专利名称：Glp-1及其类似物在制备治疗阿尔茨海默氏病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及胰高血糖素样肽-1 (Glucogon like p印tide-l， GLP-1)及其类似物的新用途， 尤其是涉及其在制备治疗阿尔茨海默氏病(Alzheimer disease, AD)药物中的应用。
技术背景胰高血糖素样肽-1 (以下简称glp-1)是一种食物刺激肠道L细胞分泌的肠肽，由36 37 个氨基酸组成，是胰高血糖素原转录后的修饰产物。GLP-1的分子量约为3355，可以通过一 种特异的肽转运体经血液循环进入大脑，在大脑皮层、海马及小脑的神经元都可检测到碘标 GLP-1的低密度结合。GLP-1的功能由GLP-1受体(Glucagon like peptide-1 rec印tor， GLP-1R)介导。GLP-1R 在啮齿类动物及人的脑中分布广泛，在背侧丘脑、脑干、矢中隔、穹窿下器、尾状核、大脑 皮层、海马、小脑中均有表达。GLP-1R属于G蛋白偶联受体B家族(分泌素家族)中的胰高血 糖素受体亚家族，在人和鼠的胰岛、肺、脑、胃、心脏及肾脏中都有广泛的表达。glp-i广泛分布于啮齿动物及人类体内，呈葡萄糖依赖性地作用于胰岛e细胞，可促进胰岛素基因的转录、胰岛素的合成和分泌，降低胰高血糖素的水平，降低胃排空率、提高饱 足感以及剌激胰岛素生物合成。另外，2型糖尿病患者胰高血糖素水平常常升高，并因此导 致肝糖元输出，而GLP-1对此有拮抗作用。这些效应使得GLP-1成为一种治疗2型糖尿病的 很好药物。1、 GLP-1具有促进胰岛素分泌并抑制胰高血糖素分泌的作用现有资料表明，持续输注GLP-1可显著降低2型糖尿病患者的空腹和餐后血糖水平，连 续输注6周GLP-1后，2型糖尿病患者的糖化血红蛋白(HbAlc)可显著降低。即使对于磺脲类 药物失效的2型糖尿病患者，输注glp-1仍能引起显著的降糖和促胰岛素分泌作用。而且，与其他胰岛素促泌剂不同的是，GLP-1促进胰岛素分泌的作用依赖于较高的葡萄 糖水平，在正常和较低葡萄糖水平下，GLP-1促胰岛素分泌和抑制胰高血糖素分泌的作用很 弱。细胞水平研究显示，在低葡萄糖水平下，GLP-1与e细胞上的G蛋白偶联受体特异性结合后，仅引起钙离子少量内流和胰岛素微量释放，而高血糖时，e细胞内的三磷酸腺苷/二磯酸腺苷(atp/adp)比值升高，atp依赖的钾通道开放使e细胞复极化延迟，glp与其受体结合 后可引起钙离子长时间内流，并导致较多的胰岛素释放。因此，GLP-1促进胰岛素分泌的作 用呈葡萄糖依赖性，使得升高GLP-1水平的药物基本不会引起低血糖。此外，在葡萄糖摄入前连续输注3小时GLP-1，可显著改善胰岛素的第一时相分泌，表明其促胰岛素分泌作用比较符合正常的生理模式。2、 GLP-i具有保护e细胞的作用e细胞功能衰退是2型糖尿病病情进展的核心原因。现有资料表明，连续输注6周GLP-1可显著改善2型糖尿病患者的e细胞功能。动物试验和体外研究表明，glp-i还能激活e细胞再生，保护人P细胞的正常形态，并且抑制0细胞凋亡。这一特性使得GLP-1可遏制2型 糖尿病的病情进展。3、 胰腺外作用现有资料表明，注射GLP-1可延缓胃排空，长期输注GLP-1后，还可作用于下丘脑摄食 中枢，增加饱胀感并抑制进食，这也有利于2型糖尿病患者控制血糖和体重。心肌细胞中也有glp-1的特异性受体，glp-1与之结合后，可以模拟胰岛素样作用，增 加心肌细胞对葡萄糖的摄取。在重度充血性心衰患者中进行的临床研究显示，此类患者长期 输注GLP-1，可以改善左室射血分数(LVEF),并增强运动能力。综上所述，GLP-1的主要生理功能是调节血糖，通过刺激胰岛素分泌和胰岛素基因的表达，抑制高血糖素的分泌，促进e细胞的增殖与分化，减少e细胞的凋亡，促进胰岛团块的形成。这一作用使得glp-1在较短时间内即从一个正常的生理性内分泌激素转变成为2型糖 尿病的治疗药物。虽然GLP-1具有多种治疗2型糖尿病的有益机制，但是，将GLP-1作为治疗2型糖尿病 的药物应用于临床，长期以来却很有难度。glp-1进入人体后，可以被广泛存在的二肽基肽 酶-4(DPP-4)快速降解，半衰期不足5min，皮下注射的半衰期也只有1 2小时。所以，天然 的GLP-1不能直接作为药物使用。克服GLP-1半衰期短，临床上难以从血液中检测到的缺点，从而能够使GLP-1应用于临 床的可行方法之一是对GLP-1进行结构修饰，使其不易被DPP-4降解。截至目前为止，已经发展了多种GLP-1的类似物，如表1中给出了 GLP-1及部分GLP-1 类似物的氨基酸序列。这些已经发展起来的GLP-1类似物中，部分制剂已经在美国获FDA批 准上市，或正在临床试验中。其中，正在注册的GLP-1增强剂有Vildagliptin、 Sitagliptin 等，进入临床III、 II期试验的有Denagliptin、 SYR 322、 Saxagliptin、 Ro-0730699、 PSN 9301、 TA 6666、 Exenatide(Ex4) 、 Val (8)GLP-1等。例如，Exenatide是爬虫类激素exendin-4的人工合成品，具有与GLP-1作用相似的结 构与功能，半衰期长，已经通过了美国食品和药物监督管理局审批，成为治疗2型糖尿病的 辅助药物，并在2005年年中在美国上市，商品名Byetta。 Exenatide已被证实可以与大鼠胰岛细胞的GLP-1R结合，可以对抗DPP-4对GLP-1的分解作用，表现出依赖性胰岛素分泌增加 效应；由于Exenatide的清除率较慢，其促胰岛素功能比GLP-1强63%，并显示出较好的安 全性和降糖疗效。表1 GLP-1及部分GLP-1类似物的氨基酸序列 7 16 30 36 45GLP-1 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR G(8) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR V(8) HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR GG(2) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAP GG(3) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS GLP-1 ET HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPPS有资料证明，其它可以对抗DPP-4的GLP-1类似物与Exenatide的作用相似。 发明内容本发明的目的是提供GLP-1及其类似物的一种新用途。事实上，本发明涉及GLP-1及其类似物作为制备治疗或预防阿尔茨海默氏病的药物中的 应用。由于GLP-1的半衰期较短，为了更好地理解本发明的实质，本发明拟以GLP-1的一种类 似物Val (8) GLP-1的药理试验及结果来说明其在制药领域中的新用途。本发明所使用的GLP-1类似物Val(8)GLP-l是由英国Ulster大学Dr Holster实验室赠 送的。该药物具有更高的生物学活性和更长的药理学活性，是一种新型的GLP-1类似物，已 经于2007年正式批准为专利(该药物同时也在中国申请了专利，公开号CN1910201A)。Morris水迷宫检测实验结果显示，Val (8)GLP-1保护组比STZ模型组的潜伏期短，过平 台次数多，说明Val(8)aP-l对于抑制AD的形成存在一定的保护作用。免疫组织检测结果也 发现，Val(8)GLP-l保护组大鼠血清中AP变化不明显、大脑皮层中的AP含量也没有明显增 加，表明Val(8)GLP-l具有降低Ae含量的功能，在该AD模型中发挥有一定的保护作用。根据氨基酸序列表和现有资料所示，GLP-1及其类似物具有相似的功效，因此，使用GLP-1 及其其他类似物均可达到同样的药理效果，区别仅在于不同的类似物的半衰期有所差异。以上实验结果说明，GLP-1及其类似物确实具有防止AD形成的作用，均可以作为制备治 疗或预防AD病的药物应用。
具体实施方式
5下面通过试验动物侧脑室给予Val (8) GLP-1 (以下简称V8)，观察V (8)对侧脑室注射链脲 菌素(Str印tototocis， STZ)诱导的AD动物模型的保护作用。 一、V(8)对STZ诱导的实验动物行为学改变的保护作用经典的Morris水迷宫检测的是大鼠在多次训练中，学会寻找固定位置的隐蔽平台，形成 稳定的空间位置认知，这种空间认知是加工空间信息(外部线索)形成的。平台的位置与大鼠 自身所处的位置和状态无关，是一种以异我为参照点的参考认知，所形成的记忆是一种空间 参考记忆。从信息的加工和提取方式来看，这种空间参考记忆进入意识系统，其储存的机制 主要涉及边缘系统(如海马)以及大脑皮层有关脑区，应该属于陈述性记忆。而临床健忘和痴 呆的病人正是陈述性记忆首先受损，而且比较突出，所以从检测的记忆属性来说，运用Morris 水迷宫来进行防治此类疾病有效药物的筛选研究是比较恰当的。本试验中应用侧脑室注射STZ诱导AD模型，试图检测V(8)对该模型有何干预效果，以 期待其是否具有防止AD的作用。1、 实验材料1) 实验动物Wistar大鼠，雄性，体重230 250g，数量50只，由山西医科大学动物中 心提供。动物词养环境用实验啮齿类动物饲料喂养，经过一周的适应性饲养后，排除体质 较差大鼠两只(食欲较差，体重明显下降)，手术前，10只一笼饲养，手术后，21天内分笼 饲养。2) 试剂及仪器水合氯醛，天津化学试剂三厂；双氧水，天津市东方华工厂；Morris水 迷宫，北京隆冠科技发展有限公司及中科院心理研究所研制；STZ，美国Sigma公司；脑立体 定位仪，深圳沃瑞森公司；电子秤，SART0RIAS LC;微量推进器，深圳沃瑞森公司。2、 实验方法 l)实验动物筛査实验前进行水迷宫初筛，以测量大鼠对水迷宫的学习与记忆获取能力，实验数据采用7 天的平均数据，数据采集和处理由Morris迷宫图像自动监视处理。 严格按照Morris方法进行，实验分为两部分第一部分，定位航行实验。历时7天，从第1天起，每天分上、下午各训练l次。训练 时随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，记录大鼠寻找并爬上平台所需时间(潜伏 期)，每次训练时间为60s。如果大鼠在60s内未找到平台，须将其引至平台，这时潜伏期记 为60s，每次训练后让其在平台上停留15s。第二部分，空间搜索实验。在第6天撤除水下平台，随机选取一入水点，在同一入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录其在60s内跨过原平台相应位置的次数和第一次通过平台的 时间。实验前1天将每只大鼠颈部染黑。实验前，预先在水池中注入自来水，水深30cm(水面 高出站台表面lcm，使大鼠不能见到站台)，站台位于一个象限的中央，加入奶粉使水池中水呈乳白色，水温保持在2i士rc。在隔音、较暗的房间内进行，通过初筛，去除先天痴呆(潜 伏期平均值〉50s)和游泳姿势不良者。2) 实验动物分组将筛查合格大鼠随机分为三组空白对照组，模型组和V(8)保护组。每组10只，共30只。3) 实验前Morris水迷宫行为测定实验操作方法同筛査，数据采集和处理由Morris迷宫图像自动监视处理系统完成。4) 实验动物侧脑室注射经水迷宫实验动物筛査、适应性训练后，对Wistar大鼠禁食不禁水12小时，腹腔注射 10y。水合氯醛(3ml/kg)施以麻醉。参考《大鼠脑立体定向图谱》，将大鼠的头固定于立体定位 仪上，剪去局部毛发，消毒后沿矢状线切开皮肤，切口长约1.5cm，将骨膜向两侧推开显露 颅骨。在前囟后l.Omm、矢状缝侧方1.5ram处钻孔，以微量进样器垂直进入，深度距离脑表 面3.5mm处缓慢注入STZ。 STZ按照3 mg/kg的剂量溶解于生理盐水中，在手术的第1和第3 天分别向两侧侧脑室内注射，每次每侧注入约1(M1。V(8)保护组同时给予每只V(8) (3nmolA4) 5W。空白对照组注射相同体积的生理盐水。每侧注入时间10min，留针5min，缓慢出针，以 防止颅压升高过快。无菌骨蜡封闭钻孔，术区滴注庆大霉素，缝合消毒。手术后大鼠分笼饲 养，给予普通伺料及自来水喂养。5) 手术后Morris水迷宫行为测定实验各组大鼠分别于术后21天进行Morris水迷宫实验，测定大鼠的空间学习记忆能力，方 法同实验前。3、实验结果空白对照组、STZ模型组和V(8)保护组分别给予生理盐水、STZ以及STZ加V(8)， 21天 后观察潜伏期和过平台次数两项数据，结果见表2、表3。由于潜伏期和过平台次数均为非正 态分布，采用配对秩和检验。根据实验结果显示，实验前与实验后21天相比，空白对照组的潜伏时间无显著差异 (P>0.05)，而实验后STZ模型组和V(8)保护组的潜伏期明显增加，并且有显著性差异(P<0.05)，对实验后21天的三组数据进行方差分析发现，三组数据间存在显著性差异，说 明实验延长了大鼠的潜伏时间(表1)。而在大鼠过平台次数方面，实验后21天三组数据的均 值都有下降，用方差分析对实验后21天的三组数据进行两两比较，发现STZ模型组与空白对 照组相比有显著性差异(P〈0.05)，与V(8)保护组相比亦有显著性差异，而V(8)保护组和空 白对照组相比，次数略有减少，但无统计学差异(表2)。表2大鼠潜伏时间的变化(s) n=10实验前(s)实验后第21天(s)空白对照组18. 20±8. 1917. 23±6. 29STZ模型组18.34±7. 9650. 23±3. 22V(8)保护组17. 89±8. 0240. 59±4. 23*注STZ模型组与空白对照组和V(8)保护组比较，*P<0.05表3大鼠过平台次数 n=10实验前实验后第21天空白对照组3. 18±1. 183. 12±1. 29STZ模型组3. 06±1.550. 63 ±0. 55V(8)保护组3. 13±0. 992. 86±1.03*注STZ模型组与空白对照组和V(8)保护组比本P〈0. 05STZ模型组的潜伏期比空白对照组长，说明STZ诱导的AD模型中存在着空间记忆能力下 降，表明该模型在行为学方面诱导出了AD变化。V(8)保护组比STZ模型组潜伏期短，过平台 次数多，说明V(8)存在一定的保护作用，但是V(8)保护组与空白对照组的潜伏期相比仍然较 长，或许与V(8)的剂量或给予次数有关，需进一步研究实验。二、 V(8)对STZ诱导的实验动物血清和脑组织A 6表达的作用AD有两大病理特征， 一是因神经元细胞外过多AP沉积形成SPs，另一个是因Tau蛋白 过度磷酸化诱导NFTs， SPs和NFTs均可引起神经元的凋亡，导致AD发病和认知功能衰退。侧脑室注射STZ诱导AD模型，可导致大鼠脑内AP增加、Tau蛋白过度磷酸化。AP沉积 在AD患者的老年斑中，是各种原因诱发AD的共同途径，也是AD形成和发展的关键因素。1、实验材料l)试剂及仪器水合氯醛，天津化学试剂三厂；双氧水，天津市东方华工厂；Morris水 迷宫，北京隆冠科技发展有限公司及中科院心理研究所研制；STZ，美国Sigma公司；P淀粉样蛋白放射免疫测定试剂盒，解放军总医院科技开发中心放免所；e淀粉样蛋白免疫组化试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司；即用型SABC免疫组化试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司；DAB显色剂，武汉博士德生物工程有限公司；脑立体定位仪，深圳沃瑞森公司；Mias-2000图像分析仪，四川大智胜股份有限公司；SN-695B型智能放免Y-测量仪，上海原子核研 究所日环仪器一厂；电子秤，SARTORIAS LC;微量推进器，深圳沃瑞森公司；D-37520型低 温高速离心机，德国Kendro公司。2)实验动物同第一部分。2、实验方法1) 实验动物筛査 同第一部分。2) 实验动物分组 同第一部分。3) 实验动物侧脑室注射 同第一部分。4) 实验取材在侧脑室注射STZ前，以及注射后的第7、第14及第21天，分别对各组大鼠采取断尾 取血，静置lh， 3000rpm/min离心20min，用移液枪移取血清，置Eppendorf管中，一20。C 冰箱内保存待用。在第21天大鼠进行Morris水迷宫实验后，将动物处死，断头，分离大脑 皮层，以4%多聚甲醛和乙醇的固定液固定，梯度酒精脱水，浸蜡，石蜡包埋待用。5) 检测血清AP水平 5. l)测定方法采用平衡饱和竞争放射免疫法检测，取聚苯乙烯试管编号，按下表操作表4 AP PIA加液程序(W)试剂 T NSB S。 S「S2 样品缓冲液/200 100//标准液// /100/样 品// //100抗血清// 1001001001251_ 0100100 100100100混匀 4°C 24hPR试剂500500 500500500充分混匀，室温放置20min后，4。C下3500rpm/min离心20min，弃去上清液，在Y计数器上测定cpm数。5. 2)结果计算以B/T计算NSB、 S。结合百分率，以B/B。计算标准品及待测样品结合百分率，在半对数 坐标纸上绘制标准曲线，并查出样品值，或由Y计数器预先编制程序，直接给出有关参数。 6)AP免疫组化染色6. l)载玻片防脱片处理6.1. l)将新载玻片在酸液中浸泡过夜，自来水反复冲洗，蒸馏水冲洗，95%乙醇浸泡2小 时，绸布擦干。6. 1. 2)将载玻片浸入新鲜配制的1 : 50 APES丙酮液内30秒，取出稍停片刻，再放入纯 丙酮溶液中，涮去未结合的APES，自然晾干。 6. 2)免疫组织化学染色程序应用链霉素 一 卵白素 一 生物素一 过氧化物酶法(SABC): 6. 2. 1)蜡块4Wn连续切片，捞片后置于6(TC烤箱24小时。6.2.2) 二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水。6.2.3) 蒸馏水新鲜配置3%过氧化氢室温15分钟，以消除内源性过氧化物酶反应。蒸馏 水洗3次。6.2.4) 热抗原修复将切片浸入0.01mol/L枸橼酸缓冲液(pH二6.0)中，电炉加热至沸腾 后断电，间隔10分钟后重复一次。冷却后以0. lmol/L PBS洗涤3次。6.2.5) 正常山羊血清封闭40分钟，甩去多余液体，不洗。6.2.6) 滴加兔抗大鼠AP多克隆抗体1 : 50稀释，置于湿盒内，4'C下过夜，PBS洗2分 钟X3次。6.2.7) 滴加生物素化山羊抗血清抗兔IgG， 37。C温箱20分钟，PBS洗2分钟X3次。 6. 2. 8)滴加试剂SABC， 37'C温箱20分钟，PBS洗5分钟X4次。 6.2.9)DAB镜下控染，蒸馏水充分洗涤，以洗去残余的染色剂。6.2. IO)苏木素轻度复染。脱水、透明、封片，显微镜观察。 6. 3)结果判定用PBS代替一抗作阴性对照。以神经细胞内外出现棕黄色颗粒为阳性，应用Mias-2000 图像分析仪，每张切片的阳性结果区域随机取5个高倍视野，测定一定面积内阳性信号平均 灰度值，计算各组平均灰度值。3、实验结果i)血清Ae检测结果对三组大鼠进行血清Ae水平检测可以发现，空白对照组、STZ模型组和V(8)保护组数 据都随时间的延长而增加，但通过T检验可以看出(表5)，空白对照组和V(8)保护组的变化 不显著(P〉0. 05)，而STZ模型组的AP升高并且在第7天、第14天和第21天与实验前相比 均有显著性差异(P〈0. 05),且STZ模型组的AP随着时间的增加变化越来越明显。V(8)保护组的血清Ae变化不明显，表明V(8)具有降低AP含量的功能，在该AD模型中 发挥一定的保护作用。表5 各组血清AP水平检测实验前第7天第14天第21天空白对照组8.84±3.099. 14±2. 749. 09±2. 548.96±2. 58STZ模型组9. 11±2. 969.36±2. 2016. 59±3. 32*22.68±3.85*V(8)保护组9. 25±3. 039. 02±2. 419. 18±2. 299. 65±2. 79注STZ模型组AP含量第7天，14天，21天与试验前相比冲<0.052)脑组织Ae含量从免疫组化染色结果可以看出，在STZ模型组出现免疫染色阳性神经元，其特征是免疫阳性部位为棕黄色，颜色深浅显示Ae量的多寡，主要出现于大脑皮层，但并未出现由Ae沉积形成的成熟老年斑。而空白对照组和V(8)保护组基本没有出现阳性染色。图像分析结果显 示STZ模型组和V(8)保护组与空白对照组相比，Ae免疫染色在大鼠大脑皮层染色灰度值均 较对照组低，即A P含量增高(表6)。由于三组数据相对比较独立，因此采用非参数体检验中的Kiallis方法，假设三组数据 没有显著性差异，把三组数据混合后计算平均秩，得到P值小于0.05，故拒绝原假设，从平 均秩来看STZ模型组的最大，因而这组数的影响具有统计学意义，即STZ对照组的大脑皮层 AP含量高于空白对照组和V(8)保护组，而V(8)保护组与空白对照组相比，大脑皮层中Ae 含量没有明显增加，没有统计学差异。表6 大鼠大脑皮层AP含量(灰度，空白对照组STZ模型组V(8)保护组脑组织AP含量65. 17±9. 8473. 44±10. 8*68. 07 ±13. 92注STZ模型组与空白对照组及V(8)保护组相比承P〈0. 051权利要求
1、GLP-1在制备治疗或预防阿尔茨海默氏病的药物中的应用。
2、 GLP-1类似物在制备治疗或预防阿尔茨海默氏病的药物中的应用。
3、 GLP-1类似物Val (S)GLP-l在制备治疗或预防阿尔茨海默氏病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及GLP-1及其类似物在制备治疗或预防阿尔茨海默氏病的药物中的应用。本发明以GLP-1的类似物Val(8)GLP-1进行药理试验，Morris水迷宫检测结果显示，Val(8)GLP-1保护组比STZ模型组的潜伏期短，过平台次数多，说明Val(8)GLP-1对于抑制AD的形成存在一定的保护作用；免疫组织检测结果发现，Val(8)GLP-1保护组大鼠血清Aβ变化不明显、大脑皮层中的Aβ含量也没有明显增加，表明Val(8)GLP-1具有降低Aβ含量的功能，在该AD模型中发挥有一定的保护作用。以上实验结果说明，GLP-1及其类似物确有防止AD形成的作用。
文档编号A61K38/17GK101607079SQ20091007455
公开日2009年12月23日 申请日期2009年6月24日 优先权日2009年6月24日
发明者张志锋, 琳 李, 颖 高 申请人:琳 李