联合利用抗菌肽和超高压制备细菌菌影的方法及应用的制作方法

专利名称：联合利用抗菌肽和超高压制备细菌菌影的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种联合利用抗菌肽和超高压技术制备细菌菌影的方法及应用，属于基因工程领域。
背景技术：
菌影是一种近年在国外开展的新型疫苗和耙向药物载体系统，它是将裂解基因在革兰氏阴性细菌中表达，在细菌细胞膜和胞壁上可形成多个穿膜隧道，在渗透压的作用下使细菌胞内细胞浆和核酸成分降解为小片断后被排出，继而形成一种空的细菌外壳，即为"细菌膜影"。菌影能够有效刺激机体产生特异性和非特异性的免疫应答，包括T细胞的活化和粘膜免疫等，而且既能携带外源抗原，又能同时递送核酸和其他药物，所以它被认为是非常有用的候选疫苗和灭活载体。菌影可以通过发酵而大量生产，加工容易，安全可靠，同时菌影表面存在很多受体，可以用来靶向作用于特异性的细胞和组织。目前，除大肠杆菌外，很多革兰氏阴性菌均能在裂解基因E作用下产
生菌影，如胸膜肺炎放线杆菌，霍乱弧菌、溶血性巴氏杆菌、幽门螺杆菌和迟钝爱德华氏菌等。菌影免疫原性好、佐剂作用明显、还是良好的药物与蛋白的靶向载体，制备方法简单，成本低廉，接种途径多样，使用安全，易于产业化推广，使菌影成为当今疫苗研究的热点，也显示了极具吸引力的应用前景。
抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，分子量在
2000 7000左右，由20 60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。世界上第一个被发现的抗菌肽是1980年由瑞典科学家G.Boman等人经注射阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹产生的具有抗菌活性的多肽，定名为Cecr叩ins。此后数年间，人们相继从细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物乃至人类中发现并分离获得具有抗菌活性的多肽。由于最初人们发现这类活性多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而命名为"antibactetialpepiides，ABP"，
中文译为抗菌肽，其原意为抗细菌肽。随着人们研究工作的深入开展，发现某些抗细菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用，因而对这类活性多肽的命名许多学者倾向于称之为"peptideantibiotics"—多肽抗生素。目前，所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经R益严重地威胁着人们的健康。寻找全新类型的抗生素是解决抗药性问题的一条有效途径。抗菌肽因为抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，而被认为将会在医药工业上有着广阔的应用前景。目前，己有多种多肽抗生素正在进行临床前的可行性研究，其中magainins己经进入三期临床试验阶段。
超高压技术是是一种新型的冷杀菌技术，它的基本原理是将100 1 OOOMPa的压力施加于细菌，改变微生物的细胞形态结构，破坏微生物细胞膜和细胞壁，增加细胞膜的通透性，导致细胞内容物流失，抑制生化反应，阻遏了细胞的新陈代谢过程，使细菌分裂减慢，生长滞后，甚至停止生长，常用于食品的灭菌和保鲜。
目前传统的菌影制备方法存在以下不足菌影的裂解效率一直很难提高，菌体内
含物释放不彻底，菌体灭活不彻底；构建裂解载体费时费力，操作繁复；传统的菌影
制备方法是建立在裂解载体的基础上，制备不同细菌的菌影需要不同的裂解载体，如
果没有相应的载体则无法制备该细菌的菌影。
目前国内外还没有将抗菌肽和超高压技术结合用于制备菌影的报道。发明内容-
本发明公开一种联合利用抗菌肽和超高压制备细菌菌影的方法，提供了一种新的细菌菌影制备方法。
本发明公开了联合利用抗菌肽和超高压制备的细菌菌影，可以作为一种新的候选疫苗使用。
本发明的联合利用抗菌肽和超高压制备细菌菌影的方法，其特征在于联合利用抗菌肽和超高压替代传统方法来制备细菌菌影，提供了一种新的细菌菌影制备方法。本发明的联合利用抗菌肽和超高压制备细菌菌影的方法如下-利用基因工程表达的方法，获得抗菌肽；将细菌菌株培养至对数生长期(OD600为0.4 0.6)时，加入抗菌肽，4"作用过夜或室温作用2 4h;离心收集菌体并用生理盐水重复洗两次，加入生理盐水重悬，进行200 250MPa超高压处理；离心收集菌体并用生理盐水重复洗两次，即制备成细菌菌影，冷冻干燥保存于一2(TC或一8(TC
备用o
本发明的联合利用抗菌肽和超高压制备细菌菌影的应用，包括以下步骤制备细菌菌影，免疫实验动物，可剌激机体产生特异的体液免疫和细胞免疫，与灭活苗相比有相同的保护率，具有良好的免疫效果，可以作为一种新的候选疫苗。
本发明的积极效果在于-传统的菌影制备方法存在以下不足菌影的裂解效率一直很难提高，菌体内含物
释放不充分，菌体灭活不彻底；构建裂解载体费时费力，操作繁复；传统的菌影制备
方法是建立在裂解载体的基础上，制备不同细菌的菌影需要不同的裂解载体，如果没
有相应的载体则无法制备该细菌的菌影。本发明联合利用抗菌肽和超高压制备细菌菌
影，提供了一种新的细菌菌影制备方法，取得了良好的效果，裂解效率高，可达
99.9999999%以上，并且操作简单，可广泛用于细菌的菌影制备；对制备的细菌菌影
进行了应用，具有良好的免疫效果，可以作为一种新的候选疫苗使用。


图1.正常猪胸膜肺炎放线杆菌的TEM照片(13000X);
图2.猪胸膜肺炎放线杆菌菌影的TEM照片(13000X);
图3.正常枯草杆菌的TEM照片(13000X);
图4.枯草杆菌菌影的TEM照片(13000X);
图5.正常大肠杆菌0138的TEM照片(13000X);
图6.大肠杆菌Ou8菌影的TEM照片(13000X);
具体实施例方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。下面用实施例来进一歩说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。实施例1
利用抗菌肽Tachyplesin I制备猪胸膜肺炎放线杆菌的菌影本实施例选用的抗菌肽为Tachyplesin I ;选用的细菌为猪胸膜肺炎放线杆菌(革
兰氏阴性菌)，为本研究室保存。
Tachyplesin I的DNA序列为
aaatggtgct tccgtgtttg ctaccgtggt atctgctacc gtcgttgccg t 51
Tachyplesin I的氨基酸序列为
Lys Trp Cys Phe Arg Val Cys Tyr Arg Gly lie Cys Tyr Arg Arg Cys Arg
1. 抗菌肽的表达
利用酵母表达系统对抗菌肽进行真核表达。
2. 细菌菌影的制备将细菌菌株过夜增菌后，按0.5%转接种于培养基中，37'C振荡培养OD6W)为0.4 0.6时，加入表达的抗菌肽Tachyplesin I至终浓度为3.5ug/mL， 4'C作用过夜或室温作用2 4h;作用结束后，4°C， 5 000 rpm离心10 min，离心收集菌体并用生理盐水重复洗两次，制备成细菌菌影；对处理前后的细菌适当稀释进行活菌计数(CFU，个/ml)，计算裂解率。
3. 菌影的保存
将离心收集菌影细胞弃尽上清，最后溶于适当体积生理盐水，计算菌影浓度，分装于1.5mL疫苗瓶，每瓶800pL左右(含菌影5.0X 10^个/mL)，高度不超过0.5cm，冷冻干燥后保存于一20。C或一8(TC。
实施例2
联合利用抗菌肽和超高压制备猪胸膜肺炎放线杆菌的菌影本实施例选用的抗菌肽为Tachyplesin I ，选用的细菌为猪胸膜肺炎放线杆菌(革
兰氏阴性菌)，为本研究室保存。
Tachyplesin I的DNA序列为
aaatggtgct tccgtgtttg ctaccgtggt atctgctacc gtcgttgccg t 51
Tachyplesin I的氨基酸序列为
Lys Tip Cys Phe Arg Val Cys Tyr Arg Gly He Cys Tyr Arg Arg Cys Arg
1. 抗菌肽的表达
利用酵母表达系统对抗菌肽进行真核表达。
2. 抗菌肽处理细菌
将细菌菌株过夜增菌后，按0.5%转接种于培养基中，37'C振荡培养0D6QG为0.4 0.6时，加入表达的抗菌肽至终浓度为0.35ug/mL，4'C作用过夜或室温作用2 4h;4'C，5 000 rpm离心10 min，离心收集菌体并用生理盐水重复洗两次。对处理前后的细菌适当稀释进行活菌计数(CFU，个/ml)，计算裂解率。
3.超高压处理
将用抗菌肽处理过的菌液装入无菌处理的聚乙烯复合袋中，真空密封，放入超高压装置中；经过200MPa，保压10min，进行超高压处理，离心收集菌体并用生理盐水重复洗两次，制备成细菌菌影；对处理前后的细菌适当稀释进行活菌计数(CFU，个/ml)，计算裂解率。
4. 菌影的保存将离心收集菌影细胞弃尽上清，最后溶于适当体积生理盐水，计算菌影浓度，分装于1.5mL疫苗瓶，每瓶800iaL左右(含菌影5.0X 1(T个/mL)，高度不超过0.5cm，冷冻干燥后保存于一2(TC或一8(TC。
实施例3
联合利用抗菌肽和超高压制备枯草杆菌的菌影
本实施例选用的抗菌肽为Catesbeianin-l，选用的细菌为枯草杆菌(革兰氏阳性菌)，为本研究室保存。
Catesbeianin-l的DNA序列为
atgatgaggg tgatgaggag gaagactaaa gttatttggg aaaaaaagga ctttattgga 60ttatacagta ttgattga 78Catesbeianin-1的氨基酸序列为
Met Met Arg Val Met Arg Arg Lys Thr Lys Val lie Tip Glu Lys LysAsp Phe lie Gly Leu Tyr Ser lie Asp
1. 抗菌肽的表达
利用酵母表达系统对抗菌肽进行真核表达。
2. 抗菌肽处理细菌
将细菌菌株过夜增菌后，按0.5X转接种于培养基中，37。C振荡培养OD6oo为0.4 0.6时，加入表达的抗菌肽至终浓度为0.35ug/mL,4。C作用过夜或室温作用2 4h;4"C，5 000 rpm离心10min，离心收集菌体并用生理盐水重复洗两次。对处理前后的细菌适当稀释进行活菌计数(CFU，个/ml)，计算裂解率。
3.超高压处理
将用抗菌肽处理过的菌液装入无菌处理的聚乙烯复合袋中，真空密封，放入超高压装置中；经过250MPa，保压10min，进行超高压处理，离心收集菌体并用生理盐水重复洗两次，制备成细菌菌影；对处理前后的细菌适当稀释进行活菌计数(CFU，个/ml)，计算裂解率。
4.菌影的保存
将离心收集菌影细胞弃尽上清，最后溶于适当体积生理盐水，计算菌影浓度，分装于1.5mL疫苗瓶，每瓶800pL左右(含菌影5.0X 10"个/mL)，高度不超过0.5cm，冷冻干燥后保存于一20。C或一80。C。
实施例4联合利用抗菌肽和超高压制备大肠杆菌o138的菌影
本实施例选用的抗菌肽为Tachyplesin I，选用的细菌为大肠杆菌0138 (革兰氏 阴性菌)，为本研究室保存。
Tachyplesin I的DNA序列为
aaatggtgct tccgtgtttg ctaccgtggt atctgctacc gtcgttgccg t 51 Tachyplesin I的氨基酸序列为
Lys Tip Cys Phe Arg Val Cys Tyr Arg Gly He Cys Tyr Arg Arg Cys Arg
1. 抗菌肽的表达
利用酵母表达系统对抗菌肽进行真核表达。
2. 抗菌肽处理细菌
将细菌菌株过夜增菌后，按0.5%转接种于培养基中，37'C振荡培养OD6QQ为0.4 0.6时，加入表达的抗菌肽至终浓度为0.35ug/mL，4'C作用过夜或室温作用2 4h;4'C， 5 000 rpm离心10min，离心收集菌体并用生理盐水重复洗两次。对处理前后的细菌 适当稀释进行活菌计数(CFU,个/ml)，计算裂解率。
3.超高压处理
将用抗菌肽处理过的菌液装入无菌处理的聚乙烯复合袋中，真空密封，放入超高 压装置中；经过250MPa，保压10min，进行超高压处理，离心收集菌体并用生理盐 水重复洗两次，制备成细菌菌影；对处理前后的细菌适当稀释进行活菌计数(CFU， 个/ml)，计算裂解率。
4.菌影的保存
将离心收集菌影细胞弃尽上清，最后溶于适当体积生理盐水，计算菌影浓度， 分装于1.5mL疫苗瓶，每瓶800pL左右(含菌影5.0X 10^个/mL)，高度不超过0.5cm， 冷冻干燥后保存于一20。C或一8(TC。
实验例l
细菌菌影的裂解效率及透射电镜(TEM)观察
按实施例1、 2、 3和4制备细菌菌影，测定裂解效率，经测定实施例1的裂解 效率可达99.9999%以上。实施例2、 3和4裂解效率可达99.9999999%以上。由此 可见，联合使用抗菌肽和超高压制备的菌影比单纯使用抗菌肽制备的菌影裂解效率要 高。
按实施例2、 3和4制备细菌菌影，用2.5 %戊二醛固定4 h， 1 %锇酸固定1 h，30 %乙醇脱水10 min， 50 %乙醇脱水15 min， 70 %醋酸铀作用12h， 80 %乙醇脱水 15 min， 95 %乙醇脱水20 min，两次无水乙醇脱水40 min，然后用环氧丙烷脱水30 min， 加入1 : 1的环氧丙烷与环氧树脂作用2 h，加入纯环氧树脂渗透3 h，然后在50 'C下 环氧树脂包埋12h，最后用环氧树脂继续包埋48h。包埋后超薄切片机制成切片，放 入铜网中。切片进行染色，以醋酸铀作用30min，水洗，然后加入柠檬酸铅作用20min， 水洗。于透射电镜(TEM)下观察。
电镜结果见图l一图6，由图可以看出，联合利用抗菌肽和超高压的方法成功制 备了猪胸膜肺炎放线杆菌(革兰氏阴性菌)、枯草杆菌(革兰氏阳性菌)和大肠杆菌 0138 (革兰氏阴性菌)的菌影。
实验例2
细菌菌影的免疫效果评价
1. 细菌菌影的制备
按实施例1制备猪胸膜肺炎放线杆菌的菌影，重悬于适当体积生理盐水，使菌 影浓度为5.0Xl()io个/mL，充分混匀。
2. 甲醛灭活铝佐剂苗的制备
将猪胸膜肺炎放线杆菌接种于培养基中，经37'C培养18-24h后制备成种子菌液， 接种于液体培养基，37t:培养18-24h后取出少量进行活菌计数，其余菌液按0.1%加 入甲醛，37。C灭活24h， 4。C保存备用。使用时5000rpm离心，并用生理盐水洗两次 后，按l: 5比例加入氢氧化铝胶，充分振荡即为甲醛灭活铝佐剂苗。
3. 无菌检验
将所制备猪胸膜肺炎放线杆菌的菌影和甲醛灭活铝佐剂苗随机抽样，接种于LB 平板，37'C培养48h，检査有无细菌生长。
4. 安全性检验
取10只18—22g小鼠，每只腹腔注射细菌菌影，注射剂量约为免疫剂量的10倍， 连续观察7—10d;甲醛灭活铝佐剂苗同上。腹腔注射细菌菌影及甲醛灭活铝佐剂苗后 小鼠无死亡及发病症状，肝脏组织触片镜检无猪胸膜肺炎放线杆菌，表明细菌菌影及 甲醛灭活铝佐剂苗安全合格。
5. 免疫实验
小鼠随机分组，每组20只，接种不同抗原进行免疫，空白对照组免相同剂量生 理盐水，相同条件下分笼饲养，免疫程序见下表。_免疫实验分组_
分组 免疫原 免疫剂量免疫途径免疫次数
_及时间
A 猪胸膜肺炎放线杆菌菌影 5Xl(^CFU/只腹腔注射三次，间
B 猪胸膜肺炎放线杆菌 5X109CFUAR腹腔注射 隔两周
灭活铝佐剂苗
C_生理盐7jC_100pL/只 腹腔注射_
6. 免疫水平的检测
间接ELISA法检测抗体效价，脾淋巴细胞转化试验检测细胞免疫水平。 血清抗体水平检测结果免疫小鼠后间接ELISA定期检测血清IgG抗体效价， 三次免疫后抗体效价达到3200 X 。
脾淋巴细胞转化试验结果免疫组较对照组有明显的细胞增值。
7. 攻毒实验
三免后一周，小鼠腹腔注射3倍最小致死量的活菌进行大剂量感染实验，对小鼠 存活情况进行计数，检测疫苗的保护效果。
三次免疫后免疫保护结果见下表，细菌菌影的保护率与甲醛灭活苗的保护率都达 到100%，空白对照组全部死亡。
疫苗免疫保护测定结果
组别存活数死亡数保护率％
A20/200/20100
B20/200/20画
C20/2020/200
结论由以上结果可以看出，联合利用抗菌肽和超高压制备的细菌菌影比单纯利 用抗菌肽制备的菌影裂解率更高，可剌激机体产生特异的体液免疫和细胞免疫，与灭 活苗相比有相同的保护率，具有良好的免疫效果，可以作为一种新的候选疫苗使用。序列表
〈110>吉林大学
〈120>联合利用抗菌肽和超高压制备细菌菌影的方法及应用 <130> 22 <歸 4
<170> Patentln version 3. 5
<210> 1
〈211〉 51
〈212〉 廳
<213>人工合成
〈400〉 1
aaatggtgct tccgtgtttg ctaccgtggt atctgctacc gtcgttgccg t 51
<210> 2
<211> 17
〈212〉 PRT
〈213>人工合成
〈400〉 2
Lys Trp Cys Phe Arg Val Cys Tyr Arg Gly lie Cys Tyr Arg Arg Cys 15 10 15
Arg
〈210> 3 〈211〉 78 〈212>舰 〈213〉人工合成 〈400> 3
atgatgaggg tgatg鄉ag gaagactaaa gttatttggg aaaaaa郷a ctttattgga 60
ttatacagta ttgattga 78
<210> 4
〈211> 25
<212> PRT
〈213〉人工合成
<400> 4
Met Met Arg Val Met Arg Arg Lys Thr Lys Val lie Trp Glu Lys Lys 15 10 15
Asp Phe lie Gly Leu Tyr Ser lie Asp 20 25
1权利要求
1、一种联合利用抗菌肽和超高压制备细菌菌影的方法，包括以下步骤将细菌菌株培养至对数生长期(OD600为0.4～0.6)时，加入抗菌肽，4℃作用过夜或室温作用2～4h；离心收集菌体并用生理盐水重复洗两次，加入生理盐水重悬，进行200～250MPa超高压处理；离心收集菌体并用生理盐水重复洗两次，即制备成细菌菌影。
全文摘要
本发明公开了一种联合利用抗菌肽和超高压制备细菌菌影的方法及应用，将细菌菌株培养至对数生长期(OD₆₀₀为0.4～0.6)时，加入抗菌肽，4℃作用过夜或室温作用2～4h；离心收集菌体并用生理盐水重复洗两次，加入生理盐水重悬，进行200～250MPa超高压处理；离心收集菌体并用生理盐水重复洗两次，即制备成细菌菌影。本发明提供了一种新的细菌菌影制备方法，取得了良好的效果，裂解效率高，可达99.9999999％以上，并且操作简单，可广泛用于细菌的菌影制备；对制备的细菌菌影进行了应用，具有良好的免疫效果，可以作为一种新的候选疫苗使用。
文档编号A61K47/46GK101683524SQ20091006728
公开日2010年3月31日 申请日期2009年7月15日 优先权日2009年7月15日
发明者孙长江, 杜崇涛, 江丽娜, 盛相鹏, 芳 谢, 雷连成, 韩文瑜 申请人:吉林大学