专利名称：含人组织因子途径抑制因子和gfp的真核双表达载体及构建方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及含人组织因子途径抑制因子(TFPI) 和绿色荧光蛋白(GFP)的真核双表达载体及构建方法。
背景技术：
目前在防治血管再狭窄的所有措施中，药物支架是目前临床上最常用的手段，但 它可能会导致部分患者出现支架内或全身系统性高敏反应，并可能导致血栓形成，最终形 成再狭窄。人组织因子途径抑制因子(TFPI)具有抗血栓、抑制血管平滑肌细胞增生以及抑 制炎症反应的三重功能，在血管再狭窄的防治中具有巨大的应用潜力。但是，由于TFPI重 组蛋白的生物半衰期短、静脉滴注所需量大、给药时间长，在使用上存在安全性较差、作用 效果较慢、没有示踪作用的指标等不足因素的存在，直接采用TFPI重组蛋白静脉滴注方式 防治血管再狭窄受到了极大限制。因此，突破目前防治血管再狭窄所有措施在保证安全性、 提高基因投递效率、使蛋白示踪且功能完整等方面存在的局限具有重大临床意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种含人组织因子途径抑制因子和 GFP的真核双表达载体，通过载体携带的TFPI基因的转录表达，以发挥TFPI蛋白抗血栓、抑 制血管平滑肌细胞增生以及抑制炎症反应的防治血管再狭窄的功能。并且，该真核双表达 载体使得TFPI和GFP从同一个双顺反子mRNA互不干扰地同时表达，通过对GFP的观察即 可有效示踪TFPI在细胞内的表达。因此，该发明不但保证了防治血管再狭窄治疗中的安全 性、提高了 TFPI基因投递效率，而且使TFPI蛋白示踪且功能完整，为相关研究提供强有力 的技术支持。本发明的第二个目的是提供一种含人组织因子途径抑制因子和GFP的真核双表 达载体的构建方法。本发明的技术方案概述如下含人组织因子途径抑制因子和GFP的真核双表达载体，用下述方法制成以序 列表SEQID NO. 2、SEQ ID NO. 3所述序列为PCR引物，以ρ IRES-TFPI为模板，扩增出人 组织因子途径抑制因子基因阅读框架，回收得序列表SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列，与 Pires2-AcGFP1-Nuc加入T4DNA连接酶进行反应，制成含人组织因子途径抑制因子和GFP的 真核双表达载体 Pires2-Acgfp1-Nuc-Tfpi。本发明运用基因工程技术成功构建并鉴定了含人组织因子途径抑制因子和GFP 的真核双表达载体，使得TFPI和GFP的基因从同一个双顺反子mRNA互不干扰地同时表达， 实现了通过观察GFP即可确定TFPI基因表达的目的，同时经检测证明了该载体不但能够在 细胞内互不干扰的同时表达TFPI和GFP基因而且能够分泌TFPI蛋白到细胞外，为人类组 织因子途径抑制因子用于疾病防治研究提供了有效研究工具。
图1为本发明技术路线；
图2为PCR扩增片段TFPI 片段大小为937bp ；
图3 为双酶切后的 TFPI 和 pIRES2-AcGFP1-Nuc ；
图4为重组质粒的PCR鉴定；
图5为重组质粒的酶切图谱鉴定；
图6为倒置荧光显微镜观察细胞内绿色荧光蛋白的表达(20X10)；
图7为RT-PCR检测TFPI的mRNA表达；
图8为内参标定后TFPI的mRNA表达量(η = 3)；
图9为ELISA检测不同时间点细胞培养液上清中的TFPI蛋白量(η
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1制备含人组织因子途径抑制因子和绿色荧光蛋白(gfp)的真核双表达载体1.分别设计上、下游PCR引物，如序列表SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3所示，由上 海生工生物工程技术服务有限公司负责合成并纯化，以pIRES-TFPI为模板，采用PCR扩 增出人组织因子途径抑制因子基因阅读框架，回收得序列表SEQ ID NO. 1所述的核苷酸 序列。反应体系为 50μ 1 无菌去离子水 34. 5μ l，10XEx Taq Buffer (Mg2+Plus) 5 μ 1， dNTP Mixture (各 2. 5mM)4y 1，模板 DNA(5. 73ng/ μ 1)2 μ 1，上、下游引物(20 μ Μ)各 1μ 1， TaKaRa Ex Taq (0. 5U/μ 1)2. 5μ 1 ；反应条件为① 94°C 预变性 2min ；② 94°C 变性 30sec ； ③55°C复性30sec ；④72°C延伸Imin ；⑤72°C延伸5min ；其中②③④重复30个循环；将 PCR反应产物上样于1. 5%琼脂糖凝胶，电泳30分钟(结果见图2，图中M表示DNA分子量 标准，100-6，OOOWide Range DNAMarker (TaKaRa) ； 1 表示 PCR 扩增片段 TFPI 片段大小为 937bp)，并用DNA纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)纯化PCR扩增DNA片段；2.用限制性内切酶EcoR I和Sac II双酶切纯化的PCR扩增片段；反应体系为 20 μ 1 纯化的 PCR 扩增片段1 μ g ；IOXT Buffer 2μ 1 ；0. 1%BSA 2μ 1 ；EcoR I 1 μ 1 ； Sac II 1μ 1 ；无菌去离子水补足20μ 1。反应条件为37°C，5小时；3.用限制性内切酶双酶切载体piRES2-acgfp1-nuc ；首先用sac ii进行酶切处理， 反应体系为 20 μ 1 =Pires2-AcGFP1-Nuc 1 μ g ；IOXT Buffer 2 μ 1 ；0. 1%BSA 2μ 1 ； Sac II 1μ 1 ；无菌去离子水补足20 μ 1。反应条件为37°C，3小时；用DNA纯化试剂盒(天根生化 科技有限公司)纯化后再使用ecor i进行酶切处理，反应体系为20 μ 1 =Pires2-acgfp1-nuc lug ；IOXH Buffer 2μ 1 ；EcoR I 1 μ 1 ；无菌去离子水补足20 μ 1。反应条件为37°C，3 小时；4.将酶切后的pcr扩增片段和载体piRES2-acgfp1-Nuc分别上样于1. 5%琼脂 糖凝胶，电泳30分钟(结果见图3，图中M表示DNA分子量标准，100-6, 000 Wide Range DNAMarker (TaKaRa) ；1表示双酶切后的tfpi片段；2表示双酶切后的Pires2-AcGFP1-Nuc)， 用DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)，分别回收纯化；
5.将上述片段进行连接反应，反应体系为25μ 1 :10XT4DNA Ligase Buffer 2· 5 μ 1 ； TFPI 片段约 0. 3pmol ；载体 ρ I Res2-AcGFP1-Nuc 约 0. 03pmol ； T4DNA Ligase (350U/ μ 1)1μ 1 ；无菌去离子水补足25 μ 1。反应条件为16°C，16小时；上述反应液直接转化感受态大肠杆菌DH5 α，并将100 μ 1转化后菌液直接涂布在 LB卡那(卡那霉素含量为100yg/ml)培养琼脂平板上，37°C，12小时；6.挑取单菌落至IOml LB卡那(卡那霉素含量为ΙΟΟμ g/ml)培养基，250rpm， 37°C培养10小时，各取1μ 1菌液进行PCR鉴定，其余菌液4°C保存；反应体系为50 μ 1 无 菌去离子水 35. 5 μ 1，10 X Ex Taq Buffer (Mg2+Plus) 5 μ 1，dNTP Mixture (各 2. 5mM) 4 μ 1， 菌液 1 μ 1，上、下游引物(20 μ Μ)各 1μ 1，TaKaRa Ex Taq (0. 5U/y 1)2. 5μ 1 ；反应条件为 ①94°C预变性2min ；②94°C变性30sec ；③55°C复性30sec ；④72°C延伸Imin ；⑤72°C延 伸5min ；其中②③④重复30个循环；将PCR反应液上样于1.5%琼脂糖凝胶，电泳30分钟(结果见图4，图中M表 示DNA分子量标准，Ikb plus DNA Marker (TaKaRa) ； 1表示PCR产物)，将阳性结果对 应的菌液从4°C取出，使用质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)，小量提取质粒 Pires2-Acgfp1-Nuc-Tfpi ；7.将上述质粒分别用限制性内切酶EcoR I, Sac II进行单酶切和双酶 切处理；反应体系和反应条件同上；将反应液上样于1.5%琼脂糖凝胶，电泳30分 钟(结果见图5，图中M表示DNA分子量标准，Ikb plus DNAMarker (TaKaRa) ； 1表示 Pires2-Acgfp1-Nuc-Tfpi ；2 表示 EcoR ι 单酶切 Pires2-Acgfp1-Nuc-Tfpi ；3 表示 Sac π 单 酶切 Pires2-Acgfp1-Nuc-Tfpi ；4 表示 ecor ι 和 Sac π 双酶切 Pires2-Acgfp1-Nuc-Tfpi)， 结果符合理论预期；8.将质粒送往上海生工生物工程技术服务有限公司和宝生物工程有限公司 (TaKaRa)进行测序，测序结果符合模板中人组织因子途径抑制因子序列。pIRES-TFPI的构建已在《壳聚糖载基因纳米粒子的研究》《生物医学工程学杂志》 (2005年)第22卷第6期，1171-1176页公开。实施例2含人组织因子途径抑制因子和GFP的真核双表达载体在NIH 3T3细胞内的表达1.用含10%胎牛血清的DMEM培养基、在含5% CO2的孵箱内培养NIH 3T3细胞； 转染前的1天，用含血清不含抗生素的DMEM培养基以IX IO5的密度将细胞接种于6孔培 养板中(每孔2ml培养基)，细胞长到50%融合时，用Opti-MEM培养基轻轻换洗两遍后进 行转染；转染过程按照Lipofectamine 2000的产品说明书进行操作；DNA 浓度为 0.67yg/ml，Lipofectamine 2000 体积浓度为 0. 08 %, DNA Lipofectamine 2000 =Iyg 1. 25 μ 1 ；转染分为三组样品，分别为①转 Pires2-Acgfp1-Nuc-Tfpi②转Pires2-Acgfp1-Nuc③不转dna。转染后24小时在倒置荧光显 微镜下观察到GFP的表达(结果见图6，图中1表示荧光下转Pires2-AcGFP1-Nuc-TFPI的细 胞；2表示明场下转Pires2-Acgfp1-Nuc-Tfpi的细胞；3表示荧光下转Pires2-Acgfp1-Nuc 的细胞；4表示明场下转PIRES2-AcGFP1-NUc的细胞；5表示荧光下不转DNA的细胞；6表示 明场下不转DNA的细胞)，同时分别在转染后24小时、36小时、48小时、60小时收取三组样 品90 μ 1的细胞上清，同时用等量完全培养基补足，收取的液体冻存 于-80°C，作为ELISA检测的样品；2.转染72小时后用Trizol试剂分别提取三组样品的细胞总RNA，RT-PCR方法 检测TFPI基因mRNA的表达。同时检测GAPDH的表达，作为内参照；其中，扩增TFPI片 段的上、下游引物以序列表SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5所示，扩增GAPDH片段的上、下游 引物以序列表SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7所示；反应体系为50 μ 1 :DEPC水31. 5 μ 1， 10 X PCRBuffer (Mg2+Plus) 5 μ 1，dNTP Mixture (各 2. 5mM)4y 1，转录反应液 5 μ 1，上、下游 引物(20μΜ)各 1μ 1，TaKaRaTaq(0. 5U/μ 1)2. 5 μ 1。反应条件为① 95°C预变性 3min ； ②95°C变性30sec ；③65°C复性30sec ；④72°C延伸30sec ；⑤72°C延伸7min ；其中②③④ 重复30个循环；将PCR反应液上样于1. 5%琼脂糖凝胶，电泳30分钟(结果见图7，图中M表示 DNA 分子量标准，150bp DNAmarker (TaKaRa) ；1 表示转 pIRESfAcGFPfNuc-TFPI 细胞 cDNA 扩增的GAPDH片段；2表示转Pires2-Acgfp1-Nuc-Tfpi细胞cDna扩增的tfpi片段；3表示 转 Pires2-AcGFP1-Nuc 细胞 cDNA 扩增的 GAPDH 片段；4 表示转 Pires2-AcGFP1-Nuc 细胞 cDNA 扩增的TFPI片段；5表示不转DNA细胞cDNA扩增的GAPDH片段；6表示不转DNA细胞cDNA 扩增的TFPI片段)。用凝胶扫描系统扫描测定各组样品TFPI片段与GAPDH片段的净光密 度值，然后将前者比后者的比值进行分析(结果见图8)；5.将冻存于-80°C的用于ELISA检测的样品取出，使其在室温下自然融化， 4671rpm 高速离心 10 分钟，取上清用 ELISA 试剂盒(AssayMax Human Tissue Factor Pathway Inhibitor(TFPI)ELISA Kit)检测，每组样品每个时间点设三个复孔，将各孔的
OD450的值代入标准曲线，所得对应的TFPI蛋白浓度进行分析(结果见图9)。
序列表
<110>中国医学科学院生物医学工程研究所
<120>含人组织因子途径抑制因子和GFP的真核双表达载体及构建方法
<160>7
<210>1
<211>937bp
<212>DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<220>
<221>gene
<222>⑴…(937)
<400>1
cgaccgaattcatgatttacacaatgaagaaagtacatgcactttgggcttctgtatgcc60
tgctgcttaatcttgcccctgcccctcttaatgctgattctgaggaagatgaagaacaca120
caattatcacagatacggagttgccaccactgaaacttatgcattcattttgtgcattca180
aggcggatgatggcccatgtaaagcaatcatgaaaagatttttcttcaatattttcactc240
gacagtgcgaagaatttatatatgggggatgtgaaggaaatcagaatcgatttgaaagtc300
tggaagagtgcaaaaaaatgtgtacaagagataatgcaaacaggattataaagacaacat360
tgcaacaagaaaagccagatttctgctttttggaagaagatcctggaatatgtcgaggtt420
<213>人工合成<220><221>gene<222>(1)... (25)<400>5cttggttgat tgcggagtca gggag25<210>6<211>21bp<212>DNA<213>人工合成<220><221>gene<222>(1)... (21)<400>6accacagtcc atgccatcac t21<210>7<211>20bp<212>DNA<213>人工合成<220><221>gene<222> ⑴…(20)<400>7tccaccaccc tgttgctgta20
8
权利要求
含人组织因子途径抑制因子和GFP的真核双表达载体，其特征是用下述方法制成以序列表SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所述序列为PCR引物，以pIRES TFPI为模板，扩增出人组织因子途径抑制因子基因阅读框架，回收得序列表SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，与pIRES2 AcGFP1 Nuc加入T4连接酶进行反应，制成含人组织因子途径抑制因子和GFP的真核双表达载体pIRES2 AcGFP1 Nuc TFPI。
2.权利要求1的含人组织因子途径抑制因子和GFP的真核双表达载体的构建方法， 其特征是由下述步骤组成以序列表SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所述序列为PCR引物，以 pIRES-TFPI为模板，扩增出入组织因子途径抑制因子基因阅读框架，回收得序列表SEQID NO. 1所述的核苷酸序列，与PIRES2-AcGFP1-Nuc加入T4连接酶进行反应，制成含人组织因 子途径抑制因子和GFP的真核双表达载体Pires2-Acgfp1-Nuc-Tfpi。
全文摘要
本发明公开了含人组织因子途径抑制因子和GFP的真核双表达载体及构建方法，载体是用下述方法制成以序列表SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所述序列为PCR引物，以pIRES-TFPI为模板，扩增出人组织因子途径抑制因子基因阅读框架，回收得SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，与pIRES2-AcGFP1-Nuc加入T4连接酶进行反应制成。本发明的载体，使得TFPI和GFP的基因从同一个双顺反子mRNA互不干扰地同时表达，实现了通过观察GFP即可确定TFPI基因表达的目的，同时经检测证明了该载体不但能够在细胞内互不干扰的同时表达TFPI和GFP基因而且能够分泌TFPI蛋白到细胞外。
文档编号A61P9/10GK101955974SQ200910070830
公开日2011年1月26日 申请日期2009年10月16日 优先权日2009年10月16日
发明者冷希岗, 刘兰霞, 宋丽萍, 朱敦皖, 楼莎, 董霞 申请人:中国医学科学院生物医学工程研究所