反引物 lul 10xPCR緩冲液 5ul Easy pfU1 ul PCR反应循环
预变性94°C 5min 变性94 °C 30S， 退火48.5°C 30S L 30个循环
延伸72 。C lmin 最后延伸72°C lOmin PCR产物酶切Her2 ScFv的PCR产物用Nco I和Not I内切酶切开
50ul体系
Her2 ScFv的PCR产物 20 ul
ddH20 21 ul Nco I2 ul Not I2 ul 10xPCR緩冲液5ul
9Her2 ScFv的PCR产物酶体系在37 °C水浴4小时。 鱼精多肽的PCR产物用Notl和PpuMI内切酶切开
50ul体系
鱼精多肽的PCR产物 20 ul ddH20 21 ul PpuM I 2 ul Not I 2 ul 10xBuffer 5 ul 鱼精多肽的PCR产物酶体系在37。C水浴4小时。 pAcGP67B用Ncol和PpuMI内切酶切开
50ul体系 pAcGP67B 20 ul ddH20 21 ul PpuM I2 ul Not I2 ul 10x緩冲液 5 ul
pAcGP67B的酶切体系在37"C水浴4小时。
将上述三个PCR产物进行切胶回收目的片段，将酶切鉴定片段大小正确的 PCR产物全部上样1%琼脂糖凝胶电泳;将目的DNA片段用干净的手术刀切下， 放入1.5ml离心管，放入回收胶前离心管称重；称重后，在1.5ml离心管中加入 以每毫克胶加入1微升体积的膜结合溶液；60。C水浴中放置10min(至胶完全溶 解)，每2-3分钟混匀一次(溶胶液应与膜结合溶液颜色相同)；将柱子放样品转 移入柱子中(柱子的最大容量为800uL),室温放置lmin，然后16000gxlmin离 心；取下柱子，弃流出液，将柱子放回原收集管中；加入700ul冲洗緩沖液至 收集管，室温放置lmin,然后16000gxlmin离心；加入500ul膜洗涤液至收集 管，然后16000gxlmin离心；取下收集管，弃流出液，再次16000gxlmin离心； 将收集管放置在一支新的1.5mL离心管中，加入50uL无核酸水(或无菌H20)至膜中央，静置片刻，然后16000gxlmin离心，收集回收质粒DNA。 将切胶回收的目的片段进行连接 Her2 ScFv5 ul Protamine5 ul pAcGP67B 5 ul DNA连接混合物 15 ul PCR仪上连接 16°Cxl小时 连接产物转化感受态细胞，CaCl2制备感受态细胞DH5a。 在15ml试管中加入3ml LB培养基，从平板上挑取一单克隆接种，37°C, 250rpm，培养过夜，约16小时。取2ml过夜菌接入200ml新鲜的LB培养基， 37°C， 260rpm，培养，直至OD600=0.4-0.5,然后将菌液水浴30-60分钟。4'C， 5000rpmx5min离心收集细菌，弃上清。用10ml 0.1M的CaCl2轻轻吹打，充分 悬浮，冰浴10min。 4°C， 5000rpmx5min离心，弃上清。加入2ml 0.1M的CaCl2 轻轻吹打，充分悬浮，冰浴30min即感受态制备完成。
转化感受态细胞准备1.5ml的离心管2支，水浴预冷；分别取100 ul DH5a 感受态细胞，各加入10 ul连接产物，混合均匀；将上述混合物放置水上30 min; 将混合物转移至42。C水浴中温育90 sec;将混合物转移至冰上放置2 min后， 加入800 ul的LB培养液，在摇床上37°C ， 150rpm培养60min; 4000rpmx5min 离心；弃800 ul的上清液，剩余100 ul混匀后涂LA板；先取20ul IPTG和70ul Xgal混合后涂布在LA板上进行蓝白斑筛选，然后把上步骤剩余的100 ul菌液 混匀后涂LA板；LA板置37。C培养箱过夜培养；在过夜培养的LA板上^i沐 10个长得比较饱满的白色克隆，分别加入6mlLA培养基中，在摇床上37。C， 250卬m培养16h。
酶切養定，收集菌液离心，得到pAcGP67B-Her2-ScFv-protamine质粒。 pAcGP67B-Her2-ScFv-protamine质粒与杆状病毒共转染sf9昆虫细胞(使用 BD BaculoGold转染试剂盒)，接种2xl06 Sf9于60mm组织培养皿中，初始细 胞密度应在50-70%铺满。使细胞牢固贴壁(大约15min)。除去培养基，加入
iilml转染緩冲液A。确认培养亚的所有区域被转染緩冲液A覆盖，以防止细胞 干燥死亡。于一无菌15ml离心管中混合0.5吗Baculo Gold TM线性DNA和2pg 重组转移载体质粒(含有目的基因)。混合物静置5min后加入lml转染緩冲液B， 混合均匀。
将lml转染緩冲液B/DNA溶液逐滴加入组织培养亚，每加入2到3滴便温 和地晃动培^JEi以使其与转染緩冲液A混匀。在此过程期间，应该可以见到形 成的沉淀使得溶液呈现轻微乳状。27度培养4小时。4小时以后，除去转染溶 液，并力口入3ml Grace昆虫细J包i咅养基(Grace's Insect Cell Culture Medium )。 5显 和晃动培养亚，然后除去培养基。加入3ml新鲜Grace昆虫细胞>培养基(Grace's Insect Cell Culture Medium )， 27。C培养4-5天。4-5天后，收集上清，用其感 染更多细胞以扩增病毒，扩增病毒后行蛋白表达。Her2单链片段抗体与鱼精蛋 白多肽的融合蛋白在sf9昆虫细胞中的表达。注意生产目的蛋白时，病毒MOI 应该在3 - 10。
接种9xl06 Sf9于T75培养瓶中，加入至含有10ml Sf9培养基(含有10%胎 牛血清)。T75培养lf瓦置培养箱中27。C培养1小时 1小时吸去旧培养基换用新 鲜培养基，并加入高滴度的病毒液，使MOI介于5-IO之间。T75培养瓶置培 养箱中27。C培养72小时。72小时后把细胞和上清吸到一个离心管中，4。C， 1000g 离心10分钟收集细胞。用预冷的PBS加入细胞中重悬洗涤，4°C, lOOOg离心 10分钟收集细胞。裂解所有细胞沉淀于lml裂解緩冲液10mM Tris-HCl，pH7.5，200mM Nacl,l%Triton X-100，10mM NaF/10mM焦石粦酸钠(Sodium Pyrophosphate) /10mM焦碌酸钠(Sodium phosphate) ， Ixphotease inhibitor cocktail.(蛋白酶抑制剂)。10000g， lOmin, 4'C离心裂解液，收集上清。
纯化Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白
先用3-5倍柱体积的洗脱緩冲液洗Ni - NTA琼脂胶柱(Pierce)。待洗脱緩冲 液流尽后，加入蛋白上清液过柱，让其緩慢流出。待上清液流尽，加入含有3-5 倍柱体积的20mM咪唑洗涤Ni - NTA柱。加入含有不同浓度的咪唑緩冲液3倍 柱体积进行洗脱，浓度分别为lOOmM， 250mM， 500mM和1000 mM,并分别收集洗脱液进行分析。
Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白的鉴定
我们成功构建了 Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽融合蛋白的杆状病毒表 达载体(pAcGP67B-Her2-ScFv-Protamine )，质粒图语可见图1,在sf9昆虫细胞 杆状病毒表达系统表达。我们把这一载体与杆状病毒包膜质粒DNA (BacuoGold Bright DNA， BDPharmingen公司) 一起共转染Sf9细胞，装配病毒载体颗粒， 感染Sf9细胞，细胞裂解液过His-Tag蛋白分离柱进行纯化，表达出来的带有6 个组氨g巴(His-Tag)的Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽融合蛋白，用抗 人IgG单抗作为一抗的Western Blot鉴定分离的融合蛋白，如图2所示，Her2 单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白经过Westoern blot进行鉴定图。对照 为感染病毒的细胞裂解蛋白，而MOI-l, 3, 5, 10和15则分别是不同病毒与 细胞数量比时的结果，可以见到大小为36KD的目标条带，而且MOI = 5和10 时表达量较高。
结果表明用pAcGP67B-Her2-ScFv-Protamine质粒和杆状病毒可以成功的表 达出Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽这种融合蛋白。而且，在MOI-5和10， 即病毒与细胞数量比为5和10时的表达效果更好，表达出来的融合蛋白大小为 36KD。
实施例2: F5-P融合蛋白靶向输送PLKl-siRNA治疗对乳腺癌原位肿瘤生 长的抑制作用
细胞扩增培养接种棵鼠制作乳腺癌肿瘤原位和转移;漠型的具体步骤如下 (其中转移模型使用的BT 474-EGFP细胞是经过本实验室转染表达绿色荧光的 EGFP并经流式筛选的细胞抹)
1人乳腺癌细胞BT474用舍10%小牛血清的DMEM/F12培养基，于37°C、饱和
湿度下5%C02的培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长； 2当细胞长满瓶底95%后用0.25%胰酶消化lmin,倒置显微镜下见细胞间隙增
大、胞质回縮时消化终止，吸尽弃去胰酶液；3加入少量血清培养液轻轻吹打冲洗掉消化液，弃去上清液；
4加入含10% FBS的培养液，轻轻吹打混匀使其脱壁^i,制成细胞悬液，然
后分瓶再培养；待细胞长满瓶底约95%后继续进行传代扩增； 5当细胞扩增至达到接种棵鼠的细胞数量时，进行消化细胞接种棵鼠； 6细胞消化后进行计数，把细胞悬液用PBS重悬至浓度为
BT 474为5 x 107个细胞/ml 7细胞接种棵鼠将细胞悬液置水上，分别取O.l ml细胞悬液切开接种到接种
到棵鼠右侧第二对乳房的脂肪垫里制作乳腺癌原位模型；接着将细胞悬液稀
释一倍至细胞浓度为2.5xl(f个细胞/ml，吸取0.2 ml细胞悬液从尾静脉打到
棵鼠体内； 8每天观察棵鼠至成瘤。
在原位接种肿瘤细胞进入棵鼠体内的第二天，我们按照实验计划以1: 6的 摩尔比混合F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA、与治疗组等量的用F5-P融合蛋白、 与治疗组等量的PLKl-siRNA、与治疗组等量的F5-P融合蛋白和阴性对照siRNA 然后置水上孵育30分钟，随即通过尾静脉注射到棵鼠体内，每周两次。然后每 天观察棵鼠生长情况和肿瘤生长情况，直至接种肿瘤细胞2-3周后可见各组肿瘤 陆续成瘤，以每周两次的频率测量肿瘤大小并制作生长曲线。F5-P融合蛋白和 PLKl-siRNA治疗组的生长曲线基本没有上升，趋势平緩。而其他三组肿瘤生长 曲线上升较快，生长曲线各观察点比较均有明显差异(*，P<0.01)。(图3)。图 4是F5-P融合蛋白靶向输送PLKl-siRNA治疗乳腺癌后进行大体样本的拍照。 照片显示F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA治疗组肿瘤成瘤率低，肿瘤小，而其他 各组肿瘤较大，而且100%成瘤。
至原位接种肿瘤细胞47天后用药物处死棵鼠，并取胂瘤和肝肺进行后续处 理。F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA治疗组肿瘤的大小明显低于其他各組(* ， PO.Ol)。把肿瘤组织称重后切成两份，其中一份液氮保存后送公司做实时定量 PCR，另一份固定后组织切片做HE染色。图5是F5-P融合蛋白靶向输送 PLKl-siRNA治疗乳腺癌后治疗终点切除胂瘤称重的结果图，可见本组肿瘤重量
14明显低于其他各组(* , PO.01 )。
实施例3: F5-P融合蛋白靶向输送PLKl-siRNA治疗对乳腺癌原位肿瘤靶 基因表达、增殖和凋亡的影响
F5-P融合蛋白靶向输送PLKl-siRNA治疗乳腺癌肿瘤原位和转移模型，具 体步骤如下
1从注射乳腺癌细胞第二天开始治疗荷瘤鼠； 2将乳腺癌模型鼠随机分组，每组8只裸鼠；
乳腺癌原位冲莫型鼠4组F5-P融合蛋白加PLK1 -siRNA组
单用F5-P融合蛋白组 单用PLKl-siRNA组 F5-P融合蛋白加NC-siRNA组 乳腺癌转移冲莫型鼠4组F5-P融合蛋白加PLKl-siRNA组
单用F5-P融合蛋白组 单用PLKl-siRNA组 F5-P融合蛋白加NC-siRNA组 3以2 mg/kg的量注射siRNA,同时以1: 6的摩尔比加入F5-P融合蛋白，冰上
孵育30分钟后通过尾静脉注射到棵鼠体内； 4每周注射两次；
5于处理乳腺癌原位4莫型鼠前6小时通过腹腔注射200 ul BRDU工作液；
6于接种肿瘤后47天处理乳腺癌原位模型鼠；于接种肿瘤后60天处理乳腺癌转
移模型鼠(有部分已于此时间点前死亡)； 7切除原位肿瘤和肝肺等组织，部分置于液氮中保存送吉玛7>司<故实时定量
PCR,部分置于4%多聚甲醛中固定后送医院做病理切片。
我们将经过实验处理的各组BT474肿瘤组织进行实时定量PCR检测耙基因 PLK1 mRNA的表达水平，同时选用18srRNA做内对照。实验结杲显示F5-P融 合蛋白和PLKl-siRNA治疗组PLK1基因的表达水平明显下降，其他三组PLK1
15基因的表达水平是其3倍以上(# ， PO.001)(图6 )。这充分证实了 F5-P融合蛋 白靶向输送PLKl-siRNA治疗乳腺癌可以明显下调PLK1基因mRNA的表达水 平，这可能是是其抑制肿瘤增殖的根本原因，说明了把PLK1基因作为耙基因的 强大治疗潜能。
我们将经过实验处理的BT 474肿瘤组织切片后进行免疫组织化学^r测本研 究革巴基因PLK1的表达水平，以及肺瘤组织的增殖率和凋亡率。实验结果显示 F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA治疗组PLK1基因的表达水平明显下降，为2.37%， 而其他三组24.06%、 24.97%和22.68% ( # ， PO.001 )。我们检测反映肿瘤组织增 殖指数的指标BRDU和凋亡指数TUNEL的表达，可见F5-P融合蛋白和 PLKl-siRNA治疗组BRDU的阳性率只有14.50%，而其他三组分别为45.59%、 46.39%和44,90% (# ， PO.001 )。同时检测凋亡率F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA 治疗组高达14.0%,而其他三组分别为3.2%、 2.8%和3.7% (# , PO.001)(图7 _9)。
实施例4: F5-P融合蛋白靶向输送PLKl-siRNA治疗对乳腺癌转移癌的抑 制作用
在接种肺瘤细胞进入棵鼠体内的第二天，我们按照实验计划以1: 6的摩尔 比混合F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA、与治疗组等量的用F5-P融合蛋白、与治 疗组等量的PLKl-siRNA和与治疗组等量的F5-P融合蛋白和Negative-control siRNA然后置水上孵育30分钟，随即通过尾静脉注射到棵鼠体内，每周两次。 然后每天观察和记录棵鼠生长情况和体重的变化。在观察期间陆续有^果鼠死亡， 均行解剖取肝和肺称重，并把组织分成两份，其中一份液氮保存，另一份固定 后组织切片做HE染色。
在观察终点前将各组存活棵鼠进行小动物成像系统检测，可见F5-P融合蛋 白和PLKl-siRNA处理组棵鼠荧光较为集中，而且较少，提示转移较少，而其 他三组棵鼠的荧光较为集中，而且较多，提示转移为广泛。观察至接种肿瘤细 胞60天时用药物处死存活棵鼠，并取肝肺称重比较后把组织分成两份，其中一份液氮保存后送公司做实时定量PCR，另 一份固定后组织切片做HE染色。 实时定量PCR法测定乳腺癌原位肿瘤和和肝肺情况，其具体步骤如下: 1将肿瘤和肝肺提取总RNA和反转录。 2PCR反应
Homo 18s rRNA基因Real-time PCR反应#^
组分 终浓度 容积
2x Real-time PCR反应液 1x 10^1
Homo 18s rRNA F引物(20uM) 0.08&M 0.08^1
Homo 18s rRNA R引物(20uM) 0.08岸 0.08pl
cDNA模板 一 2^1
rTaq DNA聚合酶(5U 1) 0.05 U/pl 0.2^1
dd H20 To 20^1
Homo HPRT基因Real-time PCR Reaction System反应#^
组分 终浓度 容积
2x Real-time PCR反应液1x 10|il
Homo HPRT F引物(20uM) 0.08pM 0.08^1
Homo HPRT R引物(20uM) 0.08|xM 0.08^1
cDNA模板 一 2^il
rTaq DNA聚合酶(5U/pl) 0.05 ， 0.2|xl
dd H20 To 20^1
反应条件 95°C， 3 min变性； 40个循环95°C， 15 s; 620C, 40 s; 结束反应。
3实验结果分析
反应结束后确认Real time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制 作标准曲线。
观察终点时F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA治疗组存活率高，为100%,而其 他三组分别为50%、 60%和70% (见图10)。湿肺称重显示F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA治疗组肺重量明显低于其他三组(P<0.05),表明肺转移较少(见 图11 )。肝肺切片HE染色可见F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA治疗组肺内基本 没有转移，而其他三组棵鼠肝肺内均有较多的转移灶(图12)。
由于人类次黄噪呤鸟噪呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因只存在于人类，故 而常常被作为一个检测人类肺瘤棵鼠体内转移的指标。本实验也收集棵鼠肝肺 组织检查，检测HPRT在棵鼠的表达肝肺中的表达，以此监测肿瘤的转移。实 验结果显示F5-P融合蛋白和PLKl-siRNA治疗组的肺组织中有3只棵鼠检测不 到转移，肝组织有4只4企测不到转移，而且有转移的棵鼠的肺肝转移的HPRT 明显低于其他三组(#,P<0.001)(图13-14)。
实施例5:免疫组织化学染色方法
具体步骤如下
l切片制备；
将肿瘤和肝肺蜡块进行5um连续切片，其余分别进4亍PLKl 、 BRDU和TUNEL 染色的免疫组化检测。
2石蜡切片经常规脱蜡和水化后，用PBS冲洗三次，每次3分钟。 3柠檬酸緩冲液微波抗原修复。
4每张切片滴加1滴过氧化物酶阻断溶液，室温下孵育IO分钟。 5 PBS液冲洗三次，每次3分钟。
6甩去多余PBS液,滴加非免疫动物血清，室温下孵育IO分钟。
7甩去血清，滴加第一抗体(兔IgG)，置于湿盒内，室温下孵育60分钟。
8 PBS液冲洗三次，每次5分钟。
9甩去多余PBS液，滴加生物素标记的抗体，室温下孵育10分钟。 10 PBS液冲洗三次，每次3分钟。
11甩去多余PBS液，滴加链亲和素-过氧化物酶溶液，室温下孵育IO分钟。 12 PBS液沖洗三次，每次3分钟。
13甩去多余PBS液，滴加DAB于显微镜下显色5~10分钟后自来水漂洗。
1814苏木素轻度复染3 10秒,切片脱水千燥，中性树胶封片，光学显微镜下观察。 15设立对照。
每批染色均设立对照(1)阳性对照以已知阳性切片为阳性对照(由试 剂公司提供)。(2)空白对照PBS液代替一抗。(3)替代对照以与第一代抗 体同种属的非免疫动物血清代替第一抗体。(4)组织学对照其中一张进行HE 染色，以确保实验观察的病变部位的准确性和可靠性。 16结果判断标准
PLK1信号均主要位于细胞浆呈棕黄色颗粒状为阳性细胞。在每张切片中随 机选取5个高倍视野(400)，每个高倍视野计数细胞，根据表达PLK1的阳性细 胞占全部细胞的百分比；所有阳性对照片结果均为阳性；空白对照片结果均为 阴性。
BRDU和TUNEL信号主要位于细胞核呈棕黄色颗粒状为阳性细胞。在每张 切片中随机选取5个高倍视野(400),每个高倍视野计数细胞，每组计数总细 胞数不少于1000个。根据表达BRDU和TUNEL1的阳性细胞占全部细胞的百 分比，所有阳性对照片结果均为阳性；空白对照片结果均为阴性。
最后统计分析，均数间的比较用t检验，卡方4企验比较率的差异。所有统计 为双侧检验，PO.05为差异有显著意义。绘制生存曲线，并用Log-rank test进 行差异检验。SPSS 16.0软件进行统计分析。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的实质和范围。序列表
<120〉一种抑制癌细胞的增殖和诱导其凋亡的方法及其应用
<160>5
<210〉 1
<211〉960
<212>DNA
<213〉人工序列
<221> misc一feature
<222〉(1)".&60)
<400> 1
atggcccagg tgcagctggt gcagtctggg gc卿ggtga aaaagcccgg ggagtctctg 60 肌gatctcct gt犯gggttc tggatacagc tttaccagct actggatcgc ctgggtgcgc 120 cagatgcccg ggaaaggcct ggagtacatg gggctcatct atcctggtga ctctgacacc 180 aaatacagcc cgtccttcca aggccaggtc accatctcag tcgacaagtc cgtcagcact 240 gcctacttgc aatggagcag tctgaagccc tcggacagcg ccgtgtattt ttgtgcgaga 300 catgacgtgg gatattgcag tagttccaac tgcgcaaagt ggcctgaata cttccagcat 360 tggggccagg gcaccctggt cgtctcc tc鄉tggag gcggttc鄉cggaggtggc 420 tctggcggtg gcggatcgca gtctgtgttg acgcagccgc cctcagtgtc tgcggcccca 480 ggacagaagg tcaccatctc ctgctctgga agcagctcca acattgggaa taattatgta 540 tcctggtacc agcagctccc aggaacagcc cccaaactcc tcatctatga tcacaccaat 600 cggcccgcag gggtccctga ccga/ttctct ggctcc犯gt ctggcacctc agcctccctg 660 gccatcagtg ggttccggtc cgaggatgag gctgattatt actgtgcctc ctgggactetc 720 accctctcgg gctgggtgtt cggcggagga accaagctga ccgtcctagg tgcggccgca 780 atggccaggt ac8gatgctg tcgcagccag agccggagca gatattaccg ccagagac犯840 ag卿tcgca gacga鄉ag gcggagctgc cagacacgga ggagagccat gaggtgttgt 900 cgccccaggt acagaccgag atgtagaaga cacagatctc atcatcacca ccaccattaa 960
<210> 1 <211>41 <212>DNA <213>人工序列 <222>(1)...(41) <400> 2
gggCC3tggC CC3ggtgC3g CtgttgC3gt CtggggC卿g
41
<210> 1 <211>44 <212>DNA <213>人工序列 <222〉 (1)...(44) <400> 3
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acctaggacg gtcagcttgg tccc
44
<210> 1
<211>34
<212>DNA<213>人工序列 <222〉 (1)…(34) <400> 4
ccggagcggc cgcaatggcc aggtac卿t gctg 34
<210> 1 <211>79 <212>DNA <213>人工序列 <222> (1)…(79) <400> 5
gccgggtccc aggaaaggat cagatctgca ttaatggtgg tggtgatgat gagatctgtg tcttctacat ctcggtctg 79
权利要求
1、一种用于治疗乳腺癌的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为Her2单链片段抗体-多肽的融合蛋白，所述Her2单链片段抗体能靶向乳腺癌细胞表面的Her2受体，所述多肽能携带siRNA。
2、 根据权利要求1所述的用于治疗乳腺癌的融合蛋白，其特征在于，所述 的多肽包括鱼精蛋白多肽。
3、 根据权利要求1所述的用于治疗乳腺癌的融合蛋白，其特征在于，所述 的用于治疗乳腺癌的融合蛋白为Her2单链片段抗体-鱼精蛋白多肽的融合蛋 白，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
4、 根据权利要求1-3之一所述的用于治疗乳腺癌的融合蛋白，其特征在 于，所述siRNA包括PLKl-siRNA,所述PLKl-siRNA能抑制肿瘤恶性表型基 因的表达。
5、 权利要求1-3之一所述的用于治疗乳腺癌的融合蛋白在治疗乳腺癌中 的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于治疗乳腺癌的融合蛋白，该融合蛋白为Her2单链片段抗体-多肽的融合蛋白，Her2单链片段抗体能靶向乳腺癌细胞表面的Her2受体，多肽能携带siRNA。该多肽包括鱼精蛋白多肽。siRNA包括PLK1-siRNA，PLK1-siRNA能抑制肿瘤恶性表型基因的表达。本发明的用于治疗乳腺癌的融合蛋白能携带PLK1-siRNA，并特异的靶向导入Her2阳性乳腺癌细胞，顺利把药物带入细胞内。治疗乳腺癌可产生强大的抑制乳腺癌生长和转移的效应，有望突破以往反义寡核苷酸和核糖酶不尽人意的基因抑制效果，成为抗Her2治疗乳腺癌的新型基因药物。
文档编号A61P35/00GK101585882SQ20091004053
公开日2009年11月25日 申请日期2009年6月25日 优先权日2009年6月25日
发明者姚燕丹, 孙天盟, 宋尔卫, 张佩琢, 均 王 申请人:中山大学;中国科学技术大学;苏州吉玛基因药物科技有限公司