专利名称：高纯度藜芦胺和介芬胺的制备方法
技术领域：
本发明涉及药物化学。具体涉及一种以中药材藜芦为原料制备高纯度藜芦胺 (Veratramine)和介芬胺(Jervine)的方法。
背景技术：
藜卢属(VeratrumLinn.)为百合科(Liliaceae)植物，世界上约有40种，据《中 国植物志》记载中国有13个种和一个变种。中医用藜芦的根和根茎入药，用于 中风痰壅，癫痫、喉痹不通及疥癣和恶疮。藜芦属植物化学成分包括甾体生物碱 类化合物、芪类化合物、二肽类、黄酮类及其它类化合物。其中生物碱是其主要 活性成分。现代研究表明，藜芦具有降血压、抗肿瘤等作用，其中藜芦甾体生物 碱，尤其是藜芦胺和介芬胺为主要生理活性成分。目前，在藜芦甾体生物碱的制 备方面，国内外尚未见高纯度藜声胺和介芬胺的工业制备研究报道。而实验室研 究报道，藜芦甾体生物碱的制备方法主要有醇提取后，酸水溶解、碱沉淀法，采 用这种方法，藜芦甾体生物碱损失极大，收率低，生产成本高；另一种方法是采 用醇类有机溶剂提取，浓縮后，以不同极性的有机溶剂，如氯仿、二氯甲垸、乙 酸乙酯等萃取富集，但采用此方法，有机溶剂残留高、毒性大、操作步骤复杂， 杂质含量高、不适宜工业生产操作等缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计操作简单、适 宜工业生产藜芦胺和介芬胺的制备方法。
本发明提供了一种高纯度藜芦胺(Veratramine)和介芬胺(Jervine)的制备 方法。该方法包括下列步骤
(1)藜卢药材原料的提取
藜卢药材粉碎后，在常压提取装置中用60~90%乙醇回流提取三次,每次1~3小时，合并提取液过滤浓縮得浓縮液；
(2) 大孔吸附树脂富集
浓縮液加2~5倍体积的水稀释后,加入到大孔吸附树脂柱上，依次以30倍体 积的去离子蒸馏水洗脱大极性杂质，再以20倍体积的0.05~0.5%的碱性水溶液 进行洗脱，继以20倍体积的10~60%的乙醇溶液洗脱进行脱色，再以70~90%的 酒精洗脱得到藜芦总留体生物碱的洗脱液；
(3) 色谱柱纯化
洗脱液减压浓縮到无醇味，进行色谱柱层析，流动相洗脱，薄层层析检测， 分别收集藜芦胺和介芬胺部位，收集液分别减压浓縮至干，重结晶，过滤，干燥， 得到高纯度藜芦胺和介芬胺。
本发明方法所述大孔吸附树脂柱为AB-8、 DlOl、 ZTC-1或Diaion HP20大 孔树脂柱。
所述碱性水溶液为氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化钙水溶液。 色谱柱填料为硅胶、氧化铝或反相硅胶。
色谱流动相为硅胶色谱，石油醚乙酸乙酯2: 1~1: 2;氧化铝色谱，石 油醚乙酸乙酯:甲醇氨水7:5:1:0.1 3:5:1:0.1;反相硅胶色谱，甲醇水50: 50~70: 30或乙醇:水40: 60~70: 30。
重结晶溶剂为60%~100%的乙醇或甲醇溶液。
本发明用乙醇水溶液进行提取，经大孔吸附树脂柱富集后，进行柱色谱纯化， 代替传统的酸碱法和有机溶剂萃取法，具有自动化程度高、操作简便、产率高的 优点，以克服现有技术上的不足之处，更适用于工业生产。
大孔吸附树脂是20世纪60年代发展起来的一类有机高聚物吸附剂，具有良 好的吸附性能，近十余年来逐渐被应用于中草药化学成分的分离和中药新药的开 发研制。大孔吸附树脂是一类以吸附为特点，对有机物有浓縮分离作用的高分子 聚合物,在水溶液中，大孔吸附树脂对有机物具有良好的吸附选择性，可以固相 萃取的方法，在吸附藜芦甾体生物碱的同时将糖类等大极性成分去除。大孔吸附 树脂的理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物的选择性较好，不受 无机盐类及强离子低分子化合物的影响。通常，酸性化合物在碱性溶液中被解吸 附，碱性化合物在酸性溶液中被解吸附。藜芦甾体生物碱为碱性化合物，而植物提取物中的色素成分多为酸性化合物，因此，本发明采用稀碱溶液对大孔吸附树 脂柱洗脱，可最大限度的将色素杂质洗脱，而藜芦留体生物碱不受影响，提高产 品的纯度。藜芦甾体生物碱富集于在大孔吸附树脂柱的70~90%乙醇洗脱部位。 继而采用色谱方法分离纯化藜芦总甾体生物碱，硅胶色谱石油醚乙酸乙酯系 统；氧化铝色谱石油醚:乙酸乙酯:甲醇:氨水系统；反相硅胶色谱甲醇:水、 乙醇:水混合体系。分别收集富含藜芦胺和介芬胺的洗脱部位，经浓縮去除有机 溶剂后，在甲醇:水、乙醇:水混合体系重结晶，过滤，可以得到高纯度的藜芦胺 和介芬胺，含量达到90~100%。本发明采用大孔吸附树脂法富集总生物碱，可 最大限度的减少藜芦生物碱的损失，进一步提高产品收率。
本发明方法制备得到的藜芦胺和介芬胺单体化合物纯度高于98%，通过光 谱数据。H-NMR、 13C-NMR、 DEPT、 MS、 UV)，单体化合物经鉴定结构为藜 戸胺(Veratramine)和介芬胺(Jervine)。
具体实施例方式
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案-实施例1:
高纯度藜芦胺(Veratramine)和介芬胺(Jervine)的制备藜芦药材5Kg粉碎 后，在常压提取装置中用60%乙醇回流提取三次，每次1小时，提取液过滤减 压浓縮至无醇味，浓縮液2倍体积的水稀释加水稀释后，加入AB-8大孔吸附树 脂柱上，以150L的去离子蒸馏水洗脱，再以100L的0.05%的氢氧化钠水溶液进 行洗脱，继以100L的10~60%的乙醇溶液洗脱进行脱色，再以70~卯％的酒精洗 脱藜戸生物碱类成分，洗脱液减压浓縮到无醇味小体积，与200g硅胶混匀后， 进行硅胶色谱柱层析，以石油醚乙酸乙酯2: 1~1: 2流动相洗脱，薄层层析 跟踪，分别收集藜芦胺和介芬胺部位，收集液减压浓縮至干后在60%乙醇溶液中 进行重结晶，过滤，干燥，得到纯度为97%的藜芦胺218和98%的介芬胺14.6g。 两个化合物的鉴定数据见表。
实施例2:
藜戸药材5Kg粉碎后，在常压提取装置中用75%乙醇回流提取三次，每次 2小时，提取液过滤减压浓缩至无醇味，浓縮液4倍体积的水稀释加水稀释后，加入D101大孔吸附树脂柱上，以150L的去离子蒸馏水洗脱，再以100L的0.1% 的氢氧化钾水溶液进行洗脱，继以100L的10~60%的乙醇溶液洗脱进行脱色， 再以70~90%的酒精洗脱藜芦生物碱类成分，洗脱液减压浓縮到无醇味，与250g 氧化铝混匀后，进行氧化铝色谱柱层析，以石油醚乙酸乙酯甲醇氨水 7:5:1:0.1 3:5:1:0.1洗脱，薄层层析跟踪，分别收集藜芦胺和介芬胺部位，收集液 减压浓縮至干后在75%乙醇溶液中进行重结晶，过滤，干燥得到纯度为92%藜 芦胺23.5g和93%的介芬胺13.3g。 实施例3:
藜芦药材10Kg粉碎后，在常压提取装置中用卯％乙醇回流提取三次，每次 3小时，提取液过滤减压浓缩至无醇味，浓縮液5倍体积的水稀释加水稀释后， 加入ZTC-1大孔吸附树脂柱上，以300L的去离子蒸馏水洗脱，再以200L的0.5% 的氢氧化钙水溶液进行洗脱，继以200L的10~60%的乙醇溶液洗脱进行脱色， 再以70~90%的酒精洗脱藜芦生物碱类成分，洗脱液减压浓缩到无醇味，与400g 反相硅胶混匀后，进行反相硅胶色谱柱层析，以甲醇水50:50-70:30洗脱，薄 层层析跟踪，分别收集藜芦胺和介芬胺部位，收集液减压浓縮至干后在甲醇溶液 中进行重结晶，过滤，干燥得到纯度为96%的藜芦胺46.4g和98%的介芬胺21.9g。
实施例4:
藜芦药材7,5Kg粉碎后，在常压提取装置中用80%乙醇回流提取三次，每 次2小时，提取液过滤减压浓縮至无醇味，浓縮液3倍体积的水稀释加水稀释后， 加入DiaionHP20大孔吸附树脂柱上，以250L的去离子蒸馏水洗脱，再以170L 的0.2%的氢氧化钠水溶液进行洗脱，继以170L的10~60%的乙醇溶液洗脱进行 脱色，再以70~90%的酒精洗脱藜芦生物碱类成分，洗脱液减压浓縮到无醇味， 与300g硅胶混匀后，进行硅胶色谱柱层析，以石油醚乙酸乙酯2: 1~1: 2洗 脱，薄层层析跟踪，分别收集藜芦胺和介芬胺部位，收集液减压浓縮至干后在 60%甲醇溶液中进行重结晶，过滤，干燥得到纯度为95%的藜芦胺32.^和96% 的介芬胺18.4g。
实施例5:
藜卢药材20Kg粉碎后，在常压提取装置中用85%乙醇回流提取三次，每次 l小时，提取液过滤减压浓縮至无醇味，浓縮液4倍体积的水稀释加水稀释后，加入AB-8大孔吸附树脂柱上，以600L的去离子蒸馏水洗脱，再以400L的0.5% 的氢氧化钾水溶液进行洗脱，继以400L的10~60%的乙醇溶液洗脱进行脱色， 再以70~90%的酒精洗脱藜芦生物碱类成分，洗脱液减压浓縮到无醇味，与400g 氧化铝混匀后，进行氧化铝色谱柱层析，以石油醚乙酸乙酯甲醇氨水 7:5:1:0.1-3:5:1:0.1洗脱，薄层层析跟踪，分别收集藜芦胺和介芬胺部位，收集液 减压浓縮至干后在80%甲醇溶液中进行重结晶，过滤，干燥得到纯度90.5%藜芦 胺59.4g和92%的介芬胺35.2g。 实施例6:
藜戸药材10Kg粉碎后，在常压提取装置中用70%乙醇回流提取三次，每次 3小时，提取液过滤减压浓縮至无醇味，浓縮液5倍体积的水稀释加水稀释后， 加入Diaion HP20大孔吸附树脂柱上，以300L的去离子蒸馏水洗脱，再以200L 的0.1%的氢氧化钠水溶液进行洗脱，继以200L的10~60%的乙醇溶液洗脱进行 脱色，再以70~90%的酒精洗脱藜芦生物碱类成分，洗脱液减压浓縮到无醇味， 与200g反相硅胶混匀后，进行反相硅胶色谱柱层析，以乙醇水40: 60~70: 30洗脱，薄层层析跟踪，分别收集藜芦胺和介芬胺部位，收集液减压浓縮至干 后在乙醇中进行重结晶，过滤，干燥得到纯度99%藜芦胺21.68和98%的介芬胺 13.1g。
两个化合物的结构鉴定数据如下 藜卢胺
白色针状结晶，mp:214~216°C， Dragendorff试剂显橘红色; ESI-MS: m/z 410[M+H]+，分子式为C27H39N02; ^-NMR和13C-NMR (CDC13， <5)见Tablel。 Table 1化合物的'H-NMR和13C-NMR数据(5/ ppm, J/ Hz)XL陽SNo.<5h
11.85 (m), 1.27 (m)38.0
22.02 (m), 1.85 (m)30.4
33.51 (m)71.8
42.62 (m), 2.52 (m)44.0
143.1
65,49 (4月.O Hz)122.0
72.40 (m), 1.86 (m)31.3
82.94 (m)41.2
91.85 (m)57.0
1036.9
112.59 (m), 2.28 (m)30.5
12140.2
13-132.7
14144.0
IS6.97(d^7.0Hz)120.0
167.21 (4月8.0Hz)125.2
17142.5
182.32 (s)15.8
191.15 (s)18.8
203.58 (m)36.1
211.40 (4^8.0 Hz)19.2
222.81 (dd,风O, 3.6 Hz)67.0
233.31 (m)70.7
242.04 (m), 1.28 (m)41.9
251.54 (m)31.9
262.95(m)，2.12(m)53.9
270.83 (d， h.O Hz)19.3
介芬胺
26
白色针晶，mp:236 238。C， Dragendorff试剂显橘红色;
<formula>formula see original document page 8</formula>ESI-MS给出/m/z 426 [M+H]+，分子式为C27H39N03; !H-NMR和13C-NMR (CD30D+CDC13，。见Table 2。 Table 2化合物的'H-NMR和13C-NMR数据(5/ppm， //Hz)
XL~6
No.
12.45 (m)， 1.14 (m)36.4
21.84 (m), 1.46 (m)30.1
33.38 (m)70.6
42.28 (m)， 2.08 (m)40.4
5141.6
65.30 (d,5,4 Hz)120.2
72.28 (m), 1.74 (m)30.1
81.60(m)37,4
91.64 (m)62.0
1036.2
11206.6
12136.9
13144.6
141.88 (m)44.0
151.85 (m), 1.28 (m)23.6
161.87(m)， 1.53 (m)30.1
1785.2
182,06 (s)12.2
190.93 (s)17.7
202.42 (m)39.2
210.91 (d,声7.8 Hz)10.8
222.66(d,^3.0，3.6Hz)65.1
233.28 (m)74,8
242.14 (m)， 1.16 (m)37.7
251.45 (m)30.0
263.03讽>12.0,4.2 Hz)， 2.24 (m)53.0
270.90 (4声7.2 Hz)17.8
权利要求
1、一种高纯度藜芦胺和介芬胺的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)藜芦药材原料的提取藜芦药材粉碎后，在常压提取装置中用60～90％乙醇回流提取三次，每次1～3小时，合并提取液过滤浓缩得浓缩液；(2)大孔吸附树脂富集浓缩液加2～5倍体积的水稀释后，加入到大孔吸附树脂柱上，依次以30倍体积的去离子蒸馏水洗脱大极性杂质，再以20倍体积的0.05～0.5％的碱性水溶液进行洗脱，继以20倍体积的10～60％的乙醇溶液洗脱进行脱色，再以70～90％的酒精洗脱得到藜芦总甾体生物碱的洗脱液；(3)色谱柱纯化洗脱液减压浓缩到无醇味，进行色谱柱层析，流动相洗脱，薄层层析检测，分别收集藜芦胺和介芬胺部位，收集液分别减压浓缩至干，重结晶，过滤，干燥，得到高纯度藜芦胺和介芬胺。
2、 根据权利要求1的方法，其特征在于所述步骤(1)大孔吸附树脂柱为 AB-8、 DlOl、 ZTC-1或DiaionHP20大孔树脂柱。
3、 根据权利要求1的方法，其特征在于所述步骤(2)碱性水溶液为氢氧化 钠、氢氧化钾或氢氧化钙水溶液。
4、 根据权利要求l的方法，其特征在于所述步骤(3)色谱柱填料为硅胶、 氧化铝或反相硅胶。
5、 根据权利要求l的方法，其特征在于所述步骤(3)的流动相为硅胶色 谱，石油醚乙酸乙酯2: 1~1: 2;氧化铝色谱，石油醚乙酸乙酯甲醇氨 水7:5:1:0.1-3:5:1:0.1;反相硅胶色谱，甲醇水50: 50~70: 30或乙醇:水40: 60~70: 30。
6、 根据权利要求l的方法，其特征在于所述步骤(3)采用色谱方法分离纯 化藜戸胺或介芬胺，重结晶溶剂为60%~100%的乙醇或甲醇溶液;甲醇:水、乙醇: 水混合体系重结晶。
7、 根据权利要求1的方法，其特征在于步骤(3)得到的单体是高纯度的高 纯度藜芦胺或介芬胺，含量均在90~100%。
全文摘要
本发明提供了一种高纯度藜芦胺(Veratramine)和介芬胺(Jervine)的制备方法。该方法将藜芦药材原料粉碎、乙醇回流提取、大孔吸附树脂富集、洗脱(解吸附)、浓缩得到藜芦总甾体生物碱、柱色谱纯化、重结晶、干燥制得单体成品。以本方法制成的藜芦胺和介芬胺纯度可达90％以上，本发明工艺简便、产率高，宜于工业化生产。
文档编号A61P35/00GK101565445SQ20091005237
公开日2009年10月28日 申请日期2009年6月2日 优先权日2009年6月2日
发明者磊 单, 张卫东, 徐希科, 李慧粱, 柳润辉, 建 汤, 沈云亨, 娟 苏 申请人:中国人民解放军第二军医大学