专利名称：含重组人促红细胞生成素的缓释微球制剂、制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制剂，尤其是一种含重组人促红细胞生成素的乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物缓释微球制剂及其制备方法。
背景技术：
促红细胞生成素(Erythropoietin ，EPO)是一种由肾脏近曲小管合成的活性 糖蛋白，能刺激骨髓红系造血母细胞的增殖和分化，对红细胞发育起主要调控作 用。目前，基因工程技术生产的重组人促红细胞生成素已成为临床上治疗肾性 贫血的首选药物，对肿瘤化疗所致贫血，及其它贫血性疾病都有良好效果。但 是，目前临床上使用的剂型为促红细胞生成素的粉针剂或者是水针剂，用于肌 肉或静脉注射。目前对所有批准适应症的治疗包括通过静脉内或皮下注射，每 周三次，起始剂量为50 150U/Kg。目前推荐的起始剂量可以在6 8周内将 血细胞比容升高到目标范围，随后建立起随患者改变的维持给药方案。促红细 胞生成素治疗贫血的给药方案都需要长期注射给药，都需要医护人员的帮助才 能进行。无疑给患者带来较大的经济负担，同时也给患者的生活带来了很大的 不便。因此，研究促红细胞生成素的长期缓释制剂具有重要意义。各国学者为 克服蛋白和多肽药物体内半衰期短、稳定性差和口服生物利用度低等缺点，已 经研究开发了多种给药方式，如呼吸道吸入、直肠给药、鼻腔、口服、透皮给 药、眼部和非胃肠道给药等。但是，这些给药方式都有各自的缺点，而缓释微 球载药系统显示了其独特的优点，得到了广泛的关注。采用生物可降解材料将 蛋白和多肽药物制成缓释微球制剂，可提高药物的稳定性，实现药物控释或缓 释。己有多种多肽和蛋白类药物的微球制剂得到批准用于临床，成功地降低了 给药频率，增加了病人的依从性。复乳溶剂挥发法是常用的制备蛋白质和多肽 微球的方法，1998年，Kissel等人报道了用W/O/W复乳溶剂挥发法研制的人 促红细胞生成素的缓释微球，人的缓释时间达到30 — 40天，成功实现了缓释的目的，但是，初释效应仍然很严重，超过了总释放量的50^以上(BittnerBetal. Recombinant human erythropoietin (rhEPO) loaded poly(lactide-co-glycolide) microspheres: influence of the encapsulation technique and polymer purity on microspherecharacteristics.EuropeanJournalof Pharmaceutics and
Biopharmaceutics， 1998， 45: 295~305)。 Burke等人使用喷雾干燥的方法首先制 备了促红细胞生成素和海藻糖的粉末，然后使用s/o/w复乳溶剂挥发法制备了 促红细胞生成素的PLGA缓释微球，海藻糖成功保护了促红细胞生成素的稳定 性，微球中蛋白质的完整性超过98% ( Paul A. Burke et al. Poly(Lactide-Co-Glycolide) Microsphere Formulations of Darbepoetin Alfa: Spray Drying Is an Alternative to Encapsulation by Spray-Freeze Drying. Pharmaceutical Research, 2004， 21(3):500-506)。但是，体外释放的研究结果表 明，人促红细胞生成素释放的总量明显不足，低于总量的30%。由于蛋白质是 生物大分子，具有脆弱的、但对其生物活性所必需的三维结构，目前，维持蛋 白药物在包封过程中和释放过程中的稳定性依然是研制蛋白类药物载体系统所 面临的挑战。尽管使用S/O/W复乳溶剂挥发法可以避免初乳制备过程中蛋白质 在水/有机溶剂界面上的变性和聚集，但是，蛋白质依然面临着很多在微球制备和 释放过程中造成蛋白质失活的不利因素，如冷冻干燥过程、聚合物降解所造成的 微球内的酸性微环境和聚合物的疏水表面。蛋白质的变性尤其是药用蛋白质不 仅仅造成药物失去药效，还可能引起免疫反应，如重组促红细胞生成素的变性 和聚集可能会造成纯红再障。因此，保持重组促红细胞生成素在微球制备、储
存和释放过程中的稳定性是建立重组人促红细胞生成素缓释微球载药系统所面 临的重要问题，此外，在释放过程蛋白质的突释效应和不完全释放也是建立重 组促红细胞生成素缓释微球载药系统所要解决的重要问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有载药系统技术上的不足，提供一种非静脉给药的 含重组人促红细胞生成素的缓释微球制剂。
本发明的另一目的是提供一种含重组人促红细胞生成素的缓释微球制剂 的制备方法。本发明的目的还包括提供一种含重组人促红细胞生成素的缓释微球制剂的 用途。
本发明的构思是这样的采用S/O/W复乳溶剂挥发法制备重组人促红细胞 生成素缓释微球，首先使用冷冻干燥法制备包含人血清白蛋白和重组人促红细 胞生成素微粒，然后使用生物可降解高分子材料乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物为载 体材料包封人血清白蛋白和重组人促红细胞生成素微粒，制备重组人促红细胞 生成素的乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物缓释微球。
具体地，本发明所说的含重组人促红细胞生成素的缓释微球制剂由高分子 材料乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物为载体材料，包封人血清白蛋白和重组人促红细 胞生成素微粒制备而成，其中，人血清白蛋白和重组人促红细胞生成素微粒由 人血清白蛋白、重组人促红细胞生成素和添加剂组成，微粒粒径大小在0.1 10 pm，所说的人血清白蛋白和重组人促红细胞生成素微粒中人血清白蛋白的质量 分数为5% 98%、重组人促红细胞生成素的质量分数为1% 50%、添加剂的 质量分数为0.1% 45%，所说的添加剂为聚乙烯醇、海藻糖、葡聚糖、淀粉、 氢氧化镁、碳酸镁、磷酸盐中的一种或它们的任意混合物。
本发明中所说的重组人促红细胞生成素包括通过基因突变产生的各种重组 人促红细胞生成素及其体外修饰物，可以是重组人促红细胞生成素、氨基酸 或其侧链糖基化修饰改变的重组人促红细胞生成素的突变体以及经聚乙二醇修 饰的重组人促红细胞生成素及其突变体。
本发明选用的乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物分子量为4.0xl03 5.5xl04，其中 聚乳酸与聚羟基乙酸(PLA:PLG)的质量比为(50:50) (85:15)。
本发明所说的含重组人促红细胞生成素的缓释微球制剂以乳酸-羟基乙酸 嵌段共聚物为基质原料，表面光滑，颗粒规则无粘连，平均粒径为60 105 pm， 载药量和包封率高，蛋白质稳定性好，缓释期达到30天以上，适合于非静脉给 药。
本发明所说的含重组人促红细胞生成素的缓释微球制剂的制备方法包括以 下歩骤
(1)将重组人促红细胞生成素、人血清白蛋白(HSA)、聚乙二醇(PEG)和添加剂的混合溶液在一80。C预冻过夜，常规冷冻干燥，所得到的固形物用二 氯甲烷洗涤除去聚乙二醇(PEG),制备得到重组人促红细胞生成素和人血清白 蛋白微粒；
(2)将乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物(PLGA)溶于有机溶剂中制成油相，取适 量上述的人血清白蛋白和重组人促红细胞生成素微粒作为固相加入上述油相， 其中固相与油相的质量体积比为0.05 0.2 (g/ml),使用超声波细胞粉碎机或
高速搅拌机将其匀化后形成S/O初乳，将初乳滴加入外水相分散介质聚乙烯醇 溶液中，室温下低速搅拌4 6小时，即得含重组人促红细胞生成素的乳酸-羟 基乙酸嵌段共聚物缓释微球制剂，常规冷冻干燥，保存。
本发明的制备方法中，采用的是普通超声波细胞粉碎机，其功率为1200 瓦，使用功率以低功率为佳；所采用的高速搅拌机是普通高速搅拌机，转速为 10000 30000转/分，以20000转/分为佳。
所述的乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物缓释微球的s/o初乳制备方式包括使用
普通高速搅拌机搅拌乳化，搅拌时间为30 300秒；或者使用普通超声波细胞粉
碎机超声乳化，超声乳化时间为20 200秒。
所述的有机溶剂为二氯甲垸或二氯甲烷和丙酮的混合液，其中当有机溶剂
为二氯甲烷和丙酮的混合液时，二氯甲烷与丙酮的体积比为75:35。 所述的油相中乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物的浓度50 250 mg/ml。 所述的外水相分散介质聚乙烯醇的浓度为0.5% 5%，可加入浓度为0
10%的无机盐，以增加重组促红细胞生成素的包封率，外水相的pH值为
6.0~8.5。
本发明中蛋白质微粒和乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物(PLGA)缓释微球制剂的 表征，通过以下实验来揭示
使用扫描电镜测定重组人促红细胞生成素和人血清白蛋白混合微粒的粒 径。载有重组促红细胞生成素的乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物微球包封率测定方 法准确称取乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物微球，加入0.5ml二氯甲烷溶解载体材 料，加入0.5ml0.01M盐酸，从有机相中充分萃取蛋白，用Bradford方法测定水相中蛋白含量；包封率=微球中蛋白量/蛋白投料量><100%。粒径分析仪 器测定微球的粒径分布，扫描电镜扫描微球的表面形态。测定载有重组促红细 胞生成素的乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物微球体外释放曲线取pH7.4 PBS缓冲 液lml于离心管中，将乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物微球悬浮其中，置37。C、 100 rpm摇床上，每日取样，每次取样时用新鲜的缓冲液替换原来的缓冲液； Bradford试剂盒测定释放样品中蛋白含量，同时使用酶联免疫分析(ELISA) 实验测定释放的重组促红细胞生成素含量，测定后计算累计蛋白质释放百分率 和重组促红细胞生成素释放百分率，绘制体外释药曲线。
间接酶联免疫分析(ELISA)实验测定体外释放样品中的重组人促红细胞 生成素将体外释放样品真空冷冻干燥成固体粉末，用0.05M, pH9.6的碳酸盐 缓冲液溶解该固体粉末成溶液，在酶标板的反应孔中加入O.l ml， 4 "C过夜。 次日洗涤后用5%的脱脂牛奶缓冲液封闭满孔，37 'C封闭2 h。洗涤后加入 1:1000稀释的兔源重组人促红细胞生成素多克隆抗体0.1 ml，37。C孵育l h。洗 涤后于各反应孔中加入新鲜稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 0.1 ml， 37 r孵育1 h。洗涤后各反应孔中加入四甲基联苯胺显色液0.1 ml， 37 'C， 10-30 min后加入终止液终止反应，于450 nm测各反应孔OD值。
载有重组人促红细胞生成素的乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物微球大鼠体内药 效学大鼠8只，体重大约250 g，每只肌肉注射乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物微 球15mg,微球用含2%羧甲基纤维素钠的生理盐水溶液悬浮，在设定的时间从 大鼠尾部取血20pl，直接稀释到0.5ml抗凝液中，用血球计数仪测定红细胞浓 度，血红蛋白浓度和血细胞比容。40天后测大鼠体内产生重组人促红细胞生成 素的抗体水平；同时使用大鼠3只，体内注射热变性的重组促红细胞生成素 O.lmg， 40天后，使用酶联免疫分析(ELISA)实验检测大鼠体内产生的重组 促红细胞生成素的抗体水平。
十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白质样品及蛋白质分子量 标准，加等体积2x十二烷基硫酸钠凝胶加样缓冲液，10(TC煮沸5min;浓縮 胶浓度为5%，分离胶浓度为10%，以考马斯亮蓝R250染色显示蛋白条带。 PLGA微球用二氯甲垸溶解后，离心弃上清，沉淀用0.02 moHL—1 pH7.4磷酸盐缓冲液悬浮，然后进行非还原SDS-PAGE分析。
间接ELISA法测大鼠血清中人促红细胞生成素抗体水平用0.05M，p1^9.6 的碳酸盐缓冲液稀释人促红细胞生成素至终浓度为lHg/ml，在酶标板的反应孔 中加入O.lml， 4'C过夜。次日洗涤后用5%的脱脂牛奶缓冲液封闭满孔，37°C 封闭2h。洗涤后加入一定稀释倍数的注射微球的大鼠血清O.lml，设置阴性对 照(不加血清)和阳性对照(加入注射变性人促红细胞生成素的、同样稀释倍数的 的大鼠血清O.lml)， 37。C孵育lh。洗涤后于各反应孔中加入新鲜稀释的辣根过 氧化物酶标记的兔抗大鼠IgG0.1ml,37t:孵育lh。洗涤后各反应孔中加四甲基 联苯胺显色液O.ltnl， 37°C， 10-30 min后加入终止液终止反应，于450 nm测 各反应孔OD值。
本发明将人血清白蛋白作为稳定剂，制备人血清白蛋白和重组人促红细胞 生成素微粒，同时加入添加剂海藻糖、氢氧化镁、磷酸盐中的一种或几种，一 方面可以使蛋白质在微球制备、储存和释放过程中得到稳定，另一方面，可以 调节微球内蛋白质的释放行为。乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物和外水相中加入无机 盐后，可显著提高蛋白质的包封率和降低蛋白质的突释效应。SDS-PAGE分析 表明所制备微球内人血清白蛋白未见有明显聚集，注射微球的大鼠体内抗体检 测试验表明，重组促红细胞生成素的抗体未见明显升高，进一步说明所制备的 微球在制备和释放过程中均保持稳定性。
本发明所制备微球表面光滑，外观均匀，颗粒规则无粘连，平均粒径在70 一105pm;载药量、包封率高；体外缓释期在30天以上，并且在所释放的蛋白 质经十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，未出现明显的聚集，所 包封和释放的蛋白质稳定性良好；大鼠体内药效学研究结果表明，所制备的微 球可以使大鼠体内红细胞浓度、血红蛋白、血细胞比容显著升高达到30天以上， 进一步测定大鼠体内的重组促红细胞生成素抗体，发现所产生的抗体量很低， 与空白对照无明显差异。
所制备乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物微球可生物降解，生物相容性好，可用于 皮下、肌肉等非静脉形式给药，用于肾性贫血患者，提高病人的血细胞比容， 因此，可作为治疗肾性贫血药物的缓释制剂。
图1为制备的人血清白蛋白和重组人促红细胞生成素微粒的电镜照片。 图2为载有重组人促红细胞生成素的乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物微球的电镜 照片。
图3为载有人促红细胞生成素的乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物微球的体外药物 释放曲线。
图4为注射人促红细胞生成素的乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物微球后大鼠体 内红细胞浓度、血红蛋白浓度、血细胞比容随时间的变化。
其中图4 (a):注射人促红细胞生成素微球前后，大鼠体内红细胞浓度随时
间的变化。
图4(b):注射人促红细胞生成素微球前后，大鼠体内血红蛋白浓度随
时间的变化。
图4 (C):注射人促红细胞生成素微球前后，大鼠体内血细胞比积随时 间的变化。
图5为注射微球40天后大鼠体内的重组人促红细胞生成素抗体的酶联免疫分析结果。
本发明取得的有益效果如下本发明所制备微球表面光滑，外观均匀，
颗粒规则无粘连，平均粒径在70 — 105jim;载药量、包封率高；药物缓释和药 效维持时间均可以达到30天以上，并且微球内的蛋白质稳定性良好。所制备的
乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物微球可生物降解，生物相容性好，可用于皮下、肌肉 等非静脉形式给药，用于肾性贫血患者，提高病人的血细胞比容，因此，可作
为治疗肾性贫血药物的缓释制剂。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。 实施例l
将10 ml浓度分别为0.5 mg/ml重组人促红细胞生成素、10 mg/ml人血清 白蛋白(HSA)、 45 mg/ml聚乙二醇的混合溶液在一80。C预冻过夜，常规冷冻 干燥，所得得到的固形物用二氯甲烷连续洗涤三次除去聚乙二醇，制备得到重组人促红细胞生成素和人血清白蛋白的混合微粒。将40mg重组人促红细胞生 成素和人血清白蛋白的混合微粒乳化于2 ml浓度为60 mg/ml的乳酸-羟基乙酸 嵌段共聚物二氯甲垸溶液中，在搅拌速率为20000转/分的条件下乳化60s，得 到S/O乳液。将该乳状液用微量取样器注入到250ml含2%聚乙烯醇的0.02 M 磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，以600 rpm的转速搅拌1 min制得S/O/W乳状液， 向该乳状液中加入250 ml0.02M磷酸盐缓冲液，室温下300 rpm搅拌6 h，将 有机溶剂挥发，微球固化后离心收集，双蒸水洗涤三次，按照常规方法冷冻干 燥，得到重组促红细胞生成素微球。所得到的蛋白质重组促红细胞生成素和人 血清白蛋白的混合微粒平均粒径为0.4 fim，所得乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物缓释 微球平均粒径为76.72 nm，包封率为12.3%，载药量为0.21%,突释率为85 %。
实施例2
将10 ml浓度分别为0.5 mg/ml重组促红细胞生成素、10 mg/ml人血清白 蛋白(HSA)、 30mg/ml聚乙二醇的混合溶液在一80 。C预冻过夜，常规冷冻干 燥，
所得得到的固形物用二氯甲烷连续洗漆三次除去聚乙二醇，制备得到重组 促红细胞生成素和人血清白蛋白的混合微粒。将40 mg重组促红细胞生成素和 人血清白蛋白的混合微粒乳化于2 ml浓度为120 mg/ml的乳酸-羟基乙酸嵌段 共聚物二氯甲烷溶液中，在搅拌速率为20000转/分的条件下乳化60s， 得到S/O乳液。将该乳状液用微量取样器注入到250 ml含2%聚乙烯醇的0.02 M磷酸盐缓冲液(pH为7.4)中，以600 rpm的转速搅拌lmin制得S/O/W乳 状液，向该乳状液中加入250ml 0.02M磷酸盐缓冲液，室温下300 rpm搅拌6h， 将有机溶剂挥发，微球固化后离心收集，双蒸水洗涤三次，按照常规方法冷冻 干燥，得到重组促红细胞生成素微球。所得到的蛋白质重组促红细胞生成素和 人血清白蛋白的混合微粒平均粒径为0.6nm，所得PLGA缓释微球平均粒径为 75.43nm，包封率为40.61%,载药量0.32%，突释率为76%。 实施例3
将10 ml浓度分别为0.5 mg/ml重组促红细胞生成素、10 mg/ml人血清白蛋白(HSA)、 45mg/ml聚乙二醇的混合溶液在一8(TC预冻过夜，常规冷冻干 燥，所得得到的固形物用二氯甲垸连续洗涤三次除去聚乙二醇，制备得到重组 促红细胞生成素和人血清白蛋白的混合微粒。将40 mg重组人促红细胞生成素 和人血清白蛋白的混合微粒乳化于2 ml浓度为150 mg/ml的乳酸-羟基乙酸嵌 段共聚物二氯甲烷溶液中，在搅拌速率为20000转/分的条件下乳化60s，得到 S/0乳液。将该乳状液用微量取样器注入到250ml含2XPVA的0.02 M磷酸 盐缓冲液(pH 7.4)中，以400 rpm的转速搅拌1 min制得S/O/W乳状液，向 该乳状液中加入250 ml 0.02M磷酸盐缓冲液，室温下300 rpm搅拌6h，将有 机溶剂挥发，微球固化后离心收集，双蒸水洗涤三次，按照常规方法冷冻干燥， 得到重组促红细胞生成素微球。所得到的蛋白质重组促红细胞生成素和人血清 白蛋白的混合微粒平均粒径为0.4 jim，所得PLGA缓释微球平均粒径为 106.24nm，包封率为65.3%，载药量为0.36%，突释率为35%。 实施例4
将10 ml浓度分别为0.5 mg/ml重组人促红细胞生成素、10 mg/ml人血清白 蛋白(HSA)、 45mg/ml聚乙二醇的混合溶液在一8(TC预冻过夜，常规冷冻干 燥，所得得到的固形物用二氯甲垸连续洗涤三次除去聚乙二醇，制备得到重组 人促红细胞生成素和人血清白蛋白的混合微粒。将40 mg重组人促红细胞生成 素和人血清白蛋白的混合微粒乳化于2 ml浓度为150 mg/ml的乳酸-羟基乙酸 嵌段共聚物二氯甲垸溶液中，在搅拌速率为20000转/分的条件下乳化 60s，得到S/O乳液。将该乳状液用微量取样器注入到250ml含2^PVA的0.02 M ， pH7.4的磷酸盐缓冲液中，该缓冲液中不含NaCl，以600rpm的转速搅拌 1 min制得S/O/W乳状液，向该乳状液中加入250 ml 0.02 M磷酸盐缓冲液，室 温下300 rpm搅拌6h，将有机溶剂挥发，微球固化后离心收集，双蒸水洗涤三 次，按照常规方法冷冻干燥，得到重组促红细胞生成素微球。所得到的蛋白质 重组促红细胞生成素和人血清白蛋白的混合微粒平均粒径为0.4 pm，所得乳酸 -羟基乙酸嵌段共聚物缓释微球平均粒径为77.23 nm，包封率为15.47%,载药 量为0.15%，突释率为87%。 实施例5将10 ml浓度分别为0.5 mg/ml重组促红细胞生成素、10 mg/ml人血清白 蛋白(HSA)、 45 mg/ml聚乙二醇的混合溶液在一80。C预冻过夜，常规冷冻干 燥，所得得到的固形物用二氯甲垸连续洗涤三次除去聚乙二醇，制备得到重组 人促红细胞生成素和人血清白蛋白的混合微粒。将40 mg重组人促红细胞生成 素和人血清白蛋白的混合微粒乳化于2 ml浓度为150 mg/ml的乳酸-羟基乙酸 嵌段共聚物二氯甲烷溶液中，在搅拌速率为20000转/分的条件下乳化60s，得 到S/O乳液。将该乳状液用微量取样器注入到250 ml含2%聚乙烯醇的0.02 M 磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，以600 rpm的转速搅拌1 min制得S/O/W乳状液， 向该乳状液中加入250ml0.02M磷酸盐缓冲液，室温下300 rpm搅拌6 h，将 有机溶剂挥发，微球固化后离心收集，双蒸水洗涤三次，按照常规方法冷冻干 燥，得到重组促红细胞生成素微球。所得到的蛋白质重组促红细胞生成素和人 血清白蛋白的混合微粒平均粒径为0.4 pm (图1):所得乳酸-羟基乙酸嵌段共 聚物缓释微球平均粒径为8(Him (图2)，包封率为70%，载药量为0.375%; 缓
释微球突释率为29% ，总蛋白和人促红细胞生成素释放总量达到卯以上(图3)。 大鼠体内释放试验结果表明，载药微球使大鼠体内红细胞浓度、血红蛋白浓度、 血细胞比容显著升高30天以上(图4)，进一步测定大鼠体内的重组促红细胞 生成素抗体，发现所产生的抗体量很低，与阴性对照无明显差异，与阳性对照 差异显著(图5)。说明我们所制备的重组人促红细胞生成素微球的稳定性好， 在制备过程中没有产生聚集和破坏。
权利要求
1、一种含重组人促红细胞生成素的缓释微球制剂，其特征在于由高分子材料乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物为载体材料，包封人血清白蛋白和重组人促红细胞生成素微粒组成，其中，人血清白蛋白和重组人促红细胞生成素微粒由人血清白蛋白、重组人促红细胞生成素和添加剂组成，所说的人血清白蛋白和重组人促红细胞生成素微粒中人血清白蛋白的质量分数为5％～98％、重组人促红细胞生成素的质量分数为1％～50％、添加剂的质量分数为0.1％～45％，所述的添加剂为聚乙烯醇、海藻糖、葡聚糖、淀粉、氢氧化镁、碳酸镁、磷酸盐中的一种或它们的任意混合物。
2、 根据权利要求1所述的含重组人促红细胞生成素的缓释微球制剂，其特 征在于重组人促红细胞生成素包括通过基因突变产生的各种重组人促红细胞生 成素及其体外修饰物，可以是重组人促红细胞生成素、氨基酸或其侧链糖基 化修饰改变的重组促红细胞生成素的突变体以及经聚乙二醇修饰的重组促红细 胞生成素及其突变体中的一种。
3、 根据权利要求1所述的含重组人促红细胞生成素的缓释微球制剂，其特 征在于乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物分子量为4.0xl03 5.5404，其中聚乳酸与聚 羟基乙酸(PLA:PLG)的质量比范围为(50:50) (85:15)。
4、 如权利要求1所述的含重组人促红细胞生成素的缓释微球制剂的制备方 法，其特征在于包括以下步骤(1) 将重组人促红细胞生成素、人血清白蛋白(HSA)、聚乙二醇(PEG) 和添加剂的混合溶液在一80'C预冻过夜，常规冷冻干燥，所得得到的固形物用 二氯甲烷洗涤除去聚乙二醇(PEC)，制备得到人血清白蛋白和重组人促红细胞 生成素微粒；(2) 将乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物(PLGA)溶于有机溶剂中制成油相，取适 量上述的人血清白蛋白和重组人促红细胞生成素微粒作为固相加入上述油相， 其中固相与油相的质量体积比为0.05 0.2 (g/ml)，使用超声波细胞粉碎机或 高速搅拌机将其匀化后形成S/O初乳，将初乳滴加入外水相分散介质聚乙烯醇溶液中，室温下低速搅拌4 6小时，即得含重组人促红细胞生成素的乳酸-羟 基乙酸嵌段共聚物缓释微球制剂，常规冷冻干燥，保存。
5、 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所制备的乳酸-羟基乙酸嵌 段共聚物缓释微球的S/O初乳制备方式包括使用普通高速搅拌机搅拌乳化，搅 拌时间为30 300秒；或者使用普通超声波细胞粉碎机超声乳化，超声乳化时间 为20 200秒。
6、 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所采用的普通超声波细胞 粉碎机，其功率为1200瓦，所采用的普通高速搅拌机，转速为10000 30000转 /分。
7、 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中所说的有机溶剂为二氯甲垸或二氯甲烷和丙酮的混合液；当有机溶剂为二氯甲烷和丙酮的混 合液时，二氯甲烷与丙酮的体积比为75:35。
8、 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中的油相中乳酸 -羟基乙酸嵌段共聚物的浓度50 250 mg/ml。
9、 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的外水相分 散介质聚乙烯醇的浓度为0.5% 5%，外水相的pH值为6.0-8.5。
10、 一种含重组人促红细胞生成素的缓释微球制剂的用途，其特征在于作为 制备治疗肾性贫血药物的缓释制剂。
全文摘要
本发明公开了一种含重组人促红细胞生成素的缓释微球制剂。采用S/O/W复乳溶剂挥发法制备得到重组人促红细胞生成素缓释微球，首先使用冷冻干燥法制备包含人血清白蛋白和重组人促红细胞生成素微粒，然后使用生物可降解高分子材料乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物为载体材料包封人血清白蛋白和重组人促红细胞生成素微粒，制备重组人促红细胞生成素的乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物缓释微球制剂。本发明所制备微球表面光滑，外观均匀，颗粒规则无粘连，平均粒径在70-105μm；载药量、包封率高；体外缓释期在30天以上。所得缓释微球制剂生物相容性好，可用于皮下、肌肉等非静脉形式给药，作为制备治疗肾性贫血药物制剂，可以提高病人的血细胞比容。
文档编号A61K47/34GK101507712SQ20091007396
公开日2009年8月19日 申请日期2009年3月20日 优先权日2009年3月20日
发明者冯美彦, 杨 姜, 倩 梁, 贺进田 申请人:河北师范大学