专利名称：黄连素在治疗乙肝病毒感染药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种黄连素在制备治疗或预防乙肝病毒 感染药物中的应用。
背景技术：
HBV是嗜肝DNA病毒科(Hepadanaviridae)的原型病毒。HBV基因组是 一个长约3200对碱基(kb)的不完全双链环DNA。它具有下述特点①HBV DNA 负链中各个ORF区均为病毒抗原蛋白编码序列，基因组中的顺式调控元件均处 于各编码区内，包括了4个启动子及2个增强子，这4个启动子分别对基因组C 及PreC、 L蛋白、M蛋白、S蛋白、及X蛋白的mRNA起调控作用。囊膜蛋白 S是S基因编码的蛋白(乙型肝炎表面抗原，HBsAg)。 HBsAg与病毒吸附到肝 细胞表面受体有关，可以通过遗传重组来改变HBV的宿主范围。HBsAg在血清 中含量最高，可刺激机体产生中和抗体。病毒核心蛋白PreC蛋白及e抗原HBeAg 是HBV核心区基因编码的两种蛋白。虽然HBeAg不是HBV感染必需的蛋白， 但近年的研究结果说明HBc蛋白协同HBx蛋白在HCC发生发展中也起了一定 的作用。P蛋白为一个含多个功能区的碱性蛋白——类DNA多聚酶蛋白，也是 HBV的一种重要结构蛋白。病毒DNA多聚酶为内源性的，可以修补病毒基因组 中短链及缺口，形成完整的双链的DNA。 HBV复制需要逆转录过程，其DNA 多聚酶具有逆转录活性。HBx蛋白是哺乳动物嗜肝DNA病毒HBV基因组最小 阅读框编码，由145 154个氨基酸组成，是病毒建立感染所必需的蛋白。也有 试验证据证明HBx蛋白参与了 HBV病毒复制。②HBV基因组结构紧密，编码 基因间相互重叠，其中P基因完全与S及PreS基因重叠，X基因与其部分重叠， 使HBV基因组能充分利用其有限的长度，成为编码效率最高的病毒之一。③不同毒株间的HBV基因组存在多态性，是变异频率较高的DNA病毒。经复制中 间体RNA反转录的复制特征是嗜肝DNA病毒行为的生物学基础。
HBV复制最主要的特点是要经过一个逆转录过程。HBV基因组的复制起始 于共价闭合环状DNA (covalently closed circular DNA， cccDNA)转录形成前基 因组RNA (pregenome RNA);再经前基因组RNA逆转录合成负链DNA，并伴 随cccDNA的扩增；然后合成正链DNA。新生成的双链DNA又可成熟为cccDNA， 再参与基因组的复制。
由于HBV的复制要利用自身的DNA聚合酶经过前基因组RNA的反转录过 程，而病毒DNA聚合酶缺乏校对功能，因此，HBV的变异频率比其它DNA病毒 要高出大约4个数量级，似乎更接近于RNA病毒。
目前对于HBV的基础研究主要是利用细胞培养模型或动物感染模型。研究 HBV的常用细胞模型主要有两类原代肝细胞系、人肝癌细胞系。HepG221.5 细胞株是应用最广泛的HBV细胞模型，该细胞株已被广泛应用于抗HBV药物的 体外筛选。
据统计，全世界乙肝病毒感染者累计达20亿，目前约有3.5亿乙肝病毒携 带者，每年被感染的人数达5000万，死于乙肝病毒感染相关疾病(肝纤维化或 肝癌)的人数约100万。我国乙肝病毒携带者为1.5亿，慢性肝炎患者有3400 万，每年死于乙肝病毒感染相关疾病的人数有27万。尽管我国实施了乙肝预防 性疫苗接种，但由于庞大的病毒携带者、免疫耐受性、抗药性、感染者是终身病 毒传染源、病毒通过母婴传播等原因，使得乙肝防治形势严峻。乙肝依然是今后 相当长一段时期内危害我国人口健康的主要传染病之一。
因此发现新的抗乙肝病毒药物也是当前乙型肝炎治疗中研究一个重点。本发 明基于上述背景，进行了大范围的药物筛选，最终发现黄连素具有良好的抗乙肝 病毒复制的作用，可以作为一种新的抗乙肝病毒药物而应用于临床。
黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.、三角叶黄连Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao或云连Coptis teeta Wall.的干燥根茎。具有清热燥湿，泻火解毒等 功效。用于湿热痞满、呕吐吞酸、泻痢、黄疸、高热神昏、心火亢盛、心烦不寐、血热吐衄、
目赤、牙痛、消渴、痈肿疔疮；外治湿疹、湿疮、耳道流脓。黄连素是一种重要的生物碱， 是我国应用很久的中药。可从黄连、黄柏、三颗针等植物中提取。它具有显著的抑菌作用。 近期文献报道生物碱类化合物具有抗流感病毒的功效，黄连素为黄连的主要有效成分，目前还未有其抗乙肝病毒作用的报道，因此本发明首次发现了黄连素具有良好的抗乙肝病毒活 性，表明其具有很好的开发利用前景。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种黄连素在作为制备治疗或预防乙肝病毒感 染药物中应用的新用途。从细胞和分子层面对黄连素抗乙肝病毒作用进行了评 价，为其进一步开发应用奠定良好的基础。
为了实现上述任务，本发明采用以下技术方案
由于黄连素具有一定的抗感染和炎症作用，同时在临床上用于肠炎性疾病有 很好的应用基础，而病毒所引起的传染性疾病发生过程中常伴随有炎症反应，故 该药物在治疗病毒性疾病的同时对病毒所引起的炎症等症状均有较好的缓解和 辅助治疗作用。
目前黄连素主要是以片剂用于肠炎性疾病，而采用常用药剂学技术，可以将
黄连素制成薄膜包衣片、胶囊剂、颗粒剂、分散剂，口服。在治疗乙肝病毒感染
及其并发症的药物中可加入该药成分或在治疗过程中联合用药使用该药。
利用目前已经公认的研究HBV复制的细胞模型HepG2.2.15细胞(购买于中
国典型微生物保藏中心)为研究对象，结合相关肝细胞，如HepG2 (购买于中
国典型微生物保藏中心)等细胞，采用转染等方法来开展药物筛选和功能评价。
1)首先进行初步评价。采用ELISA检测乙肝病毒复制过程中的2个抗原
——HBeAg和HBsAg表达量的多少来进行药物的初步筛选；
表1药物对HepG2.2.15细胞上清液中HBeAg和HBsAg表达量
GroupHBeAgHBsAg
Berberine (5ug/ml)0. 37±0.0110. 1±0. 008
Berberine((50ug/ml)0. 271±0. 090. 114±0. 012
negative control0. 019±0. 0100. 1±0. 009
positive control0. 7815±0. 0251. 745±0. 103
blank control0. 059±0. 00190. 015±0. 001
cell group0. 593±0. 0260. 2275±0. 017
结果显示药物对HepG2.2.15细胞上清液中HBeAg和HBsAg表达量有明显 抑制作用，与细胞对照组比较有明显的统计学差异(p<0.05)。
2)在初步筛选之后对有效药物重复筛选，先检测HBeAg HBsAg表达量， 再采用real—time PCR检测药物对乙肝病毒复制中病毒cccDNA的影响。表2黄连素对乙肝病毒复制中国病毒cccDNA表达量的影响
浓度_病毒滴度(cps/ml) mean土SD
12ug/ml 110608±9218
60ug/ml 41560. 91 ±620
300ug/ml 6364. 21 ±351
8ug/ml 1678. 39 ±108
40ug/tnl 1459. 58 ±166. 9
200ug/ml 522. 023 ±258. 5
Untreated (control) 444193±4570
可以看出黄连素对病毒滴度有明显的抑制作用，同时药物作用与浓度有依赖 性，表现在随着药物浓度的增加，其对病毒滴度的抑制作用越明显，与对照组比 较有显著性差异(p<0.05)。
3)选择药物最大无细胞毒性剂量进行药物作用机制的探讨
a) 药物有效性的再次确认，使用real-time PCR检测药物对乙肝病毒复制中 病毒量cccDNA的影响，同时使用Western Blot来检测病毒的复制(HBcAg含量 的变化)。
b) 考察药物对HBV病毒复制启动子的影响，采用瞬时转染(transient transfection)的方法，将带有荧光报告基因的HBV4个复制启动子(S1P、 S2P、 CP、 HBX)(病毒学国家重点实验室吴建国教授课题组构建，分别把启动子连接 到带有GFP报告基因的PGL-3载体上，这些质粒都是氨苄抗性，参考文献 Naazneen Moolla,Michael Kew and Patrick Arbuthnot. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription, Journal of Viral Hepatitis, 2002, 9, 323—331)禾口全长 启动子FP转染到己经单层贴壁的HepG2细胞中，转染8h后更换成含药培养基， 继续培养36h后，裂解细胞，测定荧光值Guciferase activity),进行统计分析， 找出药物对相关启动子的影响情况。(病毒学国家重点实验室吴建国教授课题组 构建，分别把启动子连接到带有GFP报告基因的PGL-3载体上，这些质粒都是 氨节抗性，参考文献Naazneen Moolla,Michael Kew and Patrick Arbuthnot. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription, Journal of Viral Hepatitis, 2002, 9， 323-331)。
c)药物对HBV复制过程中相关信号通路的影响。
继续深入开展有效药物的作用机制研究——一方面，从信号通路角度进行药 物对相关信号通路启动子水平的影响来探讨药物抗HBV病毒复制与信号通路之间的相关性。另一方面，根据启动子筛选结果，寻找影响不同启动子表达的上游 基因和蛋白。对药物影响比较明显的启动子进行截短、设计引物、鉴定、克隆等 方法构建不同大小的启动子片段，然后筛选药物可能的作用区域和位点。如药物 对HBV复制子HBX有明显的下调抑制作用，可以釆用RT-PCR、 EMSA等方法 继续研究药物是否对HBX的转入调控因子肝细胞核因子HNF-4amRNA和蛋白 表达的作用情况；同时借鉴目前干扰素在治疗乙肝病毒复制过程中研究比较成熟 的结果，从a-干扰素抑制病毒复制过程中调节的一些下游蛋白或基因的角度入 手，考察不同有效药物对这些蛋白表达水平的影响，与此同时，通过査阅大量文 献，可以从对HBV病毒复制有明确作用的蛋白入手，采用RT-PCR的方法初步 评价有效药物的影响，然后采用Western Blot的方法比较药物对其蛋白表达差异 的影响。
相对于目前的其他抗乙肝病毒药物而言，本发明与现有技术相比具有以下优 点和效果1、该药物是一种纯天然药物，具有毒副作用小等优点。2、可口服给 药，使用方便。3、兼有抗炎作用，故能提高治疗过程中的耐受性，提高治疗质 量和给药依从性，减轻治疗痛苦。4、药物资源丰富，降低了药物成本，并可根 据药物不同作用目的制备成不同给药剂型。
图l黄连素对HepG2细胞毒性作用，不同浓度黄连素对HepG2细胞毒性，结果 显示大范围浓度药物无明显细胞毒性。
图2黄连素对HepG2 2.15细胞上清液中HBeAg产量的影响，结果显示黄连素 能明显降低HBeAg产量。
图3黄连素对HepG2 2.15细胞上清液中HBsAg产量的影响，结果显示黄连素 能明显降低HBsAg产量。
图4 real-time PCR检测不同药物对HepG2 2.15细胞上清液中cccDNA表达量的 影响，结果显示黄连素能明显降低cccDNA产量。
图5A黄连素对一些细胞信号通路的影响，将不同信号通路的质粒转入到HepG2 细胞中，转染6小时后，加入药物，药物作用48小时后检测药物对这些信号通 路的影响。图5B黄连素对一些细胞信号通路的影响，将不同信号通路的质粒转入到HepG2 细胞中，转染6小时后，加入药物，药物作用48小时后检测药物对这些信号通
路的影响。
图6黄连素对HBV启动子影响，将不同启动子质粒转入到HepG2细胞中，转 染6小时后，加入药物，药物作用48小时后检测药物对这些信号通路的影响。 图7转染过程示意图，细胞采用脂质体瞬时转染过程图。
具体实施例方式
实施例1:黄连素对HepG2细胞和HepG2 2.15细胞的细胞毒性
用胰蛋白酶将生长良好的HepG2细胞和HepG2 2.15细胞分散成单个细胞悬 液，按1 X 105/ml浓度分种于96孔板，每孔O.lml，置37°C、 5%(302培养箱中 培养24h。待细胞长成单层后，弃培养液上清，换含不同浓度的含药维持液，每 个浓度设3个复孔，并设正常细胞对照。继续培养48h，弃培养上清，每孔加入 含100ug/ml的MTT (四甲基偶氮唑盐)不含血清的DMEM培养基100pl，置 C02培养箱中继续培养2 3h后，弃MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液(DMSO: 乙醇体积比为l: 1) IOOW，振荡5 10分钟，在酶标仪570nm波长处读取OD 值，并根据以下公式计算细胞存活率。
细胞存活率(％)=(实验孔OD值/对照组OD值)X100% 结果显示药物在0.32ug/ml—1000ug/ml的浓度范围内没有明显的细胞毒性。 实施例2:黄连素体外对HepG2 2.15细胞中HBsAg和HBeAg的影响
1) 取包被微孔反应条，固定于塑料框架上，加标本50pl/孔，阴、性对照50nl
(或1滴)/孔各两？L,同时留一孔不加作空白对照,随即加入测HBsAg或 HBeAg酶结合物50|il (或一滴)/孔，空白对照不加。
2) 置37t:恒温水浴锅，温浴30min。
3) 小心移去孔内液体，拍干；用蒸馏水将洗涤液作l: 20倍稀释，注满各孔， 停留30s后弃去，如此反复洗涤6次，每次均拍干。尽量避免孔间交叉污染。
4) 加底物液50pl (或一滴)/ L，随即加显色液50^1 (或一滴)/ L， 37。C显色 10min。
5) 每孔加50nl (或一滴)2MH2S04终止液，终止反应。6)立即用450mn波长空白校零点，分别测定阴阳性对照及标本的OD值；当有 异常值出现时，应采用双波长测定，参考波长为650nm。 结果由图2和图3可以看出黄连素对HepG2.2.15细胞上清液中所分泌的
HBeAg和HBsAg的含量有明显的抑制作用(*p<0.05 versus untreated group)。
实施例2:药物对HBV cccDNA表达的影响
采用深圳市PG生物工程股份有限公司生产的HBV核酸扩增荧光定量检测
试剂盒测定HBV的DNA量。
1) 标本的处理
取药物处理组和未加药物处理组小鼠血清lOOpl至0.5ml EP管中，加入 lOOpl DNA提取液1，振荡混匀，13，000rpm离心lOmin，弃上清，再加入 25nl DNA提取液2，振荡混匀，2,000卬m离心10s， 100。C水浴lOmin， 13,000rpm离心10min，上清-70。C保留备用。
2) 扩增前的准备
a)从试剂盒中取出HBV PCR反应液、Taq酶及UNG，室温(25'C左右， 以下相同)融化并振荡混匀，2,000rpm离心10s。反应体系的配制如下 PCR反应液37.6pl， Taq酶O.化L， UNG0.06nl，计算好各试剂的用量， 加入适当体积离心管中，充分混匀，2,000rpm离心10s。
3) 加样
a)样品和阳性工作标准品置室温30min后，2，000rpm离心5min。 PCR反 应管中分别加入处理过的标本、阳性对照和临界阳性对照。将PCR反应 管置于PCR仪，记录样品的排放顺序。
4) 反应条件
a)扩增程序37°C， 5min， 94°C， lmin， 95°C5s， 60°C， 30s， 50个循环， 反应体系为40pl。荧光信号收集设定为Fam荧光素。将阳性工作标准品 设为STAN并输入拷贝数，待测标本设为UNKN，开机扩增。
5) 结果分析
a)取3 — 15个循环的荧光信号作为检测仪进行结果分析时基线(baseline)。 阈值设定(thresghold)为阈值线刚好超过临界阳性对照品扩增曲线(无 规则的噪音线)的最高点，Ct值-40.0为准。b)检测药物在体外细胞实验过程中对HBV病毒复制影响的方法和过程类 似小鼠血清中HBV DNA的检测方法。
结果显示黄连素在不同给药浓度下均能明显抑制病毒的复制，与没有任何药 物处理组比较具有明显的差异(图4) (p<0.05)。 实施例3:药物对一些经典信号通路的影响
1、 脂质体转染法
带有负电荷的DNA与阳离子型化合物带有正电荷的末端相结合，然后DNA 结合型脂质和细胞膜相结合，使DNA进入细胞内部。脂质体转染法对有些细胞 能够产生极高的转染效率，本实验中所用到的肝细胞HepG2 (购买于中国典型 微生物保藏中心)等经过实验室长期转染实验证实采用脂质体转染较好。具体方 法以转染操作以24孔板为例。转染全过程必须严格无菌操作。
1) 在转染前一天将待转染细胞接种于24孔板中，37'C培养。转染前的细胞密 度以40-60%为准。
2) 准备以下溶液
a) 稀释2-20pl SofastTM转染试剂(购自上海太阳马公司)于100pl无血清、无 抗菌素的RIPM培养基。混匀后室温静置3min。
b) 稀释1 一2吗待转染质粒DNA于100^1无血清、无抗菌素的RIPM培养基。 混匀后室温静置。
3) 混合a)、 b)两种溶液，室温静置20min。然后再加入800^1无血清、无抗菌 素的DMEM培养基，振荡混匀(溶液可能会呈雾状浑浊，但不影响转染)。
4) 弃掉培养板中的旧培养基，用2ml无血清、无抗菌素的DMEM培养基清洗 细胞2次。
5) 加以上Sofast，转染试剂，一DNA混合物lml覆盖细胞。
6) 37。C温育6h。
7) 加入正常生长培养基，37'C培养。
8) 48-72h后检测。
2、 荧光素酶活性的测定
1)裂解细胞加入报告基因细胞裂解液，充分裂解细胞。对于贴壁细胞吸净细 胞培养液后可以直接加入裂解液；对于悬浮细胞，离心去上清后再加入裂解液。细胞裂解后可以立即测定荧光素酶，也可以先冻存，待以后再测定。冻 存的样品需融解，并达到室温后才可以开始测定；
2) 融解荧光素酶检测试剂，并达到室温；
3) 按仪器操作说明书开启荧光测定仪，将测定间隔设为2s，测定时间设为10s;
4) 每个样品测定时取样品30-100|il (如果样品量足够，请加lO(Hil)，荧光素酶
检测试剂100W，混合后测定。以报告基因细胞裂解液为空白对照。 结果见图5A和图5B，黄连素对AP-1有明显的上调作用，而对CHOP有
明显的下调作用(与没有药物处理组比较，p<0.05)，表明黄连素抑制乙肝病
毒的复制可能与其影响这两个细胞信号通路相关，相关机制正在进一步研究中。
实施例4:黄连素对HBV启动子的影响
采用上述脂质体转染方法，将本实验室构建的HBV启动子质粒(病毒学国 家重点实验室吴建国教授课题组构建，分别把启动子连接到带有GFP报告基因 的PGL-3载体上，这些质粒都是氨节抗性，参考文献Naazneen Moolla，Michael Kew and Patrick Arbuthnot. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription, Journal of Viral Hepatitis, 2002， 9, 323-331 )转入到HepG2细胞中，然后加入药物， 在48h后检测药物对启动子表达的影响。
由图6可以看出黄连素对复制启动子SIP有明显的抑制下调作用，表明黄 连素可能通过抑制SIP的表达来抑制HBV病毒的复制。
综合上述细胞模型评价及部分分子生物学实验结果显示，黄连素能够明显抑 制HBV病毒的体外复制，降低病毒产生量。而其对病毒复制的影响可能是通过 复制启动子SIP的抑制而起作用的。从药物对细胞信号通路影响的角度而言， 黄连素抑制乙肝病毒的复制可能与其对AP-1上调和对CHOP下调作用相关。相 关作用机制有待进一步深入研究。
权利要求
1、黄连素在制备治疗乙肝病毒感染药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了黄连素在治疗乙肝病毒感染药物中应用，采用HepG2.2.15细胞模型进行抗乙肝病毒药物体外筛选，通过测定给药后细胞上清液中HBeAg、HBsAg表达量的差异初步筛选药物的作用，并通过研究药物对HepG2.2.15细胞内HBV DNA复制水平(cccDNA)的抑制效果，进一步确认药物的有效性。与此同时，通过考察药物对HBV病毒启动子的活性抑制作用，研究药物在转录水平对乙肝病毒复制的影响，寻找对抗病毒药物敏感的关键的HBV顺式调控元件。在此基础上，分析并验证可能参与药物抑制病毒转录复制的关键的细胞信号转导通路，深入研究药物抗病毒的分子机制，表明该药物具有开发成抗乙肝的有效药物而应用于临床。
文档编号A61K31/4375GK101642454SQ200910063160
公开日2010年2月10日 申请日期2009年7月14日 优先权日2009年7月14日
发明者吴建国, 然 庞, 应 朱, 袁婷婷, 陶君彦 申请人:武汉大学