专利名称：双取代苯基双胍诱导恶性肿瘤细胞失巢凋亡的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于药理实验研究技术领域，涉及使用一系列双取代苯基双胍类化合物引 起恶性肿瘤细胞失巢凋亡方面的应用，更具体的说是一种具有抗肿瘤活性的双取代苯基 双胍类化合物以及含有此类化合物的药物组合物在抑制肿瘤生长和转移以及治疗整合素 a v日3高表达的人黑色素瘤、神经胶质瘤、肺癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤方 面的应用。
背景技术：
整合素a V0 3是由a v和0 3两个亚基组成的，其中a v亚基(⑶51)有1018个 氨基酸残基，分子量125 kD，0 3亚基(⑶61)有762个氨基酸残基，分子量105 kD。它是 细胞表面一类重要的粘附分子，它一方面介导细胞与细胞外基质的粘附，另一方面参与细 胞的信号转导，影响细胞的分化、增殖、生存和迁移。整合素av03对细胞的生存、生长，和 细胞周期均有重要作用，同时，它与许多重要的疾病密切相关，包括肿瘤、心血管疾病、骨质 疏松，和风湿性疾病。而且，它在细胞表面的表达具有一定的局限性，它不在内皮细胞上广 泛表达，只是在激活的内皮细胞、破骨细胞，侵袭性的肿瘤细胞(人黑色素瘤、神经胶质瘤、 肺癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤)上高表达。因此，它是一个备受关注的药物 治疗新靶点。很多肿瘤患者在治疗后难免出现复发和广泛转移，肿瘤侵袭转移的三个关键步骤 为肿瘤细胞与基底膜的粘附，细胞外基质的降解，以及细胞移行。在这个过程中有许多阶 段特异的粘附过程，其中一些细胞粘附分子的表达，尤其是整合素a 3与肿瘤细胞的转 移潜力密切相关，它通过促进肿瘤的转移和侵润能力使肿瘤的恶性表型增加，可以作为许 多侵袭的肿瘤细胞的一个标志。例如在转移性最强的肿瘤之一人类黑色素瘤中，肿瘤细胞 对许多组织和细胞外基质的侵袭能力很大程度上归因于表面粘附受体介导的作用，其中， 整合素a 3在黑色素瘤的转移和增殖中发挥了重要作用，它能通过与其配体的粘附，介 导黑色素瘤细胞向许多组织转移。又如局部侵润是恶性胶质瘤的特点之一，这也与整合素 av^3的异常表达密切相关，侵润的胶质瘤细胞可以通过a 3的作用，沿着含有基质蛋 白的某些结构(如血管壁基底膜的内侧面)进行播散。整合素a v 0 3受体可特异性的识别精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸(Arg-Gly-Asp， RGD)，并通过共价键与之结合，从而介导细胞与细胞外基质粘附，并通过一定的信号传导 通路，调节细胞生存、生长、移行等。竞争性拮抗剂与整合素受体结合后，整合素 a v日3受体不能与其正常配体结合，上述正常的功能被抑制，从而诱导细胞失巢凋亡(失 巢凋亡是指细胞由于失去与细胞外基质的粘附而引起凋亡，其最终导致肿瘤细胞的死亡， 使肿瘤不能继续生长或转移)。目前针对整合素a v 0 3的抑制剂主要有37种，均为RGD类似物，分为RGD肽类及 其肽类模拟物、单克隆抗体、非肽类小分子抑制剂三类，其中有两种在进行II期临床实验， 一种在进行I期临床实验，主要用来治疗肿瘤、风湿性关节炎、动脉硬化、骨质疏松等。目前正在研究非肽类小分子的主要是苯并二氮杂卓类，包括SB223245等，能够显著抑制整合素 a v 3 3介导的细胞粘附。肽类在体内易受酶的降解，半衰期短，开发相应的非肽类小分子抑 制剂的药物，不但在体内作用时间长，而且可以口服使用，是未来的发展方向之一。本发明人首次发现，本发明的双取代苯基双胍类化合物在制备诱导肿瘤细胞失 巢凋亡、抑制恶性肿瘤生长、侵袭转移，以及治疗整合素av 3 3高表达的人黑色素瘤、卵 巢癌、神经胶质瘤、肺癌、胃癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤的药物方面，显示出有效的药理活 性，为寻找新的有效的抗肿瘤药物开辟了一条新的途径。在本发明以前，双取代苯基双胍类化合物3，5-二氯苯基双胍曾被做为5-羟色胺 受体 3 激动剂进行研究。Mol Pharmacol. 1994,46(4) :732_742，Br J Pharmacol. 1998, 124(8) 1667-1674 ；Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2002,26(3) 463-471 中报道了其作为5-羟色胺受体激动剂的这一药理作用。但是双取代苯基双胍类化合物其 在抗肿瘤方面，尤其是诱导失巢凋亡、抑制肿瘤生长和转移方面的应用一直未被研究过。
发明内容
本发明的一个目的在于公开了双取代苯基双胍类化合物在制备抗恶性肿瘤药物 方面的应用。本发明另一个目的在于公开了双取代苯基双胍类化合物在制备抑制诱导肿瘤细 胞失巢凋亡药物方面的应用。本发明还一个目的在于公开了双取代苯基双胍类化合物在制备抑制肿瘤生长药 物方面的应用。本发明还一个目的在于公开了双取代苯基双胍类化合物在制备抑制肿瘤侵袭转 移药物方面的应用。本发明再进一步公开了双取代苯基双胍类化合物在制备治疗人黑色素瘤、卵巢 癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、神经胶质瘤等恶性肿瘤的药物方面的应用。本发明提供了双取代苯基双胍类化合物及其药用盐和含它们的药物组合物在制 备抗恶性肿瘤药物方面的应用；其中的双取代为苯环2、3、4、5、6位中任意两个位置的取 代，取代基为卤素、烷基或卤素取代的烷基。其中公开了双取代苯基双胍类化合物在制备诱 导恶性肿瘤细胞失巢凋亡方面的应用。在抑制肿瘤侵袭转移药物方面的应用。在制备抑 制肿瘤生长药物方面的应用。以及在制备治疗人黑色素瘤、神经胶质瘤、肺癌、胃癌、前列腺 癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤药物方面应用。本发明包括上述化合物的药学上可接受的无机酸和有机酸盐，包括盐酸盐、磷酸 盐、硫酸盐、醋酸盐、马来酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、甲基苯磺酸盐、富马酸盐或酒石酸盐 等。本发明所述化合物选自如下化合物中的一种或多种
编号化合物1N-(3，5-二氯苯基)双胍 本发明进一步提供了用于治疗恶性肿瘤的药物组合物，它包含作为上述活性成分 的化合物以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。含有本发明所述的作为活性成分的双取代苯基双胍类化合物的药物组合物可以 按照常规药物配制技术，通过将双取代苯基双胍类化合物与可药用载体组合来制备。载体 可以采用各种各样的形式，这取决于希望的给药途径(例如口服、肠胃外给药)。因此对于 口服液体制剂，合适的载体和添加剂包括水、乙二醇、油、乙醇、调味剂、防腐剂、稳定剂、着 色剂等等；对于口服固体制剂如散剂、胶囊剂或片剂，合适的载体和添加剂包括乳糖、淀 粉、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等等。口服固体制剂也可以用 如丙烯酸树脂等物质包衣或包肠溶衣以便调整吸收的主要部位。对于肠胃外投药，如局部给药、透皮给药和粘膜给药等制剂，载体通常包括高分子材料如卡波姆、吸收促进剂氮酮等 等。注射液也可利用水载体与适当添加剂如支架剂甘露醇、甘氨酸、增溶剂丙二醇、抗氧剂 焦亚硫酸钠等等制备。因为易于给药，片剂和胶囊剂代表最方便的口服单元剂量形式。本发明的药物组合物每剂量单位例如片、胶囊、注射剂等等应包含必需释放如上 所述的有效剂量的双取代苯基双胍类化合物。例如普通压片成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、 山梨醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或胶、以及其他药用稀释剂。例如水混合，以形 成包含本发明双取代苯基双胍类化合物的固体处方设计组合物。对于液体形式包括水溶 液、适当的增香的糖浆剂、水或含有食用油，例如棉花子油、芝麻油的增香的乳剂、以及酏剂 和相似的药用载体。本发明对上述双取代苯基双胍类化合物进行生物学活性进行测定，发现它们对肿 瘤细胞具有诱导凋亡、抑制粘附的作用。在此，为了表明目标化合物的实用性，下面给出本 发明N-(3，5- 二氯苯基)双胍、N-(3，4- 二氯苯基)双胍、N-(2-氯-5-三氟甲烷基苯基) 双胍、N-(2-甲烷-5-氯苯基)双胍、N-(2，4-二氯苯基)双胍、N-(2，3-二氯苯基)双胍、 N-(3-氯-4-氟苯基)双胍、N-(2，5-二氯苯基)双胍中的对肿瘤细胞诱导凋亡、抑制粘附 的药理实验情况。特别以N-(3，5-二氯苯基)双胍作为典型化合物代表，提供如下的药理 实验数据。药理实验一失巢凋亡的测定实验原理失巢凋亡是指由于细胞失去与细胞外基质的粘附而引起的凋亡。本方 法用于测定药物对肿瘤细胞失巢凋亡的影响。应用Armexin V/PI双标及流式检测的方法 检测凋亡细胞的百分率。选择整合素av 0 3高表达的人黑色素瘤细胞系作为受试细胞 系，选择整合素a 3的特异性配体蛋白vitronectin包被培养板，BSA包被培养板作为 对照。细胞用粘附缓冲液重悬后接种于培养板，待细胞粘附于培养板后加入受试药物及对 照药物，药物作用一段时间后收取包括悬浮和贴壁的全部细胞，进行PI/Armexin V双标记， 并进行流式检测。Armexin V选择性结合磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine，简称PS)。 磷酯酰丝氨酸主要分布在细胞膜内侧，即与细胞浆相邻的一侧。在细胞发生凋亡的早期， 不同类型的细胞都会把磷酯酰丝氨酸外翻到细胞表面，即细胞膜外侧。用带有绿色荧光的 荧光探针FITC标记的Armexin V，即Armexin V-FITC，就可以用流式细胞仪或荧光显微镜 非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。碘化丙啶可以 染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞，呈现红色荧光。用Armexin V-FITC 和碘化丙啶染色后，正常的活细胞不被Armexin V-FITC和碘化丙啶染色；凋亡早期的细胞 仅被Armexin V-FITC染色，碘化丙啶染色呈阴性；坏死细胞和凋亡晚期的细胞可以同时被 Annexin V-FITC和碘化丙啶染色。实验方法受试药物N_ (3，5-二氯苯基)双胍。实验共分8组，5个vitronectin包被组，包 括cRGDfv阳性对照组(34 u M)、苯基双胍阴性对照组(60 u M)、不加药组、N-(3, 5- 二氯苯 基)双胍30 iiM组、N-(3，5-二氯苯基)双胍60 iiM组，3个非vitronectin包被组，包括不 加药组、N-(3，5-二氯苯基)双胍30 iiM组、N-(3，5-二氯苯基)双胍60yM组。(1) 35mm培养皿中加入2ug/ml vitronectin，每孔2. 5ml，4°C过夜。对照孔用 5 u g/mlBSA包被，每孔2. 5ml，排除非特异性结合的影响。
(2)次日吸出包被液，加入1 % BSA封闭，每孔2. 5ml，室温孵育1小时，磷酸缓冲液 (PBS)洗两次。(3)以粘附缓冲液(无血清RPMI培养基加入1 % BSA, ImM CaCl2，1M MgCl2， andlOOnM MnCl2)悬浮M21人黑色素瘤细胞，每个培养皿加入2. 5 X 105细胞，37°C 5 % C02 孵箱内孵育4小时。(4)每个培养皿按要求分别加入药物，继续37°C 5% C02孵箱内孵育。(5)加药后24h收取细胞，注意每个培养皿中悬浮的和贴壁的细胞都要收集。(6)用PBS洗涤细胞2次，最后离心后弃去上清，按照碧云天Armexin V-FITC凋亡 试剂盒进行操作，加入195 ill Armexin V-FITC结合液(IX)轻轻重悬细胞。(7)加入 5ii 1 Annexin V-FITC，轻轻混勻。(8)室温(20_25°C )避光孵育lOmin。可以使用铝箔进行避光。(9) lOOOg离心5分钟，弃上清，加入190 u 1 Annexin V-FITC结合液(IX)轻轻重 悬细胞。(10)加入10 U 1碘化丙啶染色液，轻轻混勻，冰浴避光放置。(11)随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。(12)三次独立实验的结果进行统计学分析。实验结果如图2所示，药物作用24h后，vitronectin包被的5组中，不加药组凋亡率为 5. 96%,阳性对照组37. 12%,N-(3, 5-二氯苯基)双胍30 u M组和60 u M组分别为25. 23% 和37. 34% (后三者与vitronectin包被不加药组相比，均是P < 0. 05)，阴性对照组与不 加药组无明显差别。然而，BSA包被的三组中，药物处理与不处理组凋亡率无明显差别。说 明N-(3，5_二氯苯基)双胍能够诱导M21失巢凋亡，该作用是由于该药物影响了整合素a v 3 3 与 vitronectin 的结合。药理实验二 caspase-3，_8，_9活性测定实验原理Caspase (Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞调亡过禾呈中 起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 3也称CPP32、Yama或apopain，有时被写作caspase-3 或caspase3，属于caspase家族的CED-3亚家族(CED_3subfamily)，是细胞凋亡过程中的 一个关键酶，它的活化代表着凋亡即将发生。Caspase-8和caspase-9的活化分别代表着 caspase依赖的外源和内源凋亡途径被激活。本实验中所使用的碧云天Caspase-3，_8，_9 活性检测试剂盒是基于这三种caspase可以分别催化底物Ac-DEVD-pNA (acetyl-Asp-Gl u-Val-Aspp-nitroanilide), Ac-IETD-pNA(acetyl-Ile-Glu-Thr-Asp p-nitroanilide), 和 Ac-LEHD-pNA(acetyl-Leu-Glu-His-Asp p-nitroanilide)三种底物产生黄色的 pNA(p-nitroaniline)，从而可以通过测定吸光度来检测对应的caspase的活性。pNA在 405nm附近有强吸收。实验方法受试药物N_ (3，5- 二氯苯基)双胍(1)实验分组、细胞处理及药物处理方法同药理实验一，不同的是使用90mm培养 皿，每个培养皿接种2 X 106细胞)。
(2)细胞收取后，PBS洗涤一次，吸进上清后按照每200万细胞加入100ml裂解液 的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15min。(3) 4°C 16，000-20，OOOrpm 离心 10_15min。(4)把上清转移到冰浴预冷的离心管中。(5)立即测定caspase-9的酶活性或-70°C保存样品。同时可以取少量样品用 Bradford法测定蛋白浓度，尽量使蛋白浓度达到l_3mg/ml，相当于每10 yl待测样品中含 有10-30 yg蛋白。(6)测定pNA标准曲线A.标准品稀释液的配制按照每0. 9ml检测缓冲液加入0. lml裂解液的比例配制 适量的标准品稀释液。B.把试剂盒提供的pNA (10mM)用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和 200 iiM，作为标准品。C.每个浓度取100 u 1用酶标仪进行检测，或取适当量用容量不超过100 u 1的分 光光度检测杯进行检测，测定A405。D.每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405计算出实际的因pNA而 导致的吸光度，并制作出pNA浓度相当于A405的标准曲线。(7) caspase-3 酶活性的检测。A.取出pNA和适量的Ac-DEVD-pNA (2mM)，置于冰浴上备用。B.如下设置反应体系 注意在设置反应体系时先加检测缓冲液，再加待测样品，适当混勻，注意避免在 混勻时产生气泡。随后再加入10 ill Ac-DEVD-pNA (2mM)。C.加入Ac-DEVD-pNA (2mM)后混勻，注意避免在混勻时产生气泡。37 °C孵育 60-120min。发现颜色变化比较明显时即可测定A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长 孵育时间，甚至可以孵育过夜。D.样品的A405扣除空白对照的A405，即为样品中caspase 3催化产生的pNA产 生的吸光度。通过同步骤(6)中获得的标准曲线的对比就可以计算出样品中催化产生了多 少量的pNA。这样就可以计算出一个样品单位重量蛋白中所含的caspase 3的酶活力单位。一 个酶活力单位定义为当底物饱和时，在37°C可以剪切lnmol Ac-DEVD-pNA产生InmolpNA的caspase 3的酶量。(8) caspase-8和caspase-9的测定方法与(7)完全相同(除底物种类不同外)。实验结果
如图3所示，在vitronectin包被的几组中，阳性对照药物能够使 caspase-3，-8，-9的活性分别提高为不加药组的3. 48-, 4. 84-, and 3. 97-倍；N-(3，5-二氯 苯基)双胍30 ii M组使caspase-3，-8，-9的活性分别提高为不加药组的2. 09-倍、2. 29-倍 和2. 33-倍；N-(3, 5- 二氯苯基)双胍60 uM组使caspase-3, -8，-9的活性分别提高为不 加药组的2. 79-倍、3. 86-倍和3. 50-倍。阴性对照组与不加药组相比无明显区别。在BSA 包被组中，经N- (3，5- 二氯苯基)双胍处理和不处理对caspase-3，-8，和_9的活性没有明 显影响。药理实验三FAK，磷酸化FAK，Bax, Bcl-2, survivin蛋白水平的检测。实验原理局部粘着斑激酶(Focal adhesion kinase, FAK)是一种酪氨酸激酶，它的激活与 局部粘着斑的形成有关17。在整合素av 0 3与其配体结合后，在局部粘着斑处，FAK能够 直接或通过骨架蛋白talin，paxil 1 in等与0亚基的C末端相结合18-20。FAK激活后能够 自身磷酸化397位的酪氨酸残基，形成SH2结构域，通过SH2结构域与Src或Fyn结合21， 22，Src能磷酸化许多局部粘着斑成分，包括paxillin tensin和P130CAS。FAK还能够通过 Src激活PI-3激酶23-26。Src还能磷酸化FAK的925位的酪氨酸残基，使FAK能通过Grb2 禾口 mSOS 与 Ras 相连，进而激活 ERK(Ras-extracellular signal regulated kinase) -MAPK 级联。我们通过检测总FAK和磷酸化FAK的蛋白质水平，进而了解整合素a V0 3与配体的 结合被干扰后此信号通路是不是也因此被阻断。Bcl-2和Bax内源性凋亡途径上的两个重 要调节因子。在凋亡的信号通路上，Bcl-2使细胞免于凋亡，而Bax起相反的作用，Bcl-2/ Bax比值的降低是内源性凋亡通路上一个早期信号，它能够促进线粒体释放细胞色素C，这 将进一步激活 casapase 级联。Survivin 是 IAPs (inhibitor of apoptosis proteins)家 族成员，它能够内源性凋亡途径的活化，从而保护细胞使其免于凋亡。实验方法受试药物N_(3，5- 二氯苯基)双胍(1)样品制备实验分组、细胞处理及药物处理方法同药理实验二。收取各组细胞后，PBS洗两遍，于冰上加入冷RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂，混勻细 胞后，冰浴30min，用超声细胞破膜仪破碎细胞，4°C，12000rpm，离心lOmin，移上清至另一 EP管中。(2)BCA法定蛋白样品蛋白的测定取l-2iU待测蛋白提取物，以去离子水稀释至25 yl，加入 200 u 1A、B混合液，混勻后混勻后37°C孵育30min，取出放置至室温，于酶标仪上测定546nm 下的0D值。根据标准曲线计算蛋白含量。(3)丙烯酰胺凝胶电泳样品中加入6XSDS凝胶加样缓冲液，100°C煮沸5min使蛋白质变性。制胶配制10-12%分离胶，聚合后制备基层胶，聚合后可进行电泳。电泳按蛋白测定结果调整上样量以保证每个样品上样的蛋白量相等。在积层胶
12时电压为8V/cm，当染料前沿进入分离胶时，调整电压为15V/cm。当载样液中的溴芬兰抵达 分离胶下边缘时，断开电源。(4)电转移
根据凝胶面积按0. 65mA/cm2连接电源，恒流电转移5h。取出NC膜，用5%脱脂奶 封闭过夜。(5)杂交将NC膜封入合适大小的塑料袋中，按0. lml/cm2的量加入封闭液和适量 特异性抗体。于摇床上，室温反应2h。用TBST漂洗NC膜三次，每次2-3min。加入标有辣 根过氧化酶的二抗，继续室温孵育2h，用TBST漂洗NC膜三次。(6)ECL法显色按1 1的比例混合底物试剂，于暗室中将NC膜浸泡于显色液中 2-3min，可见荧光条带，取胶片进行显影，10_30s后，将胶片依次在显影液和定影液中浸泡， 可见清晰蛋白条带，以自来水充分清洗胶片，自然晾干后永久保存。实验结果如图4所示，药物处理24h后，vitronectin包被的几个组中，阳性对照药物与 不加药物组相比，使总FAK水平无明显变化，磷酸化FAK水平降低，Bcl-2/Bax水平降低， survivin水平降低。阴性对照药物无上述变化。受试药物N-(3，5-二氯苯基)双胍30 μ M 组和60 μ M组成计量依赖性的使磷酸化FAK水平降低，Bcl-2/Bax水平降低，survivin水 平降低，总FAK水平无明显变化；BSA包被组药物处理和不处理上述几个蛋白水平无明显区 别。药理实验四肿瘤细胞粘附实验实验原理肿瘤细胞通过整合素等膜表面受体与细胞外基质中相应的配体粘附，粘附是肿瘤 细胞侵袭转移的始动步骤，有利于肿瘤细胞侵犯基底膜等正常组织。本方法用于测定化合 物对肿瘤细胞与基底膜成分粘附能力的影响。选择整合素α νβ 3高表达的人黑色素瘤细 胞系Μ21作为受试细胞系，选择整合素α νβ 3的特异性配体蛋白vitronectin包被96孔 板，加入细胞的同时加入受试化合物，经过一段时间的孵育后，冲洗掉未粘附的细胞，粘附 于板上的细胞数量用结晶紫方法测定的吸光值来反映。实验方法受试药物N-(3，5-二氯苯基)双胍，N-(3，4-二氯苯基)双胍，N-(2_氯_5_三氟 甲烷基苯基)双胍，N-(2-甲烷-5-氯苯基)双胍，N-(2，4-二氯苯基)双胍，N-(2，3-二氯 苯基)双胍，N-(3-氯-4-氟苯基)双胍，N-(2，5-二氯苯基)双胍。实验分为两组受试药物和阴性对照化合物组。设定300，250，200，150，100， 50μΜ六个剂量。另设空白对照中加入等体积的溶剂，作为细胞100%粘附对照，计算实验 组中细胞粘附抑制率和半数抑制量(IC50)。
细胞漏抑制率二 (1 -值;χ 100O/O
空白对照孔OD值-BSA包被孔OD值“(1)96孔板中加入5μ g/ml玻璃体粘连蛋白(vitronectin)每孔100 μ 1，4°C过 夜。对照孔用5μ g/ml牛血清白蛋白(BSA)包被，每孔100μ 1，排除非特异性结合的影响。(2)次日吸出包被液，加入1 % BSA封闭，每孔100 μ 1，室温孵育1小时，磷酸缓冲液(PBS)洗两次。 (3)以含有 BSA、lmM CaCl2UmM MgCl2UmM MnCl2 的 RPMI1640 无血清培养液 悬浮M21人黑色素瘤细胞，每孔加入8 X IO4细胞，实验组加入受试药物，空白对照组加入溶 剂PBS作为对照，37°C 5% CO2孵箱内孵育1小时。(4)吸出培养基，每孔加入200 μ 1 PBS,轻轻冲洗三遍，以去除未粘附的细胞。(5)弃去PBS，每孔加入100 μ 1 10%戊二醛固定30分钟。(6)用去离子水洗涤至戊二醛彻底洗净，置37°C烘箱彻底干燥。(7)加入0. 的结晶紫对细胞进行染色，振摇30min。(8)用蒸馏水洗涤，至多余的结晶紫冲洗干净，置37°C烘箱彻底干燥。(9)加入10%的乙酸对细胞吸收的结晶紫进行提取。(10) 1小时后在酶标仪上进行测定，波长为595nm。实验结果各种双取代苯基双胍化合物对M21细胞粘附抑制作用的IC50见下表，可见上述8 种受试化合物均能不同程度的抑制肿瘤细胞与细胞外基质的粘附。因粘附抑制是失巢凋亡 的原因，所以这8种化合物都和N-(3，5- 二氯苯基)双胍一样能够诱导恶性肿瘤细胞失巢 凋亡和抑制肿瘤生长和转移。
6 H H
J2 NH NH
X 丫
No.X/CiO (μΜ)
3,5-Cl236.42 土 1.43
23，4-Cl238.52 ±1.66
52,4-Ch66.88 士 5,27
62,3-Cl287.26 士 3.56
73-C1,4-F97.28 士 3.55
82，5-Cl2100.24 ±8.44
32C1,5-CF3127.20 士 7.50
42-CH3,5-C1334.92 土 13.97
H>3000药理实验五体内药效初步研究利用整合素高表达的人黑色素瘤细胞建立裸鼠实验性转移模型，用以评价化合物 在体内的抗肿瘤转移作用。受试药物N-(3，5-二氯苯基)双胍。
(1)裸鼠实验性转移模型的建立BALB/Cnu/nu裸小鼠，6周龄，15. 5-18g，雌性，购自北京维通利华实验动物技术有 限公司。购买后饲养于我单位SPF级动物实验室。裸小鼠经400&7的137(^-^射线全身照 射，随机分成4组生理盐水对照组、1 X IO6组、2 X IO6组和3 X IO6组，每组6只动物。6_24h
内用号注射针头经尾静脉缓缓注入对应数目的M21细胞或生理盐水。疗效观察 观察裸鼠的一般状况，每两天称量一次体重。于接种后50天断颈处死动物，有的 鼠未到50天即出现严重恶液质，在它自发死亡前短颈处死。称体重后解剖出裸鼠完整的肺 脏，再将其用Bouin氏液(饱和苦味酸75ml+40%甲醛25ml+冰醋酸5ml)固定，24h后肺组 织呈黄色，肿瘤转移灶成白色隆起。用解剖显微镜观察并记录肺转移灶数目和大小，并按转 移灶的大小分级。I级转移灶直径小于0. 5mm ；II级转移灶直径0. 5-lmm ；III级转移灶 直径lmm-2mm ；IV级转移灶直径大于2mm。按下面公式计算总转移灶数=I级转移灶数 +11级转移灶数X2+III级转移灶数X3+IV级转移灶数X4。由两名研究者独立计数肺表 面转移灶，计算平均值。肺脏及其它所取脏器(肝、脾、肾、脑)经常规石蜡切片，HE染色， 进行组织病理学观察。实验结果结果显示IX IO6组、2X IO6组和3X106组均能100 %成瘤，癌结节数目均值分别 为84士8，70士6，88士 12，三组之间没有明显差异，阴性对照组未形成转移灶。均未见其它 脏器转移。如图5所示，A和B为黑色素瘤接种组裸鼠肺组织，表面有大小不一的白色转移 灶，图B为A垂直方向旋转180°。图C为阴性对照组鼠肺组织。如图6所示，A.肺内瘤 结节，B.肺内微小肿瘤浸润灶，C.瘤细胞沿肺边缘浸润，D.E.瘤细胞核大、核膜清晰、核仁 明显，分裂相多见。F.对照组正常肺组织，图中可见支气管。(放大倍数A/B:X80，C/D/ E :X160, F :X40)。(2)毒理实验昆明鼠36只，6周龄，随机分成6组，每组6只。六组分别尾静脉给予300、250、 200、150、100、5011^/1^的^(3，5-二氯苯基)双胍。计算 LD50。实验结果结果显示LD50为120mg/kg。(3)初步体内抗肿瘤转移活性实验实验分为阴性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。每组6只BALB/C nu/nu 裸小鼠(其条件同“裸鼠实验性转移模型的建立”部分)，均于400cGy的137Cs-γ射线全身 照射后给予尾静脉接种1X106M21细胞。5天后经尾静脉给予药物阴性对照组给予生理 盐水，低剂量组、中剂量组和高剂量组分别给予6mg/Kg、12mg/Kg、24mg/Kg N-(3，5- 二氯苯 基)双胍(为上述LD50的1/20，1/10和1/5)。每4天尾静脉给药1次，共给药5次。细胞 接种后50天实验结束。疗效观察观察、解剖、固定以及计数癌结节的方法同上。实验结果阴性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组的癌结节数目均值分别为139士26. 3548，53士4. 5753 (ρ < 0. 05vs 阴性对照组)，34士4. 0415 (ρ < 0. 05vs 阴性对照 组，ρ < 0. 05vs低剂量组组)，4· 7士2. 0111 (ρ < 0. 05vs阴性对照组，ρ < 0. 05vs低剂量 组，ρ < 0. 05vs中剂量组)。病理学分析可见，阴性对照组镜下可见大小不等的肿瘤灶，多 见大片肿瘤灶，甚至整个肺尖部布满肿瘤细胞；低剂量组可见多见灶性转移灶，可见血管周 围大量肿瘤细胞浸润；中剂量和高剂量组多见灶性和小灶性肿瘤灶，有点肿瘤灶仅有几个 肿瘤细胞组成，未见大片肿瘤灶。如图7所示，A为阴性对照组肺的代表，可见整个肺尖部充 满肿瘤细胞，B为低剂量组肺的代表，可见血管周围肿瘤细胞浸润，C为中剂量组和高剂量 组肺的代表，可见小灶性转移灶。结果提示，N-(3，5-二氯苯基)双胍能够抑制肿瘤转移， 由于N-(3，5_ 二氯苯基)双胍对整合素α νβ 3的靶向作用，可以预计它对其它整合素αν β 3高表达的肿瘤也可能产生明显的抗转移活性。综上所述，通过药理的体内体外实验可以进一步的证明本发明的双取代苯基双 胍类化合物，例如N-(3，5-二氯苯基)双胍，N-(3，4-二氯苯基)双胍，N-(2-氯-5-三氟 甲烷基苯基)双胍，N-(2-甲烷-5-氯苯基)双胍，N-(2，4-二氯苯基)双胍，N-(2，3-二 氯苯基)双胍，N-(3-氯-4-氟苯基)双胍，N-(2，5-二氯苯基)双胍。均可以显示出明显 的诱导肿瘤细胞失巢凋亡、抑制肿瘤细胞生长和侵袭转移的作用，同时具有高效、低毒的特 点，因此有望在抑制肿瘤生长、侵袭转移以及治疗整合素α νβ 3高表达的人黑色素瘤、卵 巢癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、神经胶质瘤等多种恶性肿瘤药物方面应用。
图1为双取代苯基双胍类化合物中的代表N-(3，5-二氯苯基)双胍的结构式；图2为细胞失巢凋亡实验图；图3为caspase3，8，9活性测定实验图；图4为药物作用后相关蛋白测定实验图；其中A为western blotting实验结果， B为上述western blotting量化分析结果；图5体内药效研究动物模型建立的实验图。其中，A和B为黑色素瘤接种组裸鼠 肺组织，表面有大小不一的白色转移灶，图B为A垂直方向旋转180°。图C为阴性对照组 鼠肺组织。图6为体内药效研究动物模型肺组织病理分析实验图。其中，A.肺内瘤结节，B.肺 内微小肿瘤浸润灶，C.瘤细胞沿肺边缘浸润，D.E.瘤细胞核大、核膜清晰、核仁明显，分裂 相多见。F.对照组正常肺组织，图中可见支气管。(放大倍数A/B:X80，C/D/E:X160， F :X40)。图7为体内药效研究肺组织病理分析实验图。其中，A为阴性对照组肺的代表，可 见整个肺尖部充满肿瘤细胞，B为低剂量组肺的代表，可见血管周围肿瘤细胞浸润，C为中 剂量组和高剂量组肺的代表，可见小灶性转移灶。
具体实施方式
为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制剂实施例。这些实施例仅仅是解释、 而不是限制本发明的范围。制剂可以采用本发明中的任意一个化合物的活性成分。本发明 的化合物可以合成或从市场上买到。0132]制剂1
0133]每片含10mg活性成分的片剂制备如下
0134]用量/片重量浓度(％ )0135]化合物(2)lOOmg10. 00136]微晶纤维素35mg35. 00137]淀粉45mg45. 00138]聚乙烯吡咯烷酮4mg4. 00139]羧甲基淀粉钠盐4. 5mg4. 50140]硬脂酸镁0. 5mg0. 50141]滑石粉lmg1. 00142]总计100100. 0 将活性成分，淀粉和纤维素过筛，并充分混合，将聚乙烯吡咯烷酮溶液与上述的粉 混合，过筛，制得湿颗粒于50-6CTC干燥，将羧甲基淀粉钠盐，硬脂酸镁和滑石粉预先过筛， 然后加入到上述的颗粒中压片。制剂2
注射剂的制备
化合物(1)200mg
甘露醇700mg
PEG400010mg
蒸馏水100ml
使PH值为7. 0-7. 5过滤滤液浓度为3mg/ml，按每安瓶2ml分装，冷冻干燥后即得注射剂。
制剂3
每囊含lOOmg活性成分的胶囊的制备如下
用量/囊重量浓度(％ )
化合物(3)lOOmg30. 0
聚氧乙烯脱水山梨0.05mg0. 02
糖醇单油画？酯
淀粉250mg69. 98
总计350. 05mg100.00。
实施例4
N-(2-氯-三氟甲烷基苯基)双胍100g，加糊精100g，乳糖270g，用70%醇制粒，干燥，装胶囊，制得1000粒胶囊剂。
实施例5
N-(3，5-二氯苯基)双胍80g，加入2M NaOH调节pH 8. 0，加注射用水至2000ml，
0. 22um微孔滤膜微滤，分装(每瓶2ml)，灭菌即得非布司他注射液。
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述 申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所 作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。
权利要求
双取代苯基双胍类化合物及其药用盐和含它们的药物组合物在制备抗恶性肿瘤药物方面的应用；其中的双取代为苯环2、3、4、5、6位中任意两个位置的取代；取代基为卤素、烷基或卤素取代的烷基。
2.权利要求1所述的应用，其中的双取代苯基双胍类化合物在制备诱导恶性肿瘤细胞 失巢凋亡方面的应用。
3.权利要求1所述的应用，其中的双取代苯基双胍类化合物在制备抑制肿瘤侵袭转移 药物方面的应用。
4.权利要求1所述的应用，其中的双取代苯基双胍类化合物在制备抑制肿瘤生长药物 方面的应用。
5.权利要求1所述的应用，其中的双取代苯基双胍类化合物在制备治疗人黑色素瘤、 神经胶质瘤、肺癌、胃癌、前列腺癌或卵巢癌恶性肿瘤药物方面应用。
6.权利要求1-5所述的应用，其特征在于所述化合物选自如下化合物的一种或多种 N-(3，5-二氯苯基)双胍N-(3，4-二氯苯基)双胍N- (2-氯-5-三氟甲烷基苯基)双胍N-(2-甲烷-5-氯苯基)双胍N-(2，4-二氯苯基)双胍N-(2，3-二氯苯基)双胍N-(3-氯-4-氟苯基)双胍N-(2，5-二氯苯基)双胍；N-(3，5-二氯苯基)双胍盐酸盐N-(3，5-二氯苯基)双胍苯磺酸盐N-(3，5-二氯苯基)双胍甲基苯磺酸盐N-(3，5-二氯苯基)双胍富马酸盐N-(3，5-二氯苯基)双胍酒石酸盐N-(3，5-二氯苯基)双胍马来酸盐；N-(3，4-二氯苯基)双胍盐酸盐N-(3，4-二氯苯基)双胍苯磺酸盐N-(3，4-二氯苯基)双胍甲基苯磺酸盐N-(3，4-二氯苯基)双胍富马酸盐N-(3，4-二氯苯基)双胍酒石酸盐N-(3，4-二氯苯基)双胍马来酸盐；N- (2-氯-5-三氟甲烷基苯基)双胍盐酸盐N- (2-氯-5-三氟甲烷基苯基)双胍苯磺酸盐N-(2-氯-5-三氟甲烷基苯基)双胍甲基苯磺酸盐N- (2-氯-5-三氟甲烷基苯基)双胍富马酸盐N- (2-氯-5-三氟甲烷基苯基)双胍酒石酸盐N- (2-氯-5-三氟甲烷基苯基)双胍马来酸盐；N-(2-甲烷-5-氯苯基)双胍盐酸盐N-(2-甲烷-5-氯苯基)双胍苯磺酸盐 N-(2-甲烷-5-氯苯基)双胍甲基苯磺酸盐 N-(2-甲烷-5-氯苯基)双胍富马酸盐 N-(2-甲烷-5-氯苯基)双胍酒石酸盐 N-(2-甲烷-5-氯苯基)双胍马来酸盐； N-(2，4-二氯苯基)双胍盐酸盐 N-(2，4-二氯苯基)双胍苯磺酸盐 N-(2，4-二氯苯基)双胍甲基苯磺酸盐 N-(2，4-二氯苯基)双胍富马酸盐 N-(2，4-二氯苯基)双胍酒石酸盐 N-(2，4-二氯苯基)双胍马来酸盐； N-(2，3-二氯苯基)双胍盐酸盐 N-(2，3-二氯苯基)双胍苯磺酸盐 N-(2，3-二氯苯基)双胍甲基苯磺酸盐 N-(2，3-二氯苯基)双胍富马酸盐 N-(2，3-二氯苯基)双胍酒石酸盐 N-(2，3-二氯苯基)双胍马来酸盐； N- (3-氯-4-氟苯基)双胍盐酸盐 N- (3-氯-4-氟苯基)双胍苯磺酸盐 N-(3-氯-4-氟苯基)双胍甲基苯磺酸盐 N-(3-氯-4-氟苯基)双胍富马酸盐 N- (3-氯-4-氟苯基)双胍酒石酸盐 N-(3-氯-4-氟苯基)双胍马来酸盐； N-(2，5-二氯苯基)双胍盐酸盐 N-(2，5-二氯苯基)双胍苯磺酸盐 N-(2，5-二氯苯基)双胍甲基苯磺酸盐 N-(2，5-二氯苯基)双胍富马酸盐 N-(2，5-二氯苯基)双胍酒石酸盐 N-(2，5-二氯苯基)双胍马来酸盐。
7. 一种用于治疗恶性肿瘤的药物组合物，它包含作为活性成分的权利要求1或6的化 合物以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
全文摘要
本发明涉及双取代苯基双胍类化合物及含它们的药物组合物在诱导恶性肿瘤细胞失巢凋亡和抑制肿瘤生长和转移方面的应用。本发明的双取代苯基双胍类化合物经体内外实验，显示出明显的诱导恶性肿瘤细胞失巢凋亡、启动caspase级联，抑制肿瘤生长和转移的作用，同时具有高效、低毒的特点，因此作为药物化合物有望应用在抑制肿瘤生长和侵袭转移以及治疗整合素αvβ3高表达的人黑色素瘤、神经胶质瘤、肺癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤药物方面应用。
文档编号A61K31/155GK101862315SQ200910068498
公开日2010年10月20日 申请日期2009年4月17日 优先权日2009年4月17日
发明者周圆, 张永慈, 彭辉, 朱惠芳, 杨纯正, 杨铭, 熊冬生, 纪庆, 高瀛岱 申请人:中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)