专利名称：：一种抑制肿瘤细胞增殖的药物及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种抑制肿瘤细胞增殖的药物及其应用。
背景技术：
：在正常的哺乳动物细胞中，抑癌蛋白p53主要通过泛素连接酶E3和26S蛋白酶体降解途径而维持在较低的水平。当细胞面对癌基因激活、DNA损伤等应激信号时，抑癌蛋白p53的降解会被抑制，p53的量会迅速上升，转录激活功能被活化，诱导下游靶基因激活，进而引起细胞周期阻滞、细胞凋亡或DNA损伤修复等应激反应。研究表明，p53在蛋白水平的变化与其功能的发挥有很大的关系。因此，P53泛素化降解通路对p53功能的调节十分重要。MDM2是一种重要的负责p53泛素化修饰的泛素连接酶E3。同时mdm2也是p53转录激活的下游靶基因，在p53的调节中形成一个严谨的负反馈调节机制。遗传学研究证明，MDM2在p53的调节中十分重要，MDM2功能的缺失可以挽救因p53失活而导致的胚胎致死。细胞的很多应激反应都是通过影响MDM2-p53通路来稳定p53。比如，在面对癌基因激活的情况下，pl4ARF可以通过抑制MDM2泛素连接酶活性的方式来上调p53。另外有一大类定位于核仁的蛋白也能影响该通路，包括核糖体蛋白L5、L11、L23和S7，早幼粒细胞白血病蛋白(PML)和核仁磷酸蛋白(NPM1)。核糖体蛋白参与p53的调节作用主要发生在核糖体应激的情况下，比如低浓度的放线菌素0、血清饥饿、5-氟-尿嘧啶或霉酚酸处理。核糖体应激主要是通过抑制rRNA的合成来引起核仁中的核糖体解离，从而释放出小分子蛋白。另外，位于线粒体的核糖体蛋白L41(MRPL41)，可以稳定p53，并促进p53转移到线粒体，进而引起细胞凋亡。也有研究证明，在DNA损伤时，核糖体蛋白RPL26可与p53mRNA的5'非翻译区相结合，在翻译水平调节p53。至今为止，尚无RPL26直接调控MDM2，通过影响肿瘤抑制分子p53的活性抑制肿瘤细胞增殖的报道。
发明内容本发明的目的是提供一类抑制肿瘤细胞增殖的多肽。本发明所提供的抑制肿瘤细胞增殖的多肽，是包括核糖体蛋白RPL26的自氨基末端第46-100位氨基酸残基的最长为145个氨基酸残基的片段。上述多肽的氨基酸序列具体如序列表中序列2、序列3或序列5所示。上述多肽可用于制备抑制肿瘤细胞增殖的药物。本发明的另一个目的是提供一种抑制肿瘤细胞增殖的药物。本发明所提供的抑制肿瘤细胞增殖的药物，它的活性成分是上述多肽。所述肿瘤细胞具体可为骨肉瘤细胞。本发明通过报告基因实验、免疫印迹检测、免疫共沉淀和细胞增殖检测等实验，证实RPL26可与MDM2和p53形成复合体，RPL26与MDM2的结合，可以明显降低MDM2的泛素连接酶活性，进而提高p53的稳定性和转录激活活性。RPL26的过表达可以显著抑制肿瘤细胞增殖，这一作用与p53的活性有关。RPL26可以辅助用于临床上治疗肿瘤，具有重要的意义。图1为U2-0S细胞中，RPL26可以提高p53的转录激活活性。图2为H1299细胞中，外源RPL26可以阻滞MDM2介导的p53降解。图3为MEF(p53—"mdm2—)细胞中，RPL26通过影响MDM2来增强p53的转录激活活性和稳定性。图4为MEF(p53—/—/mdm2—)细胞中，MDM2存在时，敲低RPL26可以进一步降低p53的表达。图5为H1299细胞中，RPL26阻滞MDM2介导的p53降解和MDM2降解。图6为MEF(p53—Z7mdm2—)细胞中，RPL26可以影响MDM2和p53的半衰期。图7为MEF(p53—Z7mdm2—)细胞中，各个RPL26缺失突变体对MDM2和p53的影响。图8为HEK293细胞中，RPL26、MDM2和p53三者可形成复合物。图9为U2-0S细胞中，RPL26可以抑制细胞增殖。图10为H1299细胞中，RPL26对细胞增殖无显著影响。具体实施例方式下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1、RPL26表达载体的构建根据RPL26的cDNA序列(GenBankAccessionNo.M_000987)，设计正向引物ML26-1:5'-gtacGTCGACCatgaagtttaatccctttg-3，(大写字母为SalI酶切位点)和反向引物ML26-6:5，-tcagGCGGCCGCttcctgcatcttctcaatg-3，(大写字母为NotI酶切位点)，以成人肝cDNA文库(购自Invitrogen公司)为模板，PCR扩增RPL26的编码基因。将PCR扩增产物及pCMV-Myc(购自Clontech公司)载体分别用SalI和NotI双酶切后进行连接，连接产物转入E.coliJM109感受态细胞中，利用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定，将酶切鉴定结果正确的克隆进行测序，将得到的含有RPL26编码基因的重组表达载体命名为pMyc-RPL26。同时采用上述相同方法扩增RPL26各突变体的编码基因，对获得的RPL26各突变体的编码基因进行测序，测序结果表明，获得的RPL26缺失突变体RPL26-A的氨基酸序列如序列表中序列1所示，RPL26缺失突变体RPL26-B的氨基酸序列如序列表中序列2所示，RPL26缺失突变体RPL26-C的氨基酸序列如序列表中序列3所示，RPL26缺失突变体RPL26-D的氨基酸序列如序列表中序列4所示，RPL26缺失突变体RPL26-E的氨基酸序列如序列表中序列5所示。扩增RPL26及其各缺失突变体编码基因的引物如表1所示。表1扩增RPL26及其各缺失突变体编码基因的引物4<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表l中，引物序列方向均为5'至3'，大写字母表示酶切位点。实施例2、RPL26对MDM2_p53通路的调节1、RPL26对野生型p53转录激活活性的影响将质粒pGL13-Luc(YuJ，ZhangL，HwangPM，RagoC，KinzlerKWandVogelsteinB.(1999).Identificationandclassificationofp53_regulatedgenes.ProcNatlAcadSciUSA96:14517-14522.)、pRL-CMV(购自Promega公司)、pCMV-MDM2(ZhangY，WolfGW，BhatK，JinA，AllioT，BurkhartWAetal.(2003).RibosomalproteinLllnegativelyregulatesoncoproteinMDM2andmediatesap53_dependentribosomal_stresscheckpointpathway.Mo1CellBiol23:8902-8912.)和上述实施例1构建的质粒pMyc-RPL26，按照图1所示混合，转染含有野生型p53的骨肉瘤细胞(U2-0S细胞)(购自美国标准生物品收藏中心)。图1中，+表示添加该物质，_表示不添加该物质，1X表示添加1倍物质的量的该物质，2X表示添加2倍物质的量的该物质。以Lipofectamine2000(购自Invitrogen公司)转染方法在24孔板中进行转染，每组质粒转染3个孔。转染24小时后，吸出培养基，用磷酸盐缓冲溶液将细胞洗涤一次后，以荧光素酶检测试剂盒(购自Promega公司)的方法检测p53转录激活活性，取3孔平均值，计算标准差并作图。以只转染质粒pGL13-Luc和pRL-CMV的U2-0S细胞中p53的转录激活活性为1，其它各组中p53的转录激活活性与之相比。实验设三次重复，结果如图1所示，图中误差条表示标准差。结果表明，在含有野生型p53的U2-0S细胞中，转入含有RPL26和/或MDM2的质粒(质粒pMyc-RPL26和/或质粒pCMV-MDM2)，过表达的RPL26可以增强p53的转录激活活性，这一过程有一定的剂量依赖关系。2、H1299细胞中RPL26对外源p53表达水平的影响将质粒pFlag-p53(RuiY，XuZ，LinS，LiQ，RuiH，LuoWeta1.(2004).Axinstimulatesp53functionsbyactivationofHIPK2kinasethroughmultimericcomplexformation.EmboJ23:4583-4594.)、pCMV-MDM2和上述实施例1构建的质粒pMyc-RPL26，按照图2所示混合，转染p53缺陷型细胞H1299(购自美国标准生物品收藏中心)。图2中，+表示添加该物质，_表示不添加该物质，1X表示添加1倍物质的量的该物质，2X表示添加2倍物质的量的该物质。以Lipofectamine2000转染方法在24孔板中进行转染，每组质粒转染3个孔。转染24小时后，吸出培养基，用磷酸盐缓冲溶液将细胞洗涤一次后，每孔加入80iU的2XSDS上样缓冲液裂解细胞，将细胞用沸水煮5-10分钟后进行离心，收集上清液进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，免疫印迹检测各蛋白的表达水平。同时以e-actin作为内参。实验设三次重复，结果如图2所示。结果表明，过表达的MDM2能显著降低p53蛋白的水平，同时转入含有RPL26的质粒(pMyc-RPL26)后，由MDM2引起的p53降解被抑制，因此RPL26能提高p53蛋白的水平。3、MEF(p53—Z7mdm2—)细胞中RPL26对外源p53的影响1)RPL26对外源p53转录激活活性的影响将质粒pGL13-Luc、pRL-CMV(购自Promega公司)、pMyc-p53(RuiY，XuZ，LinS，LiQ，RuiH，LuoWetal.(2004).Axinstimulatesp53functionsbyactivationofHIPK2kinasethroughmultimericcomplexformation.EmboJ23:4583-4594.)、pCMV-MDM2和上述实施例1构建的质粒pMyc-RPL26，按照图3所示混合，转染MEF(p53—"mdm2—y—)细胞(WeberJD，JeffersJR，RehgJE，RandleDH，LozanoG，RousselMFetal.(2000).p53-ind印endentfunctionsofthep19(ARF)tumorsuppressor.GenesDev14:2358-2365.)。图3中，+表示添加该物质，-表示不添加该物质。以Lipofectamine2000转染方法在24孔板中进行转染，每组质粒转染3个孔。转染24小时后，吸出培养基，用磷酸盐缓冲溶液将细胞洗涤一次后，以荧光素酶检测试剂盒(购自Promega公司)的方法检测p53转录激活活性，取3孔平均值，计算标准差并作图。以只转染质粒pGL13-Luc和pRL-CMV的MEF(p53—"mdm2—/_)细胞中p53的转录激活活性为l，其它各组中p53的转录激活活性与之相比。实验设三次重复，结果如图3所示，图中误差条表示标准差。结果表明，屏蔽掉RPL26在翻译水平对p53的影响后，单独转入含有MDM2的质粒(pCMV-MDM2)或单独转入含有RPL26的质粒(pMyc_RPL26)对p53的转录激活活性没有显著影响；在转入含有p53的质粒(pMyc-p53)的条件下，没有转入质粒pCMV_MDM2的MEF(p53—/—/mdm2——)细胞中，RPL26的过表达不能影响p53的转录激活活性；而转入质粒pCMV-MDM2后，p53的转录激活活性会因RPL26的过表达而上调。这一变化在蛋白水平也能检测到。因此，RPL26可以通过影响MDM2来增强p53的转录激活活性。2)MEF(p53—Z7mdm2—)细胞中RPL26对外源p53表达水平的影响将质粒pGL13-Luc、pRL-CMV(购自Promega公司)、pMyc-p53、pCMV-M匿2和化学合成的小RNA序列(上海吉玛制药技术有限公司)RNAiRPL26(CCGAAAGGAUGAUGAAGUUUU)或阴性对照RNAicontrol(UUCUCCGAACGUGUCACGUTT)，按照图4所示混合，转染MEF(p53—mdm2——)细胞。图4中，+表示添加该物质，-表示不添加该物质。以Lipofectamine2000转染方法在24孔板中进行转染，每组质粒转染3个孔。转染24小时后，吸出培养基，用磷酸盐缓冲溶液将细胞洗涤一次后，每孔加入80iU的2XSDS上样缓冲液裂解细胞，将细胞用沸水煮5-10分钟后进行离心，收集上清液进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，免疫印迹检测各蛋白的表达水平。同时以P-actin作为内参。实验设三次重复，结果如图4所示。结果表明，在没有转入质粒pCMV-MDM2的MEF(p53—Z7mdm2—y—)细胞中，敲低RPL26对外转p53的表达量没有显著影响，而在转入质粒pCMV-MDM2的MEF(p53—"mdm2—〃)细胞中，敲低RPL26可以进一步抑制外转p53的表达。实施例3、RPL26影响MDM2_p53通路的机制1、RPL26对MDM2和p53泛素化的影响将上述质粒pFlag-p53、pCMV-MDM2禾PpHA-Ub(ZhangY，WolfGW，BhatK，JinA，AllioT，BurkhartWAetal.(2003).RibosomalproteinLllnegativelyregulatesoncoproteinMDM2andmediatesap53—d印endentribosomal—stresscheckpointpathway.Mo1CellBiol23:8902-8912.)及上述实施例1构建的质粒pMyc-RPL26，按照图5所示混合，转染H1299细胞。图5中，+表示添加该物质，_表示不添加该物质。以Lipofectamine2000转染方法在25cm750ml培养瓶中进行转染，每组质粒转染3瓶。转染24小时后，换用含20iiM蛋白酶体抑制剂MG132(购自Sigma公司)的新鲜培养基继续培养8小时后，吸出培养基，用磷酸盐缓冲溶液常温条件下小心冲洗细胞一次，然后加入预冷的磷酸盐缓冲溶液将细胞吹起，900-1000rpm离心5分钟，收集细胞沉淀，继续用预冷的磷酸盐缓冲溶液洗两遍；最后将细胞移至1.5ml的离心管中，离心收集细胞。在收集的细胞沉淀中加入500ii1裂解缓冲液重悬细胞，超声破碎至溶液清亮(冰上操作)，4°C条件下13000rpm离心10分钟，收集上清；从上清液中吸出50y1做为对照，其余加入HA抗体(购自Roche公司)liig，4。C混匀2h以上；再加入25ii1ProteinA/GPlus-Agarose(购自SantaCruz公司)，4。C混匀2h以上；混合物4。C条件下2500rpm离心5分钟，小心吸出上清，用预冷的裂解缓冲液轻轻重悬磁珠，离心洗涤3次，向沉淀中加入50iU2XSDS上样缓冲液轻弹混匀，沸水煮5-10分钟后进行离心，收集上清液进行进行SDS-PAGE，免疫印迹检测。同时以P-actin作为内参。实验设三次重复，结果如图5所示。结果表明，在H1299细胞中，过表达的RPL26抑制了MDM2介导的p53泛素化，说明过表达的RPL26可以通过阻止MDM2对p53的泛素化和降解来上调p53的水平。2、RPL26对MDM2和p53半衰期的影响将上述质粒pMyc-p53、pCMV-MDM2、pEGFP(购自Clontech公司)和上述实施例1构建的质粒pMyc-RPL26，按照图6所示混合，转染MEF(p53—/—/mdm2—〃)细胞。图6中，+表示添加该物质，-表示不添加该物质。以Lipofectamine2000转染方法在24孔板中进行转染，每组质粒转染12个孔。转染24小时后，用含有50mg/ml放线菌酮(CHX，购自Sigma公司)的新鲜培养基继续培养，放线菌酮培养0、3、6和9h时，分别将培养基吸出，用磷酸盐缓冲溶液洗涤细胞一次后，加入80iU的2XSDS上样缓冲液裂解细胞，沸水煮5-10分钟后进行离心，收集上清液进行进行SDS-PAGE，免疫印迹检测。实验设三次重复，结果如图6所示。结果表明，单独转染质粒pMyc-RPL26对p53的半衰期没有显著影响，单独转染质粒pCMV-MDM2能显著降低p53的水平，若同时转入质粒pMyc-RPL26和pCMV-MDM2，p53及MDM2的半衰期都有延长，说明RPL26与MDM2的结合降低了MDM2的泛素连接酶活性。3、各RPL26缺失突变体对MDM2和p53表达水平的影响将上述质粒pMyc-p53、pCMV-MDM2和上述实施例1构建的各个RPL26缺失突变体按照图7所示混合，转染MEF(p53—/—/mdm2—)细胞。图7中，+表示添加该物质，_表示不添加该物质。以Lipofectamine2000转染方法在24孔板中进行转染。转染24小时后，吸出培养基，用磷酸盐缓冲溶液洗涤细胞一次后，加入80ii1的2XSDS上样缓冲液裂解细胞，沸水煮5-10分钟后进行离心，收集上清液进行进行SDS-PAGE，免疫印迹检测。实验设三次重复，结果如图7所示。结果表明，上述实施例1构建的各个RPL26缺失突变体都不能直接影响外源p53的表达水平；当同时转入质粒pCMV-MDM2时，各个RPL26缺失突变体对p53及MDM2表达水平的影响是不同的，只有包含RPL26的自氨基末端第46-100位氨基酸残基这一中间区域的缺失突变体(图7中泳道9、泳道11、泳道12和泳道14)，才可以提高MDM2及p53的稳定性。说明RPL26与MDM2的结合抑制了MDM2的泛素连接酶活性。4、RPL26、MDM2和p53相互作用的关系将上述质粒pFlag-p53、pCMV-MDM2和上述实施例1构建的质粒pMyc-RPL26，按照图8所示混合，转染HEK293细胞(购自美国标准生物品收藏中心)。图8中，+表示添加该物质，_表示不添加该物质。以Lipofectamine2000转染方法在25cm750ml培养瓶中进行转染，每组质粒转染3瓶。转染24小时后，用磷酸盐缓冲溶液常温条件下小心冲洗细胞一次，然后加入预冷的磷酸盐缓冲溶液将细胞吹起，900-1000rpm离心5分钟，收集细胞沉淀，继续用预冷的磷酸盐缓冲溶液洗涤细胞两遍；最后将细胞移至1.5ml的离心管中，离心收集细胞。在收集的细胞沉淀中加入500ia裂解缓冲液重悬细胞，超声破碎至溶液清亮(冰上操作)；4t:条件下13000rpm离心10分钟，收集上清；从上清液中吸出50yl做为对照，其余加入Myc抗体(购自SantaCruz公司)1.g，4。C混匀2h以上；再加入20y1ProteinA/GPlus-Agarose(购自SantaCruz公司)，4。C混匀2h以上；混合物4。C条件下2500rpm离心5分钟，小心吸出上清，用预冷的裂解缓冲液轻轻重悬磁珠，离心洗涤3次，向沉淀中加入40iU2XSDS上样缓冲液轻弹混匀，沸水煮5-10分钟后进行离心，收集上清液进行进行SDS-PAGE，免疫印迹检测。同时以P-actin作为内参。实验设三次重复，结果如图8所示。结果表明，p53可以与RPL26沉降于同一复合物中，这种结合在MDM2存在时更加紧密。说明MDM2、p53和RPL26可以形成复合体，而且这一复合体中可能还有其它蛋白分子的参与。实施例4、RPL26对细胞增殖的影响将上述实施例1构建的质粒pMyc-RPL26分别转染到U2-0S细胞和H1299细胞中，以Lipofectamine2000转染方法在96孔板中进行转染，每组质粒转染3个孔。转染24小时后，用磷酸盐缓冲溶液常温条件下小心冲洗细胞一次，按照MTS细胞繁殖定量检测试剂盒(GENMED)的方法检测细胞的增殖水平，取3孔的平均值，计算标准差并作图。实验设三次重复，转入质粒pMyc-RPL26的U2-0S细胞的增殖水平如图9所示，转入质粒pMyc-RPL26的H1299细胞的增殖水平如图10所示，图中误差条表示标准差。结果表明，在含有p53的野生型U2-0S细胞中，转入质粒pMyc-RPL26可以降低细胞的增殖水平；而在p53缺陷型细胞H1299中，转入质粒pMyc-RPL26，不影响细胞的增殖水平。说明RPL26对细胞增殖的影响是通过p53发挥作用的。序列表〈110〉中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所〈120〉一种抑制肿瘤细胞增殖的药物及其应用〈130〉CGGNARZ92011〈160>5〈210>1〈211>45〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>1MetLysPheAsnProPheValThrSerAspArgSerLysAsnArgLys151015ArgHisPheAsnAlaProSerHislieArgArgLyslieMetSerSer202530ProLeuSerLysGluLeuArgGinLysTyrAsnValArg354045〈210>2〈211>100〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>2MetLysPheAsnProPheValThrSerAspArgSerLysAsnArgLys151015ArgHisPheAsnAlaProSerHislieArgArgLyslieMetSerSer202530ProLeuSerLysGluLeuArgGinLysTyrAsnValArgSerMetPro354045lieArgLysAspAspGluValGinValValArgGlyHisTyrLysGly505560GinGinlieGlyLysValValGinValTyrArgLysLysTyrVallie65707580TyrlieGluArgValGinArgGluLysAlaAsnGlyThrThrValHis859095ValGlylieHis100[o川]〈210〉3〈211>55〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>3SerMetProlieArgLysAspAspGluValGinValValArgGlyHis151015TyrLysGlyGinGinlieGlyLysValValGinValTyrArgLysLys202530TyrVallieTyrlieGluArgValGinArgGluLysAlaAsnGlyThr354045ThrValHisValGlylieHis5055〈210>4〈211>45〈212〉PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>4ProSerLysValVallieThrArgLeuLysLeuAspLysAspArgLys151015LyslieLeuGluArgLysAlaLysSerArgGinValGlyLysGluLys202530GlyLysTyrLysGluGluThrlieGluLysMetGinGlu354045〈210>5〈211>100〈212>PRT<213>人工序列〈220〉〈223〉〈400〉5SerMetProlieArgLysAspAspGluValGinValValArgGlyHis15101510TyrLysGlyGinGinlieGlyLysValValGinValTyrArgLysLys202530TyrVallieTyrlieGluArgValGinArgGluLysAlaAsnGlyThr354045ThrValHisValGlylleHisProSerLysValVallieThrArgLeu505560LysLeuAspLysAspArgLysLyslieLeuGluArgLysAlaLysSer65707580ArgGinValGlyLysGluLysGlyLysTyrLysGluGluThrlieGlu859095LysMetGinGlu100权利要求一类多肽，是包括核糖体蛋白RPL26的自氨基末端第46-100位氨基酸残基的最长为145个氨基酸残基的片段。2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽的氨基酸序列如序列表中序列2、序列3或序列5所示。3.权利要求1或2所述的多肽在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。4.一种抑制肿瘤细胞增殖的药物，它的活性成分是权利要求1或2所述的多肽。5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于所述肿瘤细胞为骨肉瘤细胞。全文摘要本发明公开了一类抑制肿瘤细胞增殖的多肽。该多肽是包括核糖体蛋白RPL26的自氨基末端第46-100位氨基酸残基的最长为145个氨基酸残基的片段。通过报告基因实验、免疫印迹检测、免疫共沉淀和细胞增殖检测等实验，证实RPL26可与MDM2和p53形成复合体，RPL26与MDM2的结合，可以明显降低MDM2的泛素连接酶活性，进而提高p53的稳定性和转录激活活性。RPL26的过表达可以显著抑制肿瘤细胞增殖，这一作用与p53的活性有关。RPL26可以辅助用于临床上治疗肿瘤，具有重要的意义。文档编号A61P35/00GK101775073SQ20091007624公开日2010年7月14日申请日期2009年1月8日优先权日2009年1月8日发明者张莹,杨晓明,王建,贺福初申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所