专利名称：Dna与纳米层状羟基磷灰石复合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA与纳米层状羟基磷灰石复合物及其制备方法和应用，具体涉及一种DNA/层状羟基磷灰石纳米基因药物载体材料的制备。
背景技术：
介导基因转移的载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体的潜在诱发突变和致癌的危险限制了其在基因治疗中的应用。非病毒载体具有相对低毒、无免疫原性和致瘤性、DNA运载量大等优点。本发明的目的是建立一个非病毒载体的基因传递系统。DNA插层层状无机载体材料在近年来得到了广泛的研究。目前出现的DNA/蒙脱土、 DNA/层状双羟基化合物、DNA/页硅酸盐等DNA插层复合材料成功地对DNA进行了存储和释放，并且可以有效地保护DNA不受DNA酶的分解，同时对DNA的热稳定性也有一定的增强作用。然而，无论是蒙脱土还是层状双羟基化合物，它们的生物相容性都有待于进一步的研究。羟基磷灰石是性能优良的生物相容性材料，在生物医学领域有很大的应用前景。目前，国内外对羟基磷灰石作为基因载体方面进行了一定的研究，用于DNA载体的有羟基磷灰石和羟基磷灰石在酸性条件下的分解产物磷酸钙。磷酸钙纳米颗粒在经不同浓度的氯化钙等试剂修饰后，能与质粒DNA有效结合形成复合体，该复合体能吸附在细胞膜上，然后进入细胞内，增加进入细胞内DNA量，提高基因转染的效率。但是传统制备方法得出的普通结构的羟基磷灰石，不能形成对DNA的大量存储和有效保护。层状的羟基磷灰石在基因载体方面的应用一直是一项空白。将纳米层状羟基磷灰石和DNA运用插层技术组装在一起，有望使DNA/羟基磷灰石纳米插层复合物成为一种新型的非病毒基因传递系统，在未来基因工程的实验研究和基因治疗的临床实践以及疾病康复方面发挥重要作用。本发明首次采用溶液插层方法制备的DNA/层状羟基磷灰石复合物具有较大的层状存贮空间和优良的生物相容性，同时具有更高的酸度敏感性，可实现对基因的有效存储、保护和释放。对于基因工程和基因药物治疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种DNA与纳米层状羟基磷灰石复合物及其制备方法和应用。将DNA插层进入层状纳米羟基磷灰石内部，实现DNA的有效存贮、保护和释放，可以达到基因药物可控释放和治疗的目的。
本发明提供的DNA与纳米层状羟基磷灰石复合物是以鲑鱼精DNA和层状羟基磷灰石为原料，按照DNA和羟基磷灰石的质量比1: 5 100进行配料，其制备方法包括如下步骤
将层状羟基磷灰石的悬浮液与DNA透明溶液混合后在恒温摇床中进行振荡，静置吸附后将反应产物清洗并离心，干燥。所得复合物层间距介于3.3nm至4.8nm之间。本发明提供的DNA/层状羟基磷灰石复合物的制备方法包括如下步骤
1) 将5 100份的层状轻基磷灰石粉体加水溶解，超声得到分散均匀的悬浮液。间歇超声2 4次，每次0.5min，超声功率100 W，超声频率40KHz。
2) 用焦碳酸二乙酯(DEPC)缓冲液配置质量浓度为1 mg/ml的鲑鱼精DNA溶液，将1份DNA溶液加入到步骤l)的悬浊液中，震荡，超声分散，然后加入灭菌高纯水定容，得到混合液。超声条件间歇超声l-3次，每次0.5min，超声功率100 W，超声频率40 KHz 。
3) 将混合液放入25 r恒温摇床，转速150rpm，每振荡0.3 h，平衡吸附1 h，间歇操作此过程，累计振荡6次后静置吸附24h。
4) 反应产物水洗，然后超速离心，去除未插层的游离DNA，产物室温干燥。本发明提供的DNA/层状羟基磷灰石复合物用于基因药物载体。
显著性效果本发明提供的DNA/层状羟基磷灰石复合物具有插层结构。复合物层间距介于3.3 nm至4.8 nm之间。实现了超螺旋结构DNA的存储，保护和释放。本发明提供的复合物制备方法相对容易，成本低。制备的复合物可有效保护DNA不受DNA酶的分解，并且在较低的酸性条件下可以进行释放。对于羟基磷灰石在基因药物载体中的应用，尤其是在多基因药物治疗和蛋白质/基因复合药物治疗方面具有重要意义。
图1是X射线小角度衍射图。
图2是不同pH下释放DNA电泳照片。
具体实施方式
实施例
将50 mg层间距为3.1 nm的层状羟基磷灰石粉体加入锥形瓶中(制备方法见CN101058416)，加少量灭菌的高纯水。间歇超声3次，每次0.5 min，超声功率100 W，超声频率40KHz，最终得到分散均匀的羟基磷灰石悬浮液。用100mL焦碳酸二乙酯溶液溶解固态鲑鱼精DNA (市售)，配制成浓度为1 mg/mL的溶液。将1 mg DNA溶液逐滴加入锥形瓶中，振荡并超声，超声条件间歇超声2次，每次0.5min，超声功率100W，超声频率40KHz。最后定容至20mL。将锥形瓶放入恒温摇床振荡，转速150rpm，温度25°C，每摇动0.3h，平衡吸附lh，重复操作6次。将得到的产物清洗并超速离心，离心速率12000rpm，室温干燥。进行XRD测试和电泳测试，图1是X射线小角度衍射图谱，图2是电泳测试照片。测试结果小角度范围内羟基磷灰石衍射峰左移，对应的层间距为4.8 nm。复合物(100)晶面间距比复合前的纯羟基磷灰石(3.1nm)扩大了 1.7 nm。表明DNA分子已经进入羟基磷灰石的层间，同时还说明复合物仍然保留有层状的有序结构。电泳照片结果表明DNA在pH低于4时候开始释放，并且在pH = 2时达到释放最大值。
权利要求
1、一种DNA与纳米层状羟基磷灰石复合物，其特征在于它是以鲑鱼精DNA和层状羟基磷灰石为原料，按照DNA和羟基磷灰石的质量比1∶5～100进行配料，其制备方法包括如下步骤将层状羟基磷灰石的悬浮液与DNA溶液在摇动下反应，反应产物水洗，常温干燥；
2、 按权利要求1所述的DNA/层状羟基磷灰石复合物，其特征在于所述的DNA/层状羟基磷灰石复合物具有插层状结构，层间距为3.3 4.8nm。
3、 按权利要求1所述的DNA/层状羟基磷灰石复合物的制备方法，其特征在于它是包括如下步骤1) 将5 100份的层状羟基磷灰石粉体加水溶解，超声得到分散均匀的悬浮液；2) 用焦碳酸二乙酯(DEPC)缓冲液配置质量浓度为1 mg/ml的鲑鱼精DNA溶液，将1份DNA溶液加入到步骤l)的悬浊液中，震荡，超声分散，然后加入灭菌高纯水定容，得到混合液；3) 将混合液放入25 。C恒温摇床，转速150rpm，每振荡0.3 h，平衡吸附1 h，间歇操作此过程，累计振荡6次后静置吸附24h;4) 反应产物水洗，然后超速离心，去除未插层的游离DNA，产物室温干燥。
4、 按照权利要求3所述的DNA/纳米层状羟基磷灰石复合物的制备方法，其特征在于步骤l)所述的超声条件间歇超声2 4次，每次0.5 min，超声功率100 W，超声频率40 KHz。
5、 按照权利要求3所述的DNA/纳米层状羟基磷灰石复合物的制备方法，其特征在于步骤2)所述的超声条件间歇超声1 3次，每次0.5min，超声功率100 W，超声频率40 KHz 。
6、 权利要求1所述的DNA与纳米层状羟基磷灰石复合物的应用，其特征在于该材料用于基因药物载体。
全文摘要
本发明涉及一种DNA与纳米层状羟基磷灰石复合物及其制备方法，它是以层状羟基磷灰石和鲑鱼精DNA为原料，按照DNA与层状羟基磷灰石的质量比1∶5～100进行配料，其制备方法是将层状羟基磷灰石的悬浮液与DNA溶液于37℃下间歇摇动反应5～7次，常温下干燥；本发明提供的复合物具有插层型结构，层间距为3.3～4.8nm，实现了超螺旋结构DNA的存储，保护和释放。本发明提供的复合物制备方法相对容易，成本低。对于羟基磷灰石在多基因药物治疗和蛋白质/基因复合药物治疗方面的应用具有重要意义。
文档编号A61K47/48GK101648023SQ20091007024
公开日2010年2月17日 申请日期2009年8月26日 优先权日2009年8月26日
发明者万怡灶, 芳 何, 孟宪光, 左桂福, 王洁华 申请人:天津大学