抗a型肉毒毒素的人源性中和抗体及其应用的制作方法

专利名称：：抗a型肉毒毒素的人源性中和抗体及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抗A型肉毒毒素的中和抗体，具体地说是耙向抗A型肉毒毒素的特异性人源中和单克隆抗体及一种混合抗体。
背景技术：
：肉毒梭菌(aoW〃W/ww6o加/fm^)是一种厌氧的、革兰氏阳性的孢子形成菌，肉毒毒素(botulinumneurotoxin,BoNT)是由肉毒梭菌分泌的一种神经毒素，它可以作用于周围运动神经末梢，神经肌肉接点即突触处，抑制突触前膜释放神经介质——乙酰胆碱，从而引起肌肉松驰性麻痹。食品污染、婴儿肠道感染及伤口感染是引起人类肉毒毒素中毒的主要原因[2]。肉毒毒素(BoNT)作为目前已知毒性最强的细菌蛋白质，共分为A-G七种血清型，其中A型肉毒毒素相比其它型可引起更严重的中毒症状和导致更高的死亡率。肉毒毒素无论是作为生物武器，还是作为生物恐怖战剂，或者是偶尔肉毒中毒及突发事件，其潜在的危害不可估计。国家在制定防御策略时必须考虑肉毒毒素的预防和治疗问题。因此，进行肉毒毒素的防治研究无论是对国家生物安全、公共卫生安全及人民生命健康安全都具有重要现实意义和巨大社会价值。随着国际恐怖主义活动的闩益猖獗，各国对于肉毒毒素中毒的防治也愈加重视。由于疫苗只能在中毒前发挥有效的预防作用，而肉毒毒素的中和抗体既可以在中毒前起到短期预防的效果，更可以在中毒后使用达到治疗的目的，因此A型肉毒毒素中和抗体的研制不管对于普通民众肉毒中毒的治疗还是对于国家防御都具有重要意义。目前治疗肉毒毒素的方法是使用马源的抗毒素血清，但由于马血清的异源性、费用高、生产周期长等缺点，在一定程度上限制了它的应用。而研制具有中和作用的人源基因工程抗体成为目前人们研究的主要方向。许多实验室获得肉毒毒素中和抗体的方法是首先通过鼠杂交瘤技术获得单克隆抗体，然后对这些鼠源抗体进行基因工程改造，使之能满足人体使用的需要。但是这些抗体在人源化改造过程中往往存在亲和力及活性下降等一系列问题。随着抗体库技术的F1渐成熟，应用噬菌体抗体库展示技术、酵母展示技术及核糖体展示技术等直接获得亲和力高、特异性强、稳定性好、中和活性高的人源中和抗体，成为目前获得肉毒毒素基因工程中和抗体的主要方法，特别是利用噬菌体抗体库技术制备人源性抗体是一种比较简单、快速且经济的方法。随着噬菌体抗体库技术的快速发展，从大容量人噬菌体抗体库中筛选制备中和性抗体具有很多优势首先它的快速、高通量筛选更利于在较短时间内筛选到大量的候选克隆；其次由于抗体库的容量较大，理论上更容易筛选到高亲合力的特异性抗体；再次从人噬菌体抗体库中筛选到的抗体均为人源抗体，不需要经过改造便可直接应用于人体。目前肉毒毒素基因工程中和抗体的研发均处于实验室研究或临床前的中试生产阶段，还没有一种中和性抗体被批准上市。肉毒毒素中和抗体的研制之所以比较困难，其中重要的一点就是目前所获得的中和抗体，不论亲和力多高，单一抗体均不能很好地完全中和毒素，而两个或三个抗体联合使用则会大大提高中和活性，这可能与毒素本身具有多个受体结合区有关。针对肉毒毒素与受体细胞结合的双受体多表位的特点，必须研制多株具有不同表位的抗体进行联合使用，才能达到完全封闭结合表位的作用，从而起到较好的中和保护效果。
发明内容为了解决现有技术中存在的问题和空白，本发明的目的在于提出两种无需经人源性改造即可直接应用于人体的高亲和性、高中和性抗A型肉毒毒素人源性中和抗体。本发明的另一目的在于，提出上述抗A型肉毒毒素人源性中和抗体的新应用。本发明的发明思路及技术方案为以A型肉毒毒素保护性抗原He为筛选抗原，通过对库容量达到1.35x1010的大容量全合成人噬菌体单链抗体库进行筛选，在筛选方法上进行了改进，通过固相筛选、夹心法筛选及固相竞争筛选三种不同筛选方式共获得两个具有体内外中和活性且针对不同抗原表位的A型肉毒毒素特异性抗体CIO、1B6，从而为A型肉毒毒素的中毒治疗提供有效的治疗手段。为实现本发明的发明目的，本发明的具体技术方案为一种抗A型肉毒毒素的人源性中和抗体，该抗体是针对A型肉毒毒素的抗体，其轻链CDR3区含有如序列表SEQIDNo.l所示序列的90-99位氨基酸残基序列，其重链CDR3区含有如序列表SEQIDNo.2所示序列的99-106位氨基酸残基序列。上述的一种抗A型肉毒毒素的人源性中和抗体，其中，该抗体轻链可变区基因序列如SEQIDNo.l所示，重链可变区基因序列如SEQIDNo.2所示。一种抗A型肉毒毒素的人源性中和抗体，其中，该抗体是针对A型肉毒毒素的抗体，其轻链CDR3区含有如序列表SEQIDNo.3所示序列的90-99位氨基酸残基序列，其重链CDR3区含有如序列表SEQIDNo.4所示序列的99-108位氨基酸残基序列。上述的一种抗A型肉毒毒素的人源性中和抗体，其中，该抗体轻链可变区基因序列如SEQIDNo.3所示，重链可变区基因序列如SEQIDNo.4所示。上述抗体的形式可以为单链抗体、双价抗体、Fab抗体和全抗体形式中的任何一种。上述的抗A型肉毒毒素的人源性中和抗体在制备短期预防肉毒毒素疫苗中的应用。上述的抗A型肉毒毒素的人源性中和抗体在制备治疗肉毒毒素中毒药物中的应用。另一种抗A型肉毒毒素的人源性中和混合抗体，其是由上述两种抗体混合而成。所述混合抗体在制备短期预防肉毒毒素疫苗中的应用。所述混合抗体在制备治疗肉毒毒素中毒药物中的应用。本发明的优点及有益效果本发明与现有针对A型肉毒毒素的中和抗体相比有以下优点①首次从全合成人噬菌体抗体库中筛选获得的A型肉毒毒素中和抗体。②本发明公开的两种抗体及其混合抗体均为人源抗体，无需经人源化改造便可直接应用于人体，简化了制备步骤，降低了制备成本，克服了异源性抗体的缺陷，达到了很好的亲和力。③C10全抗体的亲和力高达6.46X10—"M，可完全满足临床使用要求。④C10和1B6抗体单独使用及两个抗体联合使用时均具有较好的体内外中和活性。上述内容已经充分的说明了本发明的技术方案和有益效果，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一歩叙述，以使公众对
发明内容有更深入的了解，具体实施方式的实施例均为最佳的技术方案，而并非对本发明的限制。图1为CIO和1B6单克隆抗体的特异性检测的柱形图。图2为竞争ELISA法检测C10和1B6针对不同抗原结合表位的柱形图。从图中的结果可以看到，CIO自身不同形式的抗体可以竞争抑制抗体与抗原的结合，而1B6和C10抗体之间不能互相竞争抑制与抗原的结合，说明C10和1B6这两株抗体是针对不同抗原结合表位的抗体。图3为采用细胞免疫荧光检测法在荧光显微镜下观察到的CIO(图3B为绿色荧光代表有结合)和1B6(图3C为绿色荧光代表有结合)全抗体对BoNT/A-Hc与PC-12细胞结合的抑制作用(注图3A为红色荧光为BoNT/A-Hc，3D为红色荧光为BoNT/A-Hc+无关抗体对照)。具体实施例方式实施例l两种A型肉毒毒素人源性中和抗体的获得一.从大容量全合成抗体库中筛选获得A型肉毒毒素特异性抗体CIO本发明中所涉及的抗体库由发明人构建获得，为本发明抗体序列的直接来源，其构建过程为选择部分使用频率较高的人抗体胚系基因家族的框架区基因进行人工合成，选用占k链可变区基因42.7%的Vk3和32.2%的Vk1，占入链基因30.5%的V人3和占28.6%的V人1，占重链可变区基因39.8%的VH3和占16.7%的VH5。在进行框架区基因的设计时，首先根据报道的框架区的氨基酸序列转换为相应的核苷酸序列，在转换过程中，按照大肠杆菌优势密码子进行转换。同时人工设计合成半随机CDR3,通过重叠拼接延伸PCR的方法合成抗体基因。然后利用限制性内切酶SfiI、NotI分别双酶切抗体基因和噬菌体展示载体。连接后的重组噬粒通过电击转化的方法转入大肠杆菌TG1，构建而成。以纯化的BoNT/A-Hc蛋白为抗原，以PBS为阴性对照，对大容量全合成抗体库共进行了三轮固相筛选，第一轮的具体筛选方法为A)抗原包被包被浓度为10"g/mL，包被量为lmL，4。C包被18h以上。PBS洗涤2遍，2min/次，之后用1%酪蛋白37°C封闭2h。B)结合按照库容量的50倍以上计算噬菌体抗体库投入量，将抗体库用0.5%酪蛋白和0.l%Tween20于37°C预封闭30min,加入封闭后的免疫管中，37°C作用lh，转入室温作用30min(轻摇)。C)洗涤用PBST洗涤10次，PBS洗涤5次，3min/次。D)洗脱用Ph2.2的0.1MHC1-Glycin(盐酸甘氨酸缓冲系统)洗脱，室温摇动10min，吸出洗脱液，lMTris中和至PH7.4，将免疫管用对1.2mL数生长期的XL1-Blue直接感染，同时将HCl-Glycin洗脱的噬菌体用9倍体积的XL-Blue进行感染。两者均室温感染10min，转入37°C、150rpm培养lh,取1%、0.1%、0.01%涂板计算产出量。剩余部分混合离心后浓缩到为lmL，分别涂于3—5块大培养板，37。C培养过夜。E)呈现将培养过夜培养板菌落刮下，取部分冻存，部分投入下一轮筛选。即将部分液加入到100mL2Y丁CTG(Tel:10"g/mL:Glucose:0.5%;Cm:100yg/mL)培养液中，使菌浓度为0D600=0.5左右，于37°C培养至OD600=0.7(菌量为2X108/mL)，加入50:1的辅助噬菌体M13K07,混匀后室温静置15min，于37°C、150rpm培养lh后加入等体积的2VTC(Cm:100yg/mL)，并加入Kana至50ug/mL，混匀后等分为3份，其中一份加入IPTG至终浓度为0.15mM，一份含0.25-0.5%葡萄糖，一份既不含有IPTG也不含有葡萄糖，为2YTCTKP培养液，三份均继续于30。C，200rpm培养过夜(10—12h)。F)噬菌体上清回收次闩离心，回收噬菌体上清，加入1/4体积的PEG8000(20%PEG8000,2.5MNaCl)混匀后于冰上作用45min，10000g以上离心30min，将沉淀重悬于2—5mLPBS中(含1X酪蛋白或2。/。BSA)。取少量测定滴度，剩余-20。C保存备用。G)噬菌体滴度测定取5uL待测噬菌体上清，稀释到500uLLB培养基中，混匀后取5"L依次稀释，共4次，取50uL稀释到450uLLB中，混匀备用。取400uL稀释的phagemid-噬菌体上清，与400"L的对数生长期的XLl-blue混合，室温静置感染15min，37°C，180rpm培养lh,取200yL铺LBCTG平板，37°C培养过夜，计数菌落数并估算滴度。在第二轮筛选中，将抗原包被量降为lyg/mL，第三轮时将包被量降为0.3ng/mL，其它歩骤均与第一轮相同，三轮筛选结果见表l。表1anti-BoNT/A-Hc特异性噬菌体抗体的筛选富集情况统计表抗原包被量Oig/mL)投入量(cfu)产出量(cfu)投入/产出比第一轮101.25x1066.25xl(T8第二轮1lx10124.5x1054.5xl(T7第三轮0.3从表l可以看出，随着筛选轮数的增加，获得的噬菌体抗体逐渐获得了富集，第三轮的投入产出比约为第一轮的20倍。从第三轮筛选获得的噬菌体抗体克隆中，随机挑取了约1000个克隆，采用噬菌体7ELISA的方法，以HRP标记的鼠抗M13抗体为二抗，初歩鉴定阳性克隆，结果显示与阴性对照孔相比，约70%的克隆为阳性克隆。挑取经初歩鉴定OD492nm/630nm大于1.8的克隆，将这些克隆进行噬菌体单克隆呈现后，离心收集噬菌体抗体上清，做进一歩的特异性鉴定。以BoNT/A-Hc为阳性抗原，TNFa、ErBb2为对照抗原，以HRP标记的鼠抗M13抗体为二抗进行检观ij，ELISA显色结果显示，约90%的克隆特异性较高，均特异性地只与BoNT/A-Hc结合，而与其他无关蛋白不发生结合。从ELISA鉴定特异性好的阳性克隆中随机挑取了18株克隆进行测序，得到了5株序列不同的单链抗体基因H2、H3-3、CIO、Bll、3H3，测序结果显示它们具有明显的框架倾向性，轻链均为X3框架，CDR3区为10个氨基酸，重链均为H5框架，CDR3区为8个氨基酸，并且CDR3区中的某些氨基酸具有明显的保守性。由于A型肉毒毒素抗体的抗原表位对于其是否具有中和活性具有很大的影响，如果所筛选到的抗体具有相同的抗原表位，则没有必要将所有抗体均进行进一歩的研究。因此，又分别构建了5株单链抗体不含E-tag标签的表达载体，与含有E-tag标签的单链抗体竞争与抗原的结合，采用竞争ELISA的方法首先验证了测序得到的5株单链抗体的抗原表位是否一致。实验结果可以看到，与单株抗体的显色值相比，各株抗体之间均存在不同程度的抑制作用，说明它们的抗原表位基本一致，或互有重叠。从上面的实验结果还可以看到，C10这株单链抗体对其它几株的抑制作用最为明显。此外，在与BoNT/A-Hc抗原结合的实验中，在抗体量基本相同的情况下，C10的显色值最高。综合以上实验结果，认为造成这种情况的原因是C10的亲和力较高，而高亲和力对于抗体的中和活性具有重要影响，因此认为C10是一株极具潜力的抗体，值得做进一歩的研究来证实它的中和活性。在最初的筛选中，还获得了大量的没有测序的阳性克隆，对于这些克隆，也采用竞争ELISA的方法验证了它们与C10的抗原表位是否一致。选取了49株噬菌体抗体进行了单克隆呈现，通过比较加入C10单链抗体与噬菌体抗体竞争结合抗原后，显色值是否降低，来判断该噬菌体抗体是否与C10具有相同的表位。从实验结果可以看到，与克隆C10自身对照相比，C10单链抗体对这49株噬菌体抗体中的大部分均有不同程度的抑制作用，说明它们的表位基本一致。二.C10单链抗体原核表达载体的构建及表达通过SfiI和NotI酶切含单链抗体基因的噬菌体质粒载体，回收scFv基因与相同酶切的表达载体Kil-SN相连，构建了单链抗体的大肠杆菌分泌表达载体。将构建正确的单链抗体表达载体Kil-SN-scFv质粒转化大肠杆菌KS1000(DE3),采用GMM培养基，37'C,200rpm培养至OD6咖m^0.6时加入IPTG至终浓度0.005mM，30。C诱导过夜。通过与Kil蛋白的共表达，促进了目的蛋白的膜穿透，在培养上清中获得了目的蛋白的较高表达，目的蛋白分子量约为28KD，用HRP标记的鼠抗E-tag抗体进行western-blot鉴定，结果显示该蛋白为目的蛋白，而空载体对照无条带出现。三.C10全抗体真核瞬时表达载体的构建及表达H293和L293-CL分别是本实验室构建保存的IgG4全抗体重链和X链表达载体，已经连接有轻重链的恒定区(CH、CL)。采用PCR的方法扩增获得C10抗体的轻重链可变区(VH、VL)基因，将其连接入相应的载体，分别构建了C10全抗体的轻重链表达载体。将构建好的C10IgG4全抗体轻重链表达载体转染293-F细胞，在无血清培养基中进行悬浮培养，分别收集l-4天的表达上清，通过ELISA的方法检测C10IgG4全抗体的瞬时表达情况。转染后72h，抗体表达量达到最高，收集表达上清，利用全抗体Fc段与ProteinA蛋白特异性结合的特性，采用HiTrapTM卬rotdnAFF预装柱纯化C10全抗体。四.从大容量全合成抗体库中筛选获得A型肉毒毒素特异性抗体1B6为了筛选到更多与C10单克隆抗体具有不同抗原结合表位的抗体，采用夹心法及固相竞争筛选两种方法分别对本实验室构建的大容量全合成噬菌体抗体库进行了两轮和三轮筛选，在夹心法筛选的第二轮中，不仅将抗原的包被量降低为2pg/mL，抗体库投入量降低至4xl011，而且还在抗体库中加入C10Diabody纯化抗体进行预封闭，以减少筛选过程中抗抗体的产生。此外，为了尽量避免重复克隆，仅进行了两轮筛选后，便挑取克隆进行鉴定。其中夹心法筛选的具体步骤如下A)抗体包被以大肠杆菌纯化表达的C10Diabody抗体包被免疫管，包被浓度为l(Vg/mL，包被量为lmL，4。C包被18h以上。PBS洗涤2遍，2min/次，之后用1X酪蛋白37。C封闭2h。B)抗原结合将抗原BoNT/A-Hc用含1%酪蛋白的PBST稀释至浓度为25吗/mL，37°C预封闭15min后，加入封闭后的免疫管中，37。C作用lh。C)抗体库结合:按照库容量的50倍以上计算噬菌体抗体库投入量,将抗体库用0.5%酪蛋白和0.1%Tween20于37°C预封闭30min，加入封闭后的免疫管中，37°C作用lh，转入室温作用30min(轻摇)。D)洗涤用PBST洗涤10次，PBS洗涤5次，3min/次。E)洗脱用Ph2.2的0.1MHC1-Glycin(盐酸甘氨酸缓冲系统)洗脱，室温摇动10min，吸出洗脱液，lMTris中和至PH7.4，将免疫管用对1.2mL数生长期的XL1-Blue直接感染，同时将HCl-Glycin洗脱的噬菌体用9倍体积的XL-Blue进行感染。两者均室温感染10min，转入37。C、150rpm培养lh，取1%、0.1%、0.01°/。涂板计算产出量。剩余部分混合离心后浓縮到为lmL，分别涂于3—5块大培养板，37。C培养过夜。其余歩骤同之前的固相筛选。在固相竞争法筛选与C10具有不同抗原表位抗体的过程中，采用纯化的BoNT/A-Hc抗原包被酶联板，首先用纯化的C10Diabody封闭其抗原表位，然后加入抗体库竞争结合其它的抗原表位。在第二轮筛选中，选取了比第一轮更严格的筛选条件，经过两轮筛选后，抗体库有了少许富集，在第三轮筛选中，为了使抗体库获得更多富集，并且减少前两轮筛选中产生的抗抗体，采用了常规固相筛选方法，并采取了更加严格的筛选条件，从筛选结果显示抗体库有了明显的富集，约富集了6倍左右。其中固相竞争筛选的具体步骤如下A)抗原包被以纯化的BoNT/A-Hc抗原包被免疫管，包被浓度为5pg/mL,包被量为lmL，4。C包被18h以上。PBS洗涤2遍，2min/次，之后用lX酪蛋白37。C封闭2h。B)C10抗体与抗原结合将纯化的C10Diabody抗体用含1%酪蛋白的PBST稀释至浓度为15pg/mL，37。C预封闭15min后，加入封闭后的免疫管中，37°C作用lh。C)PBST洗涤4次，3min/次，洗去多余的C10Diabody抗体。D)抗体库结合:按照库容量的50倍以上计算噬菌体抗体库投入量，将抗体库用0.5%酪蛋白、0.1%Tween20和2pg/mL的C10Diabody于37°C预封闭30min，加入免疫管中，37°C作用lh，转入室温作用30min。E)洗涤用PBST洗涤10次，PBS洗涤5次，3min/次。F)洗脱用Ph2.2的0.1MHC1-Glycin(盐酸甘氨酸缓冲系统)洗脱，室温摇动10min,吸出洗脱液，lMTris中和至PH7.4，将免疫管用对1.2mL数生长期的XL1-Blue直接感染，同时将HCl-Glycin洗脱的噬菌体用9倍体积的XL-Blue进行感染。两者均室温感染lOmin，转入37。C、150卬m培养lh，取1%、0.1%、0.01%涂板计算产出量。剩余部分混合离心后浓縮到为lmL，分别涂于3—5块大培养板，37。C培养过夜。其余歩骤同之前的固相筛选法。经过夹心法两轮筛选和固相竞争筛选法三轮筛选后，挑取经两种方法筛选后获得的克隆，首先采用噬菌体ELISA检测了这些克隆与BoNT/A-Hc的结合情况。大部分克隆的显色值均高于阴性对照3倍以上，选取显色值较高的克隆，进一歩鉴定它们与抗原BoNT/A-Hc结合的特异性。从实验结果可以看出，约50%的克隆特异性较好，只与BoNT/A-Hc抗原结合，而与其它无关抗原没有明显结合。选取特异性较好的10株噬菌体抗体，采取竞争ELISA的方法检测它们与C10的抗原表位是否一致。结果显示2G4、1B6、1D7、2G1、1G8、1G2、1E2七株抗体C10具有不同的抗原结合表位。我们对这7株特异性较好且与C10具有不同抗原表位的抗体进行了测序，获得了轻链X3、重链H3框架的单克隆抗体1B6。五.1B6单链抗体原核表达载体的构建及表达表达载体构建方法及表达歩骤同"CIO单链抗体原核表达载体的构建及表达"六.1B6全抗体真核瞬时表达载体的构建及表达表达载体构建方法及表达步骤同"CIO全抗体真核瞬时表达载体的构建及表达"实施例2竞争ELISA法检测C10和1B6针对不同抗原结合表位BoNT/A-Hc抗原l(ig/mL，50pL/孔，4'C包被酶联板过夜。PBST洗涤4次，5min/次。将1B6和C10噬菌体上清与C10scFv表达上清各5(^L混合后室温孵育15min后，加入酶联板中，37t:反应lh，同时设噬菌体上清与Kil-SN空载体表达上清混合物为对照。PBST洗涤4次，5min/次。加入HRP-anti-M13二抗，37。C反应30-40min。加入OPD显色液，50pL/孑L，显色后用2MH2S04终止，酶标仪492nm/630nm双波长测定光吸收值。以加入Kil-SN空载体表达上清孔的显色值为对照，观察加入C10scFv表达上清后，噬菌体抗体的显色值是否下降来判断1B6抗体与C10抗体表位是否一致。实验结果如图2所示，为竞争ELISA法检测C10和1B6针对不同抗原结合表位柱形图。从图中的结果可以看到，C10自身不同形式的抗体可以竞争抑制抗体与抗原的结合，而1B6和C10抗体之间不能互相竞争抑制与抗原的结合，说明C10和1B6这两株抗体是针对不同抗原结合表位的抗体。实施例3实施例1制备的两种A型肉毒毒素人源性中和抗体的体内外中和活性检测一.细胞免疫荧光法检测CIO、1B6全抗体对BoNT/A-Hc与PC-12细胞结合的抑制作用采用细胞免疫荧光法检测了C10和1B6全抗体的体外中和活性，将C10和1B6全抗体在体外分别与抗原BoNT/A-Hc孵育一段时间，使其充分作用后，再加入到NGF诱导分化的PC-12细胞中，观察C10和1B6全抗体在体外是否能够有效地抑制BoNT/A-Hc和PC-12细胞的结合。图1为C10和1B6单克隆抗体的特异性检测的柱形图。从图中可以看出，C10和1B6单克隆抗体均能够和BoNT/A-Hc发生特异性结合，而与无关蛋白TNFa禾口ErBb2基本不发生结合。图3为采用细胞免疫荧光检测法在荧光显微镜下观察到的C10(图3B为绿色荧光代表有结合)和1B6(图3C为绿色荧光代表有结合)全抗体对BoNT/A-Hc与PC-12细胞结合的抑制作用。(注图3A为红色荧光为BoNT/A-Hc，3D为红色荧光为BoNT/A-Hc+无关抗体对照)。红色荧光是衬染，绿色荧光代表有结合。从荧光显色结果可以看出BoNT/A-Hc单独存在(图3A)或加入无关抗体时(图3D)能够与PC-12细胞发生结合，产生绿色荧光，而将BoNT/A-Hc与C10和1B6全抗体在体外混合作用30min后，再加入PC-12细胞中，则看不到绿色荧光(图3B和图3C)，说明C10和1B6全抗体在体外能够有效地阻止BoNT/A-Hc与受体细胞的结合，具有体外中和活性。二.C10、1B6抗体的体内中和活性采用小鼠体内攻毒保护实验分别检测了C10和1B6两个抗体单株使用、两株联合使用时的体内中和活性。分别将20LD5o剂量的毒素与50吗的单株抗体或抗体混合物在体外孵育一段时间后，进行小鼠腹腔注射，不同时间观察记录小鼠存活情况(表2)。从实验结果可以看出，注射毒素组，小鼠在21h内全部死亡；1B6抗体单独使用时，可以延长小鼠致死时间，但不能完全保护20LDso剂量的毒素攻击；C10抗体单株使用12时，可以部分保护小鼠20LD5o剂量的毒素攻击；1B6和C10两株抗体联合使用时50ug抗体能够完全保护小鼠抵御20LD5Q剂量的毒素攻击。表2小鼠体内攻毒保护实验中不同时间小鼠存活情况统计<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>本发明C10和1B6混合抗体与马源抗毒素比较，本发明体内保护实验可以看出，本发明抗体可以与现有的马源抗毒素具有同等的功效。但是，由于马源抗毒素受供体马数量的限制，能提供的血清是有限的，并且对于人而言，它属于异源蛋白，在改造的过程中往往存在亲和力及活性下降等一系列问题。马源抗毒素具有高免疫原性，易引起一些副作用，9%的人使用后可能产生过敏反应，而且存在潜在病毒污染等问题，应用受到很大限制，而本发明中的基因工程的人源抗体C10和1B6可以大量地生产提供抗毒素而且安全性高，因此与马源抗毒素相比有很大的优势。序歹U表〈110〉中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所<120〉抗A型肉毒毒素的人源性中和抗体及其应用〈130>〈160〉4<170〉Patentlnversion3.5〈210〉<211〉〈212〉<213〉〈400〉MetAlaSer1GlyGinThrTyrAlaSer35lieTyrGlu50GlySerAsn65AlaGluAspPheSerSer<210>21111PRT人工序列1TyrGluLeuThrGinProProSerValSerValAla20Trp5ArgGluVal100Ala85PhelieThrCysTyrGinGinAspSerLysSerGlyAsn70GluArg55ThrLys40ProSer25ProGlyGlyGlyThr10510GlyAlaThrLeuTyrTyrCysSer90LysAspAlaLeuGlyGinSerGlylieThr75SerAlaPro45ProGlu60lieSerLeuThrValGly30ValTrpAspAsnLeu110AlaPro15AspLysLeuValArgPheSerGlyThrGin80AspLeu95Gly14<211〉117<212>PRT<213〉人工序列〈400〉2GkiValGln1SerLeuLysTrplieGlylie50GinGly65LeuGlnValThrTrpAlaArgTrpVal115LeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyGlu51015lieSerCysLysGlySerGlyTyrSerPheThrSerTyr202530TrpValArgGlnMetProGlyLysGlyLeuGluTrpMet4045TyrProGlyAspSerAspThrArgTyrSerProSerPhe5560SerlieSerThrAlaTyr7580ThrAlaMetTyrTyrCys95TrpGlyGlnGlyThrLeu110Gly35lieGlnValThrSerSer85ThrVal100SerSerlieSerAlaAspLys70LeuLysAlaSerAsp90LysArgPheAlaTyr105<210〉3<211>111〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉3MetAlaSerTyrGluLeuThrGlnProProSerValSerValAlaProGlyGinThrTyrAlaSer35lieTyrGlu50GlySerAsn65AlaGluAspGinPheVal5AlaArglieThrCys20TrpTyrGinGinLys40AspSerLysArgPro55SerGlyAsnThrAla70GluAlaAspTyrTyr85ValPheGlyGlyGly10010SerGlyAspAla25ProGlyGinAlaSerThrCysThr105GlyliePro60LeuThrlie75GinValTrp90LysLeuThr15LeuGlyAspLys30ProValILeuVal45GluArgPheSerSerGlyThrGin80AspAsnGlyArg95ValLeuGly110<210〉4〈211〉119<212〉PRT<213〉人工序列<400〉4GluValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrProSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlalieSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal50556016LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgProPheSerPheSerGlylieMetAspAspTrpGlyGinGly100105110ThrLeuVaJThrValSerSer11权利要求1、一种抗A型肉毒毒素的人源性中和抗体，其特征在于，该抗体是针对A型肉毒毒素的抗体，其轻链CDR3区含有如序列表SEQIDNo.1所示序列的90-99位氨基酸残基序列，其重链CDR3区含有如序列表SEQIDNo.2所示序列的99-106位氨基酸残基序列。2、根据权利要求1所述的一种抗A型肉毒毒素的人源性中和抗体，其特征在于，该抗体轻链可变区基因序列如SEQIDNo.l所示，重链可变区基因序列如SEQIDNo.2所示。3、一种抗A型肉毒毒素的人源性中和抗体，其特征在于，该抗体是针对A型肉毒毒素的抗体，其轻链CDR3区含有如序列表SEQIDNo.3所示序列的90-99位氨基酸残基序列，其重链CDR3区含有如序列表SEQIDNo.4所示序列的99-108位氨基酸残基序列。4、根据权利要求3所述的一种抗A型肉毒毒素的人源性中和抗体，其特征在于，该抗体轻链可变区基因序列如SEQIDNo.3所示，重链可变区基因序列如SEQIDNo.4所示。5、根据权利要求1至4中任意一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体的形式可以为单链抗体、双价抗体、Fab抗体和全抗体形式中的任何一种。6、根据权利要求1至4中任意一项所述的抗A型肉毒毒素的人源性中和抗体在制备短期预防肉毒毒素疫苗中的应用。7、根据权利要求1至4中任意一项所述的抗A型肉毒毒素的人源性中和抗体在制备治疗肉毒毒素中毒药物中的应用。8、一种抗A型肉毒毒素的人源性中和混合抗体，其特征在于，其是由权利要求2和权利要求4所述抗体混合而成。9、权利要求8所述混合抗体在制备短期预防肉毒毒素疫苗中的应用。10、权利要求8所述混合抗体在制备治疗肉毒毒素中毒药物中的应用。全文摘要本发明公开了两种抗A型肉毒毒素的人源性中和抗体，其中一种抗体的轻链可变区基因如SEQIDNo.1所示，重链可变区基因如SEQIDNo.2所示；另一种抗体轻链可变区基因如SEQIDNo.3所示，重链可变区基因如SEQIDNo.4所示组成。它们是以A型肉毒毒素保护性抗原Hc为筛选抗原，通过对库容量达到1.35×10¹⁰的大容量全合成人噬菌体单链抗体库进行筛选而获得的，这两种抗体在体外能够抑制抗原BoNT/A-Hc与受体细胞PC-12的结合，在体内单株使用时两种抗体对肉毒毒素均具有很好的抑制作用，联合使用时两者能够发挥协同作用，抑制作用更佳。且本发明抗体特异性强、亲和力高，具有很好的体内外中和活性。文档编号A61K39/08GK101503472SQ20091008002公开日2009年8月12日申请日期2009年3月17日优先权日2009年3月17日发明者蕊于,余云舟,俞炜源,孙志伟,林建波,双王申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所