表达促凋亡基因的靶向增殖的重组腺病毒及其应用的制作方法

专利名称：表达促凋亡基因的靶向增殖的重组腺病毒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种表达促凋亡基因的靶向增殖的重组腺病毒及其应用，特别涉及含 有该重组腺病毒的耙向抑制肿瘤细胞的生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡的药物。
背景技术：
生物体的一切生命活动，从出生、成长、衰老到出现疾病直至死亡都与基因有关， 基因调控着细胞的各种功能。人们已经认识到肿瘤是基因异常引起的，恶性肿瘤发病 率、死亡率较高，已经成为危害人类生命的第一位杀手，这使得肿瘤基因治疗的研究
成为近20年来基因治疗的热点。
常用于肿瘤基因治疗临床试验的目的基因有抑癌基因、自杀基因、耐药基因、反 义基因等。目前研究较多的是重组腺病毒p53，美国自1995年以来即开始了重组腺病
毒p53制品的临床试验，并已完成了I、 n期临床试验及部分in期临床试验。我国目
前已有"今又生"上市(由正常人肿瘤抑制基因p53和改构的5型腺病毒基因重组 而成)，获得了国家食品药品监督管理局颁发的新药证书、准字号生产批文、药品GMP 证书，是世界首个获准上市的基因治疗药物。基因治疗不仅作为一个新的生物医学概 念而为人们所接受，而且作为一种新的治疗手段和方法已被广大研究人员和临床工作 者所实践。到目前为止所进行的不少研究表明，基因治疗实验是安全、有效和易于操 作的。
TFAR19(TF-1 cell ap叩tosis-related gene 19)是最近发现的一种新的凋亡调 控基因，国际人类基因命名委员会将其命名为PDCD5 (programmed cell death 5)，其 编码的蛋白主要定位于细胞内，在人类50余种组织中广泛分布。目前，国内外已有 多家实验室发现PDCD5在疾病情况下，特别是在肿瘤如肝癌、乳腺癌及胃癌中的表达 明显下降，PDCD5的低表达与胃癌的不良预后相关，而针对PDCD5的siRNA能减弱Bax 过表达诱导的HeLa、 HEK293和293T细胞凋亡，说明低表达PDCD5赋予这些细胞一定 的抗凋亡能力。
阮国瑞等从mRNA及蛋白水平证实了 PDCD5在白血病病人骨髓细胞中低表达，在 国际上率先发现急性髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML)病人比慢性髓性 白血病(chronic myeloid leukemia, CML)病人表达更低的PDCD5， CML病人尤其是 加速/急变期的CML病人，PDCD5表达量与BCR-ABL表达量呈负相关。马曦等进一步的 研究表明，CML病人PDCD5基因5'调节区2个SNPs位点影响启动子活性并与CML易感性有关，拥有(—27G/—11A)这2个SNPs位点的启动子转录活性减低，并且不能被 凋亡诱导因素所上调。利用酵母双杂交系统，发现PDCD5可结合多个重要的分子如 HTATIP、 EEF1G、 KIAA1377、 RIF1等，其中组蛋白乙酰转移酶HTATIP (histone acetyltransf erase Tat interactive protein 60 kD ， HTATIP， TIP60)不仅在染 色质基因转录中发挥重要作用，具有ATP酶、DNA解旋酶及与DNA结合的活性，而且， 在DNA双链断裂修复和凋亡中发挥重要功能，由于CML病人PDCD5表达降低，拥有5' 调节区2个SNPs位点(—27G/_11A )的启动子转录活性减低，并且不能被凋亡诱导 因素所上调，因而推测，CML病人低表达或异常表达的PDCD5与TIP60结合的能力可 能受到影响，从而，可能进一步影响到TIP60发挥的染色质基因转录、DNA双链断裂 修复和凋亡等等重要功能，BCR-ABL表达量增加的CML病人PDCD5表达量进一步降低， 不仅使这些细胞抗凋亡能力增强，也可能增加了基因组内在不稳定性。说明低表达 PDCD5可能在AML、 CML病理机制或疾病进展中起一定作用。
阮国瑞等的研究结果发现，以腺病毒为载体的PDCD5基因治疗能增强低剂量伊达 比星等化疗药物的作用，PDCD5在降低化疗药毒副作用方面具潜在的应用价值(Ruan GR, Zhao HS, Chang Y， Li 几，Qin YZ, Liu YR， Chen SS, Huang XJ. Adenovirus-mediated PDCD5 Gene Transfer Sensitizes K562 Cells to Apoptosis Induced by Idarubicin in vitro and in vivo. 4do/ z^ 57'5". 2008 May; 13(5) :641-8， 4i7)。阮国瑞等得到了重组腺病毒Ad-PDCD5， Ad-PDCD5是携带PDCD5基因的非 增殖性腺病毒(专利200610012154. 8; Ruan GR， Zhao HS, Chang Y, Li JL， Qin YZ， Liu YR, Chen SS， Huang XJ. Adenovirus-mediated PDCD5 Gene Transfer Sensitizes K562 Cells to Apoptosis Induced by Idarubicin in vitro and in vivo. /iD0/ fas7's. 2008 May;13(5)'.64卜8)，具有与化疗药物协同抑制肿瘤细胞生长和/或诱导肿瘤细胞 凋亡的功能，但其性能有待进一步增强。

发明内容
本发明的目的是提供一种表达促凋亡基因的靶向增殖的重组腺病毒及其应用。 本发明提供的重组腺病毒是携带PDCD5基因(TFAR19基因)表达盒的重组腺病毒，
所述PDCD5基因表达盒自上游至下游依次包括如下组件启动子、人PDCD5 (TFAR19)
的c,A和终止子。
所述PDCD5基因表达盒中，所述启动子具体可为小鼠CMV启动子，所述终止子具 体可为TGA终止子。
所述PDCD5基因表达盒还可包括SV40polyA信号序列；所述SV40polyA信号序列 位于所述终止子的下游。所述重组腺病毒可将所述PDCD5基因表达盒插入SG600病毒基因组得到。 所述的重组腺病毒具体可将重组表达载体pPE3-FllB-PDCD5与pSG600共转染哺 乳动物细胞得到；
所述pPE3-FllB-PDCD5是pENTRll-PDCD5和pPE3-FllB-RC重组得到的；所述 pENTRll-PDCD5是将I和船t I酶切pClonl5-PDCD5得到的小片段与々e I和Abt I酶切pENTRll-Linker得到的大片段连接得到的；所述pClonl5-PDCD5是将PDCD5 基因插入pClonl5得到的。
所述哺乳动物细胞具体可为293细胞。所述PDCD5基因具体可为用及》W I酶切 pDC316-PDCD5 (pDC316-TFAR19)得到的小片段。
本发明还保护一种重组表达载体pPE3-FllB-PDCD5，所述pPE3-FllB-PDCD5是 pENTRll-PDCD5和pPE3-FllB-RC重组得到的；所述pENTRl 1-PDCD5是将jgel和 I酶切pClonl5-PDCD5得到的小片段与 I和淑I酶切pENTRll-Linker得到的 大片段连接得到的；所述pClonl5-PDCD5是将PDCD5基因插入pClonl5得到的。
所述哺乳动物细胞具体可为293细胞。所述PDCD5基因具体可为用I酶切 pDC316-PDCD5 (pDC316-TFAR19)得到的小片段。
本发明还保护一种药物，它的活性成分为所述的重组腺病毒；所述药物为如下l) 和/或2)和/或3)和/或4)的药物
1) 抑制肿瘤细胞生长的药物；
2) 诱导肿瘤细胞凋亡的药物；
3) 抑制肿瘤生长的药物；
4) 治疗癌症的药物。
所述肿瘤细胞具体可为白血病细胞系细胞，如K562细胞、MEG-Ol细胞、Dami细 胞、NB4细胞或6T-CEM细胞。所述肿瘤具体可为白血病。所述癌症具体可为白血病。
本发明构建得到了SG611-PDCD5重组腺病毒，并进行了鉴定，扩增，纯化，滴度 测定。以Ad5FllB-hTERTp重组腺病毒(又叫SG611重组腺病毒，未携带PDCD5的增殖 性腺病毒)为对照，体外及裸鼠体内实验发现单用SG611-PDCD5重组腺病毒对白血病 细胞系的K562细胞、MEG-01细胞、Dami细胞、NB4细胞和6T-CEM细胞生长具直接的 抑制作用。实验表明，本发明的重组腺病毒可应用于靶向抑制肿瘤细胞生长和/或诱 导肿瘤细胞凋亡和/或抑制肿瘤生长的药物，有望成为一种新型的治疗癌症的药物。


图1为pClonl5-PDCD5的构建流程图。 图2为pENTRll-PDCD5的构建流程图。
6图3为pPE3-FllB-PDCD5的构建流程图。 图4为SG611-PDCD5的构建流程图。 图5为pDC316-PDCD5的酶切电泳图。 图6为pClonl5-PDCD5的酶切电泳图。 图7为pENTRll-PDCD5的酶切鉴定图。 图8为pPE3-FllB-PDCD5的酶切鉴定图。 图9为用引物VT669和VT670扩增11型Fiber的鉴定图。 图10为用引物VT326和VT327扩增TERTp的鉴定图。 图11为用引物VT631和VT632扩增HRER+CMV的鉴定图。 图12为用引物VT079和VT076扩增野毒的鉴定图。 图13为用引物VT298和VT299扩增缺失的鉴定图。 图14为用引物VT633和VT634扩增PDCD5基因的鉴定图。 图15为用引物10054和59928扩增野毒的鉴定图。 图16为SG611-PDCD5感染白血病细胞系K562细胞后PDCD5的表达量。 图17为流式细胞术检测SG611-EGFP感染K562细胞的感染效率。 图18为MTT法检测SG611-PDCD5对K562细胞的杀伤作用。 图19为MTT法检测SG611-PDCD5对Dami细胞的杀伤作用。 图20为MTT法检测SG611-PDCD5对NB4细胞的杀伤作用。 图21为MTT法检测SG611-PDCD5对6T-CEM细胞的杀伤作用。 图22为MTT法检测SG611-PDCD5对MEG-01细胞的杀伤作用。 图23为SG611-PDCD5对K562细胞在裸鼠体内瘤体生长的抑制作用。
具体实施例方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。
质粒pClon15、 pENTRl 1-Linker、 pPE3-F11B-RC ( + )购自加拿大tnicrobix公司 (Invitrgoen公司代理)。
pDC316-PDCD5质粒是携带PDCD5基因的pDC316质粒，参考文献专利 200610012154.8; Liu H T, Wang Y G, Zhang Y M， et al. TRAR19, a novel apoptosis-related gene cloned from human leukemia cell line TF_1, could enhance邵optosis of some tumor cells induced by growth factor withdrawal. Biochem Biophy Res Commun， 1999; 254: 203—210。
7Ad-PDCD5是携带PDCD5基因的非增殖性腺病毒，参考文献专利200610012154. 8; Ruan GR， Zhao HS， Chang Y， Li JL， Qin YZ, Liu YR， Chen SS, Huang X丄 Adenovirus—mediated PDCD5 Gene Transfer Sensitizes K562 Cells to Apoptosis Induced by Idarubicin in vitro and in vivo. 4D。/^asis. 2008 May ;13 (5) :641-8。
SG611-EGFP即PDCD5基因被增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)取代的增殖性重组腺病毒，制备方法同SG611-PDCD5。
SG611为不含PDCD5基因的增殖性重组腺病毒对照，制备方法同SG611-PDCD5。
所有的内切酶均购自NEB公司。
Taq酶申能博彩公司。
DNA连接酶SolutionI: TakaRa公司。
蛋白酶K、 RNA酶PR0MEGA公司。
胎牛血清、小牛血清、DMEM: GIBC0BRL公司。
琼脂糖、溴化乙锭GENE公司。
琼脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物UNIPATH公司。
胶回收试剂盒QIAGEN公司。
PCR产物回收试剂盒QIAGEN公司。
质粒DNA制备试剂盒QIAGEN公司。
病毒DNA提取试剂盒QIAGEN公司。
LipofectAmine2000试剂盒GIBC0 BRL公司。
实施例l、重组腺病毒的制备 一、pClonl5-PDCD5的构建和鉴定 图1为pClonl5-PDCD5的构建流程图。 1、 pClonl5-PDCD5的构建
将pClonl5用^^ 1酶切(37t水浴6h)后，1. 2%琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试 剂盒(QIAquick Gel Extraction)回收3396bp的pClonl5线性化条带。
pDC316-PDCD5用I酶切(37。C水浴6h)后，1. 2%琼脂糖凝胶电泳，用胶回 收试剂盒(QIAquick Gel Extraction)回收423bp的PDCD5基因，酶切后的电泳图 见图5。图5中，1: PDCD5基因；M: marker。
将2ul pClonl5线性化条带和8ul PDCD5基因在10ul Solution I中12。C连接 12h，连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，铺琼脂板(含AMP)后，37。C生化培 养箱内培养10-12h。挑取生长的细菌单克隆，在含氨苄青霉素的LB溶液中，37'C摇
8床扩增12h。共获得了 8个抗生素阳性克隆。
2、 pClonl5-PDCD5的鉴定
抽提阳性克隆的质粒DNA酶切鉴定(37t水浴反应lh， 1.2%琼脂糖凝胶电泳)。
酶切体系A(^bo7 I酶切)鉴定结果ltt、 2#、 3#、 5#、 6#质粒有3396bp和423bp 两条带。酶切体系B 酶切)鉴定结果2#、 5#、 6#质粒有3452bp和367bp
两条带。酶切体系C (iXoI酶切)鉴定结果2tt、 5#、 6#质粒有591bp和3228bp两 条带。根据以上三个酶切体系的鉴定结果，选择2#、 5#、 6tt质粒进一步鉴定。酶切体 系D I禾Q 3柳# I双酶切)鉴定结果2#、 6tt质粒有367bp、 765bp、 1118bp和
1569bp四条带。酶切体系E"WII和双酶切)鉴定结果2#、 6#质粒有340bp、 367bp、 741bp和2371bp四条带。酶切体系F (i5^ I和尸W I双酶切)鉴定结果2#、 6井质粒有752bp、 1118bp和1949bp三条带。结果表明，2#、 6#质粒鉴定正确。
选择2tt质粒进行后续试验，将2#质粒命名为pClonl5-PDCD5。
二、 pENTRll-PDCD5的构建和鉴定
图2为pENTRll-PDCD5的构建流程图。
1、 pENTRll-PDCD5的构建
将2ul pClonl5-PDCD5用如I和淑I双酶切(37。C水浴8h)得到的1159bp 条带(酶切电泳图见图6，图6中，M:marker; l:目的条带)和8ul pENTRll-Linker 命e I和I双酶切(37。C水浴8h)得到的2319 bp片段在10ul Solution I中12 'C连接12h。将连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，铺琼脂板(含卡那霉素) 后，37'C生化培养箱内培养10-12h。挑取生长的细菌单克隆，在含卡那霉素的LB溶 液中，37X:摇床扩增12h。共获得了 5个抗生素阳性克隆。
2、 pENTRll-PDCD5的鉴定
抽提阳性克隆的质粒DNA酶切鉴定(37。C水浴反应lh， 1.2%琼脂糖凝胶电泳)。 酶切体系G (fco7 I酶切)鉴定结果1#、 3#、 4#、 5#质粒有204bp、 423bp和 2851bp三条带。酶切体系H (ife/^I酶切)鉴定结果1#、 3#、 4tt、 5#质粒有197bp、 367bp和2914bp三条带。根据以上两个酶切体系的鉴定结果选择ltt、 3tt、 4#、 5tt质 粒进一步鉴定。酶切体系I (J力o I和尸"I双酶切)鉴定结果1#、 3tt、 4tt、 5#质 粒有350bp、 241bp、 358bp、 126bp和2403bp五条带。酶切体系J (vT/w I和顺e I 双酶切)鉴定结果1#、 3#、 4#、 5tt质粒有475bp、 195bp、 482bp和2326bp四条带。 酶切体系K (^ge I和Abf I双酶切)鉴定结果ltt、 3tt、 4tt、 5tt质粒有1159bp和2319bp 两条带。酶切体系L (Pst I酶切)鉴定结果1#质粒有725和2753两条带。
选择ltt质粒提中样，用以上酶切体系G、 H、 I、 J、 K、 L再次进行鉴定，结果见图7。图7中，Ml: lOObp DNA Ladder (NEB); M2: A DNAAfibo7 1+历/7(/III (MBI); 1:
酶切体系G; 2:酶切体系H; 3:酶切体系I; 4:酶切体系J; 5:酶切体系K; 6:酶
切体系L。再次验证了 1#质粒为目的质粒，将其命名为pENTR11-PDCD5。
三、 pPE3-FllB-PDCD5的获得和鉴定
图3为pPE3-F11B-PDCD5的构建流程图。
1、 pPE3-FllB-PDCD5的获得
将1.5ul pENTR11-PDCD5、 1. 5ul pPE3-F11B-RC ( + )、 5. 0ul 1XTE、 2. 0ul LR (Gateway LR Clonase II enzyme mix， Invitrogen公司)混合，25。C水浴12h后，
加入lul蛋白酶K， 37'C水浴IO分钟后，转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，铺琼脂板 (含AMP)后，37。C生化培养箱内培养10-12h。挑取生长的细菌单克隆，在含氨苄青
霉素的LB溶液中，37"C摇床扩增12h。共获得了6个抗生素阳性克隆。
2、 pPE3-FllB-PDCD5的鉴定
抽提阳性克隆的质粒DNA酶切鉴定(37"C水浴反应lh， 1. 2%琼脂糖凝胶电泳)。 酶切体系M (&e I酶切)鉴定结果2#、 3#、 5#、 6tt质粒有3083bp、 1716bp、 18bp和32147bp四条带。根据酶切结果选择2tt、 3#、 5#、 6共质粒进一步鉴定。酶切 体系N (i7wl酶切)鉴定结果2#、 3#、 5#、 6tt质粒有4908、 2466、 1445、 595、 14500、 4995、 387、 591、 358和6719十条带。酶切体系0 (尸acl酶切)鉴定结果2#、 3#、 5#、 6#质粒有1022、 284和35658三条带。酶切体系P (&7I酶切)鉴定结果2tt、 3共、5tt、 6tt质粒有4183、 6006、 379、 6903、 13190、 193和6110七条带。
选择2tt质粒提中样，用以上酶切体系M、 N、 0、 P再次进行鉴定，结果见图8。 图8中，A和B分别为采用不同曝光率强度的电泳图照片。图8中，M: ADNA/fcMI+沿7^
III(MBI); 1:酶切体系M; 2:酶切体系0; 3:酶切体系P; 4:酶切体系N。再次验
证了 2tt质粒为目的质粒，将其命名为pPE3-FllB-PDCD5。
pPE3-F11B-PDCD5质粒携带有人PDCD5基因的表达盒，该表达盒包括启动子、人 PDCD5的全长cDNA、终止子和SV40 polyA信号序列。
四、 重组腺病毒的获得和鉴定 构建流程图见图4。
1、重组腺病毒的获得
用Lipof ectamine 2000试剂盒，将质粒pPE3-FllB-PDCD5与pSG600共转染至293 细胞，具体方法按试剂盒说明操作。转染后9 14 d细胞出现病毒空斑，经过3次病毒 空斑纯化，得到4株重组腺病毒毒株。
pSG600为携带SG600病毒基因结构的质粒，SG600病毒为经以下基因修饰的腺病毒以hTERTp代替病毒Ela启动子；hTERT转录起始位点下游添加3个E-box结；病 毒Ela区的CR2基因部分(nt923-946)缺失；缺失Elb启动子，代之以5个缺氧诱导因 子结合位点的缺氧增强子(HRE) 。 (Xinghua Wang， Changqing Su， Hui Cao， Kui Li， Jie Chen, Lixin Jiang, Qi Zhang, Xiaobing Wu， Xiaoyuan Jia， YongjingLiu， WeiguoWang， Xinyuan Liu， Mengchao Wu， and Qijun Qi肌 A novel triple-regulated oncolytic adenovirus carrying p53 gene exerts potent antitumor efficacy on common human solid cancers. Mol Cancer Ther 2008;7(6) 1598-1603.)(北京大学人民医院)。 2、重组腺病毒的鉴定
应用QIAGEN DNA Blood Mini Kit (QIAGEN)提取4株重组腺病毒的DNA，进行 PCR鉴定，阴性对照反应管内不加模板进行PCR。
(1) 用引物VT669和VT670扩增11型Fiber VT669: 5' -CAA CCA CAG GCG GAT CTC TAC -3'; VT670: 5' -GTT CCA GGA CCA AGT TAT ACG -3'。
扩增体系(20. 0ul):病毒DNA 2. Oul， VT669引物0. 5ul， VT670引物0.5ul， Taq酶0.5ul， Tag酶Buffer 2. 0ul， dNTP 0. 5ul， H20 14. Oul。
扩增条件95°c 3rain; 95°C 40sec， 46°C 40sec， 72°C 240sec， 35个循环；72 °C lOmin。
结果见图9。图9中，M: ADNA/EcoRI+HindlII(MBI); N:阴性对照；1-4: 4#毒株。
1#-4#毒株均可以扩增出731bp的11型Fiber片段。
(2) 用引物VT326和VT327扩增TERTp VT326: 5' -GAT CTC ACA GAC GCC CAG GA-3'; VT327: 5' -TCC TCG TCG TCA CTG GGT GGA-3'。
扩增体系(20. 0ul):病毒DNA 2.0ul， VT326引物0. 5ul， VT327引物0. 5ul， Taq酶0. 5ul， Tag酶Buffer 2. 0ul， dNTP 0. 5ul， H20 14. Oul 。
扩增条件95°c 3min; 95°C 40sec， 46°C 40sec， 72°C 240sec， 35个循环；72 °C lOmin。
结果见图10。图10中，M: ADNA/EcoRI+Hind III(MBI); N:阴性对照;1-4: 1#-4# 毒株。
1#-4tt毒株都能扩增出730bp的TERTp片段。
(3) 用引物VT631和VT632扩增服ER+CMV启动子 VT631: 5' -GCGGCCGCAGGCCTACCAAGAGGAC-3';VT632: 5' -Act agt gat ctg acg gtt cac taa ac-3'。
扩增体系(20.0ul):病毒DNA 2.0ul， VT631引物0.5ul， VT632引物0.5ul， Taq酶0. 5ul， Tag酶Buffer 2. Oul， dNTP 0.5ul， H20 14. Oul。
扩增条件95°C 3min; 95°C 40sec， 56°C 40sec， 72°C 240sec， 35个循环；72 °C 10min。
结果见图11。图11中，M: ADNA/EcoRI+Hind III(MBI); N:阴性对照；1-4: ltt-4# 毒株。
1#-4#毒株都能扩增出270bp的服ER+C匿启动子片段。
(4) 用引物VT079和VT076扩增野生型腺病毒 VT076: 5' -TCA CCT GTG TCT AGA GAA TGC-3'; VT079: 5' -GGC CAG AAA ATC CAG CAG GTA-3'。
扩增体系(20. Oul):病毒DNA 2. Oul， VT076引物0. 5ul， VT079引物0. 5ul， T叫酶0. 5ul， Tag酶Buffer 2. Oul， dNTP 0.5ul， H20 14. Oul 。
扩增条件95°C 3min; 95°C 40sec， 56°C 40sec， 72°C 240sec， 35个循环；72 °C lOmin。
结果见图12。图12中，M: ADNA/EcoRI+Hind III(MBI); N:阴性对照;1-4: 1#-4#
毒株o
1#-4#毒株均能扩增出946bp片段，说明含有病毒基因结构，SG600与 pPE3-F11B-PDCD5在293细胞内重组成功。
(5) 用引物VT298和VT299扩增缺失
VT298: 5' -GCA TTC TCT AGA CAC AGG TG-3'; VT299: 5' -ACC TGC CAC GAG GCT GGC-3'。
扩增体系(20. Oul):病毒DNA 2. Oul， VT298引物0. 5ul， VT299引物0. 5ul， Taq酶0. 5ul， Tag酶Buffer 2. Oul， dNTP 0.5ul， H20 14. Oul 。
扩增条件95°C 3min; 95°C 40sec， 56°C 40sec， 72°C 240sec， 35个循环；72 °C lOmin。
结果见图13。图13中，M: ADNA/EcoRI+Hind III(MBI); N:阴性对照；1-4: 1#-4# 毒株。
Itt-4tt毒株的CR2成功缺失了 E1A中结合Rb的CR2基序，所以扩出非特异条带。
(6) 用引物VT633和VT634扩增PDCD5基因 VT633: 5' -Act agt gat taa get cga gtc tg-3'; VT634- 5' —gat tat ggc gga cga gga get tg-3'扩增体系(20.0ul):病毒DNA 2. Oul， VT633引物0. 5ul， VT634引物0.5ul， Taq酶0.5ul， Tag酶Buffer 2. Oul， dNTP 0. 5ul， H20 14. Oul 。
扩增条件95°C 3min; 95°C 40sec， 46°C 40sec， 72°C 240sec， 35个循环；72 。C 10min。
结果见图14。图14中，M: ADNA/EcoRI+Hind III(MBI); N:阴性对照;1-4: l共-4tt 毒株。
1#-4#毒株扩增出417bp的PDCD5基因。 (7)用引物10054和59928扩增野生型腺病毒 10054: 5' —GGG CGT AAC CGA GTA AGA TTT G-3;; 59928: 5' -TGG AAG ATT ATC AGC CAG TAC-3''。
扩增体系(20,0ul):病毒DNA 2.0ul， 10054引物0. 5ul， 59928引物0.5ul， Taq酶0.5ul， Tag酶Buffer 2.0ul， dNTP 0.5ul， H20 14. Oul 。
扩增条件95°C 3min; 95°C 40sec, 56°C 40sec， 72°C 240sec， 35个循环；72 °C 10min。
结果见图15。图15中，M: ADNA/EcoRI+Hind III(MBI); N:阴性对照;1-4: 1#-4tt 毒株。
l共-4tt毒株能扩增出660bp片段，说明SG600与PPE3-F11B-PDCD5在293细胞内重组。
以上鉴定结果表明，1共-4#毒株均为可作为目的重组腺病毒，选择lft毒株进行后 续试验，将1#毒株命名为SG611-PDCD5。 五、病毒的扩增、纯化和滴度测定
将SG611-PDCD5在293细胞中反复扩增，生产50个75cW培养瓶病毒；通过氯化铯梯 度离心法纯化病毒，收获的病毒进行质检，高效液相色谱法测二者纯度均达到98%以 上；采用半数组织培养感染剂量(50% tissue culture infectious dose , TCID50 ) 法测定SG611-PDCD5效价，病毒滴度为2. 91X 101()TCID50/ml。
实施例2、 SG611-PDCD5感染K562细胞后PDCD5的表达量
实时定量RT-PCR检测不同M0I的SG611-PDCD5感染K562细胞(上海坤肯生物化工有 限公司；中国细胞库典藏细胞中心细胞目录QK10269)后PDCD5的表达水平。取对数 生长期K562细胞，以8X107孔接种于六孔板，分别进行以下四个处理，每个处理设三 个复孔
处理一至处理三分别以M0I=1的剂量感染SG611-PDCD5、 SG611-EGFP或
13Ad-PDCD5;处理四(对照)用等量生理盐水作为对照。
感染后每天同一时间收获半量细胞常规提取总RNA并经逆转录成cDNA。采用TaqMan技术在ABI 7500 Sequence Detection System (App lied B iosys2teras, USA)完成实时定量RT-PCR。 PCR引物序列、反应体系及PCR条件参见文献(Ruan GR， QinYZ, Chen SS， Li几，Ma X， Chang Y， Wang YZ, Fu JT， Liu YR. Abnormal expressionof the programmed cell death 5 gene in acute and chronic myeloid leukemia.
紐2006 S印；30(9) :1159-65.)。实时定量PCR扩增后的ABL及PDCD5的Ct值分别代入标准曲线方程进行计算，以PDCD5/ABL比值代表PDCD5表达的相对水平。
结果如图16所示，以未感染病毒的K562细胞(对照)的PDCD5/ABL水平为1，MOI为1时，与感染SG611-EGFP或Ad-PDCD5相比，K562细胞感染SG611-PDCD5后PDCD5的表达水平随时间延长而不断升高，第4、 5、 6、 7、 8、 9天PDCD5/ABL比值分别为3. 53±0. 65、 11.45±1. 75、 33. 14±11.43、 39. 23±16. 85、 70. 12±3. 13及168. 32±32. 13。
实施例3、流式细胞术检测SG611-EGFP对K562细胞的感染效率取对数生长期K562细胞，调整细胞浓度为2X10Vml，以4ml (8Xl(f细胞)/孔接种于六孔板，分别进行以下四个处理，每个处理设三个复孔
处理一至处理三分别以,1=1、 5、 10的剂量感染SG611-EGFP;处理四(对照)
用等量生理盐水作为对照。
感染后24、 48、 72、 96、 120小时后各收集细胞一次，每组均收集三复孔细胞混合，用PBS洗涤2次后，上流式细胞仪(FACSort型，美国Becton Dickinson公司)检测并计算阳性细胞百分率，激发光为488nm，检测光为530nm。
结果如图17所示，随着M0I增加，SG611-EGFP病毒感染K562细胞后，其感染效率依次增加。感染24小时后，MOI- 1、5、10的感染效率分别为6. 39%、46. 47%及71. 16%。感染72小时后，M0I=1、 5、 10的感染效率分别为31.29%、 91.27%、和93. 96%。随着时间延长，感染效率也逐渐升高。M0I为1时，在第24、 48、 72、 96、 120小时的感染效率分别为6. 39%、 7. 41%、 31. 29%、 62. 16%和83. 8%。 M0I为5时，在第24、 48、72、 96、 120小时的感染效率分别为46. 47%、 55. 44%、 91. 27%、 95. 38%和97. 74%。 M0I为10时，在第24、 48、 72、 96、 120小时的感染效率分别为71. 16%、 83. 80%、 93. 96%、98. 08%和98. 68%。
实施例4、 MTT法检测SG611-PDCD5对K562细胞的杀伤作用取对数生长期的K562细胞，调整细胞浓度为lX106/ml，以40iil/管(4X1(T细胞/孔)在10ml离心管内分别以不同MOI感染SG61卜PDCD5、 Ad-PDCD5或SG611病毒液，同时设生理盐水参照组。感染最初两小时每20-30分钟轻轻混匀，感染2小时后补充含2%FBS (GIBCO公司)的RPMI1640液至1200 ix 1,以300 u 1/孔(1X10'细胞/孔)接种于24孔板培养。分别于第3、 5和6天补充300wl、 600 u 1禾B 1200 ii 1含2。/。FBS的RPMI1640培养液。感染后第7天加入MTT工作液(5mg/ml)，每孔20ul，继续培养4小时后，加入200 yl 10%SDS-0. 01M HC1溶解细胞。570 nm波长(Bio-Rad650型酶标仪)下测定吸光度(A)值，参考波长630nm。每组病毒液每个MO工设3个复孔求平均值。细胞存活率(cell viability)以该孔的吸光度与参照孔吸光度的比值(百分数)计算。
结果如图18所示，感染7天后，MOI为l、 10、 20、 40、 80时,感染SG611-PDCD5的K562细胞随着MOI升高其细胞存活率明显降低，其存活率分别为94%、 72%、 6%、1%和0%，其中MOI为20、 40、 80时，感染SG611-PDCD5组与感染Ad-PDCD5或SG611组相比，细胞存活率降低有统计学意义的差别(尸值均小于O.Ol)。
实施例5、 MTT法检测SG611-PDCD5对Dami细胞的杀伤作用取对数生长期的Danii细胞(上海坤肯生物化工有限公司，中国细胞库典藏细胞中心细胞目录QK10058)，调整细胞浓度为lX107ml，以50iil/孔(5Xl(f细胞/孔)接种细胞至96孔板，分别以不同MOI感染SG611-PDCD5、 Ad-PDCD5或SG611病毒液，同时设生理盐水参照组。2h后补充含10呢FBS (GIBCO)的RPMI1640液至100y 1/孔。于感染后96h加入MTT工作液(5mg/ml)，每孔20ul，继续培养4小时后，加入80ul 10%SDS-0.01M HC1溶解细胞。570 nm波长(Bio-Rad650型酶标仪)下测定吸光度(A)值，参考波长630nm。每组病毒液每个MOI设3个复孔求平均值。细胞存活率(cellviability)以该孔的吸光度与参照孔吸光度的比值(百分数)计算。
结果如图19所示，感染96h后，M01为10、 40、 80、 160、 320时，感染SG611-PDCD5的Dami细胞随着MOI升高细胞存活率明显降低，其存活率分别为10.45%、 5.22%、3. 80%、 5. 22%和4. 75%，与感染Ad-PDCD5或SG611的Dami细胞相比，细胞存活率的降低幅度均有统计学意义的差别(尸值均小于0. 01)。
实施例6、 MTT法检测SG611-PDCD5对NB4细胞的杀伤作用NB4细胞上海坤肯生物化工有限公司，中国细胞库典藏细胞中心细胞目录QK10271。实验方法同实施例5。
结果如图20所示，感染96h后，MOI为10、40、80、 160和320时，感染SG611-PDCD5的NB4细胞随着M0I升高细胞存活率明显降低，其存活率分别为96.21%、 61.75%、34. 12%、 16. 04%和6. 82%,其中MOI为40、 80、 160和320时，感染SG611-PDCD5组与感染Ad-PDCD5或SG611组相比，细胞存活率的降低幅度均有统计学意义的差别(尸值均小于0. 01)。
实施例7、 MTT法检测SG611-PDCD5对6T-CEM细胞的杀伤作用6T-CEM细胞上海坤肯生物化工有限公司，中国细胞库典藏细胞中心细胞目录QK10007。
实验方法同实施例5。
结果如图21所示，感染96h后，M0I为20、 80和320时，感染SG611-PDCD5的6T-CEM细胞随着M0I升高细胞存活率明显降低，其存活率分别为76. 05%、 77. 92%和0%，其中M0I为320时，感染SG611-PDCD5组与感染Ad-PDCD5或SG611组相比，细胞存活率降低幅度有统计学意义的差别(户值小于0. 01)。
实施例8、 MTT法检测SG611-PDCD5对MEG-01细胞的杀伤作用MEG-Ol细胞上海坤肯生物化工有限公司，中国细胞库典藏细胞中心细胞目录QK10748。
实验方法同实施例4。
结果如图22所示，感染7天后，M0I为1、 10、 20、 40、 80时，感染SG611-PDCD5的MEG-01细胞随着M0I升高细胞存活率明显降低，其存活率分别为87%、 79%、 53%、8%和0. 98%，其中M0I为40、 80时，感染SG611-PDCD5组与感染Ad-PDCD5或SG611组相比，细胞存活率降低有统计学意义的差别(尸值均小于O.Ol)。
实施例9、 SG611-PDCD5对K562细胞在裸鼠体内瘤体生长的抑制作用采用4-5周龄雌性BALB/C裸鼠(北京大学医学部动物实验中心)进行动物实验。接种K562细胞前，每只裸鼠连续两天腹腔注射100mg/kg的环磷酰胺注射液。大量培养的对数生长期K562细胞，台盼兰活细胞计数后，离心收集，用无血清RPMI 1640洗涤。K562细胞以1.5X107个/点接种裸鼠腋窝皮下，每日观察裸鼠瘤体生长情况，当用游标卡尺测量肿瘤直径达5-7鹏时将动物分为4组SG611组(n二6)、SG611-PDCD5组(n:6)、 Ad-PDCD5组(n=5)和对照组(生理盐水组，『5)。 Ad-PDCD5组、SG611组
16和SG611-PDCD5组分别以2X 109pfu/ral病毒液100 n 1局部注射瘤体内，隔天一次， 共5次，每只小鼠总共注射lX109pfu。隔天观察一次肿瘤大小，运用游标卡尺测量 肿瘤长径和短径，按下列公式计算肿瘤体积L X I2 X 0.52 (L:肿瘤最大径，I: 肿瘤最小径)。
结果如图23所示，与对照组相比，Ad-PDCD5组瘤体生长无统计学意义(第28天 时，尸>0.05)。与Ad-PDCD5组相比，自注射药物后第14天起SG611-PDCD5组瘤体生 长受抑(第14、 16、 18天时，尸值均小于0.05;第20、 22、 24、 26、 28天时，尸值 均小于0.01)。SG611组瘤体生长较Ad-PDCD5组缓慢，但无统计学意义(第28天时，尸 〉0.05)。与SG611组相比，SG611-PDCD5组较SG611抑瘤效应明显，自第24天起，差 异有统计学意义(第24、 26和28天尸值分别为0. 00485、 0. 00443和0. 00284)。注射 药物后第28天对照组、Ad-PDCD5、 SG611和SG611-PDCD5组的肿瘤平均体积(mm3)分 别为2223. 19. 4±916. 81、 2080. 75±1068. 27、 1264. 46±545. 55和371. 22±113. 15。 动物实验结果显示SG611-PDCD5对K562细胞裸鼠体内瘤体生长有一定的抑制作用。
17序列表
<110〉北京大学人民医院
<120〉表达促凋亡基因的靶向增殖的重组腺病毒及其应用
<130> CGGNARY92060 〈140〉 200910077912.8 <■ 14
〈210> 1
〈211〉 21
<212> 腿 〈213〉人工序列
〈220〉 〈223>
<400> 1
caaccacagg cggatctcta c 21
〈210> 2
<211> 21
〈212〉 DNA <213>人工序列
〈220〉 <223>
〈400> 2
gttccaggac caagttatac g 21
〈210〉 3
<211> 20
〈212> DNA 〈213〉人工序列
〈220〉 <223>
〈400〉 3
gatctcacag acgcccagga 20
〈210> 4
<211> 21
〈212> 腿 <213>人工序列
〈220> <223>
〈400〉 4
tcctcgtcgt cactgggtgg a 21 <210> 5
18<formula>formula see original document page 19</formula><210> 10
〈211〉 18
〈212> DNA <213>人工序列
〈220〉 〈223>
〈400> 10
acctgccacg aggctggc 18
<210> 11
<211> 23
〈212> 腿 〈213〉人工序列
<220> 〈223〉
<400> 11
actagtgatt aagctcgagt ctg 23
<210> 12
<211> 23
〈212〉 ■ 〈213〉人工序列
〈220> <223>
<400> 12
gattatggcg gacgaggagc ttg 23
<210> 13
<211〉 22
<212> DNA
〈213〉 人工序列
〈220〉 <223〉
<400〉 13
gggcgtaacc gagtaagatt tg 22
〈210〉 14
<211> 21
〈212〉 腿 〈213〉人工序列
<220〉 <223>
<400> 14
tggaagatta tcagccagta c 2权利要求
1、包括PDCD5基因表达盒的重组腺病毒，所述PDCD5基因表达盒自上游至下游依次包括如下组件启动子、人PDCD5的cDNA和终止子。
2、 如权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于所述PDCD5基因表达盒中， 所述启动子为小鼠CMV启动子，所述终止子为TGA终止子。
3、 根据权利要求1或2所述的重组腺病毒，其特征在于所述PDCD5基因表达 盒还包括SV40polyA信号序列；所述SV40polyA信号序列位于所述终止子的下游。
4、 如权利要求1至3中任一所述的重组腺病毒，其特征在于所述重组腺病毒 是将所述PDCD5基因表达盒插入SG600病毒基因组得到的。
5、 如权利要求4中所述的重组腺病毒，其特征在于所述重组腺病毒是将重组 表达载体pPE3-FllB-PDCD5与pSG600共转染哺乳动物细胞得到；所述pPE3-FllB-PDCD5是pENTRll-PDCD5禾P pPE3-FllB-RC重组得到的；所述 pENTRll-PDCD5是将力ge I禾卩I酶切pClonl5-PDCD5得到的小片段与I禾P Afet I酶切pENTRll-Linker得到的大片段连接得到的；所述pClonl5-PDCD5是将PDCD5 基因插入pClonl5得到的。
6、 如权利要求5所述的重组腺病毒，其特征在于所述哺乳动物细胞为293细 胞；所述PDCD5基因为用fco/ I酶切pDC316-PDCD5得到的小片段。
7、 重组表达载体pPE3-F11B-PDCD5，所述pPE3-F11B-PDCD5是pENTRll-PDCD5 和pPE3-F11B-RC重组得到的；所述pENTRll-PDCD5是将I和#W I酶切 pClonl5-PDCD5得到的小片段与^《e I和I酶切pENTRll-Linker得到的大片段 连接得到的；所述pClonl5-PDCD5是将PDCD5基因插入pClonl5得到的。
8、如权利要求7所述的重组表达载体，其特征在于所述PDCD5基因为用￡boWI 酶切pDC316-PDCD5得到的小片段。
9、 一种药物，它的活性成分为权利要求1-6中任一所述的重组腺病毒；所述药 物为如下l)和/或2)和/或3)和/或4)的药物1) 抑制肿瘤细胞生长的药物；2) 诱导肿瘤细胞凋亡的药物；3) 抑制肿瘤生长的药物；4) 治疗癌症的药物。
10、 如权利要求9所述的药物，其特征在于所述肿瘤细胞为白血病细胞系细胞； 所述肿瘤细胞为K562细胞、MEG-01细胞、Dami细胞、NB4细胞或6T-CEM细胞；所述肿瘤为白血病；所述癌症为白血病。
全文摘要
本发明公开了一种表达促凋亡基因的靶向增殖的重组腺病毒及其应用。本发明提供了包括PDCD5基因表达盒的重组腺病毒，PDCD5基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、人PDCD5的cDNA和终止子。本发明构建得到的SG611-PDCD5重组腺病毒，是应用了人端粒酶逆转录酶启动子和缺氧反应启动子双调控的减毒增殖型腺病毒。以未携带PDCD5的增殖性腺病毒为对照，体外及裸鼠体内实验发现单用SG611-PDCD5重组腺病毒对白血病细胞系K562、MEG-01、Dami、NB4及6T-CEM细胞生长具直接的抑制作用。实验表明，本发明的重组腺病毒可应用于靶向抑制肿瘤细胞生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡和/或抑制肿瘤生长的药物，有望成为一种新型的治疗癌症的药物。
文档编号A61P35/00GK101497876SQ20091007791
公开日2009年8月5日 申请日期2009年2月3日 优先权日2009年2月3日
发明者吴红平, 艳 常, 李琳芳, 李金兰, 牛继红, 敏 谢, 钱其军, 阮国瑞, 陈珊珊, 马大龙, 黄晓军 申请人:北京大学人民医院