专利名称：特异性前哨淋巴结显像剂药物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种特异性前哨淋巴结显像剂药物及其制备方法，具体地说，涉及一 种Rituximab抗体标记的特异性前哨淋巴结显像剂药物及其制备方法。
背景技术：
前哨淋巴结(sentinel lymph node，SLN)是原发癌发生淋巴结转移所经过的第一 站淋巴结，前哨淋巴结将最先收容沿着淋巴引流途径转移的肿瘤细胞，因而反映了整个局 部淋巴引流区域的肿瘤状况。前哨淋巴结活检(sentinel lymph node biopsy, SLNB)是指 获取前哨淋巴结并进行病理学检查的技术手段。一般来说，前哨淋巴结无肿瘤转移即可排 除淋巴引流区域无扩散。在乳腺癌治疗中，腋窝淋巴结清扫对早期乳腺癌的生存效果并无明显改善，较大 手术范围只能增加并发症，腋窝淋巴结清扫也并不能发现内乳区淋巴结的转移。因而了解 区域淋巴结是否转移对判断预后、指导治疗有重要意义，其关键在于能准确定位原发肿瘤 引流区域的前哨淋巴结。目前使用的前哨淋巴结放射性药物有99mTc-硫胶体(99mTc-S) ,"mTc-右旋糖酐 (99mTc-DX)、99mTc-人血清白蛋白(99mTc-HAS)及其衍生物等。这些药物存在次级淋巴结摄取、 显像及活检时间受限及注射点放射性滞留高等缺陷。发展一种性能稳定、操作简单、具有高 特异性的前哨淋巴结显像剂将极大的推进前哨淋巴结活检术的发展，为乳腺癌保乳术及保 腋窝术提供有力的技术支撑，改善病人的生存质量。Rituximab (利妥昔单抗，商品名称为美罗华)是一种针对前B和成熟B淋巴细 胞膜上CD20分子研制的高纯度单克隆抗体。人体淋巴结上有大量的CD20抗原，因此对 Rituximab修饰并进行99mTc的标记，得到99mTc-Rituximab能够与前哨淋巴结内CD20抗原 结合，准确定位前哨淋巴结，从而为乳腺癌患者进行乳腺癌前哨淋巴结显像及活检分析，建 立一整套安全、方便、行之有效的乳腺癌前哨淋巴结显像技术奠定基础，为今后的临床广泛 应用提供方法和依据。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种性能稳定、操作简单、具有高特异性的前哨淋巴结 显像剂药物。本发明的另一目的是提供一种特异性前哨淋巴结显像剂药物的制备方法。本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提供 的一种特异性前哨淋巴结显像剂药物及其制备方法，对Rituximab抗体修饰并进行标记， 制备特异性前哨淋巴结显像剂药物及含有该特异性前哨淋巴结显像剂药物的显像剂。本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。前述的特异性前哨淋巴结显像剂药物及其制备方法，其中所述的抗体修饰是用 2-亚氨基噻吩或2-巯基乙醇，对Rituximab抗体进行修饰后分离。
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将分离后的抗体进行分装，加入保护剂、成型剂或多糖后冷冻干燥，制备冻干药
品.O前述的特异性前哨淋巴结显像剂药物及其制备方法，其中所述的保护剂选自以下 物质人血白蛋白、V。、人IgG和其它无关蛋白质；所述的成型剂选自以下物质尿素、蔗糖、 果糖等；所述的多糖选自以下物质中的一种或多种甘露醇、蔗糖、果糖等。前述的特异性前哨淋巴结显像剂药物及其制备方法，其中所述的抗体标记是对制 得的Rituximab的冻干药盒进行99mTc核素的标记，得到99mTc-Rituximab。一种含有前述的特异性前哨淋巴结显像剂药物的显像剂，其还包括还原剂(如氯 化亚锡)、转移螯合剂(如葡庚糖酸纳)、稳定剂(如维生素C)、成形剂(如多聚糖)等。前述的特异性前哨淋巴结显像剂药物及其制备方法，其中所述的Rituximab与 2_亚氨基噻吩按物质量摩尔比1 3至1 25混合，在4°C下避光反应40 60min，或 Rituximab与2-巯基乙醇按物质量摩尔比1 1000至1 2000混合，避光反应15min，用 PD-10柱分离纯化，PD-10柱使用前需用pH7. 4的0. OlM的磷酸缓冲液25ml饱和淋洗。前述的特异性前哨淋巴结显像剂药物及其制备方法，对其中所述的分离后的抗体 进行分装，按0. 5mg抗体，加入20mg的葡萄糖赋形剂，冷冻干燥。前述的特异性前哨淋巴结显像剂药物及其制备方法，向其中所述的冻干药盒中加 Λ 0. Iml的PBS溶解，顺序加入Img的葡庚糖，5 15 μ g氯化亚锡，370MBq的Na99mTcO4,室 温反应IOmin后，PD-10柱分离，即得到99mTc-Rituximab。前述制得的99mTc-Rituximab的放射化学纯度大于90%。所制得的冻干药盒性质稳定，在-20°C保存3个月以上，测定药盒的标记率和放射 化学纯度均大于90% ,99mTc-Rituximab与人血清37°C孵育24H性质稳定。99mTc-Rituximab的动物SPECT显像显示，99mTc-Rituximab能准确定位前哨淋巴 结，并且在30min-18H内大鼠的前哨淋巴结清析可见。无次级淋巴结显影。借由上述技术方案，本发明特异性前哨淋巴结显像剂药物及其制备方法至少具有 下列优点及有益效果(1)次级淋巴结摄取低，不显像；(2)显像及活检时间不受限；(3)注射点滞留低。
图1为本发明较佳实施例在Sprague Dawley鼠的前脚掌皮下注射 99mTc-Rituximab后的前哨淋巴结显像图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例(1)抗体修饰在Rituximab抗体中，加入2_巯基乙醇(两者物质的量比为 1 1000)，避光反应15min后，用PD-10柱分离。(2)冻干药盒的制备将分离后的抗体进行分装，每份中含有0. 5mg抗体，加入20mg的葡萄糖赋形剂，Dura-Dry 冻干机冷冻干燥。即得Rituximab的冻干药盒。(3)放射性的标记在冻干药盒中加入0. Iml的PBS溶解，顺序加入Img的葡 庚糖，15yg氯化亚锡，370MBq的Na99mTcO4,室温反应IOmin后，PD-10柱分离，即得到 99mTc-Rituximab。测定标记率及放射化学纯度。标记率的测定采用双层析展开测定，体系1 =ITLC-SG(快速硅胶薄层层析-硅胶 纸)展开剂氨水乙醇水=1 2 5(体积比)；标记物和游离锝在前沿，胶体在原点； 体系2 =TLC-SG 展开剂丙酮，标记物和胶体在原点，游离锝在前沿。采用HPLC分析，流动 相pH = 7. 4PBS, Rf = 8. 95min。结果显示，标记率和放射化学纯度大于90%。(4)冻干药盒的稳定性测定将冻干药盒放置在-20°C冰箱中，在1个月，2个月，3 个月测定药盒的标记率和放射化学纯度，均大于90%。说明99mTc-Rituximab冻干药盒性质 稳定，适用于临床的需要。(5) 99mTc-Rituximab 在动物体内的分布实验取 180_200g 雌性 Sprague Dawley 鼠， 前脚掌皮下注射 1. 8MBq/10y 1 99mTc-Rituximab,于 30min，1H，2H，4H，18H 处死。处死前 15min于注射位置周围皮下注射亚甲蓝0. Iml0分别取血，心，肺，肝，脾，肾，小肠，胃，肌肉 称重，并测定其放射性计数。计算％ ID/g;并取注射点和前哨淋巴结测定其放射性计数，计 算％ ID，具体分布结果见表1和表2。从表1可以看出局部注射99mTc-Rituximab后，99mTc-Rituximab在血液中清除较 快，主要通过肾脏排泄，18H时肾的摄取值为5. 29士0. 96% ID/g，肝脏早期也有部分放射性 聚集，其它各脏器未见有明显的放射性滞留。表 I99mTc-Rituximab 在 Sprague Dawley 鼠的体内分布(η = 4) 表2显示的是前哨淋巴结与注射点的％ ID及两者的比值的百分比。 99mTc-Rituximab主要分布在注射点及SLN内。在30min 18H内，注射点99mTc-Rituximab 的摄取量逐渐降低，SLN摄取在IH 4H内逐渐增加，在4H时达到2. 14士0. 46% ID。在4H 和18H的SLN/注射点的％ ID的百分比为14. 80士2. 11，13. 03士3. 98。表2 SLN与注射点的％ ID，及SLN/注射点％ ID的百分比(η = 4)
(5)99mTc-Rituximab 的动物显像取 180_200g 雌性 Sprague Dawley 鼠，前脚掌 注射 3. 7MBq/10y 1 99mTc-Rituximab,于注射后 30min, 1H，2H，4H，18H 在德国西门子 E. cam SPECT仪进行图像采集，能峰为1440keV，能窗为20%，矩阵128X 128，图像放大为2. 29，进 行动物正位显像。观察大鼠腋下前哨淋巴结的摄取变化和全身分布情况，其显像结果见图 1。由图1可见，局部注射99mTc-Rituximab后，30min时可显示较清晰的SLN轮廓，在1H，2H， 4H，18H均能见到前哨淋巴结清晰显像。在整个显像过程中，始终未见次级淋巴结显影。表 明99mTc-Rituximab定位SLN性能良好，表明冻干后的标记抗体具有很好的生物活性，为该 药物进行前哨淋巴结显像提供了药物支撑。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
Rituximab抗体在制备前哨淋巴结显像剂中的应用。
2.一种特异性前哨淋巴结显像剂药物，其是由99mTc核素标记经2-亚氨基噻吩或2-巯 基乙醇修饰的Rituximab获得。
3.一种含有权利要求2所述显像剂药物的显像剂。
4.如权利要求3所述的显像剂，其还包括还原剂、转移螯合剂、稳定剂和成形剂。
5.一种制备权利要求2所述显像剂药物的方法，其包括步骤用2-亚氨基噻吩或2-巯 基乙醇修饰Rituximab，用99mTc核素标记修饰后的Rituximab。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，将Rituximab用2-亚氨基噻吩或2-巯 基乙醇修饰后加入冻干保护剂或赋形剂冻干保存，在使用前用99mTc核素标记修饰后的 Rituximab。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤1)抗体的修饰 用2-亚氨基噻吩或2-巯基乙醇，对Rituximab抗体进行修饰，并用PD-10柱分离；2)冻 干将分离后的抗体进行分装，加入保护剂或成型剂后冷冻干燥，制成冻干药盒；3)抗体的 标记对制得的Rituximab的冻干药盒进行99mTc核素的标记，得到99mTc-Rituximab,优选制 得的99mTc-Rituximab的放射化学纯度大于90%。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，其中步骤1)按Rituximab与2-亚氨基噻吩 物质量摩尔比为1 3 1 25混合，避光反应45 60min或2)按Rituximab与2-巯 基乙醇物质量摩尔比1 1000 1 2000混合，避光反应15min ；反应完成后并用PD-10 柱分离。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，其中步骤2)将分离后的抗体进行分装，按 0. 5mg抗体，加入20mg的葡萄糖赋形剂，冷冻干燥。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，其中步骤3)在冻干药盒中加入0.Iml的 PBS溶解，顺序加入Img的葡庚糖，15 μ g氯化亚锡，370MBq的< Na99mTcO4,室温反应10_15min 后，当标记率小于90%，需PD-10柱分离，即得到99mTc-Rituximab。
全文摘要
本发明提供了一种特异性前哨淋巴结显像剂药物及其制备方法，对Rituximab抗体修饰并进行99mTc的标记，得到99mTc-Rituximab能够与前哨淋巴结内CD20抗原结合，准确定位前哨淋巴结，从而为乳腺癌患者进行乳腺癌前哨淋巴结显像及活检分析，建立一整套安全、方便、行之有效的乳腺癌前哨淋巴结显像技术奠定基础，为今后的临床广泛应用提供方法和依据。
文档编号A61K103/10GK101927009SQ20091008670
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月19日 优先权日2009年6月19日
发明者李艳, 杨志, 王雪娟 申请人:北京肿瘤医院