专利名称：：顺-1-甲基-1,2,3a,4,8b-六氢吡咯[3,2f]氮茚的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新药研发
技术领域：
的物质的新用途，具体是顺-1-甲基-l，2，3a,4，8b-六氢吡咯[3，2f]氮茚的用途。
背景技术：
：淀〕盼样蛋白前体蛋白(amyloidprecursorprotein,APP)由695770个氨基酸组成，有3个主要蛋白异构体APP695、APP751、APP770。脑组织中主要是APP695。APP经过e和Y分泌酶剪切产生淀粉样蛋白(0-amyloid,A0)。阿尔茨海默病(Alzheimer'sDisease,AD)发病机制的淀粉样蛋白学说认为，在遗传、环境、精神等病理条件作用下导致脑内Ae产生增加，形成沉淀斑块，对神经元产生多方面的毒性作用，导致神经元损伤，神经网络遭到破坏，从而引发AD—系列症状，主要临床表现为进行性记忆丧失。目前对于AD的治疗，涉及多种途径多种方法，包括药物治疗、免疫治疗、心理社会干预及环境、行为治疗，另外还有比较新的方法是神经干细胞移植治疗。这些治疗方法中，以药物治疗为主。药物治疗包括与神经递质有关的药物、脑细胞代谢改善剂、钙离子拮抗剂、抗e-淀粉样蛋白药、自由基消除剂和抗氧化剂以及雌激素和神经营养因子(NGF)等。针对AD的治疗方法虽然繁多，但缺乏特异性的有效的可以阻止其发展或根治的药物。中枢烟碱受体激动具有改善学习记忆、神经保护等功能。近年来越来越多的研究报道把目光放在中枢神经元烟碱受体上，发现中枢神经元烟碱受体(nAChR)激动对AD的发生发展有抑制作用。经对现有技术文献的检索发现，0ddo在"烟碱受体在阿尔茨海默病中的作用"一文中综述认为烟碱作为非特异性烟碱受体激动剂，虽然本身可以从治疗角度单独或与其他药物合用，但其选择性不高，成瘾性和其他多种不良反应限制了它的有利作用的发挥。中国专利申请CN1385429A，公开了如下内容ZY-1为高张力的三元稠环尼古丁类似物，化学名称为顺-1-甲基-l,2，3a，4，8b-六氢吡咯[3，2f]氮茚，分3子量为172，该化合物化学稳定性高，水溶性好，制备简洁，在该说明书中制备方法已公布，主要用于潜在治疗神经退化或紊乱造成的疾病。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供顺-l-甲基-l,2，3a，4，8b-六氢吡咯[3，2f]氮茚的用途。本发明发现化合物ZY-1对神经细胞损伤具有直接保护作用，能减少阿尔茨海默病发病过程中的主要致病因素淀粉样蛋白(Ae)生成，对抗记忆损伤；且化合物ZY-1毒性小，有效范围广，可用于阿尔茨海默病的治疗。本发明是通过以下的技术方案实现的本发明涉及一种顺-l-甲基-l,2,3a，4，8b-六氢吡咯[3，2f]氮茚在制备治疗阿尔茨海默病(AD)药物中的用途。本发明还涉及一种顺-l-甲基-l，2，3a,4，8b-六氢吡咯[3，2f]氮茚在抑制淀粉样蛋白产生药物中的用途。本发明还涉及一种顺-l-甲基-1,2，3a,4，8b-六氢吡咯[3，2f]氮茚在保护神经细胞药物中的用途。本发明建立神经元烟碱型乙酰胆碱a402亚型受体和A3共表达的细胞模型，并在此细胞模型检测到新型烟碱类似物ZY-1对细胞内Ae水平有抑制作用；在环己酰亚胺所致记忆巩固性小鼠动物模型和乙醇所致记忆再现障碍性模型，发现ZY-1可以增强模型小鼠的学习记忆功能；在叠氮钠造成PC12细胞化学性缺氧损伤细胞模型观察到ZY-1具有神经保护作用。这些结果为新型抗AD药物研发提供线索，为抗AD烟碱特异性药物研发提供基础。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明发现化合物ZY-1可明显减轻记忆巩固障碍及记忆重现障碍，减少阿尔茨海默病发病过程中的主要致病因素淀粉样蛋白ue)生成，对能量代谢障碍引起的神经细胞损伤具有直接保护作用；化合物ZY-1毒性小，有效范围广，故可用于阿尔茨海默病的治疗。图1为顺-l-甲基-1，2,3a，4，8b-六氢吡咯[3，2f]氮茚的化学结构式示意图；图2为顺-1-甲基-1，2,3a,4,8b-六氢吡咯[3,2f]氮茚的合成方法示意图；图3为烟碱受体激动剂和拮抗剂在SH-EP1-a4e2nAChR-hAPP695细胞对细胞内淀粉样蛋白水平的影响图4为烟碱受体激动剂和拮抗剂在SH-EP1-a4e2nAChR-hAPP695细胞对细胞内淀粉样蛋白水平的软件分析结果图5为ZY-1对PC12与叠氮钠共孵36小时后细胞生存率的影响示意图。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。以下实施例中涉及的各种实验材料均可通过公开的渠道得到。本发明的实验方法如下(1)人淀粉样前体蛋白(APP695)基因和人烟碱a4e2受体基因共表达的细胞模型的建立表达载体pcDNA3.1(-)-APP695的构建;pcDNA3.1(-)为Invitrogen公司产品，在真核细胞表达neo抗性基因。携带野生型人APP695基因(Homosapiensamyloidbeta(A4)precursorprotein,mRNA(cDNAcloneMGC:75167IMAGE:6152423),completecds，GenBank:BC065529.1)全长的载体pXC几。将a4P基因(Humannicotinicacetylcholinereceptoralpha4subunit(nAChR)mRNA，completecds，GenBank:L35901.1)转染入SH-EP1细胞，pcDNA3.1(-)-APP695用脂质体转染进SH-EP1-a4e细胞并用筛选抗生素进行加压筛选；用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测APP695mRNA表达；用Western-blotting检测细胞克隆APP695和Ae的表达；用膜片钳鉴定稳定转染细胞克隆上烟碱a4e2受体的功能。(2)在以上建立的细胞模型观察ZY-1对细胞内的影响ZY-1融于生理盐水中，用Western-blotting检测细胞内的表达；用含有蛋白酶抑制剂PMSF和AEBSF的裂解液均购自北京天根生化科技公司，用于裂解细胞；BCA试剂盒购自于江苏碧云天公司，用于测定蛋白浓度，上样进行Tris-tricine电泳，PVDF膜湿转，一抗室温孵育3h，二抗室温孵育lh，ECL荧光检测，显影定影并拍照；本发明中所涉及的野生型人APP695基因、转染a基因的SH-EP1细胞、APP695基因和人烟碱a4e2受体基因共表达的细胞模型已分别在《YamadaT，ArakiE，IzumiR,GotoI，SasakiH,SakakiY.ExpressionofAlzheiiiieramyloidbeta-proteinprecursorgeneinneuronalcells,Gerontology,1991，37(Suppll):24-30》；《WuJ,KuYP,GeorgeAA,XuL,HuJ，LukasRJ.p-amyloiddirectlyinhibitshumana4p2-nicotinicacetylcholinereceptorsheterologouslyexpressedinhumanSH陽EPlCells，JBioChem，2004,36(279):37842-37551》；《NieHZ，LiZQ，LukasRJ，ShenYH，SongL，WangX，YinM.ConstructionofSH-EPl-a邻2-hAPP695CellLineandeffectsofnicotinicagonistsonP-amyloidintheCells,CellMolNeurobiol，2008,28:103-112》文献中公开。(3)观察ZY-1对环己酰亚胺所致记忆巩固性的影响给小鼠皮下注射环己酰亚胺120mg.kg—'，空白对照组注射等容量生理盐水。24h后进行测试，计算小鼠自电栅逃往跳台的潜伏期(TL)，受刺激时间(Ts)，错误次数(N)及平台停留期(T)。(4)观察ZY-1对乙醇所致记忆再现障碍性模型的影响于重测验前30min，正常对照组ig生理盐水10mLkg—1，其余各组小鼠ig30%乙醇10mLkg—'建立记忆再现障碍性模型，计算小鼠自电栅逃往跳台的潜伏期(TL)，受刺激时间(Ts)，错误次数(N)及平台停留期(T)。(5)观察新型烟碱受体激动剂ZY-1对叠氮钠造成PC12细胞化学性缺氧损伤的影响用叠氮钠(30mmol/U建立PC12细胞化学性缺氧损伤细胞模型。(6)进行小鼠急性毒性实验给药后观察1小时内动物死亡数。计算各组死亡率，按寇氏改进法计算半数致死量LD5。。实施例1将APP695基因和pcDNA3.1(-)进行Xbal1和Hindlll双酶切，凝胶回收后用T4DNA连接酶连接，转化至DH5a细菌，氨苄青霉素抗性筛选重组子pcDNA3.1(-)-APP695，扩增提取质粒，测序鉴定。将pcDNA3.1(-)-APP695用脂质体方法LipofectamineTMPLUS试剂转染进SH-EP1-a4P2细胞，转染3d后新霉素500g/L加压筛选，14d后细胞单克隆形成，有限稀释法将细胞进行单克隆化。稳定转染34d后收集单克隆细胞，用Trizol法按说明书步骤提取细胞总RNA。以总RAN为模板，APP695引物1和引物2进行PCR。PCR程序具体为94。C变性3tnin进入循环过程，94。C变性1.5min，55'C退火1.5min，72。C延伸3min，循环31次后72。C复性10min。凝胶电泳鉴定PCR产物；然后用a4和P2基因引物进行PCR，a4引物为5，-CCATCGCTCAGCTCATTGACG-3'和5'-CTGGTCGGAGGGTGACTTGC-3'，P2引物为5'-TATTCCAATGCCGTGGTCTCC-3'和5'-TGGTCATCGTCCTCGCTC-3'，凝胶电泳鉴定PCR产物。对RT-PCR挑选出的阳性克隆，裂解细胞，提取细胞蛋白，用酶标仪测定蛋白浓度，取10ug上样进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用12%分离胶，5%积层胶，硝酸纤维素膜半干电转移，转膜时间2h，小鼠抗人APP695单抗孵育3h，山羊抗小鼠二抗孵育lh，ECL荧光检测，显影定影并拍照，检测细胞克隆APP695。用含有蛋白酶抑制剂PMSF和AEBSF的裂解液裂解细胞，BCA法测定蛋白浓度，取30.5ng上样进行Tris-tricine电泳，用16.5%分离胶，10%夹层胶，钱浓縮胶，PVDF膜湿转，转膜时间lh，6E10单抗室温孵育3h，山羊抗小鼠二抗孵育lh，ECL荧光检测，显影定影并拍照，检测细胞克隆Ae。对Western-bloting挑选出的APP695表达较高的细胞克隆进行膜片钳实验，采取传统的全细胞记录技术；钳制电位为-60mV，低通滤波为2kHz，采样滤波为5kHz，测试和记录软件用AxonDigiData-1200A，结果分析用Axonscope1.1.1软件；通过微操纵器移动快速给药装置的排管给药，给予100umo1*L—'烟碱4s，观察细胞上烟碱a4e受体通道活性。普通的原代神经细胞或神经细胞系往往多种烟碱受体亚型并存，存在一定的相互影响，无法确定药物的耙受体亚型，通过实施例l，我们得到了具有仅含a4e2烟碱受体的细胞，进一步明确药物的靶受体效应。实施例2给药6h后用含有蛋白酶抑制剂PMSF和AEBSF的裂解液裂解细胞。BCA法测定蛋白浓度，取30.5"g上样进行Tris-tricine电泳，用16.5%分离胶，10%夹层胶，4%浓縮胶，PVDF膜湿转，转膜时间lh，6E10单抗室温孵育3h，山羊抗小鼠二抗孵育lh，ECL荧光检测，显影定影并拍照(图3)，条带密度用Tanon7凝胶成像软件分析(图4)。图3:烟碱受体激动剂和拮抗剂在SH-EPl-a4e2nAChR-hAPP695细胞对细胞内淀粉样蛋白水平的影响。图4烟碱受体激动剂和拮抗剂在SH-EP1-a4e2nAChR-hAPP695细胞对细胞内淀粉样蛋白水平的软件分析结果。*表示和正常对照组相比有显著差异(p<0.05)。1:尼古丁；2:DHPE+尼古丁；3:ZY-1;4:正常对照；该图说明与对照组相比，尼古丁及ZY-1均可通过a4P2烟碱受体显著抑制细胞内Ae的生成，而同剂量的ZY-1的作用比尼古丁对Ae的生成的抑制作用更强。实施例3昆明种小鼠90只，雌雄各半，体重1822g，随机分为6组，即正常对照组(A)、模型组(B)、烟碱组(C)、ZY-1低剂量组(D)、ZY-1中剂量组(E)和ZY-1高剂量组(F)，每组15只，各组小鼠均按20mL/kg的灌胃量灌胃，A组、B组灌服O.9%的生理盐水，C组灌服烟碱溶液，D组、E组和F组分别灌服66.20、132.39、264.78mg/kg的ZY-1。各组小鼠每2天灌胃给药1次，连续15d。末次给药后lh，使用跳台法训练10次。训练后，除空白对照组外，立即给小鼠皮下注射环己酰亚胺120mg.kg-l，空白对照组注射等容量生理盐水。24h后进行测试，计算小鼠自电栅逃往跳台的潜伏期(TL)，受刺激时间(Ts)，错误次数(N)及平台停留期(T)。(表1)记忆再现障碍模型实验方法同前，不同之处在于使用30%乙醇10mLkg—1造成小鼠记忆重现障碍，并在测验前30min，正常对照组ig生理盐水10mLkg—1，其余各组小鼠ig30%乙醇10mLkg—1(表2)。该实验说明环己酰亚胺可显著縮短小鼠在平台上的停留时间，受电刺激的时间延长，错误次数显著增加，而烟碱及ZY-1均可显著延长小鼠在平台上的停留时间，縮短受刺激时间及错误次数，降低反应潜伏期，减轻记忆巩固障碍。该实验说明乙醇可显著延长小鼠受电刺激的时间延长，显著增加错误次数，延长潜伏时间。烟碱及ZY-1均可显著縮短受刺激时间及错误次数，降低反应潜伏期，减轻乙醇造成的记忆重现障碍。0.15mg/kg的ZY-1减轻乙醇造成的记忆重现障碍及环己酰亚胺造成的记忆巩固障碍效果与0.28mg/kg的烟碱作用相同，ZY-1的剂量约为烟碱所需剂量的一半。表lZY-1对环己酰亚胺引起的小鼠记忆巩固障碍的作用(^±5%n=16)药物剂量/平台停留期受刺激时间错误次数反应潜伏期<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>AP<0.05,"P<0.01，与正常对照组比较；*P<0.05，林P〈0.01，与模型组比较实施例4细胞接种在96孔培养板上72h后，用新鲜配制的含有叠氮钠(30mmol/L)和不同浓度ZY-l(0，50，100，150，200，250umol/L)的培养液预孵育细胞3h，计数活细胞数目以计算细胞存活率。实验结果显示，相同剂量的ZY-l在与损伤细胞共育24小时后，其细胞保护效果显著优于烟碱(图5)。图5为ZY-1对PC12与叠氮钠共孵36小时后细胞生存率的影响。n=7，^±SD*P<0.05与烟碱比较。叠氮钠可使存活PC12细胞数降低至原来的10%，烟碱和ZY-1在3300Mmol/L的范围内均可剂量依赖性的增加PC12细胞的存活率，保护神经细胞免受叠氮钠的损伤，在此剂量范围内，ZY-1神经保护的强度显著优于同剂量的烟碱，对抗能量代谢障碍造成的神经细胞死亡。实施例5将ZY-1按两倍稀释原则配成不同浓度的稀释液。取小鼠1620只，每4只一组，每组按以上不同稀释度的溶液灌胃，找出正式实验时的最大剂量(Dm)和最小剂量(Dn)，即引起100%和0%动物死亡的剂量或引起大多数动物死亡和大多数动物存活的两个剂量。在预实验找到的Dm和Dn间按等比级数将动物分成5个剂量组。每组10只，随机分配。给药后观察1小时内动物死亡数。计算各组死亡率。按寇氏改进法计算半数致死量LD。口服试验表明烟碱的LDs。为49mg/kg，ZY-1的LDs。为504mg/kg，毒性仅为烟碱的1/10。权利要求1、一种顺-1-甲基-1，2，3a，4，8b-六氢吡咯[3，2f]氮茚的用途，其特征在于，在制备治疗阿尔茨海默病药物中的用途。2、一种顺-l-甲基-1,2,3a，4,8b-六氢吡咯[3，2f]氮茚的用途，其特征在于，在制备抑制淀粉样蛋白产生药物中的用途。3、一种顺-l-甲基-1,2,3a，4,8b-六氢吡咯[3，2f]氮茚的用途，其特征在于，在制备保护神经细胞药物中的用途。全文摘要一种新药研发
技术领域：
的顺-1-甲基-1，2，3a，4，8b-六氢吡咯[3，2f]氮茚在制备治疗阿尔茨海默病药物中的用途，在制备抑制淀粉样蛋白产生药物中的用途以及在制备保护神经细胞药物中的用途。本发明发现顺-1-甲基-1，2，3a，4，8b-六氢吡咯[3，2f]氮茚对神经细胞损伤具有直接保护作用，能减少阿尔茨海默病发病过程中的主要致病因素淀粉样蛋白生成，对抗记忆损伤；且毒性小，有效范围广，可用于阿尔茨海默病的治疗等用途。文档编号A61K31/4353GK101618037SQ20091005596公开日2010年1月6日申请日期2009年8月6日优先权日2009年8月6日发明者明殷,王泽剑,聂惠贞,赵文娟,郭凌晨申请人:上海交通大学