专利名称：含有灵芝的发酵菌质混合物、制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌经固体发酵得到的菌质混合物、制备方法及其应用。具体讲 是一种由灵芝以含有药用原料成分的培养基质经固体发酵得到菌质混合物、其制备方法及 应用。
背景技术：
对多种药(食)用真菌代谢产物的研究，尤其是多糖类的抗肿瘤研究，目前已有许 多报道。长期以来其生产研究主要是集中在液体深层发酵，主要借鉴抗生素生产工艺；其生 产效率较高，产品质量较稳定，但存在成本较高，耗能大，且易受污染，不易操作等问题。固体发酵生产工艺使用的培养基，多是利用农副产品如麸、糠、甘蔗渣、玉米芯等， 成本大大低于液体发酵，且由于其灭菌后可在自然条件下培养，污染率较低等优点，近年来 已成为真菌生产研究的热点。早期的真菌固体发酵主要是固体培养，即将培养基装袋灭菌 后接种真菌，收获子实体，培养基的主要功能是提供真菌生长所需营养物质，即碳源、氮源、 矿质营养与维生素等成分。自20世纪七十年代后开始研究应用菌丝体，出现了无渣型和去 渣型两类生产工艺。近来有学者进一步提出了“菌质”的概念，即真菌在固体培养基上发酵后形成的既 不同于单纯的菌丝体，也不同于培养基渣滓，而是包含了真菌菌丝体活性成分、真菌代谢产 物和培养基营养成分在内的复杂成分发酵终产物体系。如，庄毅等在“药用真菌新型固体发 酵工程与槐芪菌质的研制”(《中国药学杂志》2004(3) Vol. 39，175-178)中报道了由槐耳菌 和黄芪构成发酵组合生产槐芪菌质，进行了发酵中药材的筛选、发酵终点的确定实验，并对 不同菌种接种同种基质后产生菌质的药效学比较、菌质多糖提取和清膏除杂以及这两者对 同一药效的比较试验。陈华珍等在“灵芪菌质发酵工艺初报”(《中西医结合学报》2004(3)，Vol. 2，216) 中报道了将灵芝分别在普通基质、药性基质(含黄芪)、富硒药性基质中发酵，对三种基质 中菌质的有效部位多糖的含量进行测定及动态研究，比较其变化。谷坤睿等的“14个灵芝菌株的新型双向型固体发酵及菌质多糖含量测定”(《时 珍国医国药》2005(4)，Vol. 16，313)、刘学湘等的“灵芝和灵芪菌质多糖的含量动态变化初 步分析”(《中医药学报》2005(6)，Vol. 33，33)、秦俊哲洁等的“灵芝新型固体发酵菌质种 活性成分的研究”(《食用菌》2005(1)，8)、以及郁帅陆等的“黄芪固体发酵中有效成分的变 化”(《食品与药品》2007 (03A)，Vol. 9，8)等，分别报道了对相应菌质中的多糖、蛋白、三萜 类等活性成分物质的测定及变化。陈合等在“利用中药渣培养灵芝菌及生物活性成分的研究”(《食品工业科技》 2006 (10), 58)还报道了对灵芝菌最适的发酵条件、子实体生长条件及其生物活性成分(灵 芝多糖及灵芝三萜化合物)和重金属含量等方面的研究。发酵的概念是通过微生物对有机物的作用，以获得某种或几种产品。由真菌固体 发酵所生产的菌质，实质是真菌与培养基质共同构成发酵组合，一方面通过酶作用于发酵基质，分解基质成分，摄取营养，生长大量菌丝体；另一方面真菌的代谢过程既使基质被分 解出现新成分，同时还可以合成新成分。这些新成分的性质可因不同真菌所具酶的差异而 有所不同，并还要受到基质的种类和/或性质、以及发酵条件的影响。发酵所形成的各种成 分，有的可累积在菌丝体内(胞内)，有的则仍留在基质中或由菌丝体分泌到基质中去(胞 外)，因此形成了发酵后复杂成分体系的终产物。将菌质生产和中草药应用紧密联系，将适当的中药材作为真菌固体发酵培养基或 培养基的一部分成分，使其既提供真菌生长所需营养，同时又因真菌的分解和合成作用产 生新的成分，从而使其性质发生变化；同时因不同种类真菌的生理代谢过程不同，基质中采 用的中药材品种不同而成分和功效不同，因而可得到不仅兼具真菌和中药材的功效、并可 能产生新功效的药性菌质或兼有原有营养基质和中药材基质的全性菌质发酵终产物。由于不同菌种与不同基质交叉组合可构成不同的发酵组合，并可产生种类更为繁 多的菌质，因此可成为中药材特别是菌物药开发的新途径，并可被应用于药物和/或功能 性食品中。
发明内容
鉴于此，本发明将在此基础上提供一种由灵芝以含有药用原料成分的培养基质经 固体发酵得到菌质混合物、其制备方法及在药物和/或功能性食品中的应用。灵芝(Ganoderma)在我国已有几千年的历史，现已记载有灵芝科真菌4属103种， 其中灵芝属77种，《中国药典》(2000年版)已收载作为药用。灵芝子实体含有丰富的营 养成分和药用成分，主要有水分12. 49% 13. 02%，粗蛋白11. 98% 13. 87%，粗脂肪 0. 81% 1. 96%，总糖 7. 34% 8. 10%，其多糖含量为 1. 06% 1. 33%，钙 1550μ g/g、镁 483 μ g/g、铁180 μ g/g、锌44. 7 μ g/g及磷37. 5 μ g/g等人体必需的常量或微量元素，还含 有18种常见氨基酸，总量为6. 07% 6. 38%，其中必需氨基酸含量丰富(E/T = 0. 528 0.545)；另有少量萜类物质。目前，灵芝的人工栽培技术已经普及，主要有代料和椴木栽培 两种方式，对产品的加工技术也日趋成熟，包括保健饮料(如灵芝茶、灵芝酒)、药品(如灵 芝冲剂、灵芝丸、灵芝胶囊)、美容品等多种灵芝类产品已为人们认识、接受和使用。中药丹参是唇形科鼠尾草属的多年生草本植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎，又称血参、紫丹参、红丹参等。作为一传统中药其已沿用久远，具 有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效，主治冠心病、心绞痛、心烦不眠、月经不调、经闭痛 经等症。近年来，有关丹参的药效学研究较多且日趋深入，具体表现为在扩冠脉流量、促进 微循环、血液流变学、抗血小板聚集、提高耐缺氧能力、保护缺血心肌、治疗胃溃疡和肝肾损 伤、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、降血压、增强免疫等方面具有显著疗效，目前已有包括注射、 口服、贴剂等多种形式的药物制剂供使用。本发明含有灵芝的发酵菌质混合物，是由灵芝在至少含有真菌生长所需的碳源和 氮源的营养性培养基质中，还含有药用原料丹参，然后通过丹参成分对灵芝菌丝体生长代 谢过程的影响和灵芝真菌酶系对药物成分的改造这一双向性生物转化的固体发酵过程，得 到包含菌丝及培养基质成分在内的灵芝/丹参菌质混合物这一发酵终产物。上述所说的营养性培养基质 成分、条件的选择，可参照目前在灵芝栽培方面已有 报道和/或使用的方式(如前述相关文献)。其中，固体发酵灵芝的培养基可主要使用农业的废弃生物质，如玉米芯、棉籽壳、米糠、豆粕、酒糟、锯木屑等。现有文献报道已显示，灵芝 在这些基质配方中都能很好生长。试验结果显示，在本发明所说发酵菌质混合物的培养基质中，丹参含量的高低对灵芝的生长并无明显的干扰或影响，但所得到的发酵菌质混合物的特殊药理作用的显著与 否，则主要取决于在发酵培养基中所含丹参的比例，有由量变向质变的变化过程。例如，一 种可供参考的培养基质的重量比例组成可以采用玉米芯5 % 80 %，麦麸10 % 25 %，其 余为药用原料丹参。其进一步的优选比例可以为玉米芯5%，麦麸25%，其余为药用原料 丹参。固体发酵的条件及过程等，同样也可参照前述相关文献的方式进行。例如，以上述至少含有真菌生长所需的碳源和氮源营养成分与药用原料丹参粉末 的均勻混合物为培养基质，在灵芝的适宜栽培条件下(如每年3 10月期间的自然栽培或 不限时间的人工栽培，和/或22°C 25°C条件等)，使灵芝在其中进行固体发酵30 50 天，一般也可在35 40天后，收集包含菌丝及培养基质成分在内的菌质混合物。以本发明的上述灵芝/丹参发酵菌质或其提取物(如按常规煎煮、回流、渗漉、浸 泡等方式得到的水提物)为有效药用成分，与药学中可接受的辅助成分可以共同组成具有 活血化瘀、抗氧化功效的药物。将上述的灵芝/丹参发酵菌质或其提取物作为添加成分，与 药用或保健品的辅料成分(如乳糖、淀粉、硬脂酸镁等赋形剂；蜂蜜、单糖浆等调味剂；山梨 酸、苯甲酸等防腐剂)可以共同组成具有活血化瘀、抗氧化功效的保健品；还可以以上述的 灵芝/丹参发酵菌质或其提取物为主要成分，与化妆品中允许使用的其它辅助和/或添加 剂共同组成具有抗氧化作用的化妆品。所说的这些药物、食品、化妆品等都可以通过目前相 关行业的常规方式或工艺实现，对制备方法并无特别的要求、限制，也不存在任何技术困难 或障碍。以下结合附图及实施例的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细 说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述 技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括 在本发明的范围内。
图1是本发明灵芝/丹参全性菌质的各种组合固体发酵过程中菌丝体生长速度曲 线。图2是本发明灵芝/丹参全性菌质的各种组合固体发酵过程中总多糖含量动态变 化曲线。图3是本发明灵芝/丹参全性菌质的各种组合固体发酵过程中粗蛋白含量动态变 化曲线。
具体实施例方式在如表1所示的不同组成形式的培养基质中按灵芝常规发酵方式操作，对灵芝的 生长适应性进行了试验。实验中选择玉米芯与麦麸(可根据当地情况可作调整)与丹参混 合作为灵芝发酵培养基，主要考察灵芝在各培养基上的生长情况，以及在不同含量比例丹 参的培养基质中经固体发酵制备得到的本发明所说的灵芝/丹参菌质(简称灵丹菌质)混合物的药理活性。试验所用的灵芝的常规发酵方式母种由PDA斜面培养基保存。按表1的各培养 基配方，将各成分加水拌勻，含水量为40%，装袋后压实，每袋装料500g，中间打一个圆洞， 封口(可用牛皮纸等)并扎紧，115MPa高压保持3小时灭菌，或煮沸后保持24小时的常压 灭菌。冷却后，无菌操作接入灵芝母菌种，把接好种的瓶子放在培养室培养，培养室内温度 应保持在22-25 °C。发酵结果显示，所有组合的培养基质均适于灵芝菌丝体生长，无生长抑制现象，证 明了在常规营养性培养基质中含有不同比例量的丹参，均能作为制备本发明所说灵芝-丹 参菌质混合物的发酵培养基，灵芝在其中均能很好地生长而无明显不利影响和干扰。表1灵芝-丹参全性菌质固体发酵培养基 从接种开始记录灵芝菌丝体在固体发酵培养基上的平均生长速度，得到如图1所 示的灵芝菌丝体生长曲线。由图1可以看出，菌丝生长可分为四个阶段(1)适应期(0-6d) 菌丝生长较慢，菌丝较纤弱；(2)旺盛期(6-8d)菌丝活力较强，代谢旺盛，生长快；(3)下 降期(8-13d)菌丝生长速度急剧下降；(4)回升期(13-15d)菌丝生长速度有所回升；(5) 衰退期(15-35d)菌丝活力衰退，菌丝老龄化，开始分泌黄褐色素。该实验结果表明，菌丝 生长至接种13天后，生长速度趋于平稳且不断下降，至30天后，生长速度趋于平缓不变。
以苯酚-硫酸比色法观察上述灵丹菌质固体发酵体系总多糖含量的动态变化(1)取样方法从接种日起，每隔IOd每组合的固体发酵样品各取3袋，烘干打粉(40目)作为样品。(2)供试品溶液的制备①提取上清液精密称取样品细粉5g(约相当于多糖 0. 22g)，置烧瓶中，加水IOOml置电炉上加热回流提取1. 5h，放冷至室温，3000 4000rpm 离心IOmin后收集上清液，少量水分次洗涤烧瓶及离心管，同样离心收集上清液。②提取 多糖沉淀合并全部上清液置蒸发皿中，置电炉上小心加热(避免焦化)浓缩到约15ml，放 冷至室温，加乙醇100ml，搅勻，放置使其沉淀15分钟。转移此溶液连同沉淀于离心管中， 继续用少量80%乙醇以玻棒充分刮洗蒸发皿，洗液和沉淀同样转移至离心管中，以3000 4000rpm速度离心15min，弃去上清液，在离心管中加入少量80%乙醇，轻轻洗涤，同样离心 弃去上清液(保留沉淀物)。然后将离心管(连同沉淀物)于50°C烘箱挥干乙醇，然后加 热水溶解沉淀，转移至250ml量瓶中，继续用热水以玻棒充分刮洗离心管，洗液同样转移至 250ml量瓶中，放冷至室温，用水定容至刻度，摇勻，精密量取5ml置IOOml量瓶中，用水定容 至刻度，摇勻即得供试品溶液。(3)标准曲线的制作精密称取105°C干燥至恒重的无水葡萄糖适量，加水配制成 0. 85mg/ml的贮备液。精密吸取1.0,2.0,3.0,4.0,5. Oml分别置于50ml量瓶中加水定容至 刻度，摇勻得葡萄糖稀释液。再分别精密量取上述各稀释液2ml置具塞试管中，同时精密量 取水2. Oml置另一具塞试管中，各管分别加5%苯酚溶液(新制)lml，摇勻，然后迅速加入 浓硫酸5. 0ml，立即摇勻，于40°C水浴中保温30min，取出，置冰水浴中5min。以上述2. Oml 水所制得的空白溶液做参比，于490nm波长处测定各溶液吸收度，以葡萄糖稀释液的浓度 (μ g/ml)为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。(4)样品测定取供试品溶液2. Oml置具塞试管中，按“标准曲线的制作”项下同法 加苯酚溶液和浓硫酸，测定吸收度。根据样品吸收度从标准曲线上读取葡萄糖浓度，再计算 出样品中总多糖的含量(以葡萄糖计)。实验结果如图2所示。图2结果显示，随着发酵时间的增长，各组合粗多糖含量基本呈逐渐下降趋势，从 接种后10天到30天，变化较为剧烈；接种后30天到50天，变化趋势变缓，至50天取样时 粗多糖含量与40天时相比已基本不变。以考马斯亮蓝法观察该灵丹菌质固体发酵体系粗蛋白含量动态变化(1)取样方法从接种日起，每隔IOd取各组的固体发酵样品2-4袋，按组分别混 合后烘干打粉(40目)作为样品。(2)供试品溶液的制备①提取上清液精密称取样品细粉5g(约相当于多糖 0. 22g)，置烧瓶中，加水IOOml置电炉上加热回流提取1. 5h，放冷至室温，3000 4000rpm 离心lOmin，收集上清液，用少量水分次洗涤烧瓶及离心管，同样离心收集上清液。合并全部 上清液置蒸发皿中，置电炉上小心加热(避免焦化)浓缩到约20ml，放冷至室温。(3)标准曲线的制作准确称取IOOmg牛血清白蛋白，溶于IOOml蒸馏水中，即为 1000 μ g/ml的牛血清白蛋白标准溶液。精密吸取牛血清白蛋白标准溶液0.02ml、0.04ml、 0. 06ml,0. 08ml,0. IOml、0· 20ml,0. 40ml,0. 60ml,0. 80mlU. OOml 分别置于具塞试管中加水 定容至lml，摇勻得牛血清白蛋白稀释液，各管分别加考马斯亮蓝工作液(新制)5ml，摇勻， 以1.0ml水所制得的空白溶液做参比，于590nm波长处测定各溶液吸收度，以牛血清白蛋白稀释液的浓度(Pg/ml)为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。(4)样品测定取供试品溶液1. 0ml置具塞试管中，按“标准曲线的制作”项下同法 加考马斯亮蓝工作液，测定吸收度。根据样品吸收度从标准曲线上读取蛋白质浓度，再计算 出样品中蛋白质的含量。实验结果如图3所示。由图3结果可以看出，随着发酵时间的增长，各组合灵丹菌质混合物中的粗蛋白 含量基本呈逐渐下降趋势，从接种后10天到30天，变化较为剧烈；接种后30天到50天，变 化趋势变缓，至50天取样时粗蛋白含量与40天时相比已基本不变。上述试验结果显示，采用营养性成分的比例为玉米芯5% 80% (均为w%)，麦 麸10% 25%和余量为药用原料丹参，特别是以玉米芯5%，麦麸25%和余量为药用原料 丹参形式的培养基质，使灵芝按常规方式，在灵芝的自然栽培时期(每年的3 10月)于 22°C 25°C的常温下进行的固体发酵，灵芝的生长均是正常和满意的。固体发酵时间一般 可为30 50天，更好的是在固体发酵35 40天后，收集包含菌丝及培养基质成分在内的 菌质混合物，都可以获得理想的效果。并且，随培养基质中丹参药材添加比例的增高，所得 菌质混合物的多糖和蛋白含量也呈现逐渐增高的趋势。以下的实验还进一步显示，本发明上述的灵丹菌质混合物(以下均简称“灵丹菌 质”)可以具有明显优于单一的灵芝、丹参，及其按常规方式相互组合的混合药物的生物学 功能，而灵丹菌质的生物学功能随丹参在培养基中的比例增加而升高。实验1灵丹菌质对小鼠凝血时间(CT)的影响实验动物KM种小鼠80只，体重20 士 2g。实验方法将小鼠分为正常组(蒸馏水0. 2ml/10g)、灵丹菌质组10%、30%、50%、 70% (0. 15g/10g，即每10g体重小鼠灌胃黄丹菌质中丹参含量为0. 15g，折算成灵丹菌质为 0. 15-丹参在灵丹菌质中的比例，以下同)、灵芝菌质组(无丹参单独发酵的灵芝菌质，灌 胃剂量与灵丹菌质组10%相同，即0. 15/0. 1 = 1. 5g/10g,以下同)、灵芝/丹参混合药物 组(以不含丹参的培养基质单独发酵得到的灵芝菌质代替除与灵丹菌质10%中等比例的 丹参药材外的其余部分，以下同)、和丹参药材组(与灵丹菌质同批次药材，0. 15g丹参生药 /10g，即每10g体重小鼠灌胃0. 15g丹参水提取液，以下同)，每组各10只，雌雄各半，每日 灌胃给药，正常组每日给予等量水灌胃，连续7d。末次给药后lh用内径1mm玻璃毛细管插入 小鼠内眦球后静脉丛取血，自血液流人管中开始计时，血液注满后取出毛细管平放于桌上， 每隔30s折断两端毛细管，并缓慢向左右拉开，观察折断处是否有血凝丝，至血凝丝出现时 停止计时，所得时间即为CT。结果以X士S表示，组间行t检验。实验结果与正常组相比，灵丹菌质组有明显延长小鼠凝血时间的作用(P < 0. 05，P < 0. 01)，量效关系明显，提示其具备抗凝血作用，且随着丹参在培养基中比例增 加其效果随之增加。结果如表2所示。表2灵丹菌质对小鼠凝血时间(CT)的影响 灵丹齒质组(50%)0.15g/10g255.16士 106.731 广 灵丹歯质组(70%) 0.15g/10g 267.89土47.162广
灵芝菌质组 0.15g/10g 198.33±37.9645 灵芝/丹参混合药物组 0.15g/10g 210.55 土59.3882' 丹参药材组_0.15g/10g_215.36 士49.5532*注与正常对照组相比:**P < 0. 01，*P < 0. 05。实验2灵丹菌质对小鼠尾出血时间的影响
实验动物KM种小鼠80只，体重20 士 2g。实验方法将小鼠分为正常组、灵丹菌质组10%、30%、50%、70%、灵芝菌质组、 灵芝/丹参混合药物组、和丹参药材组，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组每 日给予等量水灌胃，连续7d。末次给药后Ih取小鼠置于固定器中，使其尾部垂直，距尾尖 1.5mm处剪断，用滤纸吸血直至吸不出血为止，记录断尾尖至吸不出血的时间即为尾出血时 间。实验结果与正常组相比，灵丹菌质组有明显延长小鼠出血时间的作用(P <0. 05，P< 0.01)，量效关系明显，提示其具备延长出血时间作用，且随着丹参在培养基中 比例增加其效果随之增加。结果如表3所示。表3灵丹菌质对小鼠尾出血时间的影响 注与正常对照组相比:**P < 0. 01，*P < 0. 05。实验3灵丹菌质对小鼠尾部血栓形成的影响实验动物KM种小鼠50只，体重20 士 2g。实验方法将小鼠分为模型组、灵丹菌质组10%、30%、50%、70%、灵芝菌质组、 灵芝/丹参混合药物组、和丹参药材组，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组和正 常组每日给予等量水灌胃，连续7d。给药第4天注射1.5%角叉菜胶于小鼠左右后肢脚掌 皮下，每只脚掌0. 03ml (0. 06ml/只)，注射完毕后保持17°C温度饲养，继续给药3天，并于 注射后24h，48h，72h测量小鼠全尾长度和尾部血栓长度，计算血栓率。实验结果与模型组相比，灵丹菌质组有明显缩短小鼠尾部血栓长度的作用(P <0. 05，P< 0.01)，量效关系明显，提示其具备抗血栓作用，且随着丹参在培养基中比例增 加其效果随之增加。结果如表4所示。表4灵丹菌质对小鼠尾部血栓形成的影响
注与正常对照组相比**P < 0. 01，*P < 0. 05c
实验4灵丹菌质对小鼠耳廓微循环的影响实验动物KM种小鼠80只，体重20 士 2g。实验方法将小鼠分为正常组、灵丹菌质组10%、30%、50%、70%、灵芝菌质组、 灵芝/丹参混合药物组、和丹参药材组，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组和 正常组每日给予等量水灌胃，连续7d。末次给药前，各小鼠ipl2.5%戊巴比妥钠0.4mg/kg 麻醉，将小鼠右耳廓部用脱毛剂脱毛，耳廓平展于耳托上，64倍物镜观察，观察部位的确定 距耳廓边缘约1. 5 2mm处，在平行于耳廓边缘方向，自中间细动脉开始右行约1mm范围内 为观察部位。将测微尺(O-lOOOym)置于此处。凡与该测微尺相交之血管均视为有效，对 其进行BI. 2000图像系统分析。选择流速稳定区域微动脉(A)、微静脉(V)各一条并标记， 记录血管管径及血液流速。而后给药3d。在末次给药后0. 5h，同法麻醉并测定标记血管管 径及血液流速。分析给药前后管径及血液流速变化情况。以给药前后两次结果差值(A V， A A)及血流速度之差作为微循环改善情况的指标。实验数据进行t值检验和方差分析。实验结果与正常组相比，灵丹菌质组可明显增加微血管管径(P < 0. 01)，加快小 鼠微动脉、微静脉血流速度(p< 0.01)，量效关系明显，提示其具备改善微循环作用，且随 着丹参在培养基中比例增加其效果随之增加。结果如表5所示。表5灵丹菌质对小鼠耳廓微循环的影响 注与正常对照组相比广P < 0.01，*P < 0. 05。实验5灵丹菌质对急性脑缺血缺氧小鼠的保护作用实验动物KM种小鼠80只，体重20 士 2g。实验方法将小鼠分为正常组、阳性对照组(红景天，0. 06g/10g,即每10g小鼠体 重灌胃0. 06g红景天的水提物)、灵丹菌质组10 %、30 %、50 %、70 %、灵芝菌质组、灵芝/丹参混合药物组，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组和正常组每日给予等量水灌 胃，连续7d。末次给药后30min，200g/L乌拉坦1. Og/kg静脉注射麻醉，分离双侧颈总动脉 及迷走神经，用手术线同时结扎，观察小鼠的存活时间(每分钟呼吸少于或等于5次为死亡)。实验结果与正常组相比，灵丹菌质组有明显延长小鼠结扎双侧颈总动脉及迷走 神经后的存活时间的作用(P < 0. 05,P < 0. 01)，量效关系明显，提示其具备改善缺血脑组 织的血氧供应作用，且随着丹参在培养基中比例增加其效果随之增加。结果如表6所示。表6灵丹菌质对急性脑缺血缺氧小鼠的保护作用 注与正常对照组相比:**P < 0. 01，*P < 0. 05。实验6灵丹菌质对断头小鼠喘息时间的影响实验动物KM种小鼠80只，体重20 士 2g。实验方法将小鼠分为正常组、阳性对照组(红景天，0. 06g/10g,即每IOg小鼠体 重灌胃0. 06g红景天的水提物)灵丹菌质组10 %、30 %、50 %、70 %、灵芝菌质组、灵芝/丹 参混合药物组，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组每日给予等量水灌胃，连续 7d，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药，模型组每日给予等量自来水灌胃，连续7d。末次 给药Ih后，自小鼠耳后根部快速断头，记录小鼠断头后喘息的时间(S)。实验结果与正常组相比，灵丹菌质组具有延长小鼠断头后喘气时间的作用的趋 势，提示其具备一定抗急性耐缺氧作用，且随着丹参在培养基中比例增加其效果随之增加。 结果如表7所示。表7灵丹菌质对断头小鼠喘息时间的影响 注与正常对照组相比:**P < 0. 01，*P < 0. 05。实验7灵丹菌质抗氧化能力测评1.灵丹菌质抗氧化功效检测样品制备
灵丹发酵产物粉碎后过40目筛，取粉末5g溶于IOOml水，60°C超声提取Ih后，3000g离心lOmin，过滤后收集滤液定容为5ml，即浓度为lg/ml，然后稀释成40-400mg/ml。2.清除· OH自由基能力的测定在试管中分别加入ImlpH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液(0. 05mol/L),0. 4ml 6mmol/ L的邻二氮菲溶液(无水乙醇配制)，充分混勻后，加入0.4ml 6mmol/L FeS04溶液，加入后 立即混勻。然后向其中加入0. 5ml 一定浓度的样品溶液，混勻，再加入0. 5ml 0. 的H2O2， 最后补充体积至4ml，同时做空白试验。另再做损伤和未损伤管。其中损伤管中加入0.5ml 0. 的H2O2，未损伤管不加H2O2，最后补充各体积至4ml。于37°C下保温lh，测在536nm下 的吸光度，重复两次，计算平均值。羟自由基清除率=(Ai-AV(Atl-A) X 100%。A为不加样品时溶液的吸光值，A0为不加样和H2O2时溶液的吸光值。注意浓度控 制，先实验3-4倍浓度，再逐步稀释至最适浓度，控制温度。3.提取物清除DPPH自由基能力的测定取待测样品Iml和事先用95%乙醇配好的0. 4mg/ml的DPPH自由基试剂Iml于 IOml的玻璃试管中。样品加入后振动30s，37°C保温IOmin后517nm波长下测定其吸光值 (Ai)。同时测定不加DPPH自由基试剂的样品空白吸光值(Aj)和加DPPH自由基试剂但不加 样品的吸光值(Atl),如下表8所示。表 8
样品对DPPH 的清除百分比 I = 1-[ (Ai-Aj)/A0] X100%,实验结果通过清除率推算出样品的EC5tlt5在清除· OH、DPPH自由基方面，灵丹菌 质组的EC5tl均低于灵芝菌质组，且随着丹参在培养基中比例增加，其抗氧化效果随之增强， 这说明灵丹菌质有较好的自由基清除能力，结果如表9所示。表9灵丹菌质清除· OH、DPPH自由基的EC5tl试验结果 灵丹菌质组(50%)317.44±3.28**195.29±4.78" 灵丹菌质组(70%)288.19±5.41**65.66士7.37” 灵芝菌质组431.25士6.43251.87±12.04 灵芝/丹参混合药物组348.55土 9.12'213.47±8.2广注与灵芝菌质组相比**P < 0. 01，*P < 0. 05。实验8灵丹菌质对脑缺血小鼠脑组织MDA含量、SOD活性的影响实验动物KM种小鼠90只，体重20 士 2g。实验方法将小鼠分为模型组、假手术组、灵丹菌质组10%、30%、50%、70%、灵 芝菌质组、灵芝/丹参混合药物组、和丹参药材组，每组各10只，雌雄各半，每日灌胃给药， 模型组每日给予等量水灌胃，连续7d。①小鼠脑缺血后脑组织勻浆液的制备末次给药后lh，假手术组分离两侧颈总动脉但不结扎，其余各组在结扎两侧颈总动脉3h后断头，小心 剥取两侧大脑半球，称重，按重量体积=1 9的比例加入预冷的生理盐水(4°C )，用组 织勻浆器充分勻浆，将勻浆液以1500g，4°C离心12min，取上清液，用考马斯亮蓝法测定总 蛋白含量，-70°C冻存备用。②脑组织SOD活性、MDA含量的测定i.取大脑组织勻浆 液，采用黄嘌呤氧化酶法(SOD检测试剂盒)，于波长550nm处分别测定各组小鼠大脑组织勻 浆液的吸光度值。ii.取大脑组织勻浆液，采用TBA比色法(MDA检测试剂盒)，于波长 532nm处分别测定各组小鼠大脑组织勻浆液的吸光度值。实验结果显示，与假手术组比较，模型组小鼠脑缺血后脑中MDA含量明显增高， SOD活性明显降低；与模型组比较，灵丹菌质能显著降低小鼠脑缺血后脑中MDA含量，并显 著提高脑组织SOD活性(P < 0. 05)。试验结果如表10所示。表10灵丹菌质对脑缺血小鼠脑组织MDA含量、SOD活性的影响
p < 0. 01。
注与假手术组比较，**p < 0. 01 ；与模型组比较，Ap < 0. 05，AA 实验9灵丹菌质的安全性性试验
1.给小鼠灌食最大给药浓度和剂量都不致死，不能测出灵丹菌质的半数致死量。
2.用灵丹菌质进行了Ames试验、小鼠骨髓微核试验和染色体畸变试验，证明该物 质无致畸和致突作用。3.用灵丹菌质进行30天喂养实验研究，证明该物质不会对实验动物引起有害效 应，无毒副作用。安全性实验结果证明本发明的灵芝/丹参菌质混合物安全无毒。上述各项试验结果充分表明，本发明的灵芝/丹参全性菌质固体发酵混合物不仅 无明显毒副作用，而且在活血化瘀方面，具有明显优于单一的灵芝、丹参药物原料、也优于 其常规方式混合(复方)药物的生物学功能，其药理学功能随丹参在培养基质中的含量增 加而增加，且原料来源丰富，提取和制备方法并无特殊要求和限制。在上述研究实验的基础上，进一步可供参考的具体实施方式
还可包括下述各实施 例，其中的操作方式和条件可参考上述内容。实施例1灵芝/丹参发酵菌质混合物的固体发酵培养基及培养条件培养基组成玉米芯5%，麦麸20%，谷草5%，丹参70%。固体发酵条件常温(15 25°C)发酵30天。
实施例2灵芝/丹参发酵菌质混合物的固体发酵培养基及培养条件培养基组成玉米芯25%，麦麸25%，丹参50%。固体发酵条件同上例。实施例3灵芝/丹参发酵菌质混合物的固体发酵培养基及培养条件培养基组成玉米芯45 %，麦麸25 %，丹参30 %。固体发酵条件同上例。实施例4灵芝/丹参发酵菌质混合物的固体发酵培养基及培养条件培养基组成玉米芯70 %，麦麸10 %，棉籽壳10 %， 丹参10 %。固体发酵条件同上例。实施例5灵芝/丹参发酵菌质混合物的固体发酵培养基及培养条件培养基组成玉米芯2 %，麦麸24 %，玉米粉2 %，蔗糖1 %，食用级石膏粉1%，丹参70%。固体发酵条件常温(15 25°C )发酵45天。实施例6灵芝/丹参发酵菌质混合物的固体发酵培养基及培养条件培养基组成玉米芯5 %，锯木屑25 %，丹参70 %。固体发酵条件常温(15 25°C )发酵50天。以下是本发明发酵菌质混合物的应用实例。实施例7灵丹菌质口服液原料由上述方式得到的固体发酵终产物灵芝/丹参菌质混合物Ikg制备方法将所说原料经水提醇沉后得到的提取物浸膏与口服液中的常规辅料 (蜂蜜、单糖浆、山梨酸、苯甲酸等)混合均勻后，分装灭菌，制成灵丹菌质口服液。实施例8灵丹菌质颗粒原料由上述方式得到的固体发酵终产物灵芝/丹参菌质混合物Ikg制备方法将原料粉碎后或经水提醇沉后得到的提取物浸膏与口服固体颗粒制剂 的常规辅料(水溶性赋形剂、乙醇等)通过制粒、干燥、整粒、包装等过程，制成灵丹菌质颗 粒。实施例9灵丹菌质片剂原料由上述方式得到的固体发酵终产物灵芝/丹参菌质混合物100g，淀粉60g，乳糖30g，硬酯酸镁10g。制备方法将灵芝/丹参菌质混合物粉碎或水提醇沉后得到的提取物浸膏、淀粉、 乳糖混勻并按常规方法制粒后，加入硬酯酸镁整粒，压片，共制成1000片，得到每片含灵芝/丹参菌质混合物IOOmg的片剂。实施例10灵丹面膜原料由上述方式得到的固体发酵终产物灵芝/丹参菌质混合物100g。制备方法将灵芝/丹参菌质混合物干燥、粉碎、过120目筛，灭菌、包装制得粉状 面膜。使用时用IOOg 150g水或蜂蜜或蛋清或牛奶调成糊状，然后按面膜的使用方法往 脸部均勻涂抹，半小时后用清水洗净。实施例11灵丹面膜贴原料由上述方式得到的固体发酵终产物灵芝/丹参菌质混合物100g。制备方法将灵芝/丹参菌质混合物干燥、粉碎、过60目筛。加入10倍量纯水浸 泡半小时，加热至沸后，维持沸腾半小时，精滤药液。煮提三次，合并提取液备用。加热浓缩 提取液至浸膏状，边搅拌边加入90 %以上浓度乙醇，调节溶液含醇量为75 %，停止搅拌，加 盖密闭，静置24小时，使沉淀完全，滤取上清液。在上清液中加入总体积3% 5%的活性 炭，加热回流脱色30分钟，滤净活性炭。将脱色 后的溶液回收乙醇至无醇味即得灵丹提取 液。先将美白剂(如熊果苷或曲酸或L-抗坏血酸磷酸镁)2份和保湿剂(如芦荟提取 液或卵磷脂或透明质酸或烷基葡糖苷)混勻，再加入8份灵丹提取液。用无纺布制成的面 膜巾在最后混勻的溶液中浸泡30min，然后真空封装，灭菌即得。
权利要求
含有灵芝的发酵菌质混合物，由灵芝在至少含有真菌生长所需的碳源和氮源的营养性培养基质中经固体发酵后得到的包含菌丝及培养基质成分在内的菌质混合物，其特征是培养基质中含有药用原料丹参。
2.如权利要求1所述的含有灵芝的发酵菌质混合物，其特征是所说的药用原料丹参的 量为培养基质重量的10% 70%。
3.如权利要求2所述的含有灵芝的发酵菌质混合物，其特征是所说的药用原料丹参的 量为培养基质重量的70%。
4.如权利要求1至3之一所述的含有灵芝的发酵菌质混合物，其特征是所说培养基质 的重量比例组成为玉米芯5% 80%，麦麸10% 25%，其余为药用原料丹参。
5.如权利要求4所述的含有灵芝的发酵菌质混合物，其特征是所说培养基质的重量比 例组成为玉米芯5%，麦麸25%，其余为药用原料丹参。
6.含有灵芝的发酵菌质混合物的制备方法，其特征是以至少含有真菌生长所需的碳源 和氮源营养成分与药用原料丹参粉末的均勻混合物为培养基质，在灵芝的适宜栽培条件下 生长和固体发酵30 50天后，收集包含菌丝及培养基质成分在内的菌质混合物。
7.如权利要求6的制备方法，其特征是所说的固体发酵时间为35 40天。
8.含有灵芝的发酵菌质混合物在制药中的应用，以权利要求1所说的含有灵芝的发酵 菌质混合物或其提取物为有效药用成分，与药学中可以接受的辅助成分共同组成具有活血 化瘀、抗氧化功效的药物。
9.含有灵芝的发酵菌质混合物在制药中的应用，以权利要求1所说的含有灵芝的发 酵菌质混合物或其提取物为添加成分，与食品中可以接受的辅助成分共同组成具有活血化 瘀、抗氧化功效的功能性食品。
10.含有灵芝的发酵菌质混合物在制备化妆品中的应用，以权利要求1所说的含有灵 芝的发酵菌质混合物或其提取物为主要成分，与化妆品中可以接受的其它辅助和/或添加 剂共同组成具有抗氧化作用的化妆品。
全文摘要
含有灵芝的发酵菌质混合物，将灵芝在至少含有真菌生长所需的碳源和氮源的营养性培养基质中经固体发酵方式发酵后，得到包含菌丝及培养基质成分在内的菌质混合物，其中在培养基质中混合有药用原料丹参。通过包括药用原料成分对灵芝菌丝体生长代谢过程的影响和灵芝真菌酶系对药材成分改造在内的双向性固体发酵后，得到兼具丹参药材和灵芝真菌功效的菌质发酵终产物，可应用于制备具有活血化瘀和抗氧化功效的药物和/或化妆品。
文档编号A61P39/06GK101856373SQ200910058889
公开日2010年10月13日 申请日期2009年4月10日 优先权日2009年4月10日
发明者余梦瑶, 曾瑾, 江南, 罗霞, 许晓燕, 郑林用 申请人:德阳市食用菌专家大院