专利名称：：一种降血脂及调节肠道菌群的益生菌制剂的制备方法一种降血脂及调节肠道菌群的益生菌制剂的制备方法发明领域本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种降血脂及调节肠道菌群的益生菌制剂的制备方法。
背景技术：
：心血管疾病是一类严重危害健康的疾病。近年来，随着社会的进步和人民生活水平的日益提高以及工作节奏的不断加快，心血管疾病已逐渐成为人类健康的头号杀手。心血管疾病与血脂升高、缺少运动、压力过大、家族心血管疾病史等相关，其中血脂升高，是造成胆固醇升高的主要因素之一。目前，对血脂高的控制主要是以含洛伐他汀类的药物为主，该药物具有严重的毒副作用，容易造成如肌痛、头痛、转氨酶升高、胃肠道不适、血脂紊乱、肝肾功能损害等。"益生菌"是机体补充摄入的具有活性的微生物，可有效改善肠道菌群的平衡，对宿主产生良好的健康效应，具有防止腹泻、提高机体免疫力、降低血清胆固醇、血压、抗癌等生理功能。Kefir粒作为重要的益生菌源，在欧州许多国家，早已被广泛地应用来预防和治疗肠易激综合症、溃疡性结肠炎、便秘等胃肠消化代谢、降血脂等生理疾病。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种天然、安全，既能降血脂又可以调节肠道菌群的益生菌制剂的制备方法。本发明实现目的的技术方案是一种降血脂及调节肠道菌群的益生菌制剂的制备方法，制备方法的步骤如下(1)将Kefir源植物乳杆菌MA2进行高密度培养，得到发酵液，其菌体密度不小于108cfii/mL;(2)上述发酵液经离心收集获得菌体，加入保护剂，冻干成菌粉；(3)在冻干的菌粉中加入低聚糖混合物，混合均匀即得益生菌制剂成品。而且，所述保护剂用量为菌体重量的3倍。而且，所述保护剂的构成及其质量百分比分别为10%的脱脂奶95%、海藻糖1.5%、甘油0.5%、山梨醇2%、麦芽糊精1%。而且，所述低聚糖混合物的构成及其在菌粉中加入量分别为低聚葡萄糖0.2%、菊粉0.3%、低聚果糖0.2%。而且，所述益生菌制剂成品包含的MA2的活菌数不少于l.OX101GcfWg。而且，所述Kefir源植物乳杆菌MA2已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保存编号为CGMCC3005。本发明的优点和积极效果是本发明所制备的益生菌制剂在降血脂的同时还具有调节肠道菌群的生理功能，可以治疗和预防高血脂症状和调节肠道菌群，且无毒，安全，保存期长，可制成胶囊、微胶囊、冲剂、片剂等。图l为本发明植物乳杆菌MA2在MRS(參)及MRS-CHO培养基中的生长曲线(圏)，及胆固醇的降解率(A)。图2饲喂高脂饲料的大鼠粪便中菌群的测定结果。其中A组，高胆固醇词料(A);B组，高胆固醇饲料+植物乳杆菌MA2(,);a.大肠杆菌b.乳酸菌c.双歧杆菌。试验结果表示为平均值(SD)(n=10)具体实施例方式下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。—、Kefir源植物乳杆菌k"o6a"7/w//a"torawMA2的筛选及生理功能测定1、Kefir源植物乳杆菌Za"o6fld〃w;/a"tonwMA2的筛选(1)kefir粒中益生乳酸菌的筛选将西藏kefir粒，加一定量的生理盐水于灭菌研钵中研磨破碎，用无菌生理盐水作适当稀释后，取10(HtL分别涂布在MRS固体培养基，30'C厌氧培养48h，观察并记录菌落特征并挑取不同形态单个菌落，再分别划线接种于MRS上，重复几次纯化乳酸菌，得到乳酸菌纯菌株，然后进行革兰氏染色和过氧化氢试验，对具有革兰氏染色阳性和过氧化氢试验阴性的菌株进行斜面保藏。(2)降胆固醇益生乳酸菌的初筛将kefir粒中筛选出的各乳酸菌菌株，按4°/。接种量分别接种于含的胆固醇的MRS液体培养基(MRS-CHO)中，在37"下厌氧培养24h后，利用临苯二甲醛的方法测上清液中的胆固醇含量，计算胆固醇降解率。以不接菌的含胆固醇的MRS液体培养基作为对照。选取胆固醇降解率高的乳酸菌作为进一步的复筛菌株。胆固醇的降解率(％)-接菌的MRS培养基中上清液中胆固醇含量/未接菌的MRS培养基中上清液中胆固醇含量(对照组)xioo%(3)降胆固醇益生乳酸菌的复筛对上述筛选出来的胆固醇降解率高的菌株，进行牛乳发酵试验，观察其凝乳时间，凝乳质地，凝乳时的pH，并对其凝乳风味作出感官评价；另外，测试其对酸和和胆盐的耐受能力，选取凝乳特性，耐酸特性及耐胆盐特性良好的乳酸菌MA2，经生理生化和16SrDNA测序确定其为植物乳杆菌。本发明所使用的Z"c/otoc///^/7to"tor,MA2具有良好的体外降胆固醇功能，检测结果如附图1。本菌种已在北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保存编号为CGMCC3005。2、Kefir源植物乳杆菌丄a"o&ad/top/朋towMA2耐酸和耐胆盐特性的检测菌株的酸和胆盐耐受性是益生菌筛选的一个重要指标准。具有对宿主有生理功能的益生菌很多，实际被应用的却很少，因为所摄入的益生菌必须能够耐受胃酸、胆汁，以存活的状态到达肠道，定殖，进而成功地发挥生理功能。实验结果证明，Kefir源植物乳杆菌￡a"o&ac//topto7tomwMA2，具有很强的酸耐受性和胆盐耐受性，在pH2.0的环境中，2h后活菌数仅下降了2个数量级；另外，菌株MA2在牛胆盐中的生长延滞时间较短，显示出很强的胆盐耐受性。3、Kefir源植物乳杆菌ia"o6flcz7/^//a"tomMA2的降胆固醇和调节肠道菌群活性的大鼠试验。本实验利用高胆固醇大鼠模型，考察了从Kefir粒中筛选出来的，具有体外降胆固醇效果的益生乳酸菌…植物乳杆菌i:"cto6ac说^p/anfanimMA2的体内降低血清胆固醇及调节肠道菌群的功效；测定了40天后，Z""o6a"7/^//朋torawMA2对大鼠大鼠体重，摄食量和饲料利用率，及脏器质量的影响；而且测定了其对血清总胆固醇(TC)，高密度胆固醇(HDL"C)，低密度胆固醇(LDL—C)，甘油三酯(TG);肝脏总胆固醇，甘油三酯；粪便总胆固醇，甘油三酯的影响；另外还研究了MA2菌株对大鼠肠道菌群及粪便中有机酸含量的影响，考察了其潜在的降血脂和调节肠道菌群的益生特性。实验结果如表l，2,3，4，表lMA2对饲喂高脂饲料大鼠的体重，摄食量和饲料利用率的影响A组B组0天体重(g)140.25(4.50)140.54(4.30)40天体重(g)217.66(13.92)221.31(20.32)体重增量(g/40d))77.41(8.43)80.77(6.47)摄食量(g/40d)713.12(23,732.45(14.50)饲料利用率(％)10.860単50)11.03%(0.45)注A组，高胆固醇饲料；B组，高胆固醇词料+植物乳杆菌MA2;试验结果表示为平均值(SD)(n=10)_表2MA2对饲喂高脂饲料大鼠的脏器质量的影响脑重(g)心重(g)肝重(g)脾重(g)肾重(g)A组1.77(0.02)0.62(0.02)7.26(0.02)0.34(0.03)1.31(0.01)B组1.72(0.02)0.59(0.02)6.95(0.03)0.3(0.02)1.3(0.02)注A组，高胆固醇饲料；B组，高胆固醇饲料+植物乳杆菌MA2;试验结果表示为平均值(SD)(n=10)由表l，表2可以看出，A,B两组的体重增量，饲料利用率，脏器质量并未出现显著差异(PX).05)，这表明在饲喂期间，植物乳杆菌MA2对大鼠并没有明显的毒副作用，植物乳杆菌MA2处理组与对照组大鼠呈现出相同的生长趋势。Bernardeauetal.(2002)andLiongandShah(2006)等人，考察了嗜酸乳杆菌，千酪乳杆菌ASCC292，低聚果糖和麦芽糊精对饲喂了高胆固醇饲料的Wistar大鼠的降胆固醇作用，最终得到了与本试验相似的结果，发现其对体重增量，摄食量都没有显著的影响。_表3MA2对饲喂高脂饲料大鼠的血清TC，HDL~C，LDL-~C,TG的影响_TC(mg/dl)HDL~C(mg/dl)LDL-^C(mg/dl)TG(mg/dl)A4卯,34(26.25)62.16(9.11)300.88(31.91)124.38(15.93)B388.54(8.9)**58.27(4.28)240.56(14.45)**93.11(15.01)*注A组，高胆固醇饲料B组，高胆固醇饲料+植物乳杆菌MA2;试验结果表示为平均值(SD)(n==10),p<0.05*,p<0.01**。植物乳杆菌MA2对饲喂了高胆固醇饲料的大鼠血清的影响见表3。由表3可知，相比较于A组，B组的TC浓度显著降低(P0.05)，饲喂40天后，降低了20.76%。另夕卜，B组的LDL-C浓度也显著降低((P0.05)，降低了20.05%。相比于A组，B组大鼠的TG浓度也显著降低，在试验结束时，降低了25.14%。总之，植物乳杆菌MA2降低了伺喂高胆固醇饲料大鼠的血清总胆固醇(TC)，低密度胆固醇(LDL-C)，甘油三酯(TG)的含量，但是，对HDL-C的浓度的影响不显著。表4MA2对饲喂高脂饲料大鼠的粪便TC和TG的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注A组，高胆固醇饲料；B组，高胆固醇饲料+植物乳杆菌MA2;试验结果表示为平均值(SD)(n=10),p<0.05*.MA2对大鼠肝脏和粪便中TC，TG的影响见表4，A，B两组的肝脏重量没有显著不同(P0.05)。相比于A组，B组肝脏中的胆固醇含量和TG含量显著降低(p0.05)，进一步证明大鼠血清中的胆固醇含量确实降低，并不是胆固醇在血液和肝脏中的重分配。另外，B组大鼠的排便量显著高于A组(P0.05)，证明植物乳杆菌MA2具有促进排便的益生功能。B组大鼠粪便中TC的含量显著高于A组(P0.05)，TG的含量也高于A组，但是并不显著(PX).05)。表5MA2对饲喂高脂饲料大鼠的粪便有机酸的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注A组，高胆固醇饲料；B组，高胆固醇饲料+植物乳杆菌MA2;试验结果表示为平均值(SD)(n=10)，p<0.05*'p<0.01**。表5描述了MA2对饲喂高脂饲料大鼠的粪便有机酸的影响。由表5可知，同A组相比，添加了植物乳杆菌MA2，即B组大鼠的丙酸含量显著升高，大约是A组的3倍。有报道称丙酸含量的升高，可以影响胆固醇代谢的主要酶类，导致胆固醇含量的降低，另外，乙酸是脂合成的底物，因此乙酸合成降低，可以引起脂肪合成的减少，而本实验，A，B两组的乙酸和丁酸的含量并没有显著差异。图2描绘了植物乳杆菌MA2对高胆固醇大鼠的粪便菌群的影响。由结果可知，在整个饲养期间，两组的大肠杆菌数量，基本上都没有发生太大变化，维持在89logcfog'、而B组的乳酸菌从第20天开始显著升高，最终升高到11.53logcfo，g'1,而A组的乳酸菌只有9.34logcfuf1;B组的双歧杆菌也从第24天显著升高，最终相比于A组，升高了一个数量级。许多研究表明益生乳酸菌可以在肠道中抑制病原菌的生长，促进优势益生菌的生长，调节肠道菌群的平衡，促进机体的健康。本实验中，植物乳杆菌MA2在体内促进了乳酸菌和双歧杆菌的生长，证明其可以通过胃液和胆汁的的不利环境，成功地到达肠道，发挥了其生理作用。另外，实验结果显示，植物乳杆菌MA2在体内，对大肠杆菌并没有显示明显的抑制作用，这与先前的体外抑菌试验结果一致，推测原因可能是因为植物乳杆菌MA2不能产生细菌素类物质，而是通过营养竞争作用促进了肠道内有益菌的生长。4、结论该益生菌制剂在降血脂的同时还具有调节肠道菌群的生理功能。二、Kefir源植物乳杆菌丄actokcz7/w:y;/朋ton^MA2的益生菌制剂的制备制备方法的步骤是-(1)将甘油管保藏的菌株MA2活化，接种到MRSbroth培养基中，厌氧培养18h后，得到发酵液；离心收集菌体，加入冻干保护剂，'真空冷冻干燥得菌粉；本步骤中，保护剂的配方为(质量百分比)10%的脱脂奶95%，海藻糖1.5%，甘油0.5%，山梨醇2%，麦芽糊精1%;(2)再加入低聚糖混合物，其添加组分及各组分在菌粉中的质量百分比分别为0.2%的低聚葡萄糖、0.3%的菊粉、0.2%的低聚果糖，混合，复配，研磨，测活菌数不少于1.0X101Qcfo/g,装胶囊或装于铝箔袋，制成胶囊420mg/粒或散剂500mg/袋。此外，本发明还可以进行Kefir源植物乳杆菌￡a"o6ac7'//wsp/朋tonw7MA2益生菌微胶囊的制备，其步骤是(1)将甘油管保藏的菌株MA2活化，接种到MRSbroth培养基中，厌氧培养18h后，得到发酵液；离心收集菌体，加入冻干保护剂，真空冷冻干燥得菌粉；本步骤中，保护剂的配方为(质量百分比)10%的脱脂奶95%，海藻糖1.5%，甘油0.5%，山梨醇2%，麦芽糊精1%;制备菌悬液，使菌体的浓度达到101Dcfu/mL;(2)然后对菌体进行三层包埋，即在上述制备的菌悬液中加入与菌悬液等体积的第一层包埋材料，包埋材料选用4%大豆分离蛋白溶液，常温下，200r/min搅拌20min至均匀，再等体积加入第二层包埋材料，包埋材料选用4%的微孔淀粉溶液，200r/min搅拌20min至吸附，接着加入2倍溶液体积的第三层包埋材料，包埋材料选用2%的海藻酸钠溶液，200r/min搅拌30min搅拌均匀，将得到的混合液滴入2%的CaCl2溶液中，固化30min成球；(3)进行真空冷冻干燥，即将上述制得的微球用无菌水漂洗后放在一8(TC的冰箱中预冻3h，在冷阱温度一5rC，真空度0.09毫巴，真空冷冻千燥24h,即制得Zfl"o6a"7/M//fl"mn/wMA2微胶囊；(4)再加入(质量比)0.2%的低聚葡萄糖，0.3%的菊粉，0,2%的低聚果糖，混合，复配，研磨，活菌数不少于1.0X10Wcfu/g。权利要求1、一种降血脂及调节肠道菌群的益生菌制剂的制备方法，其特征在于制备方法的步骤如下(1)将Keffr源植物乳杆菌MA2进行高密度培养，得到发酵液，其菌体密度不小于108cfu/mL；(2)上述发酵液经离心收集获得菌体，加入保护剂，冻干成菌粉；(3)在冻干的菌粉中加入低聚糖混合物，混合均匀即得益生菌制剂成品。2、根据权利要求1所述的一种降血脂及调节肠道菌群的益生菌制剂的制备方法，其特征在于所述保护剂用量为菌体重量的3倍。3、根据权利要求1或2所述的一种降血脂及调节肠道菌群的益生菌制剂的制备方法，其特征在于所述保护剂的构成及其质量百分比分别为10%的脱脂奶95%、海藻糖1.5%、甘油0.5%、山梨醇2%、麦芽糊精1%。4、根据权利要求1所述的一种降血脂及调节肠道菌群的益生菌制剂的制备方法，其特征在于所述低聚糖混合物的构成及其在菌粉中加入量分别为低聚葡萄糖0.2%、菊粉0.3%、低聚果糖0.2%。5、根据权利要求1所述的一种降血脂及调节肠道菌群的益生菌制剂的制备方法，其特征在于所述益生菌制剂成品包含的MA2的活菌数不少于1.0X101()cfo/g。6、根据权利要求1所述的一种降血脂及调节肠道菌群的益生菌制剂的制备方法，其特征在于所述Kefir源植物乳杆菌MA2已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保存编号为CGMCC3005。全文摘要本发明涉及一种降血脂及调节肠道菌群的益生菌制剂的制备方法，其步骤为(1)将Kefir源植物乳杆菌MA2进行高密度培养，得到发酵液，其菌体密度不小于10<sup>8</sup>cfu/mL；(2)上述发酵液经离心收集获得菌体，加入保护剂，冻干成菌粉；(3)在冻干的菌粉中加入低聚糖混合物，混合均匀即得益生菌制剂成品。本发明所制备的益生菌制剂在具有降血脂功能的同时还具有调节肠道菌群的生理功能，可以治疗和预防高血脂症状和调节肠道菌群，且无毒，安全，保存期长，可制成胶囊、微胶囊、冲剂、片剂等。文档编号A61K35/66GK101559082SQ200910069088公开日2009年10月21日申请日期2009年6月1日优先权日2009年6月1日发明者王艳萍,女许申请人:天津科技大学