专利名称：：一种抗肿瘤药物组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种抗肿瘤药物组合物，具体涉及一种主要用于非小细胞肺癌药物治疗联合用药的药物组合物，也可用于黑素瘤、纤维素瘤、血管内皮瘤、肾细胞癌等肿瘤治疗的联合用药，属于医药领域。
背景技术：
：1971年，Folkman首次提出"肿瘤依赖血管生成"的学说，即肿瘤细胞通过血管供应方式获得生长所需的营养，同时血管也为肿瘤转移提供了通道。因此，抑制肿瘤新生血管形成可以成为治疗肿瘤的一种新的方法(HainingTan等，/历oc/ew2008)。血管内皮抑素(Endostatin)是1997年哈佛大学的，Reilly等发现的一种强有力的血管新生抑制因子，其化学本质上是胶原XVIII的一个片段，可以通过抑制肿瘤血管的生成从而抑制肿瘤的生长，而且作为一种内源物质，几乎没有毒副作用和药物抵抗作用(O'ReillyMS等，Ce//1997;88(2),277-285)。ThomasBoehm等人的动物实验表明，血管内皮抑素可以抑制小鼠肺癌，纤维肉瘤和黑色素瘤的生长甚至消除了肿瘤(ThomasBoehm等，Nature,1997;3卯(27)，404-407)。2000年，罗永章教授更改了其血管内皮抑素上的七个氨基酸序列，使其结构更加稳定，使其成为临床药物成为可能。这种重组血管内皮抑素(即恩度)己开发为一种新的抗肿瘤药物，正处于临床II期试验阶段，但是作为一种蛋白质药物，其结构的不稳定性严重影响了其疗效。人体生理环境中的一些不稳定因素(如局部过酸，尿素浓度增加等)会造成血管内皮抑素的变性及聚集，而影响其生物功能。由于其结构的不稳定性和较短的半衰期，需要较高的剂量才能达到和维持临床疗效，且价格昂贵，这些都限制了血管内皮抑素的大规模临床应用。设法缓解血管内皮抑素的变性反应，增强其结构稳定性并提高其临床疗效具有十分重要的意义。
发明内容本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种抗肿瘤药物组合物，该组合物配方合理，体内稳定性高，疗效显著。实现本发明目的的技术方案是一种抗肿瘤药物组合物，该组合物是将4080份规格为5mg/3ml的恩度注射液和20~60份甘油混匀，于低温离心机中在4'C室温条件下以1000~5000转/秒充分离心，取上清液所得到，该组合物pH值为5.5±0.5。所述肿瘤为非小细胞肺癌、肾细胞癌、黑素瘤、纤维素瘤和血管内皮瘤。重组人血管内皮抑素是一种球蛋白，它的二级结构中有两个a螺旋结构，而且有两对二硫键，这两对二硫键对稳定它的空间构象起着至关重要的作用。本发明通过研究发现甘油能够保护重组人血管内皮抑素蛋白的二级结构和分子构象，从而增强其稳定性、保护其生物学活性，此外，甘油作为一种多元醇并不影响溶液的pH值和介电常数。综上所述，本发明与现有技术相比，具有以下有益效果1.本发明的抗肿瘤药物组合物能有效地提高有效成分的稳定性，使之能在体内复杂环境下仍然具有生物学活性。通过荧光淬灭光谱分析和圆二色光谱分析(图l和图2)，抗肿瘤组合物与恩度相比，能在更酸的环境下保护有效成分蛋白的二级结构和分子构象。通过流式细胞仪分析，抗肿瘤药物组合物比恩度能在更酸的条件下保护有效成分蛋白的生物学活性。2.本发明的药物组合物能有效提高药物的抗肿瘤效应。在动物实验中，注射抗肿瘤药物组合物组和单纯恩度组的荷瘤鼠的肿瘤体积与对照组相比都有显著降低；抗肿瘤药物组合物组和单纯恩度组相比，给药21天后肿瘤体积减小有显著性差异(P<0.05)，说明本发明药物组合物能更有效的减小荷瘤鼠的肿瘤体积。图l-A为恩度的有效成分蛋白的酸滴定荧光光谱图，其中，曲线1~8分别代表pH浓度为l.O、1.5、2.0、2.5、3.5、4.0、4.5、5.5时所得光谱;图l-B为实施例2抗肿瘤药物组合物的有效成分蛋白的酸滴定荧光光谱图，其中，曲线18分别代表pH浓度为1.0、1.5、2.0、2.5、3.5、4.0、4.5、5.5时所得光谱；图l-C为实施例3抗肿瘤药物组合物的有效成分蛋白的酸滴定荧光光谱图，其中，曲线17分别代表pH浓度为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、5.5时所得光谱；图l-D为恩度与实施例2抗肿瘤药物组合物的参数A对比分析图，参数A代表365tim处的荧光强度与320nm处的荧光强度的比值(其中pH5.5处恩度的参数A的值设定为l)，其值能反映蛋白的构象变化程度。图2-A为恩度的有效成分蛋白的酸滴定圆二色光谱图，其中，曲线110分别4代表pH浓度为l.O、1.5、2.0、2.5、3,0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5时所得光谱;图2-B为实施例2抗肿瘤药物组合物的有效成分蛋白的酸滴定圆二色光谱图，其中，曲线110分别代表pH浓度为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5时所得光谱；图2-C为实施例3抗肿瘤药物组合物的有效成分蛋白的酸滴定圆二色光谱图，其中，曲线110分别代表pH浓度为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5时所得光谱；图2-D为恩度与实施例2抗肿瘤药物组合物的酸滴定圆二色光谱曲线峰值参数对比图3-A为恩度对血管内皮细胞凋亡率的影响结果图3-B为实施例2抗肿瘤药物组合物对血管内皮细胞凋亡率的影响结果图；图3-C为实施例3抗肿瘤药物组合物对血管内皮细胞凋亡率的影响结果图。具体实施例方式为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。以下实施例和实验步骤中采用恩度注射液的规格均为5mg/3ml，甘油型号为SAK33-GA-99.5，含量为99.5%以上。实施例1取甘油1.6ml于离心管内，吸取0.4ml恩度注射液加入甘油中，反复抽吸十次混匀，于4。C低温离心机中以2000转/秒离心IO分钟，取上清液，即得到抗肿瘤药物组合物。实施例2~5的制备方法均与实施例1相似，是将恩度注射液与甘油按比例(其体积配比用量见表1)混匀后，于低温离心机中在4。C室温条件下以1000~5000转/秒充分离心，取上清液即得到抗肿瘤药物组合物。表l.实施例2~5中各组分体积配比<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>采用实施例2和3制备的抗肿瘤药物组合物进行如下实验1.抗肿瘤药物组合物活性蛋白结构变化将恩度注射液(以下均简称为恩度)和实施例2、3制备的抗肿瘤药物组合物加入pH为l.O、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的缓冲液中,有效蛋白的终浓度为0.6pM，在24'C条件下作用2小时以上，再使用荧光光谱分析仪测定了不同pH条件下恩度中活性蛋白结构和抗肿瘤药物组合物活性蛋白结构变化，结果见图1-A、l-B、l-C和l-D。另外还使用了远紫外圆二色光谱法测定了不同pH条件下恩度和抗肿瘤药物组合物中活性蛋白结构变化，使用的有效蛋白终浓度均为2.3pM，结果见图2-A、2-B、2-C和2-D。从上述荧光光谱中可以发现与恩度相比，抗肿瘤药物组合物的有效成分蛋白能够在更低的pH环境下维持其空间构象。从上述圆二色光谱中可以发现抗肿瘤药物组合物比恩度能在更低的pH环境中维持有效成分蛋白的二级结构，以上分析从不同方面均说明抗肿瘤药物组合物比恩度具有更好的稳定性。2.抗肿瘤药物组合物对血管内皮细胞增殖的影响常规培养血管内皮细胞(ECV304)，分别用有效成分浓度为1、6、11^M的恩度和有效成分浓度为l、6、11^M的实施例2所得抗肿瘤药物组合物处理，用四甲基偶氮唑盐(MTT)作用，用酶标仪分析细胞增殖的抑制率，其结果见表2(组l、2、3对应的有效成分浓度分别为1、6、llpM)。表2.抗肿瘤药物组合物对血管内皮细胞增殖的影响(n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>抗肿瘤药物组合物和恩度的作用机制主要是通过抑制形成血管的内皮细胞增殖迁移来达到抑制肿瘤新生血管的生成，阻断肿瘤细胞的营养供给，从而达到抑制肿瘤增殖或转移目的。表2中的结果表明，随着浓度的升高，抗肿瘤药物组合物与恩度抑制血管内皮细胞增殖的能力均提高，但在相同浓度条件下，抗肿瘤药物组合物与恩度相比能更有效的抑制血管内皮细胞的增殖(P<0.05)。3.抗肿瘤药物组合物对血管内皮细胞凋亡率的影响常规培养血管内皮细胞(ECV304)，用有效成分浓度为5pM的恩度、5pM实施例2所得抗肿瘤药物组合物和5pM实施例3所得抗肿瘤药物组合物处理，作用24小时后，经过PI单染，用流式细胞仪分析细胞凋亡率，结果见图3-A、3-B和3-C，对应的细胞凋亡率分别为7.0%、14.1%和13.9%。该实验结果表明在相同浓度下抗肿瘤药物组合物比恩度能更有效的抑制血管内皮细胞，说明抗肿瘤药物组合物具有更有效的生物学功能。4.抗肿瘤药物组合物对荷瘤鼠肿瘤大小的影响将非小细胞肺癌细胞株注入黑色Lewis小鼠皮下诱导成瘤，待皮下瘤体积约10mmX10mmX10mm进行实验，分为三组，每组10只。分别按照20mg/kg的剂量注射恩度和实施例2所得抗肿瘤药物组合物，注射部位远离肿瘤形成部位，对照组以同样方法每日注射生理盐水.每日测量肿瘤长度和宽度，连续注射21天。第21天处死小鼠，取下肿瘤，测量肿瘤的体积大小，结果见表3。表3.抗肿瘤药物组合物对荷瘤鼠肿瘤大小的影响(n=10)分组给药前肿瘤体积(mm3)给药21天后肿瘤体积(mm3)单纯恩度组99498抗肿瘤药物组合物组99046生理盐水组(对照)9871680由表3可以看出，与对照组相比，注射抗肿瘤药物组合物组和单纯恩度组的荷瘤鼠的肿瘤体积均有显著降低，抗肿瘤药物组合物组与单纯恩度组相比给药21天后肿瘤体积减小有显著性差异(P<0.05)，以上结果表明抗肿瘤药物组合物能更有效的减小荷瘤鼠的肿瘤体积。综上所述，本发明的抗肿瘤药物组合物能有效的保护有效成分重组人血管内皮抑素的分子结构，并且通过细胞试验和动物实验证实该抗肿瘤药物组合物具有抑制血管内皮细胞的增殖和抑制小鼠体内瘤块的生长，并且比恩度具有更显效的抑瘤功能。权利要求1.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于该组合物是将40～80份规格为5mg/3ml的恩度注射液和20～60份甘油混匀，于低温离心机中在4℃～室温条件下以1000～5000转/秒充分离心，取上清液所得到，该组合物pH值为5.5±0.5。2.根据权利要求1所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于所述肿瘤为非小细胞肺癌、肾细胞癌、黑素瘤、纤维素瘤和血管内皮瘤。全文摘要本发明公开了一种抗肿瘤药物组合物，该组合物是将规格为5mg/3ml的恩度注射液40～80份和甘油20～60份混匀，于低温离心机中在4℃～室温条件下以1000～5000转/秒充分离心，取上清液所得到，该组合物pH值为5.5±0.5。该药物组合物能显著提高有效成分的稳定性和抗肿瘤效应，具有增强药物疗效，减少副作用等优点。文档编号A61K38/17GK101642560SQ200910063690公开日2010年2月10日申请日期2009年8月24日优先权日2009年8月24日发明者纯徐,芳杨,杨瑞莉,肖秀凤,蕾魏申请人:武汉大学