专利名称：：芹菜素在制备预防和治疗人缺血损伤引起疾病的药物应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及芹菜素在制备预防和治疗缺血性疾病上的新用途，其目的是提供一种通过阻断细胞程序性坏死而发挥拮抗局部缺血所引起的机体器官损伤并减轻其功能障碍的预防和治疗药物。荩菜素(Apigenin，4，，5，7-Trihydroxyflavone，5，7_dihydroxy_2_(4-hydroxyphenyl)-4h-l-benzopyran-4-on，4，5，7-三羟基黄酮)是芹菜中的主要生物活性成分，广泛存在于多种水果、蔬菜、豆类和茶叶、玄参科植物水蔓青、寥科虎杖、百合科毛叶藜芦及松科植物中，属于多酚类黄酮类化合物，具有多种生物学活性。现有研究表明它具有抑制致癌物质的致癌活性、抗病毒、抗炎、抗氧化及诱导细胞凋亡等作用，因此被用于抗肿瘤等实验性治疗，前期虽有个别研究注意到芹菜素能减轻脑缺血_再灌流引起的神经损伤和肝缺血再灌流引起的肝功能损伤现象，但因不清楚其作用机制，所以无法明确芹菜素能否广泛应用于缺血性坏死的阻断治疗。我们在研究中发现，在适宜的药物浓度下，芹菜素在体外培养细胞体系中，可以通过抑制细胞内的CK2激酶从而降低Hsp90复合体中重要的辅助伴侣分子cdc37的磷酸化[图1]，由于cdc37的磷酸化对于维系Hsp90的分子伴侣功能是至关重要的，降低cdc37的磷酸化可导致Hsp90的分子伴侣功能受到抑制，介导多种Hsp90的底物蛋白分子被降解，其中包括对于细胞程序性坏死具有重要介导作用的RIP1激酶蛋白，与其他具有Hsp90抑制功能的天然药物比较，雷公藤红素(Cel)可以明显降低RIP1的表达，但同时诱导PARP蛋白剪切，细胞出现凋亡，提示细胞毒性较强。姜黄素(Cur)则未显示具有降低RIP1蛋白表达的作用，只有芹菜素在降低RIP1表达的同时并不诱导细胞凋亡(图2)。继之我们在体外由死亡受体介导的细胞程序性坏死的实验体系中检测了芹菜素和雷公藤红素对于阻断死亡受体介导的细胞程序性坏死的影响，结果显示雷公藤红素的确具有较强的细胞毒性，而芹菜素预处理则可以明显增强L929细胞对肿瘤坏死因子介导细胞坏死的耐受性[图3]，证实芹菜素可以通过强大的降低RIP1激酶蛋白水平的作用，实现其对细胞程序性坏死的保护作用，且其作用效果与已知的细胞坏死保护剂Necrostatin-l(Nec-l)相当[图3]。芹菜素对细胞拮抗坏死的保护作用在大鼠体内脑缺血_再灌流损伤模型也得到进一步证实[表1]。四图1.芹菜素(Api)按选择的时间处理前列腺癌细胞系LNCaP及PC_3细胞，收集细胞后裂解，采用抗Cdc37抗体行免疫共沉淀(IP)实验，沉淀产物经SDS-PAGE及转膜后分别与抗磷酸化丝氨酸、Cdc37、Hsp90及雄激素(AR)抗体进行蛋白印记检测，以全细胞裂解液(WCL)为参照。结果显示芹菜素可时间依赖地降低Cdc37的磷酸化，及Cdc37与Hsp90及其底物AR和Cdk4的结合，抑制Hsp90的分子伴侣功能。图2.芹菜素处理前列腺癌细胞系LNCaP及PC_3细胞后，收集细胞裂解，蛋白印记法检测各蛋白表达的改变。结果显示芹菜素可时间依赖性地诱导包括RIP-1、Src、XIAP、Cdk4、Survivin等多种Hsp90底物蛋白降解。图3.蛋白印记法比较天然药物雷公藤红素(Cel)、姜黄素(Cur)及芹菜素(Api)对L929细胞RIP1蛋白稳定性及细胞凋亡的影响，结果显示雷公藤红素可以明显降低RIP1蛋白的表达，但同时引起PARP蛋白剪切，诱导细胞凋亡。姜黄素对RIPl及PARP蛋白均没有影响，仅芹菜素可以有效降低RIP1蛋白的水平，同时不剪切PARP蛋白诱导细胞凋亡。图4.采用活细胞计数法检测肿瘤坏死因子TNF-a诱导L929细胞坏死，同时比较Nec-1、芹菜素及雷公藤红素预处理对TNF-a诱导细胞坏死的影B向，结果表明雷公藤红素自身细胞毒性较强，而芹菜素具有良好的细胞保护作用，其效果与已知细胞坏死保护剂Nec-1相当。五具体实施例方式下列实施例仅对本发明作进一步说明，而本发明不受此限制。实施例一芹菜素对死亡受体介导的L929细胞程序性坏死的保护作用取对数生长期L929细胞，lxl05/ml接种于6孔细胞培养板中。实验设(1)正常对照组；(2)单纯肿瘤坏死因子(TNF-a)处理组；(3)TNF_a与已知细胞坏死抑制剂Nec_l共处理组；(4)单纯芹菜素处理组；(5)芹菜素预处理后加入TNF-a处理组；(6)单纯雷公藤红素(Cel)处理组；(7)雷公藤红素预处理后加入TNF-a处理组。次日(5)(7)组分别加入芹菜素和雷公藤红素预处理6小时后，移除药物，细胞经PBS冲洗后，更换新鲜培养基，除(1)组外，各组分别加入100ng/ml肿瘤坏死因子(TNF-a)，24小时后消化细胞，胎盘蓝染色，计数活细胞数，并计算细胞生存百分率。结果如图4所示，芹菜素预处理显示良好的细胞坏死保护作用，预处理后可明显降低TNF-a介导的细胞死亡，其保护作用与Nec-1相当。实施例二芹菜素对SD(Sprague-Dawley)大鼠脑缺血再灌流损伤的保护作用健康雄性SD大鼠，体重300-350克，随机分为4组假手术组、模型组(结扎导致脑缺血2小时后再灌流24小时)、尼莫地平阳性对照组及芹菜素治疗组。术前三天，尼莫地平组及芹菜素治疗组动物分别于腹腔注射lmg/kg/day尼莫地平或20mg/kg/day芹菜素。三日后采用Longa的方法制备SD大鼠脑缺血再灌注模型，各组在缺血1小时后按3mg/kg尼莫地平或3mg/kg芹菜素剂量分别静脉注射给药一次，缺血2小时后再灌流24小时。各组动物断头处死，取脑组织制备冠状脑片，2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)法染色，观察测量梗塞区体积。表l.雷公藤红素对大鼠脑缺血再灌流损伤脑梗塞体积的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求芹菜素在制备预防和治疗人缺血损伤性疾病的药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的疾病是局部脑缺血所引起的脑梗塞。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的疾病是局部心肌缺血所引起的心绞痛、心肌梗塞。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的疾病是缺血所引起的肾梗死。5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的疾病是缺血所引起的肝损伤。6.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的疾病是四肢局部缺血所引起的骨骼肌坏死。7.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的疾病是肺缺血所引起的肺损伤。8.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的疾病是肠道缺血所引起的肠粘膜损伤。9.如权利要求1所述的药物，其特征在于辅以药学上可以接受的载体或辅料制成干粉剂、片剂、胶囊剂(含软、硬胶囊)、胶丸、滴丸、脂质体、颗粒剂、口服液、针剂及外用剂型等。全文摘要本发明涉及天然药物芹菜素在制备抗缺血损伤性疾病的药物中的应用。这些疾病包括急性心肌梗塞、脑梗塞、肠缺血、四肢缺血性坏死及肝、肾等器官因缺血造成的细胞坏死及功能损害。文档编号A61P9/10GK101711758SQ200910084958公开日2010年5月26日申请日期2009年6月5日优先权日2009年6月5日发明者于晓妉,徐元基,杜芝燕,赵名,陈国柱申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所